CN113999210B - 一组2-苯氨基-4-三氮唑基嘧啶类衍生物及其应用 - Google Patents
一组2-苯氨基-4-三氮唑基嘧啶类衍生物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于药物化学领域，具体涉及一类含有2‑苯氨基‑4‑三氮唑基嘧啶类衍生物，其结构如下所示：
；其中，R1为氢、氯、氟、三氟甲基；R2为甲基、乙基、异丙基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基；R3为
或‑SO2NH2。药理实验表明，此类化合物及其药学上可接受的盐具有抑制肿瘤细胞增殖的作用。
Description
技术领域
本发明属于药物化学领域，具体涉及一组含有2-苯氨基-4-三氮唑基嘧啶类衍生物及其在肿瘤治疗领域的用途。
背景技术
肿瘤是严重威胁人类生命健康的重大难治性疾病之一。在我国，恶性肿瘤已成为居民的第一位死因。尽管抗肿瘤药物作为肿瘤治疗的重要手段在肿瘤患者的临床治疗中发挥着十分重要的作用，然而，目前临床应用的抗肿瘤药物多数为细胞毒药物，存在毒副作用大，易产生耐药等问题。因此，寻找结构新颖、对肿瘤杀伤力强的化合物，是药物化学工作者的努力方向之一。
周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)是一类属于Ser/Thr家族的细胞周期调节性激酶，是细胞周期调节的核心，它与细胞周期蛋白(cyclins)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CKIs)组成细胞周期调控网络***，调节细胞周期的进程。目前已发现CDK家族有21个成员。部分CDK家族激酶的表达上调与肿瘤的发生发展有密切的关系。例如，CDK2、CDK4、CDK6、CDK8、CDK11的上调与乳腺癌、直肠癌的发展与恶化正相关。因此，选择性地抑制CDK的活性，阻止肿瘤细胞的异常增殖，是肿瘤治疗的重要思路之一。目前已上市的CDK家族抑制剂包括辉瑞公司开发的CDK4/6双重抑制剂palbociclib，诺华公司开发的CDK4/6抑制剂ribociclib，以及礼来公司的abemaciclib，用于联合来曲唑治疗ER+/HER2-的晚期乳腺癌。除了已上市的这三个药物，十多个靶向于CDK的活性小分子目前处于上市前期或临床试验中。
发明内容
本发明目的在于提供一种对肿瘤细胞具有增殖抑制作用的2-苯氨基-4-三氮唑基嘧啶类衍生物。
本发明的另一个目的是提供上2-苯氨基-4-三氮唑基嘧啶类衍生物类衍生物在医药学抗癌中的用途。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供的2-苯氨基-4-三氮唑基嘧啶类衍生物及其药学上可接受的盐，具有如下结构通式：
其中，R1为氢、氯、氟、三氟甲基；
R2为甲基、乙基、异丙基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基；
R3为
或-SO2NH2。
本发明所述的4-三氮唑-2-苯氨基嘧啶类衍生物及其药学上可接受的盐，可选自下述化合物之一：
氮-(2-氨基苯基)-4-((4-(1-环己基-1H-1,2,3-***-4-基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺；
氮-(2-氨基苯基)-4-((4-(1-环戊基-1H-1,2,3-***-4-基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺；
氮-(2-氨基苯基)-4-((4-(1-异丙基-1H-1,2,3-***-4-基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺；
氮-(2-氨基苯基)-4-((4-(1-环己基-1H-1,2,3-***-4-基)-5-氟嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺；
氮-(2-氨基苯基)-4-((4-(1-环戊基-1H-1,2,3-***-4-基)-5-氟嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺；
氧-(2-氨基苯基)-4-((5-氟-4-(1-异丙基-1H-1,2,3-***-4-基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺；
4-(1-环戊基-1氢-1,2,3-***-4-基)-N-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)嘧啶-2-胺；
4-(1-环己基-1氢-1,2,3-***-4-基)-N-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)嘧啶-2-胺；
4-((4-(1-环戊基-1氢-1,2,3-***-4-基)嘧啶-2-基)氨基)苯磺酰胺；
4-(1-环己基-1氢-1,2,3-***-4-基)-5-氟-N-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)嘧啶-2-胺；
4-(1-异丙基-1氢-1,2,3-***-4-基)-N-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)嘧啶-2-胺；
4-(1-环戊基-1氢-1,2,3-***-4-基)-5-氟-N-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)嘧啶-2-胺；
4-((4-(1-环戊基-1H-1,2,3-***-4-基)-5-氟嘧啶-2-基)氨基)苯磺酰胺；
4-(1-环己基-1氢-1,2,3-***-4-基)-5-氟-N-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)嘧啶-2-胺；
4-(1-异丙基-1氢-1,2,3-***-4-基)-5-氟-N-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)嘧啶-2-胺。
本发明提供了上述2-苯氨基-4-三氮唑基嘧啶类衍生物或其药学上可接受的盐在制备抗癌药物中的应用，即用于肿瘤的治疗。
进一步的，本发明还提供了上述2-苯氨基-4-三氮唑基嘧啶类衍生物或其药学上可接受的盐在制备预防和治疗肝癌、结肠癌药物中的应用。
和现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明创新性的提供了一类2-苯氨基-4-三氮唑基嘧啶类衍生物。试验结果显示：本发明所涉及的2-苯氨基-4-三氮唑基嘧啶类衍生物具有较好的CDK抑制活性，从而发挥肿瘤增殖抑制作用，可用于癌症尤其是肺癌、结肠癌的预防和治疗。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。
下述实施例中，如无特殊说明，所用原料均为可以直接购买到的普通市售产品，或者可以参考现有文献进行合成。
实施例1：2-氯-4-(1-异丙基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)嘧啶(2a)
将2-氯-4-乙炔基嘧啶(1,178mg，1.28mmol)、叠氮基环丙烷(2-Azidopropane，130mg，1.53mmol)加入四氢呋喃(THF，5mL)和水(5mL)的混合溶剂中在常温下搅拌。将五水硫酸铜(CuSO4.5H2O，65mg,0.26mmol))和抗坏血酸钠(103mg,0.52mmol)溶于水(5mL)中，将此溶液加入上述搅拌体系中反应1h。反应完毕后，反应体系中加入乙酸乙酯(20mL)，用水萃取3次，有机相用无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩、柱色谱分离(石油醚：乙酸乙酯＝10:1，体积比)，得到白色固体(2a)。收率：55％。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ＝8.67(d,1H,J＝6.5Hz,Ar-H),8.35(s,1H,triazole-H),8.07(d,1H,J＝6.5Hz,Ar-H),4.97-4.89(m,1H,CH),1.65(d,6H,J＝6.5Hz,CH3)；ESI-MS:m/z＝224[M+H]+。
实施例2：2-氯-4-(1-环戊基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)嘧啶(2b)
制备方法参照实施例1，其中，将叠氮基环丙烷替换为叠氮基环戊烷(Azidocyclopentane)，得白色固体(2b)，收率：81％。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ＝8.67(d,1H,J＝6.0Hz,Ar-H),8.33(s,1H,triazole-H),8.07(d,1H,J＝6.5Hz,Ar-H),5.07-5.00(m,1H,CH),2.36-2.30(m,2H,CH2),2.12-2.07(m,2H,CH2),1.97-1.90(m,2H,CH2),1.84-1.78(m,2H,CH2)；ESI-MS:m/z＝250[M+H]+。
实施例3：2-氯-4-(1-环己基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)嘧啶(2c)
制备方法参照实施例1，其中，将叠氮基环丙烷替换为叠氮基环己烷(Azido-cyclohexane)，得白色固体(2c)，收率：79％。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ＝8.66(d,1H,J＝6.5Hz,Ar-H),8.34(s,1H,triazole-H),8.06(d,1H,J＝6.5Hz,Ar-H),4.58-4.52(m,1H,CH),2.30-2.26(m,2H,CH2),1.99-1.94(m,2H,CH2),1.82-1.72(m,3H,CH2),1.53-1.41(m,2H,CH2),1.32-1.29(m,1H,CH2)；ESI-MS:m/z＝264[M+H]+。
实施例4：2-氯-4-(1-环己基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)-5-氟嘧啶(2d)
制备方法参照实施例1，其中，分别将2-氯-4-乙炔基嘧啶和叠氮基环丙烷替换为2-氯-4-乙炔基-5-氟嘧啶(2-chloro-4-ethynyl-5-fluoropyrimidine)和叠氮基环己烷。得白色固体(2d)，收率：74％。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ＝8.56(d,1H,J＝3.0Hz,Ar-H),8.31(s,1H,triazole-H),4.63-4.55(m,1H,CH),2.31-2.27(m,2H,CH2),1.99-1.95(m,2H,CH2),1.85-1.76(m,3H,CH2),1.55-1.46(m,2H,CH2),1.37-1.32(m,1H,CH2)；ESI-MS:m/z＝282[M+H]+。
实施例5：4-((4-(1-异丙基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酸甲酯(3a)
将双二亚苄基丙酮钯(Pd(dba)2，0.03mmol)、4,5-双(二苯基膦)-9,9-二甲基氧杂蒽(Xantphos，0.01mmol)、碳酸铯(Cs2CO3，0.60mmol)加入含有2-氯-4-(1-异丙基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)嘧啶(2a，0.30mmol)和4-氨基苯甲酸甲酯(0.33mmol)的二氧六环(10mL)混合溶液中，用氮气置换反应体系中的空气，在110℃下反应5h后冷却至室温，减压除去溶剂，剩余物中加入二氯甲烷，用饱和食盐水萃取，有机相用无水硫酸钠干燥、浓缩，得到的粗品用柱色谱分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝15:1，体积比)，得到白色固体，收率：80％。1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.17(s,1H),8.79(s,1H),8.63(d,J＝5.1Hz,1H),7.99(dd,J＝25.8,8.9Hz,4H),7.50(d,J＝5.1Hz,1H),4.97(hept,J＝6.7Hz,1H),3.83(s,3H),1.60(s,3H),1.59(s,3H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ166.06,159.70,159.14,157.48,145.13(2C),130.29(2C),122.97,121.66,117.74(2C),108.23,52.90,51.66,22.53(2C).ESI-MS m/z:339.2[M+H]+。
实施例6：4-((4-(1-环戊基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酸甲酯(3b)
制备方法参照实施例5，其中，将2-氯-4-(1-异丙基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)嘧啶(2a)替换为2-氯-4-(1-环戊基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)嘧啶(2b)，得白色固体(3b)，收率：84％。1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.17(s,1H),8.77(s,1H),8.64(d,J＝5.1Hz,1H),8.09–7.89(m,4H),7.50(d,J＝5.1Hz,1H),5.12(p,J＝7.0Hz,1H),3.84(s,3H),2.34–2.17(m,2H),2.16–2.00(m,2H),1.96–1.80(m,2H),1.81–1.62(m,2H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ166.05,159.70,159.13,157.45,145.15,145.13,130.26(2C),123.83,121.67,117.74(2C),108.26,61.46,51.66,32.82(2C),23.66(2C).ESI-MS m/z:365.2[M+H]+。
实施例7：4-((4-(1-环己基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酸甲酯(3c)
制备方法参照实施例5，其中，将2-氯-4-(1-异丙基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)嘧啶(2a)替换为2-氯-4-(1-环戊基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)嘧啶(2c)，得白色固体(3c)，收率：83％。1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.19(s,1H),8.78(s,1H),8.63(d,J＝5.0Hz,1H),7.99(dd,J＝24.6,8.7Hz,4H),7.50(d,J＝5.0Hz,1H),4.77–4.48(m,1H),3.83(s,3H),2.25–2.06(m,2H),1.98–1.80(m,4H),1.78–1.63(m,1H),1.58–1.39(m,2H),1.37–1.19(m,1H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ166.55,160.18,159.67,157.94,145.63,145.46,130.81(2C),123.69,122.10,118.21(2C),108.70,60.05,52.08,33.17(2C),25.14(2C),25.08.ESI-MS m/z:379.2[M+H]+。
实施例8：4-((4-(1-异丙基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酸(4a)
将4-((4-(1-异丙基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酸甲酯(3a，250mg)加入6mL甲醇中溶解。将氢氧化钠(NaOH，50mg)溶于0.5mL水中，加入上述溶液，60℃反应约5h，至原料反应完全。处理：反应液冷却至室温，用2N盐酸调节pH至中性，反应液蒸干，得到4a的粗品(白色固体)，不需进一步纯化，直接做下一步。1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.11(s,1H),8.78(s,1H),8.63(d,J＝5.0Hz,1H),7.96(dd,J＝22.9,8.7Hz,4H),7.49(d,J＝5.1Hz,1H),5.04–4.88(m,1H),1.61(s,3H),1.59(s,3H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ167.18,159.75,159.11,157.49,145.15,144.73,130.40(2C),122.94,122.90,117.67(2C),108.13,52.89,22.52(2C).ESI-MS m/z:325.1[M+H]+。
实施例9：4-((4-(1-环戊基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酸(4b)
制备方法参照实施例8，其中，将4-((4-(1-异丙基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酸甲酯(3a)替换为4-((4-(1-环戊基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酸甲酯(3b)，得白色固体(4b)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.13(s,1H),8.79(s,1H),8.62(d,J＝5.1Hz,1H),7.95(dd,J＝26.7,8.8Hz,4H),7.48(d,J＝5.1Hz,1H),5.12(p,J＝6.9Hz,1H),2.33–2.17(m,2H),2.13–1.97(m,2H),1.92–1.78(m,2H),1.77–1.61(m,2H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ167.27,159.74,159.10,157.42,145.15,144.64,130.35(2C),123.90,123.87,117.66(2C),108.13,61.42,32.82(2C),23.66(2C).ESI-MS m/z:351.2[M+H]+。
实施例10：4-((4-(1-环己基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酸(4c)
制备方法参照实施例8，其中，将4-((4-(1-异丙基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酸甲酯(3a)替换为4-((4-(1-环己基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酸甲酯(3c)，得白色固体(4c)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.56(s,1H),10.13(s,1H),8.77(s,1H),8.62(d,J＝5.1Hz,1H),7.96(dd,J＝22.2,8.7Hz,4H),7.48(d,J＝5.1Hz,1H),4.78–4.50(m,1H),2.23–2.06(m,2H),2.01–1.80(m,4H),1.77–1.62(m,1H),1.46(q,J＝13.2Hz,2H),1.37–1.13(m,2H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ167.68,160.23,159.64,157.94,145.49,145.24,130.93(2C),123.66,123.32,118.14(2C),108.60,60.03,33.17(2C),25.14(2C),25.08.ESI-MS m/z:365.2[M+H]+。
实施例11：(2-(4-((4-(1-异丙基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(5a)
将4-((4-(1-异丙基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酸(4a，250mg，0.77mmol)和2-氨基苯基氨基甲酸叔丁酯(161mg，0.77mmol)，2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU，322mg，0.85mmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中，再加入二异丙基乙胺(0.5mL)，室温反应过夜。处理：将反应液中加入二氯甲烷，用饱和食盐水萃取，收集有机相，无水硫酸钠干燥、浓缩、硅胶柱分离，得白色固体(5a)，收率：71％。1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.10(s,1H),9.76(s,1H),8.79(s,1H),8.69(s,1H),8.63(d,J＝5.1Hz,1H),8.00(dd,J＝25.5,8.8Hz,4H),7.61–7.50(m,2H),7.49(d,J＝5.1Hz,1H),7.26–7.11(m,2H),4.97(hept,J＝6.7Hz,1H),1.60(s,3H),1.58(s,3H),1.46(s,9H).13CNMR(101MHz,DMSO)δ165.46,160.29,159.65,157.97,153.96,145.69,144.46,132.02,130.54(2C),129.05,126.74,126.40,125.85,124.64,124.38,123.40,118.19(2C),108.58,80.15,53.40,28.50(3C),23.05(2C).ESI-MS m/z:515.3[M+H]+。
实施例12：(2-(4-((4-(1-环戊基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(5b)
制备方法参照实施例11，其中，将4-((4-(1-异丙基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酸(4a)替换为4-((4-(1-环戊基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酸(4b)，得白色固体(5b)，收率：74％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.05(s,1H),8.54(d,J＝5.1Hz,1H),8.17(s,1H),7.97(d,J＝8.7Hz,2H),7.83–7.71(m,3H),7.61(d,J＝5.1Hz,1H),7.51(s,1H),7.33–7.28(m,1H),7.24–7.12(m,2H),6.96(s,1H),5.09–4.94(m,1H),2.39–2.25(m,2H),2.20–2.06(m,2H),2.03–1.89(m,2H),1.87–1.76(m,2H),1.52(s,9H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ165.30,159.60,158.84,158.12,154.61,146.27,143.12,131.02,130.13,128.57(2C),127.47,125.89,125.87,125.76,124.55,122.07,118.16(2C),109.02,81.22,62.28,33.49(2C),28.31(3C),24.06(2C).ESI-MS m/z:541.3[M+H]+。
实施例13：(2-(4-((4-(1-环己基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(5c)
制备方法参照实施例11，其中，将4-((4-(1-异丙基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酸(4a)替换为4-((4-(1-环己基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酸(4c)，得白色固体(5c)，收率：74％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.23(s,1H),8.52(d,J＝5.0Hz,1H),8.18(s,1H),8.07–7.91(m,3H),7.76(d,J＝7.5Hz,2H),7.70(d,J＝7.1Hz,1H),7.58(t,J＝10.9Hz,1H),7.47–7.31(m,2H),7.22–7.05(m,2H),4.68–4.36(m,1H),2.36–2.15(m,2H),2.00–1.72(m,4H),1.63–1.40(m,11H),1.39–1.21(m,2H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ165.48,159.63,158.74,158.12,154.62,146.02,143.20,130.83(2C),130.43,128.60,127.35,125.84,125.74,125.61,124.52,121.40,118.18(2C),108.88,81.00,60.52,38.60(2C),33.49,28.32(2C),25.11(2C),25.00.ESI-MS m/z:555.3[M+H]+。
实施例14：N-(2-氨基苯基)-4-((4-(1-异丙基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺(6a)
将(2-(4-((4-(1-异丙基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(5a，150mg)加入5mL二氯甲烷中溶解，逐滴加入三氟乙酸(1mL)，反应1h后，将溶剂蒸除，得白色固体6a，收率：100％。1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.04(s,1H),9.58(s,1H),8.77(s,1H),8.62(d,J＝5.1Hz,1H),7.98(s,4H),7.47(d,J＝5.1Hz,1H),7.17(d,J＝7.5Hz,1H),6.98(t,J＝7.6Hz,1H),6.79(d,J＝7.9Hz,1H),6.62(t,J＝7.5Hz,1H),5.08–4.73(m,3H),1.59(s,3H),1.57(s,3H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ165.46,160.31,159.62,157.95,145.69,143.97,143.54,129.17(2C),127.25,127.08,126.80,124.14,123.39,118.09(2C),116.87,116.68,108.48,53.41,23.03(2C).ESI-MS m/z:415.2[M+H]+。
实施例15：N-(2-氨基苯基)-4-((4-(1-环戊基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺(6b)
制备方法参照实施例14，其中，将(2-(4-((4-(1-异丙基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(5a)替换为(2-(4-((4-(1-环戊基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(5b)，得白色固体(6b)，收率：100％。1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.10(s,1H),9.98(s,1H),8.76(s,1H),8.64(d,J＝5.1Hz,1H),8.11–7.95(m,4H),7.49(d,J＝5.1Hz,1H),7.35(d,J＝7.3Hz,1H),7.25–6.97(m,3H),5.18–5.07(m,1H),2.32–2.19(m,2H),2.14–1.98(m,2H),1.96–1.81(m,2H),1.80–1.64(m,2H).ESI-MS m/z:441.2[M+H]+。
实施例16：N-(2-氨基苯基)-4-((4-(1-环己基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺(6c)
制备方法参照实施例14，其中，将(2-(4-((4-(1-异丙基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(5a)替换为(2-(4-((4-(1-环己基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(5c)，得白色固体(6c)，收率：100％。1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.04(s,1H),9.55(s,1H),8.77(s,1H),8.63(d,J＝5.1Hz,1H),8.01(s,4H),7.48(d,J＝5.1Hz,1H),7.20(d,J＝7.0Hz,1H),7.07–6.92(m,1H),6.90–6.74(m,1H),6.74–6.49(m,1H),4.91(s,2H),4.73–4.52(m,1H),2.24–2.07(m,2H),1.97–1.79(m,4H),1.79–1.64(m,1H),1.58–1.39(m,2H),1.38–1.22(m,1H).13CNMR(101MHz,DMSO)δ164.91,159.84,159.10,157.47,145.06,143.49,143.04,128.67(2C),126.82,126.54,126.23,123.73,123.05,117.60(2C),116.33,116.18,107.97,59.53,32.69,24.62(2C),24.60.ESI-MS m/z:455.2[M+H]+.
实施例17：4-(1-环戊基-1H-1,2,3-***-4-基)-N-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)嘧啶-2-胺(7a)
制备方法参照实施例6，其中，将4-氨基苯甲酸甲酯替换为4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺，得白色固体(7a)，收率：48％。1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.40(s,1H),8.30(d,J＝5.1Hz,1H),7.52–7.42(m,2H),7.21(d,J＝5.1Hz,1H),6.92–6.83(m,2H),5.02–4.90(m,1H),3.12–2.99(m,4H),2.62–2.47(m,4H),2.27(s,3H),2.25–2.13(m,2H),2.06-1.96(m,2H),1.89–1.78(m,2H),1.75–1.63(m,2H).13C NMR(101MHz,MeOD)δ162.05,159.82,159.12,148.08,147.48,134.62,124.48,122.25(2C),118.30(2C),107.90,63.68,55.98(2C),50.78(2C),45.99,34.31(2C),25.08(2C).ESI-MS m/z:405.3[M+H]+。
实施例18：4-(1-环己基-1H-1,2,3-***-4-基)-N-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)嘧啶-2-胺(7b)
制备方法参照实施例17，其中，将2-氯-4-(1-环戊基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)嘧啶替换为2-氯-4-(1-环己基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)嘧啶，得白色固体(7b)，收率：51％。1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.43(s,1H),8.31(d,J＝5.1Hz,1H),7.58–7.45(m,2H),7.22(d,J＝5.1Hz,1H),6.98–6.83(m,2H),4.46(tt,J＝11.6,3.7Hz,1H),3.29–3.04(m,8H),2.70(s,3H),1.89–1.66(m,5H),1.44-1.38(m,2H),1.30-1.12(m,3H).13C NMR(101MHz,MeOD)δ162.00,159.83,159.15,147.25,146.92,135.42,123.83,122.13(2C),118.73(2C),108.09,61.91,55.18(2C),54.82,47.90,44.26,34.41(2C),26.21(2C),26.17.ESI-MS m/z:419.3[M+H]+。
实施例19：4-((4-(1-环戊基-1H-1,2,3-***-4-基)嘧啶-2-基)氨基)苯磺酰胺(7c)
制备方法参照实施例6，其中，将4-氨基苯甲酸甲酯替换为磺胺(4-氨基苯磺酰胺)，得白色固体(7c)，收率：67％。1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.62(s,1H),8.56(d,J＝5.1Hz,1H),7.97(d,J＝8.8Hz,2H),7.87(d,J＝8.8Hz,2H),7.48(d,J＝5.0Hz,1H),4.68–4.54(m,1H),2.32–2.18(m,2H),2.07–1.74(m,6H),1.68–1.34(m,4H).13C NMR(101MHz,MeOD)δ161.46,160.06,159.14,145.48,137.03,128.22(2C),124.03,119.28(2C),109.50,107.76,62.00,34.42(2C),26.23(2C),26.19.ESI-MS m/z:386.1[M+H]+。
实施例20：4-(1-环己基-1H-1,2,3-***-4-基)-5-氟-N-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)嘧啶-2-胺(7d)
制备方法参照实施例17，其中，将2-氯-4-(1-环戊基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)嘧啶替换为2-氯-4-(1-环己基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)-5-氟嘧啶，得白色固体(7d)，收率：41％。1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.45(d,J＝2.1Hz,1H),8.28(d,J＝2.7Hz,1H),7.49(d,J＝9.0Hz,2H),6.87(d,J＝9.1Hz,2H),4.57–4.40(m,1H),3.11–2.99(m,4H),2.62–2.47(m,4H),2.26(s,3H),2.16–2.05(m,2H),1.90–1.64(m,5H),1.52–1.23(m,3H).13C NMR(101MHz,MeOD)δ157.20,148.73(d,JC-F＝252.9Hz),146.45,146.11(d,JC-F＝23.5Hz),144.44(d,JC-F＝11.9Hz),140.65(d,JC-F＝6.3Hz),133.61,124.71(d,JC-F＝8.8Hz),120.04(2C),116.96(2C),60.62,54.61(2C),49.49(2C),44.63,32.96(2C),24.82(2C),24.76.ESI-MS m/z:437.3[M+H]+。
实施例21：细胞周期依赖激酶2/4/6(Cyclin-dependent protein kinase 2/4/6,CDK2/4/6)抑制活性测试
1，CDK2抑制活性测试过程
(1)配制1×kinase buffer：Enzymatic buffer kinase 5×(厂家：Cisbio)用去离子水稀释5倍，同时加入氯化镁(MgCl2)、氯化锰(MnCl2)和二硫苏糖醇(DTT)，MgCl2终浓度10mM，MnCl2终浓度1mM,DTT终浓度1mM；
(2)测试化合物以10μM为起始，4倍稀释，7个浓度，用1×kinase buffer配制4倍终浓度待测化合物工作液，然后2.5μL/孔加入384孔反应板中，溶媒(此处指配制化合物使用的DMSO)对照孔加入与待测化合物孔等浓度的DMSO对照；
(3)用1×kinase buffer配制4倍终浓度的生物素化ATF2(ATF2 biotin，厂家：Cisbio)，然后2.5μL/孔加入384孔反应板中；
(4)用1×kinase buffer配制4倍终浓度的ATP，2.5μL/孔加入384孔反应板中；
(5)用1×kinase buffer配制4倍终浓度的CDK2酶溶液，2.5μL/孔加入384孔反应板中混匀起始反应，阴性对照孔加入2.5μL的1×kinase buffer，室温孵育60min；
(6)1×Detection buffer(厂家：Cisbio)中加入磷酸化ATF2抗体的铕穴状化合物(pAb anti-phospho ATF2-Eu cryptate，厂家：Ciscib)和亲和素化的XL665(Streptavidin-XL665，厂家：Cisbio)，10μL/孔加入384孔反应板中，室温孵育60min；
(7)酶标仪中采用HTRF法检测665nM和625nM处荧光信号。
2，CDK4/6抑制活性测试过程
(1)配制1×kinase buffer：Enzymatic buffer kinase 5×(厂家：Cisbio)用去离子水稀释5倍，同时加入氯化镁(MgCl2)和二硫苏糖醇(DTT)，MgCl2终浓度50mM，DTT终浓度1mM；
(2)测试化合物以10μM为起始，4倍稀释，7个浓度，用1×kinase buffer配制4倍终浓度待测化合物工作液，然后25μL/孔加入384孔反应板中，对照孔加入与待测化合物孔等浓度的DMSO对照；
(3)用1×kinase buffer配制4倍终浓度的生物素化的可磷酸化视网膜母细胞瘤基因底物(Rb biotinylated peptide，厂家：Cisbio)，然后加入2.5μL/孔加入384孔反应板中；
(4)用1×kinase buffer配制4倍终浓度的ATP，2.5μL/孔加入384孔反应板中；
(5)用1×kinase buffer配制4倍终浓度的CDK4、CDK6酶溶液，2.5μL/孔加入384孔反应板中混匀起始反应，阴性对照孔加入2.5μL的1×kinase buffer，室温孵育90min；
(6)1×Detection buffer(厂家：Cisbio)中加入磷酸化Rb抗体的铕穴状化合物(Anti-p-Rb-K,厂家：Cisbio)和亲和素化的XL665(Streptavidin-XL665，厂家：Cisbio)，10μL/孔加入384孔反应板中，室温孵育60min；
(7)酶标仪中采用HTRF法检测665nM和625nM处荧光信号。
3数据分析
计算665/625比值，将阴性对照组设为Tz，溶媒对照组记为C，待测化合物组记为Ti，计算待测化合物孔的酶活性抑制率；抑制率％＝(Ti-Tz)/(C-Tz)*100，采用GraphPadPrism 5的log(inhibitor)vs.normalized response-Variable slope拟合量效曲线，从而得出各个化合物抑制酶活性的IC50值。结果见下表1。
表1CDK2、CDK4和CDK6的测试结果
表1中可以看出：化合物均具有一定的酶抑制活性，其中，实施例17、实施例18、实施例19和实施例20对CDK2、CDK4和CDK6酶抑制活性最好，且对CDK4酶抑制活性尤为显著。
实施例22：细胞抑制活性测试
1测试过程
(1)细胞接种
收集对数生长期的细胞(人肝癌细胞HepG2、人结肠癌细胞HCT116)，计数后调节细胞浓度(HepG2：1.5×105/mL，HCT116：1.1×105/mL)，100μL/孔接种于96孔板，然后在37℃、5％CO2培养箱中孵育过夜。
(2)平行对照板固定，待测板加入待测物
平行对照板：25μL/孔加入预冷三氯乙酸(Trichloroacetic acid,TCA)，4℃固定1h，去离子水洗板5次，自然晾干；
待测板加入待测物：测试化合物浓度为50μM起始，10倍稀释，5个浓度。用含10％FBS的DMEM完全培养基配制2倍终浓度待测化合物工作液，然后100μL/孔加入96孔中，溶媒对照孔加入与待测化合物孔等浓度的DMSO对照，调零孔加入完全培养基，37℃、5％CO2培养箱中培养72h。
(3)待测板测OD值
50μL/孔加入预冷的50％TCA，4℃固定1h，去离子水洗板5次，自然晾干；100μL/孔加入0.4％磺酰罗丹明B，室温染色10min，然后1％醋酸100μL/孔洗板5次，自然晾干；150μL/孔加入10mM Tris-base，振荡约5min；515nm处检测OD值。
2数据分析
将平行对照组OD值记为Tz，溶媒对照组OD值记为C，待测组OD值记为Ti：
生长率％＝[(Ti-Tz)/(C-Tz)]×100
抑制率％＝100-[(Ti-Tz)/(C-Tz)]×100
以化合物浓度的log值作为X轴，对应的细胞生长抑制率为Y轴，利用GraphPadPrism 5的log(inhibitor)vs.response-Variable slope拟合量效曲线，从而得出待测化合物抑制细胞生长的IC50值。结果见下表。
表中可以看出：化合物均具有一定的细胞生长抑制活性，其中实施例14、实施例15、实施例16和实施例19细胞生长抑制活性最好，可作为临床预防和治疗肝癌、结肠癌的潜在药物。
Claims (4)
1.一组2-苯氨基-4-三氮唑基嘧啶类衍生物或其药学上可接受的盐，其结构如下所示：
其中，R1为氢、氯、氟或三氟甲基；
R2为甲基、乙基、异丙基、环丙基、环丁基、环戊基或环己基；
R3为
或-SO2NH2。
2.根据权利要求1所述的4-三氮唑-2-苯氨基嘧啶类衍生物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述4-三氮唑-2-苯氨基嘧啶类衍生物从如下任一化合物中选取：
氮-(2-氨基苯基)-4-((4-(1-环己基-1H-1,2,3-***-4-基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺；
氮-(2-氨基苯基)-4-((4-(1-环戊基-1H-1,2,3-***-4-基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺；
氮-(2-氨基苯基)-4-((4-(1-异丙基-1H-1,2,3-***-4-基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺；
氮-(2-氨基苯基)-4-((4-(1-环己基-1H-1,2,3-***-4-基)-5-氟嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺；
氮-(2-氨基苯基)-4-((4-(1-环戊基-1H-1,2,3-***-4-基)-5-氟嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺；
氮-(2-氨基苯基)-4-((5-氟-4-(1-异丙基-1H-1,2,3-***-4-基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺；
4-(1-环戊基-1氢-1,2,3-***-4-基)-N-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)嘧啶-2-胺；
4-(1-环己基-1氢-1,2,3-***-4-基)-N-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)嘧啶-2-胺；
4-((4-(1-环戊基-1氢-1,2,3-***-4-基)嘧啶-2-基)氨基)苯磺酰胺；
4-(1-环己基-1氢-1,2,3-***-4-基)-5-氟-N-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)嘧啶-2-胺；
4-(1-异丙基-1氢-1,2,3-***-4-基)-N-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)嘧啶-2-胺；
4-(1-环戊基-1氢-1,2,3-***-4-基)-5-氟-N-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)嘧啶-2-胺；
4-((4-(1-环戊基-1H-1,2,3-***-4-基)-5-氟嘧啶-2-基)氨基)苯磺酰胺；
4-(1-异丙基-1氢-1,2,3-***-4-基)- 5-氟-N-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)嘧啶-2-胺。
3.权利要求1或2所述的4-三氮唑-2-苯氨基嘧啶类衍生物或其药学上可接受的盐在制备抗癌药物中的应用。
4.权利要求1或2所述的4-三氮唑-2-苯氨基嘧啶类衍生物或其药学上可接受的盐在制备预防和治疗肝癌、结肠癌药物中的应用。
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