CN114010805B - 一种含有稳定剂的微球、制备方法及其应用 - Google Patents
一种含有稳定剂的微球、制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种含有稳定剂的微球，所述微球适合于包裹药物或者惰性气体，成分包括微球载体材料、渗透压调节剂、稳定剂、药物或惰性气体，其中所述稳定剂包括甘露醇、几丁糖和聚甲基丙烯酸甲酯的混合物，其质量体积百分数(％，w/v)分别为2％～3％:0.2％～1.5％:0.2％～1.5％，加入该稳定剂，能够解决微球混悬液中的普遍易分层，微球浓度的极度不均匀问题，且提高微球的稳定性，不易破碎，从而提高微球制剂的稳定性，适合微球产业化生产。
Description
技术领域
本发明属于医药及化学领域，具体涉及一种含有稳定剂的微球、制备方法及其应用。
背景技术
微球是一种将药物等包裹或分散在生物可降解材料基质中制成粒径几微米到几百微米的球形实体。具有降低给药频率、提高顺应性，减少毒副作用、提高疗效，降低血药浓度波动，提高用药安全性等优点，被广泛应用于缓控释注射剂、植入剂等。例如，目前已经上市的
(注射用亮丙瑞林微球)，Sandostatin
(注射用醋酸奥曲肽微球)等。
其中一类微球可以载入惰性气体，主要应用于超声造影领域，利用含有气泡的液体对超声波有强散射的特性,临床将超声造影剂注射到人体血管中用以增强血流的超声多普勒信号和提高超声图像的清晰度和分辨率。目前第二代超声造影剂为包裹高密度惰性气体为主的外膜薄而柔软的气泡，稳定时间长，振动及回波特性好。常用的惰性气体例如已上市的
(注射用全氟丙烷人血白蛋白微球)的全氟丙烷，
(注射用六氟化硫微泡)等。
微球，尤其是气体微球类产品(微泡)，类似一种球壁、球内气体和溶液的结构，这种溶液随着生产配置后，就会等待后续制备成为冻干粉注射剂，而后使用时，冻干粉注射剂就会被复溶成混悬液，注射入人体。这其中涉及一个长期存在的质量问题，即工业生产的微泡混悬液(制备罐)中的微球稳定性较差，一是溶液出现分层(通常分为上、中、下层，根据取样位置不同，得出的微球浓度不同)、二是溶液中微球会出现破裂(室温放置10min即开始出现破碎)，进一步使得微球的溶液质量稳定性降低。
为了规避气体微球不稳定的问题，现行业普遍选择的是采用专利CN110101878A描述的连续生产方式，即不让气体微球出现静置动作，微球制备出来立即完成灌装，但这也存在整条生产线联动要求高，产能低，损耗高，成品率低等诸多问题。专利CN101130094A描述另外一种方式，微球静置过夜，待不稳定微球消失，分层稳定后，重新混合用于灌装，但该工艺复杂耗时，且不能保证混合后产品浓度和均一性，并不适合产业化。
上述这两类方案具有耗时长，物料浪费等缺点，且也无法从根本上解决微球稳定性的问题，即，使微球在制备完成后，在一定时间内，例如2h(这个时间足以保证后续灌装工序的完成)，微球溶液不出现分层，微球破碎率非常小的要求。
因此，这需要微球制备时，对其组方进行调整，融入惰性气体后，得到一种稳定的微球混悬液，从而维持溶液的稳定，由于微球混悬液中稳定剂研究较少，而加入何种成分能够达到这种效果，成为了微球研究的一个重大课题。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种含有稳定剂的微球，包括溶液和氟化物惰性气体两部分，按质量体积百分数(％，w/v)，溶液由以下组分组成：
微球载体材料2％～10％，所述微球载体材料为丝素蛋白、玉米醇溶蛋白、白蛋白中的一种或多种混合物；
稳定剂2％～10％，所述稳定剂为甘露醇、几丁糖和聚甲基丙烯酸甲酯的混合物；
渗透压调节剂0.2％～20％，所述渗透压调节剂为氯化钠，葡萄糖的一种或混合物；
余量为水；
所述氟化物惰性气体分散于所述溶液中，比例为40-140g：1000ml，所述氟化物惰性气体为六氟化硫、全氟丙烷、全氟丁烷中的一种或多种混合物。
因为本产品通常为注射剂，人体注射量较小(5ml左右)，因此渗透压调节上，相对宽松，设计在等渗范围上下浮动，甚至可以高于等渗条件。
本发明中所述成分，均为w/v，根据渗透压调节剂可选用氯化钠、葡萄糖的一种或多种混合物，其中氯化钠的浓度倾向于等同于生理盐水的浓度，而葡萄糖的浓度也倾向于等渗溶液，通常为5％w/v，特殊情况可采用5％以上，目前葡萄糖注射液浓度包括5％，10％，20％，50％(w/v)，因此，推荐所述葡萄糖浓度为5％-20％，进一步优选5％-10％。
发明中还应考虑氯化钠的浓度筛选，由于生理盐水的浓度为0.9％，根据渗透压研究发现，注射剂的NaCl，考虑到其他组分的浓度，浓度范围优选0.5％-1％(w/v)，属于生理可接受范围。
《中国药典》规定等渗为285～310mOsmol/kg，除另有规定外，应符合下列规定：静脉注射260～500mOsmol/kg，上述处方在各组分高浓度情况下，渗透压符合药典对静脉注射给药注射剂要求。
惰性气体以40-140g：1L比例分散于液体，足以保证溶液得到充足的惰性气体，从而产生符合标准的微泡悬液，过高则造成惰性气体的浪费。
上述配方中，各成分含量均在正常用量，甚至低于该组分正常的用量，经过渗透压测定，属于目前注射液领域生理可接受范围内。
另外，微球载体材料调整到2％-10％，有利于更好地载气，降低微球载体材料的浓度就会降低其载气能力。
进一步地，所述微球，包括溶液和氟化物惰性气体两部分，按质量体积百分数(％，w/v)，溶液由以下组分组成：
微球载体材料2％～8％，所述微球载体材料为丝素蛋白、玉米醇溶蛋白、白蛋白中的一种或多种混合物；
稳定剂2％～6％，所述稳定剂为甘露醇、几丁糖和聚甲基丙烯酸甲酯的混合物；
渗透压调节剂0.5％～15％，所述渗透压调节剂为氯化钠和葡萄糖的混合物；
余量为水；
所述氟化物惰性气体分散于所述溶液中，比例为40-140g：1000ml。
进一步地，所述微球，包括溶液和氟化物惰性气体两部分，按质量体积百分数(％，w/v)，溶液由以下组分组成：
微球载体材料2％～5％，所述微球载体材料为丝素蛋白、玉米醇溶蛋白、白蛋白中的一种或多种混合物；
稳定剂2％～5％，所述稳定剂为甘露醇、几丁糖和聚甲基丙烯酸甲酯的混合物；
所述氯化钠为0.5％-1％；
所述葡萄糖为5％-10％；
余量为水；
所述氟化物惰性气体分散于溶液中，比例为40-140g：1000ml。
进一步，提供一种微球，按照质量体积百分数(％，w/w)计，各组分如下：
人血白蛋白4％；葡萄糖10％；氯化钠0.54％；甘露醇2.2％；几丁糖0.5％(分子量19000道尔顿)；聚甲基丙烯酸甲酯0.5％(分子量15000道尔顿)；水调节至100％，得到溶液，氟化物惰性气体以40-140g：1L的比例加入溶液，得到所述微球的混悬液。
在本发明中，针对的是本领域的一种普遍存在的技术难题，针对于气体混入的微球混悬剂，制备过程中，其稳定性极大地影响了产品质量和使用。
按照本领域的设计理念，通常是含有的成分越少越好，因此申请人在研发过程中，现有工艺采用了实验例1，一种常规的处方，其中载体蛋白选择人血白蛋白，同时加入葡萄糖和氯化钠，目的是模拟人体等渗溶液的环境，当加入全氟丙烷进行载气时，发现一个长期被忽视的问题，即所得微泡特别脆弱，例如，破碎，或者微泡之间的融合，室温防止后很快发生破碎，微球浓度也发生降低，出现分层，上、中、下层的微球浓度RSD达到20-80％，当微球上、中、下层的微球浓度的差异增大，直接导致无法进行稳定的分装，这也是灌装后的质量要求所不允许的。其中伴随着微球粒径的变化，微球溶液也会导致微球粒径变大。
为了解决上述技术问题，本发明采用更高标准的质控体系，其中，微球浓度与直径：微球浓度不低于1×109个/mL(现有市售产品的微球浓度通常在0.8×109/mL以下)；平均微球直径应为2.0-5.0μm，优选2.5-4.0μm，更优选2.50～3.50μm。
一方面，人体毛细血管平均内径小于8μm，粒径过大的微球无法在毛细管内自由移动而干扰血液流动；另一方面，微球粒径过小则超声反射能力差，导致超声影像不清晰，故微球粒径应控制在一定的范围内。
由于影响微球破碎的原因众多，无法确定是何种原因，可能是由于微球韧性、压强等原因。发明人需要通过加入具有安全性的稳定剂材料来尝试改善这一问题。而经过一系列筛选，发明人发现了一种特殊的稳定剂，采用甘露醇、几丁糖和聚甲基丙烯酸甲酯的组合，意外发现，该稳定剂的加入能够提高微球壁材的坚韧性，使其保持微球形态，提高微球的粘度，避免微球的沉降。优选地，在微球溶液(混悬液)中，甘露醇：几丁糖：聚甲基丙烯甲酯质量体积百分数范围分别为2％～5％:0.1％～2％:0.1％～2％，优选2％～3％:0.2％～1.5％:0.2％～1.5％比例。进一步优选2％～3％:0.2％～1.0％:0.2％～1.0％，进一步优选2％-3％：0.5％-1.0％：0.5％-1.0％。
其中几丁糖分子量在5000～40000道尔顿，聚甲基丙烯酸甲酯分子量在4000～20000道尔顿之间。
进一步优选，所述几丁糖的分子量在5000～20000道尔顿，所述聚甲基丙烯酸甲酯分子量范围为4000～20000道尔顿。优选所述聚甲基丙烯酸甲酯分子量范围为4000～16000道尔顿，更优选，所述几丁糖的分子量在18000～20000道尔顿，所述聚甲基丙烯酸甲酯分子量范围为14000～16000道尔顿。
试验中发现，几丁糖和聚甲基丙烯酸甲酯的分子量提升，得到的微泡质量更好。
进一步地，将所述微球制备为混悬液，在室温条件放置120min，与初值比，微球浓度降低量≤10％，微球浓度不低于1×109个/mL；微球粒径介于1.0～5.0μm，优选2-3.5μm，进一步，2.5-3.5μm，并在样品上、中、下三层取样微球浓度RSD≤10％；所述初值为微球从声振室制得稳定后首次测定的各个参数，例如0-5min内。
所述上、中、下层属于一种主观模糊定义，但由于工业生产罐高度的限制，又客观存在，例如生产罐为2-10m高，举例为，所述上层为距样品罐顶1/5处，所述中层为为距样品罐顶1/2处，所述下层为距样品罐顶4/5处，这种表述仅为举例，本领域或普通技术人员能够想象、理解并实现的，并在合适范围内进行调整。
本发明进一步提供上述微球的制备方法，其中，所述制备方法为：
将微球载体材料、葡萄糖、渗透压调节剂、稳定剂、水、混合搅拌，制得溶液，而后溶液与氟化物惰性气体或药物进入声振工艺的混合，即得所述微球。采用声振工艺制备(声振工艺属于本领域现有技术，例如本发明采用声振仪(XL2020)美国Heat System公司、声振功率30-80W，声振温度50-72℃)。
具体地，将微球载体材料、葡萄糖、甘露醇、氯化钠、几丁糖、聚甲基丙烯酸甲酯、水低速混合搅拌100-1000r/min(优选500r/min)，1-120min(优选10-20min)，制得溶液。氟化物惰性气体和溶液分别连续不断地进入声振室，制备微球悬浮液。
进一步地，本发明提供了一种上述含有稳定剂的微球在制备造影剂中的应用。
本发明优选将制备得到的微球混悬液，经过灌装后，进行封瓶冻干，制备为冻干粉剂，使用时，重新使用相应的溶液，例如等渗葡萄糖溶液或者生理盐水进行复溶(相关渗透压改变可忽略不计)，而后进行注射操作，属于本领域常规操作。
根据本发明，将所述制备的微球混悬液，放置在室温120min，利用库尔特计数仪测定微球浓度。与现有技术相比，本发明提供了一种高稳定性的微球，加入了甘露醇、几丁糖和聚甲基丙烯酸甲酯，事实上，单独使用甘露醇、几丁糖(生理可接受浓度范围)、PMMA(生理可接受范围)均无法改善这一情况，即使两种组合，效果也很差。因此这种三种同时加入的情况，也是本领域少有的做法，属于非常规做法，同时产生了很好的效果，
区别还在于，甘露醇、几丁糖和PMMA这三种成分所起到的角色不同，且具体起效机制并不清楚，由于本领域相关研究较少，这三种成分并没有协同作用的启示和记载。
达到的技术效果如下：
1、申请人设定了室温下120min为其分界点，不仅给随后的灌注分装充分的时间，也同时给与制备的微泡混悬液充分的时间，便于其变化，从而考察其稳定性和粒径等参数。
本发明微球混悬液在室温下放置120min稳定性良好，无分层现象。与5min时取样相比，120min时，微球浓度数值无明显变化(变化值≤10％，最低达到3.3％，见实施例1)，微球浓度≥1.0×109个/mL(最优处方达到1.721×109，见实施例1)，上、中、下层的微球浓度RSD≤10％(最优处方达到6.2％，见实施例1)。
微球浓度和粒径保证其载气量的稳定，变化值低，分装到各瓶中的微球数量差异非常小，本发明提供的微球稳定性良好，有利于批量生产、连续灌装工艺的进行，微球收率及产能较高。
2、所用原材料生物相容性好，无易引发速发型过敏反应的表面活性剂成分。优选了微球稳定剂的种类及比例，显著提高了微球的浓度，保证了微球的稳定性和有效性。
具体实施方式
以下优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过下述优选实施例已对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
本发明中未特殊规定溶剂的情况下，均指水溶液，在未规定的温度时，均指室温。
以下列举了部分本发明的实施例，对本发明的上述内容作进一步的详细说明但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。
有文献报道处方中加入稳定剂可以提高微球制剂产品稳定性，主要采用的稳定剂有：糖类，通过促进微球水化层的形成而提高稳定剂；高分子聚合物，通过分散、助悬、乳化作用，提高溶液的黏度，避免微球沉降，从而增强稳定性；表面活性剂，通过抑制微球聚集，降低表面张力，增加静电排斥作用，而使界面稳定；pH调节剂，通过调节微球所处外环境，减缓微球的降解；氨基酸类，通过增强氢键作用力，增强微球的稳定性；低浓度的盐类，可与微球形成复合体，使其微球二级结构更为紧实、稳定，从而增强其稳定性。但试验结果显示这些稳定剂对氟化物气体微球的稳定性虽然有一定改善，并不能完全解决稳定性问题，实际上，现有技术并没有给出明确指示，何种成分能够作为通用的稳定剂，也就没有明确的指导方针，属于本领域的研究空白。
针对这一情况，本发明的发明人采用了取代表性的成分，以实施例1为基本处方(该处方为市售产品，且组分简单)，进行尝试性筛选，分别选用了以下筛选方法：
技术文件中：
所使用稳定剂筛选成分说明：
本发明中，各组分，例如(PMMA、几丁糖)等，只有一个注射的常用浓度，例如甘露醇静脉滴注常用浓度5％～20％(w/v)。几丁糖注射用常用浓度为1.2％(w/v)，LD50＞16g/kg(大鼠)，而吐温80的用量通常在2％以下，否则有溶血风险。其他材料并没有推荐的使用剂量，因此，本发明中，所有组分剂量，遵从一般筛选方法的平行原则，但同时会兼顾不同浓度的筛选，由于数据过多，仅进行主要实验举例。
由于发明人并不清楚，针对血浆注射液，特别是载气材料微泡产品所应当采用稳定剂的种类，因此进行了代表性添加剂的筛选，分为甘露醇(糖类)、PMMA(高分子聚合物，4000-16000道尔顿)、几丁糖(糖类5000-19000道尔顿)、透明质酸(高分子聚合物)、吐温80(表面活性剂)、醋酸钠(pH调节剂)、半胱氨酸(氨基酸类)、PVP k30(高分子聚合物)、见实验例F1-F9。
人血白蛋白，奥克特珐玛药剂生产有限公司，注射用；
医用几丁糖，上海其胜生物制剂有限公司，18000～20000道尔顿(主要为19000道尔顿)，5000道尔顿；
医用PMMA，法国阿科玛，SG7，14000～16000道尔顿(主要为15000道尔顿)；4000道尔顿，以及其他参数产品，属于本领域易于获取产品。
其他成分属于本领域常用药用成分，普通技术人员可参考市售产品获得。
本发明所述水均指注射用水。
参照市售超声造影剂处方，制备了气体微球悬浮液作为对照(F1，对照组1)，对代表性的糖类、高分子聚合物、表面活性剂、pH调节剂、氨基酸等单独用作稳定剂进行了筛选(如表1)，参照文献及相容性实验结果，前期实验发明人先对甘露醇的浓度进行筛选，其在2-3％(w/v)，对于微球的稳定性具有了改善作用，效果较好，且其中2-2.5％是优选范围，因此，设计平行试验，各处方采用相同的制备方法，包括如下主要步骤：将微球载体材料、渗透压调节剂、稳定剂、水混合搅拌，制得溶液，而后溶液与氟化物惰性气体共同进入声振室，声振制备，即得微球悬浮液。本发明考察微球浓度、上、中、下三层RSD以及微球粒径三个指标，评价指标顺序为上、中、下三层RSD＞微球浓度变化＞微球浓度＞粒径，即，稳定性和均一度为第一标准。
对本实施例所述制备的微球混悬液进行稳定性评价，将微球悬液放置在室温(25℃)下，5min、60min、120min，分别于距样品罐顶1/5处(上层)，距样品罐顶1/2处(中层)，距样品罐顶4/5处(下层)，三点取样，采用库尔特计数仪测定微球浓度，利用激光粒度仪测量微球粒径。
表1单一组分稳定剂组成的微球处方
结果表明，与市售微球制剂相比(处方F1)，可见在单一组分的稳定剂组合中，甘露醇(F2)的稳定效果最好，能够一定程度地提高微球浓度的稳定性，部分缓解分层情况，60min样品的微球浓度大于1.0×109个/mL，变化值小于10％(与5min比较)，RSD小于10％；120min样品微球浓度小于1.0×109个/mL，变化值大于10％(与5min比较)，RSD大于20％。依然不符合要求。F3几丁糖组，微球浓度和RSD下降非常高，F4 PMMA组，微球浓度几乎变化趋势和F1相同。所有组粒径均略高于5μm，凸显单一成分并不能得到所需要的微球产品。
表2单一组分稳定剂组成的微球处方的稳定性数据
2、两种不同稳定剂组分的组合的实验例
参照实验例1进行微球制备，在加入甘露醇为稳定剂的基础上，加入另一种稳定剂成分以提高微球的稳定性，由于甘露醇的加入，由于其他稳定剂的使用浓度并不具有指导规范，第二种稳定剂选用低浓度(0.5％，对于所选稳定剂，均属低使用浓度)进行平行试验，取样方法及稳定性评价方法同实验例1。
表3两种组分稳定剂组成的微球处方
结果表明，以两种组分为稳定剂时，制得的微球的稳定性较单用甘露醇时更高。室温放置120min时，上、中、下层的微球浓度RSD＞10％，微球浓度数值变化＞10％，仍不满足要求。在两种组分的稳定剂组合中，甘露醇与几丁糖联用的效果最好，因此选择在该组合基础上进一步筛选。同样微球粒径也高于所设定的优选标准，5μm。
表4两种组分稳定剂组成的微球处方的稳定性数据
同样条件下，第二种稳定使用较高浓度，5％也没有，相应数据并没有好转。因此本发明采用两种稳定剂也同样达不到预期效果。
3、三种稳定剂组分的组合实验例
参照实验例1进行微球制备，在加入甘露醇—几丁糖为稳定剂的基础上，加入另一种稳定剂成分(以0.5％低浓度起始)以提高微球的稳定性。取样方法及稳定性评价方法同实验例1。
表5三种组分稳定剂组成的微球处方
结果表明，联用甘露醇-几丁糖-聚甲基丙烯酸甲酯＝2.0：0.5：0.5为稳定剂时(F17)，可进一步提高微球稳定性。室温放置60min或120min时，上、中、下层的微球浓度RSD＜10％，微球浓度数值变化＜10％，微球浓度＞1.0×109个/mL，满足要求，微球粒径也符合要求。
表6三种组分稳定剂组成的微球处方的稳定性数据
由F18-22处方可知，其他组合，加入了吐温-80，醋酸钠缓冲液、半胱氨酸、PVP30等，溶液的微球浓度、上、中、下微球浓度RSD，微球的粒径仍不符合规定，因此三种组分的组合仅有F17达到了设定的标准，符合了生产要求。
4、三种稳定剂组分的不同比例实验例
进一步的，筛选甘露醇-几丁糖-聚甲基丙烯酸甲酯之间的比例，以确定稳定剂组合的处方范围。参照实验例1进行微球制备，取样方法及稳定性评价方法同实验例1。
表7三种组分稳定剂不同比例组成的微球处方组成
结果表明，联用甘露醇：几丁糖：聚甲基丙烯酸甲酯＝2-3％：0.2-1.5％：0.2～1.5％范围内时，均可满足室温放置60min或120min时，上、中、下层的微球浓度RSD＜10％，微球浓度数值变化＜10％，微球浓度＞1.0×109个/mL的微球稳定性要求。较优的，当处方比例同F28时，微球悬液放置120min后，浓度仍可维持1.584×109个/mL，上、中、下层微球浓度RSD值为6.0％，微球粒径无明显变化，远优于按照现有技术(F1)制备的微球，放置120min后，微球浓度0.865×109个/mL，上、中、下层微球浓度RSD值为71.8％的制备效果。
由于F17-28，RSD值和微球浓度降低值相差不大，因此均适用于微球开发，甘露醇在2％-3％浓度下为其安全浓度，考虑其他成分安全性，推荐几丁糖浓度0.5-1.0％，聚甲基丙烯酸甲酯0.5％-1.0％更好。
表8三种组分稳定剂不同比例组成的微球处方的稳定性数据
5、不同载体材料实验例
参照实验例1进行微球制备，考察微球载体材料对稳定性的影响。取样方法及稳定性评价方法同实验例1。
表9不同载体材料的微球处方组成
结果表明，微球载体材料对微球稳定性无明显的影响。优选的，微球载体材料为4％人血白蛋白。
表10不同载体材料的微球处方组成微球处方的稳定性数据
6、不同分子量的几丁糖、聚甲基丙烯酸甲酯实验例
参照实验例1进行微球制备，考察不同分子量的几丁糖、聚甲基丙烯酸甲酯对稳定性的影响。取样方法及稳定性评价方法同实验例1。
表11不同分子量的几丁糖和聚甲基丙烯酸甲酯微球处方
结果表明，高分子量的几丁糖、聚甲基丙烯酸甲酯制备的微球的稳定性最好。
表12不同分子量的几丁糖和聚甲基丙烯酸甲酯微球处方的稳定性数据
7、不同氟化物惰性气体或药物实验例
参照实验例1进行微球制备，考察载不同氟化物气体或药物对稳定性的影响。取样方法及稳定性评价方法同实验例1。
表13不同氟化物惰性气体的微球处方
结果表明，不同氟化物气体或药物及其载气量对稳定性无影响。
表14不同氟化物惰性气体的微球处方的稳定性数据
结论
由上述实施例可知，不加入稳定剂时，所制备的微球极不稳定，于室温(25℃)放置10min后即开始出现微球破碎现象，导致微球浓度显著降低达10％以上；同时出现分层现象，上、中、下层的微球浓度RSD≥10％；以甘露醇、几丁糖、聚甲基丙烯酸甲酯中其中一种为稳定剂时，能够一定程度地提高微球浓度的稳定性，部分缓解分层情况，但是依然不符合要求。在此基础上，优选甘露醇、几丁糖、聚甲基丙烯酸甲酯联合加入，可以更显著地增加微球稳定性。当甘露醇：几丁糖：聚甲基丙烯酸甲酯的比例为2％-3％:0.2％-1％:0.2％-1％，特别是2-3％：0.5-1.0％：0.5％-1.0时，获得高稳定性微球。优选的处方载六氟化硫、全氟丙烷、全氟丁烷等碳氟类不溶性气体，均可保持室温下放置120min时，微球浓度数值与初值相比无明显变化(变化值≤10％)，微球浓度≥1.0×109个/mL，上、中、下层的微球浓度RSD≤10％。
本发明适用微球超声造影剂，适应各种惰性气体、载体材料，具有很好的稳定剂，适合实际生产中，临时微球溶液储存和静置，不必采用高规格要求的连续生产，生产出来的产品，具有微球浓度高，粒径低，上中下微球浓度分布均匀，保证了分装药剂的质量稳定性，具有极好的生产意义。
备注：
甘露醇为糖类，作为赋形剂通常用于普通冻干制剂，但是无文献报道在微球制剂中作为稳定剂使用过；聚甲基丙烯酸甲酯极少用于微球的壁材，但被广泛应用于化妆品、涂漆等领域；注射用几丁糖主要用于关节软骨修复，尚无用于气体微泡的报道。同样，单独使用甘露醇、聚甲基丙烯酸甲酯、或几丁糖对于微泡的稳定性也没有明显的作用。本发明人创造性地进行组合发现，当甘露醇联合稳定剂几丁糖和聚甲基丙烯酸甲酯，可以极大地增强微球壁材的坚韧性，保持微球形态，也不易分层。
安全性数据：
体外溶血实验是检验静脉注射用制剂安全性的评价指标之一，以实施例1为例，按人体重量(60kg)与家兔重量(1.5kg)换算，设置浓度梯度(1～5号试管约折合人体用剂量的20倍)。因此，取家兔1只耳缘静脉取血，置于有玻璃珠的三角锥瓶中，加入等体积生理盐水轻轻晃动，2500rpm离心5min去除色素及蛋白，反复操作，直到上清液呈无色透明为止。加入生理盐水制成2％兔血生理盐水(v/v)混悬液。取7支干净试管并编号，如表1加入相应体积液体，1～5号分别加入微球悬液，6号为阴性对照组(加入生理盐水)，7号为阳性对照组(加入蒸馏水)，摇匀后，放置于37℃水浴中并分别观察，记录0.5、1、2、3小时的结果，如溶液变清呈红色，则表示溶血，如微球悬液在半小时内引起溶血即不宜做静脉注射用。3小时不引起溶血作为合格。
溶血试验结果判断标准：
(1)全溶血：溶液澄明，红色，管底无红细胞残留；
(2)部分溶血：溶液澄明，红色或棕色，底部有少量红细胞残留；镜检红细胞稀少或变形；
(3)不溶血：红细胞全部下沉，上清液体无色澄明；镜检红细胞不凝聚；
(4)红细胞凝聚：溶液中有棕红色或红棕色絮状沉淀，振摇后不分散；
(5)当阴性对照管无溶血和凝聚发生，阳性对照管有溶血发生时，若受试物管中的溶液在3小时内不发生溶血和凝聚，则受试物可以注射使用，若受试物中的溶液在3小时内发生溶血或聚集，则受试物不能注射使用。
实验结果如表1，1～5号试管在3小时内加入不同体积的微球悬液均未出现溶血现象，可见该微球安全性良好，可用于静脉注射使用，同样也验证其他浓度的处方也不会引起相关的溶血效果。
表1体外溶血性实验
注：1至5号管为供试品，6号管为阴性对照管，7号管为阳性对照管(完全溶血对照)。部分溶血为+；完全溶血为++；不溶血为-。
实施例中所有百分数，如无特殊说明，均指质量体积百分数(w/v)。
实施例1
人血白蛋白4％(奥克特珐玛药剂生产有限公司，注射用)；葡萄糖10％；氯化钠0.54％；甘露醇2.2％；几丁糖0.5％(分子量19000道尔顿)；聚甲基丙烯酸甲酯0.5％(分子量15000道尔顿)，水加入搅拌得到溶液，全氟丙烷气体：溶液为100g：1L，进入声振室，进行声振混合，得到本发明所述微球。惰性气体不参与溶液的体积变化，分散于液体中。
配置方法：
取人血白蛋白40g(固体原料或购买高浓度商用注射用白蛋白溶液，进行计算得到所需溶液的体积)，葡萄糖100g，氯化钠5.4g(固体或购买商用生理盐水，进行计算，称取所需溶液的体积)，甘露醇22g，几丁糖5g，聚甲基丙烯酸5g，加水配置为1L溶液，500r/min低速混合搅拌15min，制得生理可接受的注射溶液，溶液经0.22μm双级除菌过滤器过滤收集。采用声振工艺制备全氟丙烷气体微球。全氟丙烷气体经0.22μm气体过滤器过滤，全氟丙烷气体100g和溶液分别连续不断地进入声振室，声振仪(XL2020)美国Heat System公司，声振功率30-80W，声振温度50-72℃，即得微球悬浮液(微球)。
实施例2
人血白蛋白4％(奥克特珐玛药剂生产有限公司，注射用)；葡萄糖10％；氯化钠0.54％；甘露醇2.2％；几丁糖0.8％(分子量19000道尔顿)；聚甲基丙烯酸甲酯0.2％(分子量15000道尔顿)，水加入搅拌得到溶液，全氟丙烷气体：溶液为100g：1L。
制备方法同实施例1。
实施例3
人血白蛋白4％(奥克特珐玛药剂生产有限公司，注射用)；葡萄糖10％；氯化钠0.54％；甘露醇2.2％；几丁糖0.8％(分子量5000道尔顿)；聚甲基丙烯酸甲酯0.2％(分子量4000道尔顿)，水加入搅拌得到溶液，全氟丙烷气体：溶液为100g：1L，水加入。
制备方法同实施例1。
实施例4
人血白蛋白4％(奥克特珐玛药剂生产有限公司，注射用)；葡萄糖10％；氯化钠0.54％；甘露醇2.2％；几丁糖0.2％(分子量19000道尔顿)；聚甲基丙烯酸甲酯0.8％(分子量15000道尔顿)，水加入搅拌得到溶液，全氟丙烷气体：溶液为100g：1L。
制备方法同实施例1。
实施例5
人血白蛋白4％(奥克特珐玛药剂生产有限公司，注射用)；葡萄糖10％；氯化钠0.54％；甘露醇2.2％；几丁糖0.2％(分子量5000道尔顿)；聚甲基丙烯酸甲酯0.8％(分子量4000道尔顿)，水加入搅拌得到溶液，全氟丙烷气体：溶液为100g：1L。
制备方法同实施例1。
实施例6
人血白蛋白4％(奥克特珐玛药剂生产有限公司，注射用)；葡萄糖10％；氯化钠0.54％；甘露醇2.2％；几丁糖0.5％(分子量19000道尔顿)；聚甲基丙烯酸甲酯0.5％(分子量15000道尔顿)，水加入搅拌得到溶液，六氟化硫气体：溶液为100g：1L，水加入。惰性气体不参与溶液的体积变化，可分散于液体中。
制备方法同实施例1。
实施例7
丝素白蛋白4％(苏州丝美特生物技术有限公司，低内毒素)；葡萄糖10％；氯化钠0.54％；甘露醇2.2％；几丁糖0.5％(分子量19000道尔顿)；聚甲基丙烯酸甲酯0.5％(分子量15000道尔顿)，水加入搅拌得到溶液，全氟丙烷气体：溶液为100g：1L。惰性气体不参与溶液的体积变化，可分散于液体中。
制备方法同实施例1。
Claims (9)
1.一种含有稳定剂的微球，其特征在于，由溶液和氟化物惰性气体两部分组成，按质量体积百分数(w/v)计，溶液由以下组分组成：
微球载体材料2％～10％，所述微球载体材料为丝素蛋白、玉米醇溶蛋白、白蛋白中的一种或多种混合物；
稳定剂2％～10％，所述稳定剂为甘露醇、几丁糖和聚甲基丙烯酸甲酯的混合物；所述甘露醇：几丁糖：聚甲基丙烯酸甲酯的质量体积百分数分别为2％～5％:0.1％～2％:0.1％～2％；所述几丁糖的分子量在5000～20000道尔顿，所述聚甲基丙烯酸甲酯分子量范围为4000～20000道尔顿；
渗透压调节剂0.2％～20％，所述渗透压调节剂为氯化钠和葡萄糖的混合物；
余量为水；
所述氟化物惰性气体分散在所述溶液中，比例为40-140g：1000ml，所述氟化物惰性气体为六氟化硫、全氟丙烷、全氟丁烷中的一种或多种混合物。
2.根据权利要求1所述微球，其特征在于，由溶液和氟化物惰性气体两部分组成，按质量体积百分数(w/v)计，溶液由以下组分组成：
微球载体材料2％～8％，所述微球载体材料为丝素蛋白、玉米醇溶蛋白、白蛋白中的一种或多种混合物；
稳定剂2％～6％，所述稳定剂为甘露醇、几丁糖和聚甲基丙烯酸甲酯的混合物；
渗透压调节剂0.5％～15％，所述渗透压调节剂为氯化钠和葡萄糖的混合物；
余量为水；
所述氟化物惰性气体分散于所述溶液中，比例为40-140g：1000ml。
3.根据权利要求1所述微球，其特征在于，由溶液和氟化物惰性气体两部分组成，按质量体积百分数(w/v)计，溶液由以下组分组成：
微球载体材料2％～5％，所述微球载体材料为丝素蛋白、玉米醇溶蛋白、白蛋白中的一种或多种混合物；
稳定剂2％～5％，所述稳定剂为甘露醇、几丁糖和聚甲基丙烯酸甲酯的混合物；
所述氯化钠为0.5％-1％；
所述葡萄糖为5％-10％；
余量为水；
所述氟化物惰性气体分散于所述溶液中，比例为40-140g：1000ml。
4.根据权利要求1所述的微球，其特征在于，所述甘露醇：几丁糖：聚甲基丙烯酸甲酯的质量体积百分数分别为2％～3％:0.2％～1.5％:0.2％～1.5％。
5.根据权利要求4所述的微球，其特征在于，所述甘露醇：几丁糖：聚甲基丙烯酸甲酯的质量体积比分别为2％～3％:0.2％～1.0％:0.2％～1.0％。
6.根据权利要求1所述的微球，其特征在于，所述几丁糖的分子量在18000～20000道尔顿，所述聚甲基丙烯酸甲酯分子量范围为14000～16000道尔顿。
7.根据权利要求1所述的微球，其特征在于，将所述微球制备为混悬液，在室温条件放置120min，与初值比，微球浓度降低量≤10％，微球浓度不低于1.0×109个/mL；微球粒径介于2.0～5.0μm，并在样品上、中、下三层取样微球浓度RSD≤10％。
8.根据权利要求1所述的微球的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：
将微球载体材料、渗透压调节剂、稳定剂、水混合搅拌，制得溶液，而后所述溶液与氟化物惰性气体共同进入声振室，声振制备，即得所述微球。
9.权利要求1所述微球在制备超声造影剂中的应用。
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