CN108290899A - 一种取代的吡咯并嘧啶化合物及其应用 - Google Patents

一种取代的吡咯并嘧啶化合物及其应用 Download PDF

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Abstract

提供一种取代的吡咯并嘧啶化合物及包含该化合物的组合物及其应用。具体地，公开了式（I）所示的吡咯并嘧啶化合物，或其晶型、药学上可接受的盐、前药、立体异构体、水合物或溶剂合物的药物组合物。所述化合物可作为细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）抑制剂，进而可适用于制备治疗CDK相关疾病（如乳腺癌等）的药物。

Description

一种取代的吡咯并嘧啶化合物及其应用 技术领域
本发明属于医药领域。具体地，本发明涉及一种取代的吡咯并嘧啶化合物及其用途，更具体地是，涉及吡咯并嘧啶化合物及其药物组合物可作为CDK抑制剂，用于治疗和预防与CDK抑制剂相关疾病。
背景技术
细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)是一种丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，在调节细胞-周期不同阶段之间的转换中发挥关键作用，所述转换如从G1中的静止期(有丝***和为了新一轮细胞***的DNA复制开始之间的间歇)到S(活跃DNA合成期)的进展，或从G2向M期的进展，其中发生活跃的有丝***和细胞***。
CDK复合物通过调节细胞周期蛋白亚单位(例如，细胞周期蛋白A，B1，B2，D1，D2，D3和E)和催化激酶亚单位(例如，CDK1，CDK2，CDK4，CDK5和CDK6)的缔合而形成。如名称所暗含，CDKs显示对细胞周期蛋白亚单位的绝对依赖以便磷酸化它们的目标底物，不同的激酶/细胞周期蛋白对发挥作用来调节通过细胞-周期特定阶段的进展。这些蛋白激酶是一类调节多种细胞功能的蛋白质(酶)。这伴随着蛋白质底物上特定氨基酸的磷酸化，导致底物蛋白质的构象改变。构象变化调节底物的活性或它与其它结合配体的相互作用的能力。蛋白激酶的酶活性是指激酶将磷酸基团加至底物上的速率。它可以例如通过测定作为时间的函数的转化为产物的底物的量来测量。底物的磷酸化在蛋白激酶的活性位点处发生。
CDK的活性以翻译后方式、通过与其他蛋白的瞬时缔合并通过改变它们的细胞内定位得以调节。肿瘤发展与CDK及其调节因子的基因变化和失调密切相关，表明CDK抑制剂可能是有用的抗癌治疗剂。早期结果表明：转化的细胞和正常细胞在它们对例如细胞周期蛋白A/CDK2的需求方面是不同的，可能开发缺乏用常规的细胞毒性药和细胞生长抑制药观察到的一般宿主毒性的新型抗肿瘤剂。尽管抑制细胞周期相关CDK与例如肿瘤学应用明确相关，但是抑制RNA聚合酶-调节的CDK也可与癌症适应症高度相关。
已显示CDK参与细胞周期进展和细胞转录，生长控制丧失与疾病的异常细胞增殖有关(参见例如Malumbres和Barbacid，Nat.Rev.Cancer 2001，1：222)。已显示细胞周期蛋白依赖性激酶的活性增加或短暂异常活化导致人肿瘤的发展(Sherr C.J.，Science 1996，274：1672-1677)。
许多疾病都与上述蛋白激酶介导的事件所触发的细胞应答异常有关。这些疾病包括但不限于自身免疫性疾病、炎性疾病、骨病、代谢疾病、神经病学和神经变性疾病、癌症、心血管疾病、*** 反应和哮喘、阿尔茨海默病和与激素有关的疾病。因此，人们在医药化学方面进行了大量努力来寻找可有效作为治疗剂的蛋白激酶抑制剂。
哺乳动物细胞周期的开始、进行和结束受各种对细胞生长很关键的细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)复合物调控。这些复合物至少包含催化(CDK本身)和调控(细胞周期蛋白)亚基。对于细胞周期调控而言一些更重要的复合物包括细胞周期蛋白A(CDK1和CDK2)、细胞周期蛋白B1-B3(CDK1)和细胞周期蛋白D1-D3(CDK2、CDK4、CDK5、CDK6)、细胞周期蛋白E(CDK2)。这些复合物各自参与细胞周期的特定阶段。然而，并非所有CDK族成员均仅参与细胞周期控制。因此，CDK7、CDK8和CDK9参与转录的调控，CDK5在神经元和分泌细胞功能中起作用。
Palbociclib是第一个被美国FDA批准用于乳腺癌治疗的CDK4/6抑制剂。因为所有的活细胞都在进行细胞***，而Palbociclib具有阻止细胞***过程(也被称为“细胞周期”)的能力，因此具有潜在的广泛适用性。Palbociclib联合其他抗癌治疗如内分泌治疗、化疗、靶向治疗，可能会对各种癌症有效。不管是乳腺癌还是其他癌症的临床试验均表明，每日一次给药Palbociclib是安全的，其主要副作用是可逆性中性粒细胞减少，出现计数降低副作用时应暂停用药以及重新开始较低剂量的用药。其他副作用包括疲劳(33％)、恶心(30％)，腹泻(18％)、便秘(12％)、皮疹(12％)。此外，诺华的CDK抑制剂Ribociclib(LEE011)仍处于III期临床试验中。
因此，仍然需要开发蛋白激酶如CDK1、CDK2、CDK4、CDK5、CDK6、CDK7、CDK8和CDK9的抑制剂；仍然需要用于与蛋白激酶有关的障碍的新治疗和疗法。仍然需要可用于治疗或预防或改善癌症、移植物排斥和自身免疫性疾病的一种或多种症状的化合物。
发明内容
针对以上技术问题，本发明公开了一种吡咯并嘧啶化合物及包含该化合物的组合物，其作为一种有效的细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂和/或具有更好药效学/药代动力学性能。
对此，本发明采用的技术方案为：
本发明的目的是提供一类新型有效的细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂和/或具有更好药效学/药代动力学性能的化合物。
本发明的第一方面中，提供了一种式(I)所示的吡咯并嘧啶化合物，或其晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化合物：
式中：
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22、R23、R24、R25、R26、R27相互独立地选自由“氢(H)、氘(D)”组成的组；
及其生理学上可接受的盐、前药、水合物、溶剂化物、互变异构体和立体异构体，包括这些化合物以所有比例形成的混合物；
附加条件是，所述吡咯并嘧啶化合物至少含有一个氘原子。
在另一优选例中，氘在氘代位置的氘同位素含量至少是大于天然氘同位素含量(0.015％)，较佳地大于30％，更佳地大于50％，更佳地大于75％，更佳地大于95％，更佳地大于99％。
具体地说，在本发明中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22、R23、R24、R25、R26和R27各氘代位置中氘同位素含量至少是5％，较佳地大于10％，更佳地大于15％，更佳地大于20％，更佳地大于25％，更佳地大于30％，更佳地大于35％，更佳地大于40％，更佳地大于45％，更佳地大于50％，更佳地大于55％，更佳地大于60％，更佳地大于65％，更佳地大于70％，更佳地大于75％，更佳地大于80％，更佳地大于85％，更佳地大于90％，更佳地大于95％，更佳地大于99％。
在另一优选例中，式(I)中化合物的R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22、R23、R24、R25、R26、R27，至少其中一个R含氘，更佳地两个R含氘，更佳地三个R含氘，更佳地四个R含氘，更佳地五个R含氘，更佳地六个R含氘，更佳地七个R含氘，更佳地八个R含氘，更佳地九个R含氘，更佳地十个R含氘，更佳地十一个R含氘，更佳地十二个R含氘，更佳地十三个R含氘，更佳地十四个R含氘，更佳地十五个R含氘，更佳地十六个R含氘，更佳地十七个R含氘，更佳地十八个R含氘，更佳地十九个R含氘，更佳地二十个R含氘，更佳地二十一个R含氘，更佳地二十二个R含氘，更佳地二十 三个R含氘，更佳地二十四个R含氘，更佳地二十五个R含氘，更佳地二十六个R含氘，更佳地二十七个R含氘。
作为本发明的进一步改进，R1、R2、R3、R4、R5、R7和R8各自独立地为氘或氢。
作为本发明的进一步改进，R9、R10和R11各自独立地为氘或氢。
作为本发明的进一步改进，R12和R13各自独立地为氘或氢。
作为本发明的进一步改进，R14、R15、R16、R17、R18、R19、R20和R21各自独立地为氘或氢。
作为本发明的进一步改进，R22、R23、R24、R25、R26和R27各自独立地为氘或氢。
在另一优选例中，所述化合物选自下组化合物或其药学上可接受的盐，但不局限于下列化合物：
在另一优选例中，所述化合物不包括非氘代化合物以及只有R22、R23、R24、R25、R26和R27全被氘代的化合物。
在本发明的第二方面中，提供了一种制备药物组合物的方法，包括步骤：将药学上可接受的载体与本发明第一方面中所述的化合物，或其晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物进行混合，从而形成药物组合物。
在本发明的第三方面中，提供了一种药物组合物，它含有药学上可接受的载体和本发明第一方面中所述的化合物，或其晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物。
可用于本发明药物组合物中的药学上可接受的载体包括但不限于任何助流剂、增甜剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、矫味增强剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、崩解剂、助悬剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂。
本发明药物组合物可配制成固态、半固态、液态或气态制剂，如片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、膏剂、乳剂、悬浮剂、溶液剂、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶剂、微球及气溶胶等。
给予本发明药物组合物的典型途径包括但不限于口服、直肠、透黏膜、经肠给药，或者局部、经皮、吸入、肠胃外、舌下、***内、鼻内、眼内、腹膜内、肌内、皮下、静脉内给药。优选口服给药或注射给药。
本发明的药物组合物可以采用本领域周知的方法制造，如常规的混合法、溶解法、制粒法、制糖衣药丸法、磨细法、乳化法、冷冻干燥法等。
本发明化合物可作为细胞周期蛋白依赖激酶的抑制剂。例如，本发明的化合物是细胞周期蛋白依赖激酶的抑制剂，特别优选的细胞周期蛋白依赖激酶选自CDK1、CDK2、CDK3、CDK4、CDK5、CDK6和CDK9，更特别优选的选自CDK1、CDK2、CDK3、CDK4、CDK5和CDK9。
CDK在细胞周期调控、细胞凋亡、转录、分化和CNS功能中起作用。因此，CDK抑制剂可用于有细胞增殖、细胞凋亡或分化障碍例如癌症的疾病治疗。具体地，RB+ve肿瘤可能对CDK抑制剂特别敏感。这些包括ras、Raf、生长因子受体中的肿瘤窝藏突变或生长因子受体的过度表达。有CDK抑制剂的高度甲基化启动子区及细胞周期蛋白依赖激酶的肿瘤过度表达细胞周期蛋白伴侣另外的肿瘤也可显示敏感性。RB-ve肿瘤也可对CDK抑制剂敏感。
可被抑制的癌症实例包括但不限于，癌症，例如膀胱癌、乳腺癌、结肠癌(例如，结直肠癌例如结肠腺癌和结肠腺瘤)、肾癌、表皮癌、肝癌、肺癌例如腺癌、小细胞肺癌和非小细胞肺癌、食道癌、胆囊癌、卵巢癌、胰腺癌例如外分泌胰腺癌、胃癌、***、甲状腺癌、鼻癌、头颈癌、***癌或皮肤癌例如鳞状细胞癌；淋巴系的造血细胞肿瘤，例如白血病、急性淋巴性白血病、慢性淋巴细胞白血病、B-细胞淋巴瘤(例如弥散性大B细胞淋巴瘤)、T-细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤或伯基特氏淋巴瘤；髓系造血细胞肿瘤，例如急性和 慢性髓系白血病，骨髓增生异常综合征或早幼粒细胞白血病；甲状腺滤泡癌；源于***肿瘤，例如纤维肉瘤或横纹肌肉瘤；中枢或周围神经***肿瘤，例如星形细胞瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤或神经鞘瘤；黑素瘤；***瘤；畸胎瘤；骨肉瘤；着色性干皮病；角化棘细胞瘤；甲状腺滤泡癌或卡波西肉瘤。
本发明所述的细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂可与其他抗癌药组合使用。例如，细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂已与其他抗癌药用于组合治疗中。
因此，在药物组合物中，本发明用于治疗包括异常细胞生长的疾病或病症的用途或方法，在一个实施方案中包括异常细胞生长的疾病或病症是癌症。
一类癌症包括人乳腺癌(例如，原发性乳腺肿瘤、***阴性乳腺癌、乳腺浸润性导管腺癌、非子宫内膜样乳腺癌)；和套细胞淋巴瘤。另外，其他癌症是结直肠癌和子宫内膜癌。
癌症另一个亚类包括淋巴系造血肿瘤，例如白血病、慢性淋巴性白血病、套细胞淋巴肿瘤和B-细胞淋巴瘤(例如弥漫性大B细胞淋巴瘤)。
在治疗中本发明化合物可能有用的另一亚类癌症包括肉瘤、白血病、神经胶质瘤、家族性黑素瘤和黑素瘤。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
本文中，如无特别说明，“卤素”指F、Cl、Br、和I。更佳地，卤原子选自F、Cl和Br。
本文中，如无特别说明，“氘代”指化合物或基团中的一个或多个氢被氘所取代；氘代可以是一取代、二取代、多取代或全取代。术语“一个或多个氘代的”与“一次或多次氘代”可互换使用。
本文中，如无特别说明，“非氘代的化合物”是指含氘原子比例不高于天然氘同位素含量(0.015％)的化合物。
本发明还包括同位素标记的化合物，等同于原始化合物在此公开。可以列为本发明的化合物同位素的例子包括氢，碳，氮，氧，磷，硫，氟和氯同位素，分别如2H，3H，13C，14C，15N，17O，18O，31P，32P，35S，18F以及36Cl。本发明中的化合物，或对映体，非对映体，异构体，或药学上可接受的盐或溶剂化物，其中含有上述化合物的同位素或其他其他同位素原子都在本发明的范围之内。本发明中某些同位素标记化合物，例如3H和14C的放射性同位素也在其中，在药物和底物的组织分布实验中是有用的。氚，即3H和碳-14，即14C，它们的制备和检测比较容易，是同位素中的首选。同位素标记的化合物可以用一般的方法，通过用易得的同位素标记试剂替换为非同位素的试剂，用示例中的方案可以制备。
药学上可接受的盐包括无机盐和有机盐。一类优选的盐是本发明化合物与酸形成的盐。适合形成盐的酸包括但并不限于：盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸；甲酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、苯甲酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、苯磺酸、萘磺酸等有机酸；以及脯氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等氨基酸。另一类优选的盐是本发明化合物与碱形成的盐，例如碱金属盐(例如钠盐或钾盐)、碱土金属盐(例如镁盐或钙盐)、铵盐(如低级的烷醇铵盐以及其它药学上可接受的胺盐)，例如甲胺盐、乙胺盐、丙胺盐、二甲基胺盐、三甲基胺盐、二乙基胺盐、三乙基胺盐、叔丁基胺盐、乙二胺盐、羟乙胺盐、二羟乙胺盐、三羟乙胺盐，以及分别由吗啉、哌嗪、赖氨酸形成的胺盐。
术语“溶剂合物”指本发明化合物与溶剂分子配位形成特定比例的配合物。“水合物”是指本发明化合物与水进行配位形成的配合物。
本发明还提供了包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或所述化合物的药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体的药物组合物。所述载体在与制剂的其他成分相容以及，在药学上可接受的载体的情况下，在用于药物中的量下不会对其接受者有害的意义上是“可接受的”。
式(I)化合物和包含所述化合物的组合物是CDK抑制剂，并且可以用于治疗、预防或消除各种CDK的相关病症。包含这些化合物的药物组合物用于在不同治疗领域诸如癌症中治疗、预防疾病或障碍或减慢所述疾病或障碍进程。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明公开的取代的吡咯并嘧啶化合物及包含该化合物的组合物对CDK具有优异的抑制性，同时具有更好的药代动力学参数特性。可以改变剂量并形成长效制剂，改善适用性。用氘取代化合物中的氢原子，由于其氘同位素效应，能够提高化合物在动物体内的药物浓度，以提高药物疗效。用氘取代化合物中的氢原子，由于某些代谢产物被抑制，可能提高化合物的安全性。
具体实施方式
下面更具体地描述本发明式(I)结构化合物的制备方法，但这些具体方法不对本发明构成任何限制。本发明化合物还可以任选将在本说明书中描述的或本领域已知的各种合成方法组合起来而方便地制得，这样的组合可由本发明所属领域的技术人员容易地进行。
通常，在制备流程中，各反应通常在惰性溶剂中，在室温至回流温度(如0℃～100℃，优选0℃～80℃)下进行。反应时间通常为0.1小时-60小时，较佳地为0.5-24小时。
实施例1 制备中间体2-氯-7-环戊基-N,N-二甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物7)
具体合成步骤如下：
步骤1.[2-氯-5-(3,3-二乙氧基-丙-1-炔基)-嘧啶-4-基]-环戊基胺(化合物3)的合成。
将(5-溴-2-氯-嘧啶-4-基)-环戊基胺(2.0g，7.3mmol)和丙炔醛二乙基二缩醛(1.1g，8.6mmol)，Pd(dppf)Cl2(510mg，0.73mmol)，CuI(140mg，0.73mmol)和5mL三乙胺加入到20mL二甲基甲酰胺(DMF)中，氮气置换三次，升温到100℃，反应过夜。反应完全后冷却至室温，加入40mL水，用乙酸乙酯萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，经硅胶柱分离得淡黄色油状物1.01g，收率43％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.18(s,1H),7.20(d,J＝7.6Hz,1H),5.56(s,1H),4.33(t,J＝7.5Hz,1H),3.63(ddq,J＝35.4,9.6,7.1Hz,4H),1.93(s,2H),1.76–1.47(m,6H),1.16(t,J＝7.1Hz,6H)；ESI-MS:324[M++1]。
步骤2. 2-氯-7-环戊基-6-二乙氧基甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(化合物4)的合成。
将[2-氯-5-(3,3-二乙氧基-丙-1-炔基)-嘧啶-4-基]-环戊基胺(1.01g，3.1mmol)溶于10mL四氢呋喃，加入四丁基氟化铵(2.4g，9.3mmol)，于65℃反应2小时。旋蒸蒸除溶剂，加入20mL水，用乙酸乙酯萃取，有机相用20mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，经硅胶柱分离得淡黄色油状物830mg，收率82％。ESI-MS:324[M++1]。
步骤3. 2-氯-7-环戊基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲醛(化合物5)的合成。
将2-氯-7-环戊基-6-二乙氧基甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(830mg，2.6mmol)溶于10mL二氧六环，缓慢滴加4mL浓盐酸，室温搅拌20分钟，加入15mL水,，用乙酸乙酯萃取，有机相用10mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，经硅胶柱分离得淡黄色固体525mg，收率82％。ESI-MS: 250[M++1]。
步骤4. 2-氯-7-环戊基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸(化合物6)的合成。
将2-氯-7-环戊基-6-二乙氧基甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲醛(525mg，2.1mmol)溶于5mLDMF中，加入过氧单磺酸钾(1.4g，2.3mmol)，室温反应6小时。反应结束后加入10mL水，有大量固体析出，过滤干燥得到淡黄色固体475mg，收率85％。ESI-MS:266[M++1]。
步骤5. 2-氯-7-环戊基-N,N-二甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物7)的合成。
将2-氯-7-环戊基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸(475mg，1.8mmol)，O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU，680mg，1.8mmol)和N,N-二异丙基乙胺(DIEA，0.9mL，5.4mmol)溶于10mL DMF中，冰浴下滴加2M的二甲胺甲醇溶液(1.1mL，2.2mmol)，滴加完毕于室温下反应30分钟，加入20mL水，用乙酸乙酯萃取，有机相用20mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，经硅胶柱分离得红色固体420mg，收率80％。ESI-MS:293[M++1]。
实施例2 制备7-环戊基-N,N-二甲基-2-((5-(哌嗪-1-基-2,2,3,3,5,5,6,6-d8)吡啶-2-基)氨基)-7H-吡 咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物14)
具体合成步骤如下：
步骤1. 1-(6-硝基吡啶-3-基)哌嗪-2,2,3,3,5,5,6,6-d8(化合物10)的合成。
将5-溴-2-硝基吡啶(202mg，1mmol)溶于10mL正丁醇，加入三乙胺(0.7mL，5mmol)和哌嗪-2,2,3,3,5,5,6,6-d8盐酸盐(332mg，2mmol)，于90℃反应6小时，冷却至室温，加入20mL 水,，用乙酸乙酯萃取，有机相用20mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，经硅胶柱分离得黄色固体175mg，收率81％。ESI-MS:217[M++1]。
步骤2. 4-(6-硝基吡啶-3-基)哌嗪-2,2,3,3,5,5,6,6-d8-1-羧酸叔丁酯(化合物11)的合成。
将1-(6-硝基吡啶-3-基)哌嗪-2,2,3,3,5,5,6,6-d8(175mg，0.8mmol)溶于10mL二氯甲烷，依次加入三乙胺(0.22mL，1.6mmol)和(Boc)2O(210mg，0.96mmol)，室温搅拌过夜，反应完全后加入10mL水，分层，水相用二氯甲烷萃取，合并有机相，用20mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，经硅胶柱分离得黄色固体230mg，收率90％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.18(d,J＝9.1Hz,1H),8.12(d,J＝3.0Hz,1H),7.20(dd,J＝9.2,3.1Hz,1H),1.49(s,9H)；ESI-MS:317[M++1]。
步骤3. 4-(6-氨基吡啶-3-基)哌嗪-2,2,3,3,5,5,6,6-d8-1-羧酸叔丁酯(化合物12)的合成。
将4-(6-硝基吡啶-3-基)哌嗪-2,2,3,3,5,5,6,6-d8-1-羧酸叔丁酯(230mg，0.73mmol)溶于10mL异丙醇，加入30mg 10％的钯碳，氢气置换三次，在1个大气压的氢气氛下室温搅拌过夜。反应完全后滤除钯碳，滤液浓缩，经硅胶柱分离得红褐色固体165mg，收率80％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.73(d,J＝2.9Hz,1H),7.19(dd,J＝8.9,2.9Hz,1H),6.51(dd,J＝8.8,0.7Hz,1H),4.37(s,2H),1.48(s,9H)；ESI-MS:287[M++1]。
步骤4. 4-(6-((7-环戊基-6-二甲酰胺-7-H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)-吡啶-3-基)哌嗪-2,2,3,3,5,5,6,6-d8-1-羧酸叔丁酯(化合物13)的合成。
将2-氯-7-环戊基-N,N-二甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲酰胺(90mg，0.3mmol)溶于5mL甲基异丁酮中，依次加入醋酸钯(3mg，0.015mmol)，1,1'-联萘-2,2'-双二苯膦(BINAP，18mg，0.03mmol)，碳酸铯(146mg，0.45mmol)和4-(6-氨基-吡啶-3-基)-哌嗪-2,2,3,3,5,5,6,6-d8-1-羧酸叔丁酯(97mg，3.3mmol)，氮气置换三次，反应混合物于110℃反应过夜。反应完毕降至室温，加入10mL水，用乙酸乙酯萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，经硅胶柱分离得淡黄色油状物110mg，收率66％。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.71(s,1H),8.36(s,1H),8.14(s,1H),7.98(s,1H),7.33(dd,J＝9.1,3.0Hz,1H),6.45(s,1H),4.77(p,J＝8.8Hz,1H),3.15(s,6H),2.08-2.13(m,6H),1.70(s,2H),1.48(s,9H)；ESI-MS:543[M++1]。
步骤5. 7-环戊基-N,N-二甲基-2-((5-(哌嗪-1-基-2,2,3,3,5,5,6,6-d8)吡啶-2-基)氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物14)的合成。
将4-(6-((7-环戊基-6-二甲酰胺-7-H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)-吡啶-3-基)哌嗪-2,2,3,3,5,5,6,6-d8-1-羧酸叔丁酯(110mg，2mmol)溶于5mL二氯甲烷中，加入2mL三氟乙酸，室温搅拌2小时，减压蒸除溶剂，加入10mL饱和碳酸氢钠溶液，搅拌10分钟，用二氯甲烷萃取， 有机相用10mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，经硅胶柱分离得淡黄色固体80mg，收率90％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.68(s,1H),8.35(d,J＝9.1Hz,1H),7.99(d,J＝2.9Hz,1H),7.81(s,1H),7.32(dd,J＝9.1,3.0Hz,1H),6.43(s,1H),4.82–4.75(m,1H),3.15(s,4H),2.58(s,2H),2.04(m,4H),1.71(m,4H)；ESI-MS:443[M++1]。
实施例3制备7-环戊基-N,N-二甲基-2-((5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基-3,4,6-d3)氨基)-7H-吡咯并 [2,3-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物19)
具体合成步骤如下：
步骤1. 2-氨基-5-(哌嗪-1-基)吡啶-3,4,6-d3(化合物16)的合成。
将4-(6-氨基吡啶-3-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(556mg，2mmol)加入到10mL 10％氘氧化钠的重水溶液中，氮气保护下于200℃反应5小时。冷却至室温，加入10mL重水，用二氯甲烷萃取，有机相用10mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，经硅胶柱分离得淡黄色油状物145mg，收率40％。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ5.62(s,2H),3.40-3.44(m,4H),2.83-2.89(m,4H)；ESI-MS:182[M++1]。
步骤2. 4-(6-氨基吡啶-3-基-2,4,5-d3)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(化合物17)的合成。
将2-氨基-5-(哌嗪-1-基)吡啶-3,4,6-d3(145mg，0.8mmol)溶于10mL二氯甲烷，依次加入三乙胺(0.22mL，1.6mmol)和(Boc)2O(210mg，0.96mmol)，室温搅拌过夜，反应完全后加入10mL水，搅拌分层，水相用二氯甲烷萃取，合并有机相，用20mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，经硅胶柱分离得棕色固体200mg，收率90％。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ5.65(s,2H),3.41-3.45(m,4H),2.82-2.88(m,4H),1.41(s,9H)；ESI-MS:282[M++1]。
步骤3. 4-(6-((7-环戊基-6-二甲酰胺-7-H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)-吡啶-3-基-2,4,5-d3)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(化合物18)的合成。
将2-氯-7-环戊基-N,N-二甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲酰胺(90mg，0.3mmol)溶于5mL甲基异丁酮中，依次加入醋酸钯(3mg，0.015mmol)，BINAP(18mg，0.03mmol)，碳酸铯(146mg，0.45mmol)和4-(6-氨基吡啶-3-基-2,4,5-d3)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(93mg，0.33mmol)，氮气置换三次，反应混合物于110℃反应过夜。反应完毕加入10mL水，用乙酸乙酯萃取，有机相用10mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，经硅胶柱分离得淡黄色油状物116mg，收率70％。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.71(s,1H),7.98(s,1H),6.46(s,1H),4.77(t,J＝8.8Hz,1H),3.60(t,J＝5.1Hz,4H),3.12(d,J＝17.7Hz,10H),2.54(s,2H),2.04(s,4H),1.73(s,2H),1.49(s,9H)；ESI-MS:538[M++1]。
步骤4. 7-环戊基-N,N-二甲基-2-((5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基-3,4,6-d3)氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物19)的合成。
将4-(6-((7-环戊基-6-二甲酰胺-7-H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)-吡啶-3-基-2,4,5-d3)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(116mg，2.2mmol)溶于5mL二氯甲烷中，加入2mL三氟乙酸，室温搅拌2小时，减压蒸除溶剂，加入10mL饱和碳酸钠溶液，搅拌10分钟，用二氯甲烷萃取，有机相用10mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，经硅胶柱分离得淡黄色固体85mg，收率90％。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.69(s,1H),8.00(s,1H),6.44(s,1H),4.78(t,J＝9.0Hz,1H),3.26(s,8H),3.15(s,6H),2.57(s,2H),2.12(s,4H),1.67(s,2H)；ESI-MS:438[M++1]。
实施例4制备7-(环戊基-3,4-d2)-N,N-二甲基-2-((5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-7H-吡咯并[2,3-d] 嘧啶-6-甲酰胺(化合物30)
具体合成步骤如下：
步骤1.环戊胺-3,4-d2(化合物21)的合成。
将3-环戊烯胺(1.66g，20mmol)溶于20mL CH3OD，加入160mg10％钯碳，氘气置换三次，在1个大气压的氘气氛下室温搅拌过夜。反应完全后滤除钯碳，滤液浓缩，得红褐色固体1.57g，收率90％。ESI-MS:88[M++1]。
步骤2. 5-溴-2-氯-N-(环戊基-3,4-d2)嘧啶-4-胺(化合物23)的合成。
将5-溴-2，4-二氯嘧啶(3.6g，16mmol)溶于20mL无水乙醇，加入三乙胺(4.4mL，32mmol)，冰浴下缓慢滴加环戊胺-3,4-d2(1.57g，18mmol)，滴加完毕于室温搅拌5小时，减压蒸除溶剂，残留物经硅胶柱分离得白色固体3.3g，收率75％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.09(s,1H),5.44(s,1H),4.40(p,J＝6.9Hz,1H),2.12(dt,J＝12.9,6.3Hz,2H),1.75(d,J＝7.2Hz,1H),1.67(s,1H),1.46(tt,J＝13.7,6.3Hz,2H)；ESI-MS:278[M++1]。
步骤3. 2-氯-N-(环戊基-3,4-d2)-5-(3,3-二乙氧基丙基-1-炔-1-基)嘧啶-4-胺(化合物24)的合成。
将5-溴-2-氯-N-(环戊基-3,4-d2)嘧啶-4-胺(2.0g，7.3mmol)和丙炔醛二乙基二缩醛(1.1g，8.6mmol)，Pd(dppf)Cl2(510mg，0.73mmol)，CuI(140mg，0.73mmol)和5mL三乙胺加入到20mLDMF中，氮气置换三次，升温到100℃，反应过夜。反应完全后冷却至室温，加入40mL水，用乙酸乙酯萃取，有机相用20mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，经硅胶柱分离得淡黄色油状物1.01g，收率43％。ESI-MS:326[M++1]。
步骤4. 2-氯-7-(环戊基-3,4-d2)-6-(二乙氧基甲基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(化合物25)的合成。
将2-氯-N-(环戊基-3,4-d2)-5-(3,3-二乙氧基丙基-1-炔-1-基)嘧啶-4-胺(1.01g，3.1mmol)溶于10mL四氢呋喃，加入四丁基氟化铵(2.4g，9.3mmol)，于65℃反应2小时。旋蒸蒸除溶剂，加入20mL水，用乙酸乙酯萃取，有机相用20mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，经硅胶柱分离得淡黄色油状物830mg，收率82％。ESI-MS:326[M++1]。
步骤5. 2-氯-7-(环戊基-3,4-d2)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲醛(化合物26)的合成。
将2-氯-7-(环戊基-3,4-d2)-6-(二乙氧基甲基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(830mg，2.6mmol)溶于10mL二氧六环，缓慢滴加4mL浓盐酸，室温搅拌20分钟，加入15mL水，用乙酸乙酯萃取，有机相用10mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，经硅胶柱分离得淡黄色固体525mg，收率82％。ESI-MS:252[M++1]。
步骤6. 2-氯-7-(环戊基-3,4-d2)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸(化合物27)的合成。
将2-氯-7-(环戊基-3,4-d2)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲醛(525mg，2.1mmol)溶于5mLDMF中，加入过氧单磺酸钾(1.4g，2.3mmol)，室温反应6小时。反应结束后加入10mL水，有大量固体析出，过滤干燥得到淡黄色固体475mg，收率85％。ESI-MS:268[M++1]。
步骤7. 2-氯-7-(环戊基-3,4-d2)-N,N-二甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物28)的合成。
将2-氯-7-(环戊基-3,4-d2)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酸(475mg，1.8mmol)，HBTU(680mg，1.8mmol)和DIEA(0.9mL，5.4mmol)溶于10mLDMF中，冰浴下滴加2M的二甲胺甲醇溶液(1.1mL，2.2mmol)，滴加完毕于室温下反应30分钟，加入20mL水，用乙酸乙酯萃取，有机相用20mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，经硅胶柱分离得红色固体420mg，收率80％。ESI-MS:295[M++1]。
步骤8. 4-(6-((7-(环戊基-3,4-d2)-6-二甲酰胺-7-H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)-吡啶-3-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(化合物29)的合成。
将2-氯-7-(环戊基-3,4-d2)-N,N-二甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲酰胺(90mg，0.3mmol)溶于5mL甲基异丁酮中，依次加入醋酸钯(3mg，0.015mmol)，BINAP(18mg，0.03mmol)，碳酸铯(146mg，0.45mmol)和4-(6-氨基-吡啶-3-基)-哌嗪-1-羧酸叔丁酯(91mg，0.33mmol)，氮气置换三次，反应混合物于110℃反应过夜。反应完毕降至室温，加入10mL水，用乙酸乙酯萃取，有机相用10mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，经硅胶柱分离得淡黄色油状物115mg，收率70％。ESI-MS:537[M++1]。
步骤9. 7-(环戊基-3,4-d2)-N,N-二甲基-2-((5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲酰胺(化合物30)的合成。
将化合物4-(6-((7-(环戊基-3,4-d2)-6-二甲酰胺-7-H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)-吡啶-3-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(115mg，0.2mmol)溶于5mL二氯甲烷中，加入2mL三氟乙酸，室温搅拌2小时，减压蒸除溶剂，加入10mL饱和碳酸钠溶液，搅拌10分钟，用二氯甲烷萃取，有机相用10mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，经硅胶柱分离得淡黄色固体85mg，收率90％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ9.40(s,1H),8.76(s,1H),8.18(d,J＝9.1Hz,1H),8.04(d,J＝3.0Hz,1H),7.48(dd,J＝9.1,3.0Hz,1H),6.60(s,1H),4.73(t,J＝8.6Hz,1H),3.27(m,4H),3.22–3.14(m,4H),3.05(s,6H),2.42(d,J＝9.6Hz,1H),1.98(d,J＝6.2Hz,4H),1.63(s,1H)；ESI-MS:437[M++1]。
实施例5制备7-环戊基-N,N-二甲基-2-((5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基-4-d)胺)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶 -6-甲酰胺-4-d(化合物42)
具体合成步骤如下：
步骤1.嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮-5,6-d2(化合物32)的合成。
向20mL微波管中加入尿嘧啶(2.24g，20mmol)，0.2g 10％钯碳和10mL重水，氢气鼓泡1分钟，密封放入微波反应仪。于130℃微波反应1.5小时，待降至室温后取出，加入20mL重水，升温至95℃，加热1小时后趁热过滤，滤液浓缩得到白色固体1.82，收率80％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ10.80(s,2H)；ESI-MS:115[M++1]。
步骤2. 5-溴嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮-6-d(化合物33)的合成。
将嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮-5,6-d2(1.82g，16mmol)加入到20mL重水中，搅拌下缓慢加入液溴(0.83mL，16mmol)，将反应混合物升温至100℃反应30分钟，缓慢冷却至室温，有大量固体析出，过滤，滤饼用热水洗涤，干燥得淡黄色固体2.75g，收率90％。ESI-MS:192[M++1]。
步骤3. 5-溴-2,4-二氯嘧啶-6-d(化合物34)的合成。
向5-溴嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮-6-d(2.75g，14.4mmol)中加入1mL N,N-二甲基苯胺，开启搅拌，冰浴下向反应混合物中缓慢滴加冷的三氯氧磷(7mL，72mmol)，滴加完毕升温至回流，反应2小时。冷却至室温，减压蒸除三氯氧磷，甲苯拖带3次，向浓缩残留物中缓慢加入冰水，用氨水调PH至中性，用乙酸乙酯萃取，有机相用10mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，经硅胶柱分离得淡黄色固体2.22g，收率68％。ESI-MS:228[M++1]。
步骤4. 5-溴-2-氯-N-环戊基嘧啶-6-d-4-胺(化合物35)的合成。
将5-溴-2,4-二氯嘧啶-6-d(2.22g，9.78mmol)溶于20mL无水乙醇，加入三乙胺(2.7mL，19.6mmol)，冰浴下缓慢滴加环戊胺(0.92g，10.8mmol)，滴加完毕于室温搅拌5小时，减压蒸除溶剂，残留物经硅胶柱分离得白色固体2.02g，收率75％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ7.37(d,J＝7.6Hz,1H),4.31(h,J＝7.3Hz,1H),1.97–1.84(m,2H),1.74–1.48(m,6H)；ESI-MS:277[M++1]。
步骤5. 2-氯-N-环戊基-5-(3,3-二乙氧基丙基-1-炔-1-基)嘧啶-6-d-4-胺(化合物36)的合成。
将5-溴-2-氯-N-环戊基嘧啶-6-d-4-胺(2.0g，7.3mmol)和丙炔醛二乙基二缩醛(1.1g，8.6mmol)，Pd(dppf)Cl2(510mg，0.73mmo)，CuI(140mg，0.73mmol)和5mL三乙胺加入到20mLDMF中，氮气置换三次，升温到100℃，反应过夜。反应完全后冷却至室温，加入40mL水，用乙酸乙酯萃取，有机相用20mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，经硅胶柱分离得淡黄色油状物1.01g，收率43％。ESI-MS:325[M++1]。
步骤6. 2-氯-7-环戊基-6-(二乙氧基甲基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-d(化合物37)的合成。
将2-氯-N-环戊基-5-(3,3-二乙氧基丙基-1-炔-1-基)嘧啶-6-d-4-胺(1.01g，3.1mmol)溶于10mL四氢呋喃，加入四丁基氟化铵(TBAF，2.4g，9.3mmol)，于65℃反应2小时。旋蒸蒸除溶剂， 加入20mL水，用乙酸乙酯萃取，有机相用20mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，经硅胶柱分离得淡黄色油状物830mg，收率82％。ESI-MS:325[M++1]。
步骤7. 2-氯-7-环戊基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-d-6-甲醛(化合物38)的合成。
将2-氯-7-环戊基-6-(二乙氧基甲基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-d(830mg，2.6mmol)溶于10mL二氧六环，缓慢滴加4mL浓盐酸，室温搅拌20分钟，加入15mL水，用乙酸乙酯萃取，有机相用10mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，经硅胶柱分离得淡黄色固体525mg，收率82％。ESI-MS:251[M++1]。
步骤8. 2-氯-7-环戊基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-d-6-羧酸(化合物39)的合成。
将2-氯-7-环戊基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-d-6-甲醛(525mg，2.1mmol)溶于5mLDMF中，加入过氧单磺酸钾(1.4g，2.3mmol)，室温反应6小时。反应结束后加入10mL水，有大量固体析出，过滤干燥得到淡黄色固体475mg，收率85％。ESI-MS:267[M++1]。
步骤9. 2-氯-7-环戊基-N,N-二甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-d-6-甲酰胺(化合物40)的合成。
将2-氯-7-环戊基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-d-6-羧酸(475mg，1.8mmol)，HBTU(680mg，1.8mmol)和DIEA(0.9mL，5.4mmol)溶于10mLDMF中，冰浴下滴加2M的二甲胺甲醇溶液(1.1mL，2.2mmol)，滴加完毕于室温下反应30分钟，加入20mL水,，用乙酸乙酯萃取，有机相用20mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，经硅胶柱分离得红色固体420mg，收率80％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ6.80(s,1H),4.80(p,J＝8.7Hz,1H),3.03(d,J＝12.9Hz,6H),2.29–2.16(m,2H),2.08–1.88(m,4H),1.64(dtd,J＝12.1,7.1,6.6,2.6Hz,2H)；ESI-MS:294[M++1]。
步骤10. 4-(6-((7-环戊基-6-二甲酰胺-7-H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基-4-d)氨基)-吡啶-3-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(化合物41)的合成。
将2-氯-7-环戊基-N,N-二甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-d-6-甲酰胺(90mg，0.3mmol)溶于5mL甲基异丁酮中，依次加入醋酸钯(3mg，0.015mmol)，BINAP(18mg，0.03mmol)，碳酸铯(146mg，0.45mmol)和4-(6-氨基-吡啶-3-基)-哌嗪-1-羧酸叔丁酯(91mg，0.33mmol)，氮气置换三次，反应混合物于110℃反应过夜。反应完毕降至室温，加入10mL水,，用乙酸乙酯萃取，有机相用10mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，经硅胶柱分离得淡黄色油状物115mg，收率70％.1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ9.36(s,1H),8.17(d,J＝9.1Hz,1H),8.01(d,J＝2.9Hz,1H),7.46(dd,J＝9.1,3.0Hz,1H),6.60(s,1H),4.72(q,J＝8.9Hz,1H),3.48(t,J＝5.0Hz,4H),3.09-3.05(d,J＝9.6Hz,10H),2.43(s,2H),1.98(s,4H),1.70–1.59(m,2H),1.42(s,9H)；ESI-MS:536[M++1]。
步骤11. 7-环戊基-N,N-二甲基-2-((5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基-4-d)胺)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲酰 胺-4-d(化合物42)的合成。
将化合物4-(6-((7-环戊基-6-二甲酰胺-7-H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基-4-d)氨基)-吡啶-3-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(115mg，0.2mmol)溶于5mL二氯甲烷中，加入2mL三氟乙酸，室温搅拌2小时，减压蒸除溶剂，加入10mL饱和碳酸钠溶液，搅拌10分钟，用二氯甲烷萃取，有机相用10mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，经硅胶柱分离得淡黄色固体85mg，收率90％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ9.39(s,1H),8.19(s,1H),8.03(s,1H),7.49(s,1H),6.60(s,1H),4.74(m,1H),3.23-3.28(m,4H),3.14-3.20(m,4H),3.05(s,6H),2.34-2.44(m,2H),1.98(d,4H),1.64(s,2H)；ESI-MS:436[M++1]。
生物活性测试。
(1)酶活性测定。
实验材料：
CDK2/cyclin A，CDK4/cyclin D1，CDK6/cyclin D1。ULight标记的多肽底物ULight-4E-BP1和ULight-MBP。铕标记的抗髓磷脂碱蛋白抗体和铕标记的兔源抗体，Envision多标记分析仪进行信号的检测。
实验方法：
将待检测的化合物进行三倍稀释，包括10个浓度梯度。CDK2/cyclin A测试化合物初始浓度为10uM，CDK4/cyclin D1和CDK6/cyclin D1测试化合物初始浓度为1uM。
CDK2/cyclin A的酶反应体系：
标准的Lance Ultra方法通过10微升的酶反应体系进行，包含0.5纳摩CDK2/cyclin A蛋白，100纳摩ULight-MBP多肽，和25微摩的ATP。分别将其溶解在酶缓冲液中，缓冲液的成分包括：PH7.5的羟乙基哌嗪乙硫磺酸溶液50mM，乙二胺四乙酸1毫摩，氯化镁10毫摩，0.01％Brij-35，二硫苏糖醇2毫摩。开始反应后，用顶部热封膜TopSeal-A将OptiPlate384孔板封好，室温孵育60分钟。
CDK4/cyclin D1的酶反应体系：
标准的Lance Ultra方法通过10微升的酶反应体系进行，包含1纳摩CDK4/cyclin D1蛋白，50纳摩ULight-4E-BP1多肽，和350微摩的ATP。分别将其溶解在酶缓冲液中，缓冲液的成分包括：PH7.5的羟乙基哌嗪乙硫磺酸溶液50mM，乙二胺四乙酸1毫摩，氯化镁10毫摩，0.01％Brij-35，二硫苏糖醇2毫摩。开始反应后，用顶部热封膜TopSeal-A将OptiPlate384孔板封好，室温孵育90分钟。
CDK6/cyclin D1的酶反应体系：
标准的Lance Ultra方法通过10微升的酶反应体系进行，包含0.8纳摩CDK6/cyclin D1蛋白，50纳摩ULight-4E-BP1多肽，和250微摩的ATP。分别将其溶解在酶缓冲液中，缓冲液的成分包括PH7.5的羟乙基哌嗪乙硫磺酸溶液50毫摩，乙二胺四乙酸1mM，氯化镁10毫摩，0.01％Brij-35，二硫苏糖醇2毫摩。开始反应后，用顶部热封膜TopSeal-A将OptiPlate384孔板封好，室温孵育180分钟。
准备酶反应终止缓冲液，用1倍稀释的检测缓冲液溶解EDTA，终止反应在室温进行5分钟。分别在CDK2/cyclin A、CDK4/cyclin D1和CDK6/cyclin D1反应中加入5微升检测混合液(分别用铕标记的抗髓磷脂碱蛋白抗体和铕标记的兔源抗体配置)。室温孵育60min，根据时间分辨荧光共振能量转移原理利用Envision仪器检测反应信号。
数据分析：
利用方程式(Max-Ratio)/(Max-Min)*100％将原始数据换算成抑制率，IC50的值即可通过四参数进行曲线拟合得出。
按照上述方法对实施例2-5及其没有氘代的化合物Ribociclib进行测试，激酶抑制作用如下表1所示。
表1：
如表1所示，本发明的化合物对CDK4/cyclin D1和CDK6/cyclin D1表现出优良的抑制活性，对CDK2/cyclin A表现出很低的抑制活性。特别是实施例4和5的化合物对CDK4/cyclin D1和CDK6/cyclin D1的抑制活性优于未氘代的化合物Ribociclib。
(2)细胞毒性测试
检测化合物对MCF-7和MDA-MB-436细胞活性的抑制效应。
试剂和耗材
1.细胞培养：RPMI-1640培养基、胎牛血清、抗生素(Penicillin-Streptomycin)
2.细胞系：MCF-7和MDA-MB-436
3.检测试剂：活细胞检测试剂盒CellTiter-Glo
4.其他主要耗材及试剂：化合物稀释板，中间板，检测板，DMSO
实验原理
ATP的含量直接反应了细胞的数量及细胞状态，通过对ATP进行定量测定来检测培养物中活细胞数目。活细胞检测试剂盒采用萤光素酶作检测物，试剂盒中使用UltraGlow萤光素酶生成的稳定辉光型信号，发光过程中萤光素酶需要ATP的参与，有代谢活性细胞的呼吸作用和其他生命活动过程可以产生ATP。向细胞培养基中加入CellTiter-GloTM试剂，测量发光值，光信号和体系中ATP量成正比，而ATP又和活细胞数正相关，从而可以检测出细胞的增殖情况。检测板使用PE公司的Envision进行分析。
实验方法
1.制备细胞板
将MCF-7和MDA-MB-436细胞分别种于384孔板中，MCF-7检测每孔包含200个细胞，MDA-MB-436检测每孔包含600个细胞。细胞板置于二氧化碳培养箱中过夜培养。
2.准备化合物
用ECHO进行3倍稀释，10个化合物浓度，设置双复孔实验。
3.化合物处理细胞
将化合物转移到细胞板中，化合物起始浓度为10uM。细胞板置于二氧化碳培养箱中培养6天。
4.检测
向细胞板中加入Promega CellTiter-Glo试剂，室温孵育10分钟使发光信号稳定。采用PerkinElmer Envision多标记分析仪读数。
按照上述方法对实施例2-5及其没有氘代的化合物Ribociclib进行测试，细胞毒性实验如下表2所示。
表2
编号 MCF-7 MDA-MB-436
Ribociclib 468.69 >10000
实施例2 530.42 >10000
实施例3 1315.43 >10000
实施例4 363.49 >10000
实施例5 456.22 >10000
如表1所示，本发明的化合物对MCF-7和MDA-MB-436细胞表现出优良的抑制活性。特别是实施例4和5的化合物对MCF-7和MDA-MB-436细胞的抑制活性优于未氘代的化合物Ribociclib。所以本发明化合物有希望作为治疗ER阳性、HER2阴性乳腺癌的药物。
(3)代谢稳定性评价。
微粒体实验：人肝微粒体：0.5mg/mL，Xenotech；大鼠肝微粒体：0.5mg/mL，Xenotech；辅酶(NADPH/NADH)：1mM，Sigma Life Science；氯化镁：5mM，100mM磷酸盐缓冲剂(pH为7.4)。
储备液的配制：精密称取一定量的化合物Ribociclib和实施例2-5粉末，并用DMSO分别溶解至5mM。
磷酸盐缓冲液(100mM，pH7.4)的配制：取预先配好的0.5M磷酸二氢钾150mL和700mL的0.5M磷酸氢二钾溶液混合，再用0.5M磷酸氢二钾溶液调节混合液pH值至7.4，使用前用超纯水稀释5倍，加入氯化镁，得到磷酸盐缓冲液(100mM)，其中含100mM磷酸钾，3.3mM氯化镁，pH为7.4。
配制NADPH再生***溶液(含有6.5mM NADP，16.5mM G-6-P，3U/mL G-6-P D，3.3mM氯化镁)，使用前置于湿冰上。
配制终止液：含有50ng/mL盐酸***和200ng/mL甲苯磺丁脲(内标)的乙腈溶液。取25057.5μL磷酸盐缓冲液(pH7.4)至50mL离心管中，分别加入812.5μL人肝微粒体，混匀，得到蛋白浓度为0.625mg/mL的肝微粒体稀释液。取25057.5μL磷酸盐缓冲液(pH7.4)至50mL离心管中，分别加入812.5μL SD大鼠肝微粒体，混匀，得到蛋白浓度为0.625mg/mL的肝微粒体稀释液。
样品的孵育：用含70％乙腈的水溶液将相应化合物的储备液分别稀释至0.25mM，作为工作液，备用。分别取398μL的人肝微粒体或者大鼠肝微粒体稀释液加入96孔孵育板中(N＝2)，分别加入2μL 0.25mM的的工作液中，混匀。
代谢稳定性的测定：在96孔深孔板的每孔中加入300μL预冷的终止液，并置于冰上，作为终止板。将96孔孵育板和NADPH再生***置于37℃水浴箱中，100转/分钟震荡，预孵5min。从孵育板每孔取出80μL孵育液加入终止板，混匀，补充20μL NADPH再生***溶液，作为0min样品。再向孵育板每孔加入80μL的NADPH再生***溶液，启动反应，开始计时。相应化合物的反应浓度为1μM，蛋白浓度为0.5mg/mL。分别于反应10、30、90min时，各取100μL反应液，加入终止板中，涡旋3min终止反应。将终止板于5000×g，4℃条件下离心10min。取100μL上清液至预先加入100μL蒸馏水的96孔板中，混匀，采用LC-MS/MS进行样品分析。
数据分析：通过LC-MS/MS***检测相应化合物及内标的峰面积，计算化合物与内标峰面积比值。通过化合物剩余量的百分率的自然对数与时间作图测得斜率，并根据以下公式计算t1/2和CLint，其中V/M即等于1/蛋白浓度。
对本发明化合物及其没有氘代的化合物同时测验比较，评价其在人和大鼠肝微粒体的代谢稳定性。作为代谢稳定性的指标的半衰期及肝固有清除率如表3所示。表3中采用未经氘代的化合物Ribociclib作为对照样品。如表1所示，通过与未经氘代的化合物Ribociclib对照，本发明化合物可以显著改善代谢稳定性。
表3
(4)大鼠中的药代动力学评价。
8只雄性Sprague-Dawley大鼠，7-8周龄，体重约210g，分成2组，每组4只，单次口服给予5mg/kg；(a)对照组：Ribociclib；(b)试验组：实施例化合物，比较其药代动力学差异。
大鼠采用标准饲料饲养，给予水。试验前16小时开始禁食。药物用PEG400和二甲亚砜溶解。眼眶采血，采血的时间点为给药后0.083小时，0.25小时、0.5小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时和24小时。
大鼠吸入***后短暂麻醉，眼眶采集300μL血样于试管。试管内有30μL1％肝素盐溶液。使用前，试管于60℃烘干过夜。在随后一个时间点血样采集完成之后，大鼠***麻醉后处死。
血样采集后，立即温和地颠倒试管至少5次，保证混合充分后放置于冰上。血样在4℃5000rpm离心5分钟，将血浆与红细胞分离。用移液器吸出100μL血浆到干净的塑料离心管中，标明化合物的名称和时间点。血浆在进行分析前保存在-80℃。用LC-MS/MS测定血浆中本发明化合物的浓度。药代动力学参数基于每只动物在不同时间点的血药浓度进计算。
实验结果表明，相对于对照化合物，本发明化合物在动物体内具有更好的药物动力学，因而具有更好的药效学和治疗效果。
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则份数和百分比为重量份和重量百分比。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (10)

  1. 一种取代的吡咯并嘧啶化合物，其特征在于：如式(I)所示的吡咯并嘧啶化合物，或其晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化合物，
    式中：
    R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22、R23、R24、R25、R26、R27相互独立地选自由“氢(H)、氘(D)”组成的组；
    及其生理学上可接受的盐、前药、水合物、溶剂化物、互变异构体和立体异构体，包括这些化合物以所有比例形成的混合物；
    附加条件是，所述吡咯并嘧啶化合物至少含有一个氘原子。
  2. 根据权利要求1所述的吡咯并嘧啶化合物，其特征在于：R1、R2、R3、R4、R5、R7和R8各自独立地为氘或氢。
  3. 根据权利要求1所述的吡咯并嘧啶化合物，其特征在于：R9、R10和R11各自独立地为氘或氢。
  4. 根据权利要求1所述的吡咯并嘧啶化合物，其特征在于：R12和R13各自独立地为氘或氢。
  5. 根据权利要求1所述的吡咯并嘧啶化合物，其特征在于：R14、R15、R16、R17、R18、R19、R20和R21各自独立地为氘或氢。
  6. 根据权利要求1所述的吡咯并嘧啶化合物，其特征在于：R22、R23、R24、R25、R26和R27各自独立地为氘或氢。
  7. 根据权利要求1所述的吡咯并嘧啶化合物，其特征在于：所述化合物选自下组化合物或其药学上可接受的盐，但不局限于下列化合物：
  8. 一种药物组合物，其特征在于：其含有药学上可接受的载体和如权利要求1～6任意一项所述的取代的吡咯并嘧啶化合物，或其晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物、立体异构体、前药或同位素变体的药物组合物作为有效成分，并含有常规药用载体。
  9. 一种如权利要求1～7任意一项所述的吡咯并嘧啶化合物的用途，其特征在于：用于制备预防或治疗癌症的药物中的用途。
  10. 根据权利要求8的用途，其中所述的癌症选自乳腺癌、胰腺癌、结直肠癌、肺癌和黑素瘤、肉瘤、白血病、神经胶质瘤、家族性黑素瘤和黑素瘤、套细胞淋巴瘤和非小细胞肺癌。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113636973A (zh) * 2021-09-07 2021-11-12 山东铂源药业有限公司 一种4-(6-氨基吡啶-3-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯的工业化制备方法
CN114573591A (zh) * 2022-04-16 2022-06-03 成都施贝康生物医药科技有限公司 一种取代的吡咯并嘧啶化合物及其应用

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111100128B (zh) * 2018-10-26 2022-09-06 广安凯特制药有限公司 一种瑞博西尼中间产品的合成方法及其中间体化合物
CN111995569B (zh) * 2019-05-27 2023-12-05 成都博腾药业有限公司 一种细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂中间体的制备方法
CN114957248B (zh) * 2022-05-09 2023-12-29 南开大学 一种吡咯并嘧啶化合物及其制备方法、药物组合物和应用
CN117069663B (zh) * 2023-08-31 2023-12-26 四川维亚本苑生物科技有限公司 一种瑞博西尼中间体v的合成方法及瑞博西尼的合成方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102186856A (zh) * 2008-08-22 2011-09-14 诺瓦提斯公司 作为cdk抑制剂的吡咯并嘧啶化合物
CN103003280A (zh) * 2010-02-19 2013-03-27 诺瓦提斯公司 作为cdk4/6抑制剂的氘化吡咯并嘧啶化合物
WO2015181737A1 (en) * 2014-05-28 2015-12-03 Piramal Enterprises Limited Pharmaceutical combination for the treatment of cancer

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102186856A (zh) * 2008-08-22 2011-09-14 诺瓦提斯公司 作为cdk抑制剂的吡咯并嘧啶化合物
CN103003280A (zh) * 2010-02-19 2013-03-27 诺瓦提斯公司 作为cdk4/6抑制剂的氘化吡咯并嘧啶化合物
WO2015181737A1 (en) * 2014-05-28 2015-12-03 Piramal Enterprises Limited Pharmaceutical combination for the treatment of cancer

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NEELIMA VIDULA ET AL.: "Cyclin-Dependent Kinase 4/6 Inhibitors for the Treatment of Breast Cancer: A Review of Preclinical and Clinical Data", 《CLINICAL BREAST CANCER》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113636973A (zh) * 2021-09-07 2021-11-12 山东铂源药业有限公司 一种4-(6-氨基吡啶-3-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯的工业化制备方法
CN114573591A (zh) * 2022-04-16 2022-06-03 成都施贝康生物医药科技有限公司 一种取代的吡咯并嘧啶化合物及其应用
CN114573591B (zh) * 2022-04-16 2023-04-25 成都施贝康生物医药科技有限公司 一种取代的吡咯并嘧啶化合物及其应用

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