CN114009307B - 含有希瓦氏菌的功能型黄瓜育苗生物基质及其制备方法 - Google Patents

含有希瓦氏菌的功能型黄瓜育苗生物基质及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及育苗基质技术领域，具体涉及含有希瓦氏菌的功能型黄瓜育苗生物基质及其制备方法。制备方法为向常规基质中添加希瓦氏菌A0B14，所述希瓦氏菌A0B14已于2018年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为Shewanella sp.，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.16843。本发明所使用的希瓦氏菌A0B14适合于各种常规基质，能够在基质中长时间存活，并在黄瓜的根际稳定定植，具有显著的促生效果。

Description

含有希瓦氏菌的功能型黄瓜育苗生物基质及其制备方法
技术领域
本发明涉及育苗基质技术领域，具体涉及含有希瓦氏菌的功能型黄瓜育苗生物基质及其制备方法。
背景技术
随着设施农业发展，设施土壤连作障碍问题日趋严重，制约了设施蔬菜产业的持续发展。同时，设施农业对健康抗病种苗的需求量不断增大。这也促进了工厂化育苗的快速发展，近年来工厂化育苗已成为种苗生产的主要方式，工厂化育苗使用的基质质地轻，保水、保肥、透气性好，但仍未解决种苗抗病性较差的问题，主要依靠大剂量的使用杀菌剂和肥料保证种苗质量和存活。近年来，有研究者尝试向基质中添加生防菌剂提高种苗抗病性，但在实际应用过程中发现，这些微生物定植困难、持效期短、效果不稳定，限制了该技术的推广应用。
作物根际微生物的相关研究揭示了根际微生物对植物的重要生态学功能，尤其是根际细菌的促生功能。已有学者从作物根际筛选一些细菌添加到育苗或者栽培基质，取得了较好的效果，已经使用的菌株包括不动杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、阴沟肠杆菌、解淀粉芽孢杆菌、醋酸钙不动杆菌、芽孢杆菌、类芽孢杆菌、死谷芽孢杆菌、哈茨木霉菌等。这为研发新型微生物育苗和栽培基质提供了新的方向。
目前，含有植物促生菌的基质产品种类还十分有限，继续寻找新的植物促生菌资源开发新型微生物育苗基质。此外，含有植物促生微生物基质产品的难题是保证促生菌剂在基质中的长期存活，而目前一般基质产品的货架期在2-6个月，还没有相关的产品能够保证植物促生菌的存活。
发明内容
针对含有植物促生菌的基质产品种类还十分有限、且基质产品中微生物难以长期存活的技术问题，本发明提供一种含有希瓦氏菌的功能型黄瓜育苗生物基质及其制备方法，本发明所使用的希瓦氏菌A0B14适合于各种常规基质(市售基质和/或自制基质)，能够在基质中长时间存活，并在黄瓜的根际稳定定植，具有显著的促生效果。
第一方面，本发明提供一种含有希瓦氏菌的功能型黄瓜育苗生物基质的制备方法，向常规基质中添加希瓦氏菌A0B14，所述希瓦氏菌A0B14已公开于中国专利申请CN201910049412.7中，具体保藏信息如下：
分类命名为Shewanella sp.，保藏日期为2018年11月30日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.16843。
进一步的，包括如下步骤：
(1)制备希瓦氏菌A0B14发酵液；
(2)按照基质干重5％，向常规基质中添加希瓦氏菌A0B14发酵液，混合均匀装袋。
进一步的，所述希瓦氏菌A0B14发酵液的制备方法为：
将希瓦氏菌A0B14接种于TSB培养基上，28℃、180rpm过夜培养后作为一级种子；一级种子按照接种量5％接种于大豆粉培养基进行发酵生产，pH自然，发酵温度25-35℃，发酵转速150-300rpm，发酵时间36-48小时。
进一步的，所述大豆粉培养基的制备方法为：
将脱脂大豆粉按照5％加入自来水中，pH自然，121℃高压蒸汽灭菌15min。
第二方面，本发明提供一种采用上述制备方法制得的含有希瓦氏菌的功能型黄瓜育苗生物基质。
进一步的，所述功能型黄瓜育苗生物基质中的活菌数≥1.0×107CFU/g基质干重，基质有机质≥15％，总养分1.5％-5％，水分≤35％，pH值6.5-7.5，Ec≤2.5ms/cm，其中总养分指N含量、P2O5含量及K2O含量之和。
进一步的，所述功能型黄瓜育苗生物基质常温放置6个月后，活菌数≥9×108CFU/g基质干重。
本发明的有益效果在于，本发明提供一种含有希瓦氏菌A0B14的黄瓜育苗基质产品及其制备方法，希瓦氏菌的呼吸***多样，能够利用的有机和无机化合物高达20多种，包括发酵产生的二碳和三碳化合物、氨基酸及多种糖类，接种希瓦氏菌A0B14后，希瓦氏菌能够在常规基质中长期存活，堆放6个月后有益活菌数≥9×108CFU/g基质干重；希瓦氏菌A0B14能够在黄瓜的根际稳定定植，具有显著的促生效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是总活菌数随时间变化曲线。
图2是希瓦氏菌活菌数随时间变化曲线。
图3是常规基质和生物基质的促生效果对比照片。
图1、图2中＊代表在每一个取样时间对照基质和生物基质具有显著性差异(独立样本t检验)。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
本发明具体实施方式使用的TSB培养基为市售产品；
大豆粉培养基按照如下制备方法制得：
将脱脂大豆粉按照5％加入自来水中，pH自然，121℃高压蒸汽灭菌15min。
实施例1
一种含有希瓦氏菌的功能型黄瓜育苗生物基质，采用如下制备方法制得：
(1)制备希瓦氏菌A0B14发酵液：
将希瓦氏菌A0B14接种于TSB培养基上，28℃、180rpm过夜培养后作为一级种子；一级种子按照接种量5％接种于大豆粉培养基进行发酵生产，pH自然，发酵温度25℃，发酵转速300rpm，发酵时间48小时，发酵后菌落数约为2×108CFU/mL；
(2)按照基质干重5％，向灭菌的常规基质(购自山东商道生物科技股份有限公司，组分为：淀粉树脂泡沫粒子25％、牛粪秸秆发酵物35％、草炭40％)中添加希瓦氏菌A0B14发酵液，混合均匀装袋，得到含有希瓦氏菌的功能型黄瓜育苗生物基质(以下简称“生物基质”)，该生物基质满足活菌数≥1.0×107CFU/g基质干重，基质有机质≥15％，总养分(N+P2O5+K2O)1.5％-5％，水分≤35％，pH值6.5-7.5，Ec≤2.5ms/cm。
实施例2
实施例2与实施例1的区别在于，步骤(1)希瓦氏菌A0B14的发酵条件不同，实施例2的发酵条件为发酵温度35℃，发酵转速150rpm，发酵时间36小时。
对比例1
以等体积的大豆粉培养基代替希瓦氏菌A0B14发酵液，加入灭菌的常规基质中，混合均匀装袋，得到对照基质。
验证例1
对实施例1的生物基质、对比例1的对照基质随时间变化的活菌数变化趋势进行测定，测定方法为每30天取1g样品进行活菌计数，重复4次。每克样品装入50ml离心管后加入10ml无菌水震荡，然后使用无菌水梯度稀释到108涂布，平板计数时对基质中的总活菌数和希瓦氏菌活菌数分别进行计数，按照菌落形态对希瓦氏菌进行识别，并使用16S rRNA基因对菌株进行鉴定确定希瓦氏菌形态识别的准确性，鉴定发现通过形态可以基本确定平板中的希瓦氏菌。
计数结果如图1、图2所示，与对照基质相比，生物基质中总活菌数显著上升，在放置半年后，生物基质中希瓦氏菌活菌数≥9×108CFU/g基质干重，证明本发明制备的生物基质货架期明显长于6个月。
验证例2
使用6个月的实施例1生物基质和常规基质进行黄瓜育苗试验，比较二者促生效果。试验于2021年5月中旬在山东省科学院生态研究所人工温室(温度25℃、光周期L：D＝16：8、光照强度20000lx)内开展。黄瓜品种为强生719(山东鲁寿农业集团)。
试验方法：在一次性纸杯内装满两种基质，随后每个纸杯内点播一粒黄瓜种子，表面覆盖基质后于人工温室内培养，出苗后每隔一天浇水10mL，出苗7天后测量株高、茎粗、地上和地下部分鲜重。株高用直尺测定根到生长点的长度；茎粗用游标卡尺测定平行于子叶方向子叶下2cm处粗；地上、下部鲜重采用万分之一电子天平称量；地上、下部分干重是将幼苗鲜样于烘箱105℃杀青15min后，80℃烘干至恒重，然后用万分之一电子天平称量；壮苗指数＝(茎粗/株高+地下干重/地上干重)×单株干重。实验重复6次。
结果如图3所示，与常规基质相比，生物基质的黄瓜幼苗根干重提高约87.2％，茎干重提高约66.5％，根茎比提高约10.1％，植株干重提高约70.1％，壮苗指数提高109.7％。综上，该育苗基质具有显著的促生效果，证明本发明制备的生物基质货架期明显长于6个月。
验证例3
使用实施例1生物基质种植黄瓜幼苗，在黄瓜种植后的第7、14、21、35、49、63天采集黄瓜植株，采集后剪掉植株的地上部分，抖落附着于根部的土壤后，剪取部分主根、侧根以及不定根约10g至灭菌后的50mL离心管内，每采集完一棵植株后，剪刀均使用75％乙醇消毒并使用灭菌水冲洗三次后再使用。采集完毕后，装有根部样本的离心管置于冰盒内转运至实验室。随后，每个样品管内加入灭菌后的1×PBS缓冲液35mL，置于摇床中180rpm清洗20min后，使用无菌滤纸吸干根表面的水分，如此反复清洗3次，从上述样本中取0.2g使用无菌水充分研磨，10倍梯度稀释至108后涂布于TSB平板进行计数，按照菌落形态对希瓦氏菌进行识别，并使用16S rRNA基因对菌株进行鉴定确定希瓦氏菌形态识别的准确性。经测定，在黄瓜种植后的第7、14、21、35、49、63天后希瓦氏菌在根际的定植量为1.34×104、1.28×103、1.69×104、1.71×104、1.52×104、1.48×103CFU/g根，表明生物基质中希瓦氏菌A0B14能够在黄瓜根际长期定植。
验证例4不同菌株在基质中的定植存活情况
使用实施例1生物基质，同时按照同样的方法制备另外4株市售菌株的生物基质，四株菌株分别为：希瓦氏菌ATCC700550、希瓦氏菌ATCC8071、贝莱斯芽孢杆菌BMZ141112和类芽孢杆菌ATCC9995。放置半年后，五种基质各取1g样品装入50ml离心管，并加入10ml无菌水震荡，然后使用无菌水梯度稀释到108涂布计数，重复4次。活菌计数结果为：含A0B14、ATCC700550、ATCC8071、BMZ141112、ATCC9995的生物基质中活菌数量分别为9.1×108、2.7×105、3.6×104、3.2×104、1.7×103CFU/g基质干重。
验证例5希瓦氏菌A0B14在不同配方基质的定植情况
按照下述重量比的原料制备A、B、C、D四种基质，并按照基质干重5％，向四种基质中分别加入希瓦氏菌A0B14发酵液(制备方法同实施例1)，混合均匀后装袋，四种基质均满足活菌数≥1.0×107CFU/g基质干重。
A.泥炭土：珍珠岩：蛭石：腐熟秸秆＝4：1：0.5：4.5；
B.泥炭土：珍珠岩：蛭石：腐熟牛粪＝4：1：0.5：4.5；
C.泥炭土：珍珠岩：蛭石：腐熟椰丝＝4：1：0.5：4.5；
D.泥炭土：珍珠岩：蛭石：腐熟平菇种植菌渣＝4：1：0.5：4.5。
放置半年后，四种基质各取1g样品装入50ml离心管，并加入10ml无菌水震荡，然后使用无菌水梯度稀释到108涂布计数，重复4次。活菌计数结果为：A、B、C、D四种基质中活希瓦氏菌A0B14数量分别为9.7×108、9.2×108、9.1×108、1.1×109CFU/g基质干重。
尽管通过参考附图并结合优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种希瓦氏菌A0B14制备功能型黄瓜育苗生物基质的应用，其特征在于，制备方法包括如下步骤：
（1）制备希瓦氏菌A0B14发酵液：将希瓦氏菌A0B14接种于TSB培养基上，28℃、180rpm过夜培养后作为一级种子；一级种子按照接种量5%接种于大豆粉培养基进行发酵生产，pH自然，发酵温度25-35℃，发酵转速150-300rpm，发酵时间36-48小时；
所述希瓦氏菌A0B14已于2018年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为Shewanella sp.，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No. 16843；
（2）按照基质干重5%，向常规基质中添加希瓦氏菌A0B14发酵液，混合均匀装袋；
所述希瓦氏菌A0B14能够在基质中长时间存活，功能型黄瓜育苗生物基质中的活菌数≥1.0×107CFU/g基质干重，常温放置6个月后，活菌数≥9×108CFU/g基质干重。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述大豆粉培养基的制备方法为：
将脱脂大豆粉按照5%加入自来水中，pH自然，121℃高压蒸汽灭菌15min。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，基质有机质≥15%，总养分1.5%-5%，水分≤35%，pH值6.5-7.5，Ec≤2.5ms/cm。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述总养分指N含量、P2O5含量及K2O含量之和。
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