CN113994205A - 使用金属螯合剂作为流动相添加剂改善基于rplc的肽图分析色谱性能 - Google Patents

使用金属螯合剂作为流动相添加剂改善基于rplc的肽图分析色谱性能 Download PDF

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Abstract

本技术涉及一种分析包含分析物的样品的方法。该方法包括将包含该分析物的该样品进样到流动相中。该流动相包含浓度在约1ppm至约10ppm之间的金属螯合剂添加剂。该方法还包括使用液相色谱分离该分析物，并使用质谱仪、紫外检测器或它们的组合分析该分析物。

Description

使用金属螯合剂作为流动相添加剂改善基于RPLC的肽图分析 色谱性能
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年6月7日提交的名称为“RPLC-BASED PEPTIDE MAPPINGCHROMATOGRAPHIC PERFORMANCE USING METAL CHELATORS AS MOBILE PHASE ADDITIVES”的美国临时专利申请号62/858,380的优先权和权益，该专利申请的全部内容据此以引用方式并入。本申请还要求于2019年8月6日提交的名称为“RPLC-BASED PEPTIDE MAPPINGCHROMATOGRAPHIC PERFORMANCE USING METAL CHELATORS AS MOBILE PHASE ADDITIVES”的美国临时专利申请号62/883,182的优先权和权益，该专利申请的全部内容据此以引用方式并入。
技术领域
本公开涉及使用金属螯合剂作为流动相添加剂来改善基于反相液相色谱(RPLC)的肽图分析的色谱性能。更具体地，本公开涉及一种分析包含完整蛋白质或脂肪酸的样品以进行肽图分析的方法，该方法包括使用浓度在约1ppm至约10ppm之间的柠檬酸作为流动相添加剂。
背景技术
蛋白质修饰的肽水平分析是在治疗性蛋白质的整个生命周期中定期进行的主要分析方法之一。已经证明它是阐明基于蛋白质的治疗剂的发现和/或表征阶段期间的结构信息以及在作为过程开发的一部分的控制策略的开发中评估产物和/或过程相关杂质的非常有价值的工具。作为监测工具，肽图分析在制造环境中被定期部署为身份测定以及批量释放测定以确保药物产品安全。最近，肽图分析已被部署为多属性监测(MAM)技术，以通过同时有效和直接地监测多个潜在的关键质量属性(pCQA)来提高生产率和数据质量。
肽图分析工作流程依赖于将完整蛋白质还原为其二级结构、氨基酸直链，其中将其酶促处理以在特定氨基酸残基处裂解氨基酸链以产生肽混合物。单独的肽物理化学性质(例如pKa、疏水性等)由其组成氨基酸的累积特性决定。如图1A-图1D所示，氨基酸可表现出带电基团、极性基团、中性基团(疏水的)以及独特的基团。在消化后，基于蛋白质的治疗剂的肽水平分析通常在LC-UV或LC-UV/MS平台上使用反相液相色谱(RPLC)进行。
发明内容
在RPLC中通常使用流动相添加剂诸如甲酸(FA)和三氟乙酸(TFA)以改善分析物保留性和峰形状。然而，FA和TFA在肽图分析工作流程中不一定作为离子配对试剂彼此互补。当FA在基于MS的测定中产生与TFA相比有利的质谱强度时，作为弱离子配对试剂，FA在基于UV的测定中具有与TFA相比增加的基线噪声和更宽的峰。此外，LC***中的痕量金属污染在过去已被记录为影响表现出特定电荷部分诸如磷酸化基团的化合物的回收和分离性能。痕量金属污染与寡核苷酸分析中增加的质谱加合物有关，这可能对色谱分离产生负面影响。
本技术通过使用金属螯合剂作为流动相添加剂，特别是柠檬酸作为流动相添加剂，解决了现有技术的问题。使用柠檬酸作为流动相添加剂提高了色谱性能(例如，更好的峰分辨率)并且色谱性能在延长的时间段内(例如，在2天-3天内或64次-100次连续进样)保持。使用柠檬酸来增强LC/MS***的性能以用于磷酸肽分析的先前尝试没有改变流动相(溶剂)组成以避免干扰色谱性能(Winter等人，“Citrate Boosts the Performance ofPhosphopeptide Analysis by UPLC-ESI-MS/MS”,J.of Proteome Research,2009,8,418-424)。然而，本技术通过将柠檬酸作为添加剂添加到流动相中来改变流动相，其在本文中显示增强肽和脂肪酸的色谱性能。
在一个方面，本技术涉及一种分析包含分析物的样品的方法。该方法包括将包含分析物的样品进样到包含浓度在约1ppm至约10ppm之间的金属螯合剂添加剂的流动相中。该方法还包括使用液相色谱分离该分析物，并使用质谱仪、紫外检测器或它们的组合分析该分析物。该方法可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
在一些实施方案中，金属螯合剂添加剂选自由以下项组成的组：柠檬酸、柠檬酸钠、异柠檬酸盐、柠檬酸二铵和柠檬酸三铵。金属螯合剂添加剂可为柠檬酸。在一些实施方案中，流动相中柠檬酸的浓度为约1ppm至约10ppm。在一些实施方案中，流动相中柠檬酸的浓度为约10ppm。在一些实施方案中，流动相中柠檬酸的浓度为约1ppm。
在另一方面，本技术涉及一种分析包含完整蛋白质的样品以进行肽图分析的方法。该方法包括将样品中的完整蛋白质还原为氨基酸直链。该方法还包括酶促处理该氨基酸直链以产生肽混合物。将包含肽混合物的样品进样到包含柠檬酸的流动相中。使用反相液相色谱分离该肽混合物。使用质谱仪、紫外检测器、荧光检测器或它们的组合分析分离的肽。该方法可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
在一些实施方案中，肽混合物中的至少一种肽包含带电氨基酸残基。肽混合物中的至少一种肽可具有净电荷。在一些实施方案中，净电荷为负的。在一些实施方案中，净电荷为正的。肽的净电荷是指特定pH下的电荷总和。从图1A-图1D可以看出，侧链具有不同的pKa，因此根据流动相的pH，氨基酸可具有正电荷或负电荷。净电荷合计电荷状态，例如，5个正电荷和6个负电荷将具有净“负电荷”。
蛋白质可为单克隆抗体(mAb)。在一些实施方案中，蛋白质为合成蛋白质或重组蛋白质。
在一些实施方案中，氨基酸为天冬氨酸、谷氨酸或异天冬氨酸。肽混合物可包括PENNYK肽和PENNYK肽的脱酰胺形式。氨基酸可用胰蛋白酶、Lys-C、Asp-N或它们的组合进行酶促处理。
在一些实施方案中，色谱性能在约2天至约3天的时段内保持，其中平均USP拖尾值为约0.95至约1.30。在一些实施方案中，色谱性能在约48次连续进样内保持，其中平均USP拖尾值为约0.95至约1.30。在一些实施方案中，USP拖尾值在约0.98至约1.20、或约1.00至约1.10之间。在一些实施方案中，USP拖尾值为约1.00。
在一些实施方案中，肽混合物包含肽和肽的脱酰胺物质。
流动相中柠檬酸的浓度可为约1ppm至约10ppm。流动相中柠檬酸的浓度可为约1ppm。在一些实施方案中，流动相中柠檬酸的浓度为约10ppm。
流动相还可包括甲酸、乙酸、水、乙腈、甲醇、异丙醇、正丙醇、三氟乙酸、二氟乙酸或它们的组合。
在一些实施方案中，该方法还包括在分离肽混合物之前用柠檬酸钝化反相色谱柱。
在另一方面，本技术涉及一种分析包含脂肪酸的样品的方法。该方法包括将包含脂肪酸的样品进样到包含柠檬酸的流动相中。该方法还包括使用反相液相色谱分离脂肪酸。使用质谱仪、紫外检测器或它们的组合分离分离的脂肪酸。该方法可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
在一些实施方案中，脂肪酸包括月桂酸。流动相中柠檬酸的浓度可为约1ppm至约10ppm。
在另一方面，本技术涉及一种用于分析样品的套件。该套件包括液相色谱柱、包含柠檬酸流动相添加剂的小瓶和在用于分析包含分析物的样品的方法中使用柠檬酸流动相添加剂的说明书。该方法包括将柠檬酸流动相添加剂添加到流动相中，将包含分析物的样品进样到包含柠檬酸的流动相中，使用液相色谱分离分析物，以及使用质谱仪、紫外检测器或它们的组合分析分离的分析物。套件可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
在一些实施方案中，液相色谱柱为反相液相色谱柱。柠檬酸流动相添加剂可以约1ppm至约10ppm的浓度添加到流动相中。分析物可为脂肪酸。在一些实施方案中，分析物为完整蛋白质。在一些实施方案中，柠檬酸的浓度为约1ppm。在一些实施方案中，柠檬酸的浓度为约10ppm。
在一些实施方案中，该方法还包括将完整蛋白质还原为氨基酸直链，并酶促处理该氨基酸直链以产生肽混合物。
在另一方面，本技术涉及一种用于分析样品的套件。该套件包括液相色谱柱、包含金属螯合剂流动相添加剂的小瓶和在用于分析包含分析物的样品的方法中使用柠檬酸流动相添加剂的说明书。该方法包括将金属螯合剂流动相添加剂添加到流动相中以获得浓度在约1ppm至约10ppm之间的金属螯合剂流动相添加剂，将包含分析物的样品进样到包含金属螯合剂的流动相中，使用液相色谱分离分析物，以及使用质谱仪、紫外检测器、荧光检测器或它们的组合分析分离的分析物。套件可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
在一些实施方案中，金属螯合剂流动相添加剂选自由以下项组成的组：柠檬酸、柠檬酸钠、异柠檬酸盐、柠檬酸二铵、柠檬酸三铵和甲酸铵。
附图说明
通过以下结合附图所作的详细描述，将更充分地理解本技术，在附图中：
图1A显示肽的物理化学性质(例如pKa、疏水性等)由其组成氨基酸的累积特性决定。图1A示出了具有带电侧链的氨基酸。
图1B显示肽的物理化学性质(例如pKa、疏水性等)由其组成氨基酸的累积特性决定。图1B示出了具有极性不带电侧链的氨基酸。
图1C显示肽的物理化学性质(例如pKa、疏水性等)由其组成氨基酸的累积特性决定。图1C示出了特殊情况的氨基酸。
图1D显示肽的物理化学性质(例如pKa、疏水性等)由其组成氨基酸的累积特性决定。图1D示出了具有疏水侧链的氨基酸。
图2A是根据本技术的说明性实施方案的NIST mAb RM的胰蛋白酶消化物的代表性总离子色谱图(TIC)。图2A是肽图谱的示例，其示出了来自胰蛋白酶消化物的经由MS电离和检测的所有肽。
图2B是根据本技术的说明性实施方案的PENNYK肽的代表性提取离子色谱(XIC)。
图2C是根据本技术的说明性实施方案的PENNYK肽的代表性单离子记录(SIR)色谱图，其示出了PENNYK肽天然和脱酰胺形式在甲酸条件下使用适度梯度作为关键对紧密洗脱(参见图2D)。
图2D列出了根据本技术的说明性实施方案的用于图2A、图2B和图2C的代表性色谱图的梯度和其他色谱条件。
图3是描绘根据本技术的说明性实施方案的用于计算品质因数的变量的图。
图4A是根据本技术的说明性实施方案的色谱图，其示出了直接在结合30％磷酸溶液的清洁程序之后进行PENNYK肽的基于RPLC/MS的分离的***的基线性能。
图4B是根据本技术的说明性实施方案的色谱图，其示出了在结合30％磷酸溶液的清洁程序之后12小时进行PENNYK肽的基于RPLC/MS的分离的***的基线性能。
图4C是根据本技术的说明性实施方案的色谱图，其示出了在结合30％磷酸溶液的清洁程序之后24小时进行PENNYK肽的基于RPLC/MS的分离的***的基线性能。
图5A是根据本技术的说明性实施方案的色谱图，其示出了在初始进样时使用用浓度为0.001％的金属螯合剂柠檬酸制备的流动相进行分离。
图5B是根据本技术的说明性实施方案的色谱图，其示出了在32小时的第24次进样时使用用浓度为0.001％的金属螯合剂柠檬酸制备的流动相进行分离。
图5C是根据本技术的说明性实施方案的色谱图，其示出了在64小时的第48次进样时使用用浓度为0.001％的金属螯合剂柠檬酸制备的流动相进行分离。
图5D是示出根据本技术的说明性实施方案的USP拖尾值的图。
图6A是根据本技术的说明性实施方案的具有标识为含有阴离子残基的感兴趣肽的“PENNYK”肽的胰蛋白酶消化的NIST mAb的基于RPLC/MS的分离的色谱图。
图6B是用于使用由H2O:MeCN(0.1％FA v/v)组成的流动相在72小时内以W0.05监测PENNYK肽和相关杂质的USP拖尾因子的单离子记录(SIR)。根据本技术的说明性实施方案，SIR叠加是时间对齐的以便于比较。
图7是示出根据本技术的说明性实施方案以7.5小时的间隔绘制以监测在使用由H2O:MeCN(0.1％FA v/v)组成的流动相的色谱性能的劣化速率的在W0.05及以下的拖尾因子的图。当峰宽接近基线时，观察到拖尾因子具有类指数行为。
图8A是示出根据本技术的说明性实施方案的没有向流动相中添加螯合剂的情况下随时间推移3次进样的PENNYK肽SIR叠加的色谱图。拖尾因子和相对峰面积计算报告在表中。SIR叠加是时间对齐的，以便于比较。
图8B是示出根据本技术的说明性实施方案的向流动相中添加1ppm柠檬酸的情况下随时间推移3次进样的PENNYK肽SIR叠加的色谱图。拖尾因子和相对峰面积计算报告在表中。SIR叠加是时间对齐的，以便于比较。
图8C是示出根据本技术的说明性实施方案的向流动相中添加5μM(0.9ppm)亚甲基二膦酸的情况下随时间推移3次进样的PENNYK肽SIR叠加的色谱图。拖尾因子和相对峰面积计算报告在表中。SIR叠加是时间对齐的，以便于比较。
图9A是示出根据本技术的说明性实施方案的没有向流动相中添加螯合剂的情况下在PENNYK肽(T37)区域内洗脱的主要肽物质的提取离子色谱图(XIC)。初始条件下的对应基线质谱用于评估质谱污染物并在插图中示出。
图9B是示出根据本技术的说明性实施方案的向流动相中添加1ppm柠檬酸的情况下在PENNYK肽(T37)区域内洗脱的主要肽物质的提取离子色谱图(XIC)。初始条件下的对应基线质谱用于评估质谱污染物并在插图中示出。
图9C是示出根据本技术的说明性实施方案的向流动相中添加5μM(0.9ppm)亚甲基二膦酸的情况下在PENNYK肽(T37)区域内洗脱的主要肽物质的提取离子色谱图(XIC)。初始条件下的对应基线质谱用于评估质谱污染物并在插图中示出。
图9D是示出根据本技术的说明性实施方案的针对不含螯合剂的色谱图归一化的柠檬酸和亚甲基二膦酸的MS响应并绘制为％强度变化的图。星号指示在XIC中没有检测到针对亚甲基二膦酸的峰。
图10是示出根据本技术的说明性实施方案的在RPLC/MS条件下使用降低的质量负荷评估柱负荷对拖尾的影响的色谱图。W0.01处的拖尾因子计算为1.05，并且与高斯拟合吻合良好，指示由于柱负荷效应引起的拖尾存在最小。
图11A是示出根据本技术的说明性实施方案的T37(HC)GFYPSDIAVEWESNGQPENNYK对于1ppm螯合剂在60℃处的实验(1110)和高斯拟合(1115)的色谱图。对于肽段T37(图11A-C)和T14(图11D-F)，在流动相中存在和不存在螯合剂(柠檬酸)的情况下，在60℃和40℃处评估温度对拖尾的影响。对于两种肽，在存在螯合剂的情况下，拖尾因子在较低温度下几乎保持不变，拖尾仅增加5％。在不存在螯合剂的情况下，与拖尾增加1.10倍的T37相比，T14表现出2.35倍的拖尾增加。星号表示从绘制数据中外推的Tf值。
图11B是示出根据本技术的说明性实施方案的T37(HC)GFYPSDIAVEWESNGQPENNYK对于1ppm螯合剂在40℃处的实验(1120)和高斯拟合(1125)的色谱图。
图11C是示出根据本技术的说明性实施方案的T37(HC)GFYPSDIAVEWESNGQPENNYK对于无螯合剂在40℃处的实验(1130)和高斯拟合(1135)的色谱图。
图11D是示出根据本技术的说明性实施方案的T14(LC)VDNALQSGNSQESVTEQDSK对于1ppm螯合剂在60℃处的实验(1140)和高斯拟合(1145)的色谱图。
图11E是示出根据本技术的说明性实施方案的T14(LC)VDNALQSGNSQESVTEQDSK对于1ppm螯合剂在40℃处的实验(1150)和高斯拟合(1155)的色谱图。
图11F是示出根据本技术的说明性实施方案的T14(LC)VDNALQSGNSQESVTEQDSK对于无螯合剂在40℃处的实验(1160)和高斯拟合(1165)的色谱图。
图12是示出根据本技术的说明性实施方案的使用H2O:NeCN(0.1％FA v/v)在有和没有螯合剂(柠檬酸)作为流动相添加剂的67小时时段内监测PENNYK肽在W0.01处的拖尾因子的图。在存在螯合剂的情况下色谱性能稳定，平均拖尾因子为0.96％(％RSD＝0.43％)。
图13A是不存在螯合剂的情况下NIST mAb RM的胰蛋白酶消化物的肽图谱。使用与关于图2概述的方法相同的方法。
图13B是根据本技术的说明性实施方案的在存在螯合剂的情况下NIST mAb RM的胰蛋白酶消化物的肽图谱。使用与关于图2概述的方法相同的方法。
图14示出了根据本技术的说明性实施方案的向流动相中添加螯合剂改善月桂酸(聚山梨醇酯20(PS-20)的主要脂肪酸组分)的回收率以获得线性MS响应的图。
图15示出了根据本技术的说明性实施方案在测试如图16-图21中所示的几种不同流动相添加剂中使用的***条件。
图16A是根据本技术的说明性实施方案的在具有1ppm柠檬酸流动相添加剂的情况下PENNYK肽的色谱图和脱酰胺物质(插图)。
图16B是根据本技术的说明性实施方案的在具有1ppm柠檬酸钠流动相添加剂的情况下PENNYK肽的色谱图和脱酰胺物质(插图)。
图16C是根据本技术的说明性实施方案的在具有1ppm柠檬酸流动相添加剂的情况下PENNYK肽的组合QDa MS扫描(顶部质谱)和图16A和图16B中所示的基线色谱图的组合质谱(图16C的底部质谱)。
图16D是根据本技术的说明性实施方案的在具有1ppm柠檬酸钠流动相添加剂的情况下PENNYK肽的组合QDa MS扫描(顶部质谱)和图16A和图16B中所示的基线色谱图的组合质谱(图16D的底部质谱)。
图17A是根据本技术的说明性实施方案的在具有1ppm柠檬酸流动相添加剂的情况下PENNYK肽的色谱图和脱酰胺物质(插图)。
图17B是根据本技术的说明性实施方案的在具有1ppm异柠檬酸盐流动相添加剂的情况下PENNYK肽的色谱图和脱酰胺物质(插图)。
图17C是根据本技术的说明性实施方案的在具有1ppm柠檬酸流动相添加剂的PENNYK肽的组合QDa MS扫描(顶部质谱)和基线色谱图的组合质谱(底部质谱)。尽管在图17A和图17B中没有注意到基线质谱，但是对于基线使用关于图16A和图16B所使用的相同的时间区域。
图17D是根据本技术的说明性实施方案的在具有1ppm异柠檬酸盐流动相添加剂的PENNYK肽的组合QDa MS扫描(顶部质谱)和基线色谱图的组合质谱(底部质谱)。尽管在图17A和图17B中没有注意到基线质谱，但是对于基线使用关于图16A和图16B所使用的相同的时间区域。
图18A是根据本技术的说明性实施方案的在具有1ppm柠檬酸流动相添加剂的情况下PENNYK肽的色谱图和脱酰胺物质(插图)。
图18B是根据本技术的说明性实施方案的在具有1ppm柠檬酸二铵流动相添加剂的情况下PENNYK肽的色谱图和脱酰胺物质(插图)。
图18C是根据本技术的说明性实施方案的在具有1ppm柠檬酸流动相添加剂的PENNYK肽的组合QDa MS扫描(顶部质谱)和基线色谱图的组合质谱(底部质谱)。尽管在图18A和图18B中没有注意到基线质谱，但是对于基线使用关于图16A和图16B所使用的相同的时间区域。
图18D是根据本技术的说明性实施方案的在具有1ppm柠檬酸二铵流动相添加剂的PENNYK肽的组合QDa MS扫描(顶部质谱)和基线色谱图的组合质谱(底部质谱)。尽管在图18A和图18B中没有注意到基线质谱，但是对于基线使用关于图16A和图16B所使用的相同的时间区域。
图19A是根据本技术的说明性实施方案的在具有1ppm柠檬酸流动相添加剂的情况下PENNYK肽的色谱图和脱酰胺物质(插图)。
图19B是根据本技术的说明性实施方案的在具有1ppm柠檬酸三铵流动相添加剂的情况下PENNYK肽的色谱图和脱酰胺物质(插图)。
图19C是根据本技术的说明性实施方案的在具有1ppm柠檬酸流动相添加剂的PENNYK肽的组合QDa MS扫描(顶部质谱)和基线色谱图的组合质谱(底部质谱)。尽管在图19A和图19B中没有注意到基线质谱，但是对于基线使用关于图16A和图16B所使用的相同的时间区域。
图19D是根据本技术的说明性实施方案的在具有1ppm柠檬酸三铵流动相添加剂的PENNYK肽的组合QDa MS扫描(顶部质谱)和基线色谱图的组合质谱(底部质谱)。尽管在图19A和图19B中没有注意到基线质谱，但是对于基线使用关于图16A和图16B所使用的相同的时间区域。
图20A是根据本技术的说明性实施方案的在具有1ppm柠檬酸流动相添加剂的情况下PENNYK肽的色谱图和脱酰胺物质(插图)。
图20B是根据本技术的说明性实施方案的在具有1ppm亚甲基二膦酸流动相添加剂的情况下PENNYK肽的色谱图和脱酰胺物质(插图)。
图20C是根据本技术的说明性实施方案的在具有1ppm柠檬酸流动相添加剂的PENNYK肽的组合QDa MS扫描(顶部质谱)和基线色谱图的组合质谱(底部质谱)。尽管在图20A和图20B中没有注意到基线质谱，但是对于基线使用关于图16A和图16B所使用的相同的时间区域。
图20D是根据本技术的说明性实施方案的在具有1ppm亚甲基二膦酸流动相添加剂的PENNYK肽的组合QDa MS扫描(顶部质谱)和基线色谱图的组合质谱(底部质谱)。尽管在图20A和图20B中没有注意到基线质谱，但是对于基线使用关于图16A和图16B所使用的相同的时间区域。
图21A是根据本技术的说明性实施方案的在具有1ppm柠檬酸流动相添加剂的情况下PENNYK肽的色谱图和脱酰胺物质(插图)。
图21B是根据本技术的说明性实施方案的在具有5μM Agilient InfinityLab流动相添加剂的情况下PENNYK肽的色谱图和脱酰胺物质(插图)。
图21C是根据本技术的说明性实施方案的在具有1ppm柠檬酸流动相添加剂的PENNYK肽的组合QDa MS扫描(顶部质谱)和基线色谱图的组合质谱(底部质谱)。尽管在图21A和图21B中没有注意到基线质谱，但是对于基线使用关于图16A和图16B所使用的相同的时间区域。
图21D是根据本技术的说明性实施方案的在具有5μM Agilient InfinityLab流动相添加剂的PENNYK肽的组合QDa MS扫描(顶部质谱)和基线色谱图的组合质谱(底部质谱)。尽管在图21A和图21B中没有注意到基线质谱，但是对于基线使用关于图16A和图16B所使用的相同的时间区域。
具体实施方式
在RPLC中通常使用流动相添加剂诸如甲酸(FA)和三氟乙酸(TFA)以改善分析物保留性和峰形状。然而，FA和TFA在肽图分析工作流程中不一定作为离子配对试剂彼此互补。当FA在基于MS的测定中产生与TFA相比有利的质谱强度时，作为弱离子配对试剂，FA在基于UV的测定中具有与TFA相比增加的基线噪声和更宽的峰。除电离效率之外，所选的离子配对试剂对保留性、分离效率和色谱分辨率具有相当大的影响，这可不同程度地影响峰形和宽度。混淆离子配对试剂选择的影响的是存在蛋白质和/或肽与分析流动路径的润湿表面的非特异性相互作用，这可影响色谱性能。
LC***中的痕量金属污染在过去已被记录为影响表现出特定电荷部分诸如磷酸化基团的化合物的回收和分离性能。最近，痕量金属污染已与寡核苷酸分析中的增加的质谱加合物有关。考虑到这一证据，有理由认为具有带电部分的肽也可与痕量金属相互作用，这可不利地影响色谱性能。
痕量金属污染源已被识别为含有杂质的流动相、金属表面诸如仪器管以及甚至含有金属的柱硬件诸如玻璃料和柱的壳体本身。在这些情况下，金属杂质诸如铁可从金属表面浸出或解吸并将其自身沿流动路径嵌入玻璃料、过滤器以及甚至固定相，在固定相上它们可与所研究的目标分析物发生负面相互作用。这在开发肽图分析工作流程时提出了挑战，其中杂质的色谱分辨率需要可以稳健方式递送一致且准确的测量的方法，然而整个流动路径处于可阻碍分析的痕量金属污染的风险中。
将诸如EDTA或CDTA的金属螯合剂应用于“清洁”LC***是一种使痕量金属污染最小化的方法。然而，这些***洗涤往往是长时间和冗长的，导致显著的仪器停机时间。用惰性材料诸如PEEK或低铁含量金属合金工程化LC***是另一种方法，然而，工艺复杂性和材料可用性可增加此类***的成本和延迟部署。减轻金属污染的另选方法是将痕量金属螯合剂直接添加到流动相中，以充当金属清除剂来溶解和最小化润湿表面的污染，以及充当任何含有不溶性污染物的表面的保护基团。尽管文献已显示此类添加剂对小的磷酸化化合物在回收和一定程度的色谱性能方面的影响，但是关于生物分子诸如肽的潜在应用，即使有也是很少的证据。当前技术的目的是证明将金属螯合剂添加到流动相中作为添加剂以改善基于RPLC的肽分离的色谱性能的适用性。
该技术包括分析包含分析物的样品的方法。该技术包括将样品进样到包含浓度在约1ppm至约10ppm之间的金属螯合剂添加剂的流动相中。浓度可为例如1ppm、2ppm、3ppm、4ppm、5ppm、6ppm、7ppm、8ppm、9ppm或10ppm。这些值可用于形成例如在约1ppm至约10ppm或约2ppm至约5ppm之间的范围。使用液相色谱(LC)从样品中分离分析物。使用质谱仪、紫外(UV)检测器或它们的组合分析分离的分析物。金属螯合剂可以是浓度为约1ppm至约10ppm的柠檬酸。柠檬酸的浓度可为例如1ppm、2ppm、3ppm、4ppm、5ppm、6ppm、7ppm、8ppm、9ppm或10ppm。这些值可用于形成例如在约1ppm至约10ppm或约2ppm至约5ppm之间的范围。金属螯合剂也可以是柠檬酸钠、异柠檬酸盐、柠檬酸二铵、柠檬酸三铵或它们的组合。
如本文所用，术语“约”意指该数值是近似的，并且较小的变化不会显著影响所公开的实施方案的实践。在使用数值限制的情况下，除非上下文另外指明，否则“约”意指该数值可改变±10％并且仍然在所公开的实施方案的范围内。
该技术还包括一种分析包含完整蛋白质的样品以进行肽图分析的方法。该方法包括将样品中的完整蛋白质还原为氨基酸直链。该方法还包括酶促处理该氨基酸直链以产生肽混合物。将包含肽混合物的样品进样到包含柠檬酸的流动相中。使用RPLC分离肽混合物。使用质谱仪、紫外检测器、荧光检测器或它们的组合分析单独的肽。在一些实施方案中，除柠檬酸之外或代替柠檬酸，使用柠檬酸钠、异柠檬酸盐、柠檬酸二铵或柠檬酸三铵。
肽混合物中的至少一种肽包括带电氨基酸残基或具有净电荷。净电荷可为负的。净电荷可为正的。表1示出了不同pH值下的PENNYK肽电荷。甲酸pH为约3.0，因此净电荷略为正。不受理论的约束，与金属离子的相互作用最有可能发生在肽链上的负电荷之间。蛋白质可为合成的或重组的。蛋白质可为单克隆抗体(mAb)。氨基酸可为天冬氨酸、谷氨酸或异天冬氨酸。肽混合物可包括肽和肽的脱酰胺物质。例如，肽混合物可包括PENNYK肽和PENNYK肽的脱酰胺形式(如下文详细讨论的)。氨基酸可用胰蛋白酶、Lys-C、Asp-N或它们的组合进行酶促处理。氨基酸可用本领域技术人员已知的其他酶进行酶促处理。
表1：不同pH值下的PENNYK肽电荷
pH 电荷
1.00 2.0
1.50 2.0
2.00 1.9
2.50 1.7
3.00 1.4
3.50 0.8
4.00 -0.0
4.50 -1.2
5.00 -2.2
5.50 -2.7
6.00 -2.9
6.50 -3.0
7.00 -3.1
7.50 -3.2
8.00 -3.5
8.50 -3.9
9.00 -4.2
9.50 -4.7
10.00 -5.5
USP拖尾值可为约0.95至约1.30，并且可在约两天至约三天的时段内保持。USP拖尾值可在约1天、2天、3天、4天或5天内保持。USP拖尾值可在约48次连续进样内保持。例如，USP拖尾值可在约40次至约100次连续进样之间保持。在一些实施方案中，USP拖尾值在约0.98至约1.20、或约1.00至约1.10之间。在一些实施方案中，USP拖尾值为约1.00。
柠檬酸的浓度可为例如1ppm、2ppm、3ppm、4ppm、5ppm、6ppm、7ppm、8ppm、9ppm或10ppm。这些值可用于形成例如在约1ppm至约10ppm或约2ppm至约5ppm之间的范围。流动相还可包括甲酸、乙酸、水、乙腈、甲醇、异丙醇、正丙醇或它们的组合。
该方法还可包括在分离肽混合物之前用柠檬酸钝化RPLC柱。
本文所述的方法也可用于分离分析物脂肪酸(例如，月桂酸)。该方法可包括将包含脂肪酸的样品进样到包含柠檬酸的流动相中。可使用RPLC分离脂肪酸。可使用质谱仪、紫外检测器、荧光检测器或它们的组合来分析分离的脂肪酸。
柠檬酸的浓度可为例如1ppm、2ppm、3ppm、4ppm、5ppm、6ppm、7ppm、8ppm、9ppm或10ppm。这些值可用于形成例如在约1ppm至约10ppm或约2ppm至约5ppm之间的范围。在分离脂肪酸时也可使用关于肽分离描述的其他实施方案。
本文所述的技术还包括套件。该套件可包括液相色谱柱(例如，RPLC柱)和包含柠檬酸流动相添加剂的小瓶。该套件还包括用于在用于分析包含分析物(例如，肽、PENNYK肽、脂肪酸、月桂酸)的样品的方法中使用柠檬酸流动相添加剂的说明书。该说明书可为本文所述方法中的任一种。该说明书可包括向流动相中添加柠檬酸流动相添加剂。该说明书还可包括关于柠檬酸流动相添加剂的特定浓度的详细信息，例如，获得约1ppm至约10ppm的柠檬酸流动相添加剂。该说明书还可说明将包含分析物的样品进样到包含柠檬酸的流动相中。使用套件提供的液相色谱柱(或RPLC柱)分离分析物。然后可使用质谱仪、紫外检测器或它们的组合来分析分离的分析物。用套件分析的分析物可为脂肪酸、月桂酸、蛋白质、肽、PENNYK肽、完整蛋白质、合成蛋白、重组蛋白或它们的组合。
当分析物为蛋白质、完整蛋白质、合成蛋白质或重组蛋白质时，该方法还可包括将完整蛋白质还原为氨基酸直链，并酶促处理该氨基酸直链以产生肽混合物。
作为本技术的套件的另一个示例，该套件可包括液相色谱柱、包含金属螯合剂流动相添加剂的小瓶和用于在本文所述的任何方法中使用金属螯合剂添加剂的说明书。例如，该方法可包括将金属螯合剂流动相添加剂添加到流动相中以获得浓度在约1ppm至约10ppm之间的金属螯合剂流动相添加剂，将含有分析物的样品进样到具有金属螯合剂的流动相中，使用LC分离分析物，以及使用质谱仪、紫外检测器、荧光检测器或它们的组合分析分离的分析物。金属螯合剂添加剂可为柠檬酸。金属螯合剂也可为柠檬酸钠、异柠檬酸盐、柠檬酸二铵、柠檬酸三铵或甲酸铵。
对于初始研究，鉴定代表性肽和相关品质因数对于评估螯合剂对色谱性能的影响是必要的。为此，所研究的肽对于目标应用前景应该是重要的，并且含有可与金属物质相互作用的带电氨基酸残基。天冬酰胺到天冬氨酸和异天冬氨酸的脱酰胺是单克隆抗体(mab)的常见翻译后修饰。由于其与药物功效的直接相关性，脱酰胺已被认为是基于mAb的治疗剂的关键质量属性(CQA)。因此，生物药物公司在控制和监测杂质诸如脱酰胺中投入了大量资源。在所监测的脱酰胺物质中，具有SEQ ID NO 1的PENNYK肽是值得关注的，因为其在用胰蛋白酶对完整mAb进行酶促处理后含有7个疏水氨基酸和4个带电氨基酸。这些特征使其分离特别具有挑战性(参见图2A、图2B和图2C)。使用基于RPLC的分离，PENNYK肽天然和脱酰胺形式在甲酸条件下使用适度梯度作为关键对紧密洗脱(参见图2D)。如图2C的SIR迹线所示，峰拖尾可阻碍脱酰胺形式的精确积分。对于基于LC的分离，理想峰被定义为具有1.0的拖尾因子和窄的峰宽的高斯峰。对于初始研究，在5％下的USP拖尾因子将用作评估使用螯合剂作为在基于RPLC的肽分离中的流动相添加剂的影响的品质因数。
SEQ ID NO 1：GFYPSDIAVEWESNGQPENNYK
SEQ ID NO 1的下划线部分为疏水的，粗体部分为带电的，并且斜体部分为阴离子的(注意一些为用粗体和斜体两者表示的带电且阴离子的)。分子式为C114H158N28O39，单同位素质量为2543.12Da，并且平均质量为2544.67Da。
关于品质因数，在基于RPLC的方法中，通常由于对总体色谱性能的C-项贡献而接受峰拖尾。带电基团的静电相互作用的存在可能表现为拖尾以及带电的肽与润湿的流动路径中的痕量金属污染物相互作用。由于这些原因，USP拖尾因子可用作确定金属螯合剂对肽的影响的品质因数(参见EQ.1)
Figure BDA0003396336980000161
在EQ.1中，Tf为拖尾因子，W0.05为5％峰高处的峰宽，Rt为保留时间，F为从5％峰高处的宽度起始点到保留时间(Rt)的时间(参见图3)。拖尾因子，Tf，建立峰的最大允许不对称性。出于药学目的，Tf被定义为5％峰高的宽度处峰的前沿与后沿之间的距离除以5％峰高处峰最大值与峰的前沿之间的距离F的两倍。对于对称峰，Tf为1.0，并且Tf的值随着拖尾变得更加明显而增加。当Tf小于1.0，存在峰的“前沿”，其可与质量负荷或潜在的过载相关。
从研究寡核苷酸分离中加合物形成的先前工作中，发现使用30％磷酸的初始***洗涤能够减少LC***中的痕量金属污染。使用这种相同的方案，清洁LC***，以使用基于RPLC的分离方法确定PENNYK肽的基线性能。该方案涉及在每次实验之前使用包含30％磷酸v/v％的溶液洗涤和钝化LC/MS***。使用LC/MS级水由储备试剂制备酸。清洁和钝化的***模块包括BSM、AS-FTN和CM-A，其中不锈钢两通代替柱。在两通旁通TUV和质量检测器之后，将流引导至废液。对于每次处理，制备250mL酸溶液，并使其以1.0mL/min流动通过LC/MS***，持续250分钟。在清洁和钝化方案之后，使用1L的LC/MS级水以1mL/min的流速冲洗***过夜或至少12小时或直到洗脱液达到约7.0的pH。如图4A所示，在用30％磷酸溶液净化***后，基于RPLC的方法能够直接以最少的拖尾从PENNYK的脱酰胺形式中解析其天然形式。然而，使用相同的样品和流动相，根据USP拖尾因子以及对天然和脱酰胺肽形式之间分辨率的视觉评估，运行相同的方法12小时(图4B)和24小时(图4C)后，观察到色谱性能恶化。这表明发生了痕量金属污染的积聚，并负面影响了该方法解析PENNYK肽的天然和脱酰胺形式的能力。为了保持色谱性能，用浓度为0.01％的金属螯合剂柠檬酸制备流动相。使用相同的方法，由用于NIST mAb参考材料的胰蛋白酶消化物的形式制成48次连续进样。如图5A-图5C所示，PENNYK肽的色谱性能在64小时的时段内保持，其中平均USP拖尾值为1.00(图5D)。
这表明螯合剂作为流动相添加剂可在延长的时间段内增加和保持关键物质的色谱性能。
实施例1-PENNYK肽
液相色谱中金属离子介导的吸附已被确认为是导致易于与金属基活性位点发生类似阳离子交换相互作用的化合物峰形不佳、拖尾和回收率降低的一个因素。当使用弱酸(例如甲酸)作为流动相添加剂时，在基于RPLC/MS的分离中，表现出携带负电荷的氨基酸诸如天冬氨酸和谷氨酸的肽对金属离子介导的吸附特别敏感。在基于RPLC/MS的肽图分析测定中，评估了作为金属络合流动相添加剂的柠檬酸和亚甲基二膦酸减轻金属离子介导的吸附的能力。在该实施例中，色谱性能稳定，其中在流动相浓度为1ppm的螯合剂存在下，感兴趣肽的峰拖尾减少多达40％。在67小时的时间研究中，观察到性能增益稳定，其中平均USP拖尾因子为1.00％，％RSD＝0.64。螯合剂的稳定作用改善了肽图分析测定稳健性，其中目标杂质的相对峰面积为2.32％(％R.S.D.＝2.23)和2.57％(％R.S.D.＝3.97)。该实施例表明，螯合剂作为流动相添加剂提供了一种改善在基于甲酸的RPLC条件下对金属离子介导的吸附敏感的生物分子的色谱性能的方法。
在基于LC的测定中，金属离子介导的吸附已被认为是导致易于基于电荷相互作用的化合物峰形不佳、拖尾和回收率降低的一个因素。不受理论的束缚，所提出的机制是金属杂质形式的痕量流动相污染物被润湿的流动路径或柱内的活性位点吸附，在此之后，它们对携带负电荷的溶质分子表现出阳离子交换特性。这些高能活性位点表现出的强结合特性导致峰拖尾和回收率降低，其中吸附的溶质分子的解吸(如果存在)朝向洗脱带的后区发生。这种固定化金属离子亲和色谱(IMAC)样现象已被证明在分离和回收磷酸化化合物中特别有问题，其中磷酸化基团的固有螯合特性增强了金属离子结合特性。
在色谱中结合流动相添加剂是抑制高能活性位点的吸附特性的众所周知的策略。就金属离子介导的吸附而言，使用基于MALDI-MS技术的早期工作表明，通过向基质中添加柠檬酸二铵或磷酸，磷酸化化合物的回收率得到改善。在使用EDTA和磷酸作为样品添加剂的LC-ESI-MS分析中，进一步研究了金属络合剂对改善磷酸化肽回收率的有益效果。通过Winter等人使用呈柠檬酸盐形式的更MS相容的螯合剂以克服在使用EDTA时在RPLC条件下ESI喷雾针的堵塞，证明了对这些技术的改进。(D.Winter,J.Seidler,Y.Ziv,Y.Shiloh,W.D.Lehmann,Citrate boosts the performance of phosphopeptide analysis byUPLC-ESI-MS/MS,Journal of proteome research,8(2009)418-424.)Siedler等人的进一步研究表明，使用金属络合剂作为样品添加剂可跨各种LC/MS配置实现性能增益。(J.Seidler,N.Zinn,E.Haaf,M.E.Boehm,D.Winter,A.Schlosser,W.D.Lehmann,Metalion-mobilizing additives for comprehensive detection of femtomole amounts ofphosphopeptides by reversed phase LC-MS,Amino acids,41(2011)311-320.)
最近，Hsiao等人在金属离子络合剂存在下，在HILIC条件下研究了阴离子和磷酸化化合物的回收率和峰形。(J.J.Hsiao,O.G.Potter,T.W.Chu,H.Yin,Improved LC/MSMethods for the Analysis of Metal-Sensitive Analytes Using Medronic Acid as aMobile Phase Additive,Analytical chemistry,90(2018)9457-9464.)值得注意的是，发现与更传统的螯合剂诸如EDTA相比，向流动相中直接添加亚甲基二膦酸(medronic acid)不会产生显著的离子抑制或残留的LC吸附。由于金属杂质在补充溶剂、试剂和LC设备中以痕量水平普遍存在，因此在实验的执行期间可能会引入金属杂质，诸如此类的直接方法在开发稳健的基于LC的测定中更具吸引力，因为阴离子或磷酸化化合物的拖尾和不良峰形可能影响测定的灵敏度和准确度，就像治疗性蛋白质一样。
基于肽的分析是在治疗性蛋白质的整个生命周期中定期进行的主要分析方法之一。它已被证明是基于蛋白质的治疗剂的表征和质量控制的非常有价值的工具，以阐明结构信息并评估蛋白质修饰。最近，基于MS的肽图分析已被部署在制造环境中，以通过同时有效监测多个潜在的关键质量属性(pCQA)来改善生产率和数据质量。作为其组成的一部分，肽固有地将含有天冬氨酸和谷氨酸形式的携带负电荷的氨基酸，它们可能受到金属离子介导的吸附的影响。有趣的是，对文献的检索表明，在评估金属络合剂及其对含有这些电荷基序的肽的影响时，可找到有限的信息。考虑到离子配对剂诸如三氟乙酸(TFA)作为流动相添加剂在基于RPLC的肽分离中能够将吸附假象抑制到可接受的水平，这并不令人惊讶。然而，随着在治疗性生物制剂的开发和制造中实施基于MS的方法的数量增加，利用较弱的流动相添加剂诸如甲酸(FA)有利于灵敏度而不是色谱性能，人们担心金属离子介导的吸附会影响测定的稳健性和性能。
本实施例的目的是评估在RPLC-MS条件下金属络合剂对含有携带负电荷的残基的肽(例如天冬氨酸和谷氨酸)的影响。就峰拖尾和MS响应方面的色谱性能将用作评估结果的量度，并讨论减少金属离子介导的非磷酸化阴离子肽吸附的最佳策略。
材料和方法
材料
NIST单克隆抗体参考材料8671购自National Institute of Standards andTechnology(Gaithersburg,MD)并在使用前储存在-80℃。Tris-盐酸盐(Tris-HCl)、盐酸胍、二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)、柠檬酸(≥99.5％)、柠檬酸钠(纯)、柠檬酸铵二元(≥99.0％)、柠檬酸三铵(≥97％)、DL-异柠檬酸三钠盐水合物(≥93％)和甲酸铵(MS级)购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)并按原样使用。
Figure BDA0003396336980000191
去活化剂添加剂(亚甲基二膦酸)购自Agilent Scientific Instruments(Santa Clara,CA)，并按照制造商说明书使用。序列级修饰的胰蛋白酶购自Promega(Madison,WI)并在使用前储存在-20℃。LC/MS级水、乙腈和硝酸购自Honeywell(Charlotte,NC)。LC/MS级甲酸和正磷酸(85％)购自FisherScientific(Hampton,NH)。
Figure BDA0003396336980000192
Micro-P6离心柱购自Bio-Rad Laboratories,Inc.(Hercules,CA)并储存在4℃。
样品制备
为了控制整个实施例中的可变性，注意对样品的选择、准备和数据采集。将可商购获得的mAb标准品(NIST RM 8671)用改编自Ren等人(An improved Trypsin DigestionMethod Minimizes Digesterion-Induced Modifications on Proteins,AnalyticalBiochemistry,392(2009)12-21)的方案进行促酶处理，以减少消化假象。简而言之，使用以下方案用序列级胰蛋白酶消化完整的mAb。用适用的LC/MS级水制备储备溶液。将20μL的NIST mAb以10mg/mL添加到60μL由0.1M Tris-HCl(pH7.5)和8.25M胍构成的变性缓冲液中。向该溶液中以400mM的浓度添加在0.1M Tris-HCl(pH7.5)中制备的2.5μl DTT。将样品在MJ
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PTC-100热循环仪中(可从MJ Research,Inc.,Waltham,MA商购获得)中在37℃处温育60分钟。温育后，将在0.1M Tris-HCl(pH7.5)中制备的5μL 400mM IAA添加到混合物中，随后在黑暗中在室温处温育45分钟。通过用加载到柱上的500μL 0.1M Tris-HCl(pH7.5)的缓冲液洗涤并使用
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5415R离心机(可从Eppendorf AG,Hauppauge,NY商购获得)以1000g离心1分钟到废液瓶中，制备用于样品脱盐的Micro-P6离心柱(可从Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA商购获得)。重复该步骤总共4个洗涤循环。然后将样品加载到柱床的中心，并以1000g离心4分钟到收集瓶中。脱盐后，将在制造商提供的重悬缓冲液中制备的10μL 1mg/mL胰蛋白酶以1:20的酶与底物的比率添加到样品中。将该混合物在37℃处温育60分钟。温育后，将消化物用含有0.1％甲酸的LC/MS级水以1:1的比率稀释。所有分析均使用10μL的进样体积。为了使样品降解最小化，将样品均质化为主池，并且等分到ppendorf
Figure BDA0003396336980000203
管(可从Eppendorf AG,Hauppauge,NY商购获得)中并在使用前酶消化后储存在-80℃。
LC/MS***配置
使用
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I-Class PLUS系列LC仪器(可从Waters Technologies Corporation,Milford,MA商购获得)进行数据采集，以使***分散性最小化，并利用梯度准确度对色谱性能的影响。该***配置有二元溶剂管理器(BSM)，其配备有380μL混合器(PN 205000705)、流通针样品管理器(SM-FTN)和柱管理器(CM-A)。使用配备有10mm分析流动池的可调谐紫外检测器(TUV)在214nm波长下采集光学数据。TUV后在线配置
Figure BDA0003396336980000205
单四极杆质量检测器(可从Waters Technologies Corporation,Milford,MA商购获得)，以便于监测关键肽物质。在
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Figure BDA0003396336980000207
CSHC18柱(1.7μm，2.1×100mm)(可从Waters Technologies Corporation,Milford,MA商购获得)上在60℃处进行反相分离。在1％B的初始等度保持5分钟后，施加60分钟梯度至35％B。然后通过在3分钟内将％B组成升至70％来清洁该柱，并在70％下再保持2分钟。然后在1分钟内返回初始条件后，进行柱平衡持续6分钟。所有梯度均以0.200ml/min的流速进行，总运行时间为87分钟。用LC/MS级水(MP A)和乙腈(MP B)以0.1％FA v/v制备流动相。在两个流动相中分别以1ppm或5μM制备金属络合剂的柠檬酸和亚甲基二膦酸。为了确保螯合剂溶解度，制备了流动相，其中MP A中含3％B，MP B中含3％A。使用450-1250m/z的全扫描范围和849.2m/z和849.6m/z处的单离子记录，以2Hz的采样速率在正模式下采集MS四极杆数据，以分别监测NIST RM的肽T37(HC)的天然和脱酰胺形式的[M+3H]+3电荷状态。锥电压、毛细管电压和探针温度分别设置为10V、1.5kV和600℃。
***清洁和钝化
在每次实验之前，使用30％(v/v％)磷酸的溶液对LC/MS进行清洁和钝化，该溶液用LC/MS级水由储备试剂制备。清洁和钝化的***模块包括BSM、AS-FTN和CM-A，其中不锈钢两通代替柱。在两通旁通TUV和质量检测器之后，将流引导至废液。对于每种处理，以所需的浓度制备250mL磷酸溶液的溶液，并使其以1.0mL/min流动通过LC/MS***，持续250分钟。按照清洁和钝化方案，使用1L LC/MS级水以1mL/min的流速冲洗***过夜或至少12小时，或直到洗脱液达到约7.0的pH。通过在塑料锥形管中收集大约10mL洗脱液并使用FisherScientific Acument XL250pH/mV/ISE测量仪(Pittsburgh,PA)进行测量来确定pH。
结果和讨论
对于本实施例，鉴定代表性肽对于评估螯合剂对色谱性能的影响是必要的。为此，所研究的肽对于目标应用应该是重要的，并且含有可与金属离子相互作用的带电氨基酸残基。天冬酰胺到天冬氨酸和异天冬氨酸的脱酰胺是已与药物功效相关的单克隆抗体(mAb)的常见翻译后修饰。因此，生物药物公司在控制和监测杂质诸如脱酰胺中投入了大量资源。在所监测的脱酰胺物质中，“PENNY”肽(SEQ ID NO 1)是值得关注的，因为其在用胰蛋白酶对完整mAb进行酶促处理后含有7个疏水氨基酸和4个带负电荷的氨基酸，使其成为金属离子介导的吸附的理想候选物。此外，PENNYK序列位于所有人源化mAb中的Fc结构域的恒定区中，这增加了其相关性，因为在整个生物制药行业中常规监测肽作为关键质量属性。
在评估金属络合剂之前，有必要建立基线***性能，以便于比较结果。从先前的工作中观察到，30％的磷酸溶液能够置换吸附在整个润湿的流动路径表面上的痕量金属杂质。按照类似的程序，使用磷酸溶液清洁***流体路径。在中和***后，使用RPLC/MS肽图分析测定中常见的常规RPLC流动相(H2O:MeCN，0.1％FA)，进行一系列10次mAb消化物进样，其中在蛋白质进样之间发生4次空白进样。
如图6A所示，使用经酶促处理的NIST mAb参考材料的基于RPLC的分离对天然PENNYK肽(T37)的初步表征显示，PENNYK肽大约在60分钟分离梯度的中间洗脱，保留时间为34.9分钟。由于色谱图的峰密度和杂质的紧密洗脱性质，使用单离子记录(SIR)监测天然和脱酰胺形式的分布，如图6B所示。使用5％峰宽处的USP拖尾因子(Tf＝W0.05/2f)来评估PENNYK在进样系列过程中的拖尾。在磷酸洗涤后，观察到初始色谱性能(0小时)是可接受的，其中天然峰的拖尾计算为1.12。然而，在连续使用仪器72小时后观察到拖尾增加，计算的拖尾因子为1.21。传统上，在色谱性能方面，低于1.2的拖尾值通常被认为是可接受的，然而如色谱图中所示，增加的拖尾可显著影响紧密洗脱低丰度峰的分布和积分。在该进样系列中，在72小时时段内，在35.35分钟处的前导杂质峰表现出相对面积从1.58％到1.40％的12％降低，而在35.55分钟处的拖尾杂质峰表现出从2.20％到2.76％的25％增加。尽管微妙，但这些观察证明，在存在相对低程度的拖尾量的情况下，紧密洗脱的低丰度杂质更倾向于表现出增加的可变性，由于拖尾峰边缘接近基线时拖尾增加，避免这种情况是不切实际的。
如图7所示，较低峰宽处的拖尾因子表现出类指数行为，以更长的运行时间和灵敏度为代价使更浅的梯度成为一个有争议的问题。在仔细观察图7时，观察到的色谱性能随时间的劣化表明拖尾的原因是以具有吸附特性的污染物的形式引入的，而不是作为预先存在的条件引入的，因为***紧接在使用磷酸的清洁方案之后的表现是可接受的。在我们先前的研究中，观察到金属加合物物质诸如Na+和K+能够吸附到LC流体路径内的金属表面上。然而，活性位点与Na+和K+相关的可能性是可忽略的，考虑到其显示由甲酸诱导的酸性LC条件足以置换弱吸附的金属离子诸如Na+和K+。如果金属离子介导的吸附是拖尾的原因，则这些观察结果将表明具有较强吸附特性的金属离子诸如Fe II/III可能存在于润湿的流动路径中作为吸附位点，并且导致观察到的PENNYK肽的色谱性能劣化，类似于由Seidle等人(Metal Ion-Mobilizing Additives for Comprehensive Detection of FemtomoleAmounts of Phosphopeptides by Reversed Phase LC-MS,Amino acids,41(2011)311-320)进行的观察。随着这种概念的推进，探索了采用金属络合剂的缓解策略。
选择柠檬酸和亚甲基二膦酸作为金属络合剂，以评估其对PENNYK拖尾和面积响应的影响。使用简化的进样系列，采用与前面相同的清洁方法和分离。以相同的方式制备流动相，其中添加浓度为1ppm的对应螯合剂。如图8A-图8C所示，与没有螯合剂的先前实验相比，两种螯合剂在稳定PENNYK肽的色谱性能方面都具有显著的影响(图8A)。从初始进样开始保持观察到的性能增益，大大降低了实验可变性并确证了金属离子介导的吸附的概念。不受理论的束缚，螯合剂与流动相中存在的金属离子杂质络合，并充当增溶剂以防止金属离子吸附到流体表面上，或作为保护基团以减轻金属离子介导的吸附。如图8B和图8C所示，在低至1％峰高的峰宽处，柠檬酸和亚甲基二膦酸能够在22小时内将峰拖尾减少多达40％。减轻拖尾提高了低丰度杂质的峰面积一致性(％R.S.D.＜3％)，其中亚甲基二膦酸表现出的峰面积更接近初始分离(图8A，0小时)。但应当注意，观察到亚甲基二膦酸负面影响总体色谱性能，并且表现出增加的电离效率差异和/或离子抑制假象。
如图9A-图9D所示，使用在PENNYK肽的附近区域(从32分钟到54分钟)洗脱的主要肽物质的提取离子色谱图(XIC)来评估这些肽的MS响应。对PENNYK肽(T37)的MS响应的检查显示，与不存在螯合剂的相同运行相比，柠檬酸(图9B)和亚甲基二膦酸(图9C)均具有增加的MS响应(图9A)。在这种情况下，柠檬酸MS-响应比初始运行高35％，而亚甲基二膦酸仅显示比初始运行高10％的MS-响应。相对于柠檬酸，由亚甲基二膦酸表现出的较低MS-响应可能部分地由于流动相中的外来污染物。如图9A-图9C的插图所示，初始条件下的组合MS质谱指示在具有螯合剂、特别是具有亚甲基二膦酸的流动相中存在较高程度的质谱污染。在没有商业螯合剂杂质谱的先验知识的情况下，仅可推测这些外来组分导致跨实验的电离效率差异，如图9D所示。与Hsiao等人的发现相反，本实施例显示亚甲基二膦酸具有增加稍后洗脱肽中的峰拖尾的非预期效果，最显著的是在图9C中所示的峰3中。峰3的研究鉴定其为烷基化铰链区肽T20(HC)：THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK(SEQ ID NO 2)。与此相比，柠檬酸峰谱通常跨相同的肽物质得到保留或改善，最显著的是在稍后洗脱物质(峰7-11)中。有趣的是，峰3在不存在螯合剂的情况下没有显示出拖尾的显著增加，尽管含有谷氨酸残基但肽T14(LC)：VDNALQSGNSQESVTEQDSK(SEQ ID NO 3)，其含有多个谷氨酸和天冬氨酸残基，表现出与PENNYK肽类似的拖尾行为(数据未示出)。不受理论的束缚，观察到的差异的可能原因可能是由于肽的酸性特性的变化，与亚甲基二膦酸的双膦酸根结构、或螯合剂亲和力/配位特性相比，柠檬酸的羧酸基团充当肽的更好模拟物。鉴于此，需要进一步研究以充分理解螯合剂和肽物理化学性质在肽的吸附/配位特性中所起的作用。然而，在肽图分析测定中由螯合剂提供的色谱性能增益是明显的，特别是对于CQA的靶向测定或其中关键物质不受螯合剂存在下的二次相互作用影响的常规监测场景。
在确立了金属离子介导的吸附的支持证据的情况下，评估柠檬酸的衍生物包括柠檬酸钠、柠檬酸二铵、柠檬酸三铵对US/MS响应的影响以及色谱性能是否可进一步改善。有趣的是，与柠檬酸和亚甲基二膦酸相比，所探索的所有衍生物均显示出增加的前沿。假定流动相以相同浓度的螯合剂制备并且跨螯合剂组使用相同样品，观察到的前沿似乎与螯合剂而不是样品或样品基质相关。但应当注意，螯合剂不具有相当的纯度，这可能导致一些观察到的差异。关于色谱性能，另选的螯合剂在PENNYK肽的天然峰和杂质之间表现出增加的分辨率，但不能改善杂质峰之间的分辨率，并且在一些情况下分辨率降低。如所预期的，与基于铵的衍生物相比，含Na+的衍生物在MS-质谱中产生更多的盐加合物，然而在色谱性能方面，这两种类型均没有提供优于柠檬酸或亚甲基二膦酸的优点。还评估了高达50ppm的添加剂浓度，但没有观察到任何附加有益效果。应当注意，在柠檬酸的情况下，1ppm似乎是对色谱具有可观察到的效果所需的螯合剂的最小量。鉴于这些结果，选择柠檬酸，考虑到其最佳MS-响应、与天然条件相当的选择性和不存在二次相互作用。
为了确定图8B中观察到的残留拖尾是否是柱过载的结果，通过用等量的样品缓冲液稀释样品，在降低的质量负荷下进行肽图谱。如图10所示，峰拖尾仅减少了附加的7％(Tf＝1.05)，其中在低至1％峰高的峰宽处峰形具有理想的高斯行为。除了质量负荷之外，还评估了对拖尾的热力学贡献。如图11A-图11C所示，对于在存在螯合剂的情况下在40℃的较低温度处进行的分离，Tf值为1.13，PENNYK肽的峰拖尾被保留。尽管观察到一些峰变宽，但色谱分布和相对强度与60℃数据高度相似。在不存在螯合剂的情况下，T37在40℃处确实表现出11％的拖尾的边缘增加(Tf＝1.26)，相对强度与图6A和图6B中所示的色谱分布更相似。这些观察表明，对于PENNYK肽，在存在螯合剂的情况下，质量负荷和热对残留峰拖尾的贡献是最小的。在表现出与如图11D-图11F所示的类似行为的肽段T14中观察到了确证数据。作为含有酸性残基的肽，T14的色谱分布在较低温度下大致保留，在螯合剂存在下拖尾仅增加6％，与从流动相中去除螯合剂时拖尾增加超过2倍相反。与T14相比，在有和没有螯合剂存在的情况下在T37中观察到的对拖尾的较低敏感性进一步支持了以下概念，即在本研究中金属离子介导的吸附是PENNYK肽拖尾的主要贡献因素。为了评估在更剧烈条件下测定的长期稳定性，使用改进的梯度在48次连续进样系列上进行肽图谱。如图12所示，新制备的肽消化物的峰拖尾在连续使用仪器67小时内是稳定的，其中在W0.01处的平均拖尾因子为0.96(％R.S.D.＝0.43)。应当注意，在W0.05处的峰宽经实验确定为高斯，其中计算的拖尾因子为1.00(％R.S.D.＝0.64)。螯合剂的稳定作用改善了测定稳健性，其中对于前导和拖尾杂质峰，相对峰面积计算为2.32％(％R.S.D.＝2.23)和2.57％(％R.S.D.＝3.97)。总之，这些结果证明使用螯合剂作为流动相添加剂提供了一种改善在基于甲酸的RPLC条件下对金属离子介导的吸附敏感的生物分子的色谱性能的方法。
结论
金属离子介导的吸附由于其对色谱性能和问题化合物回收的影响而成为正在进行的研究兴趣领域。在生物制药工业中，基于蛋白质的治疗剂的肽水平分离对于紧密洗脱关键对特别具有挑战性，因为峰拖尾和回收直接影响在准确度和灵敏度方面的测定稳健性。金属离子介导的关键肽的吸附进一步使问题复杂化，特别是在其中有限的资源可用于开发和验证常规监测测定的制造环境中。在这种情况下，非常需要稳健的并且能够递送准确且一致的结果的测定。该实施例证明，作为流动相添加剂的金属络合剂可显著降低金属离子介导的敏感化合物的吸附，以改善在基于RPLC/MS的分离中的色谱性能。具体地，在流动相中存在浓度为1ppm的柠檬酸的情况下，PENNYK肽的峰拖尾在低至1％峰高的峰宽处减少多达40％。金属离子介导的吸附的减少允许准确定量与PENNYK肽相关的低丰度脱酰胺杂质，一种与药物产品功效相关的已知关键质量属性，其中％R.S.D.≤2.4％。螯合剂对色谱性能的稳定特性通过在跨越67小时的48次进样系列中天然峰的平均峰拖尾值计算为1.0(R.S.D.为0.64％)来证明，相比之下，在不存在螯合剂的情况下性能恶化，其中峰拖尾在同一时间段内增加至1.85。此外，当使用柠檬酸作为流动相添加剂时，PENNYK肽的MS响应得到改善，其中MS信号强度增加35％，从而增加了检测低丰度关键杂质的测定灵敏度。总之，这些结果证明了使用螯合剂作为流动相添加剂的分离条件以改善基于RPLC/MS的分离中对金属离子介导的吸附敏感的肽的色谱性能。这些条件特别适合其中固有地需要稳健且一致的测定以确保药品安全和有效的制造环境。
实施例2-月桂酸
测试流动相螯合剂对不同分析物类型例如月桂酸的影响。使用与关于图2概述的方法相同的方法。以4,000ppm开始月桂酸的系列稀释。在75:25乙腈：水和1ppm柠檬酸的流动相中等度运行10μL进样。图14示出了向流动相中添加螯合剂改善月桂酸(聚山梨醇酯20(PS-20)的主要脂肪酸组分)的回收率以获得线性MS响应的图。这对于在修整阶段(清洁或精化)之后定量存在于药物产品的药物物质中的杂质是有用的。在校准曲线中没有线性响应的情况下，使用多点校准曲线或单点校准曲线准确地定量脂肪酸是不可能的。
实施例3-流动相添加剂的比较
在本实施例中，将几种不同的流动相添加剂与1ppm柠檬酸进行比较。***条件示于图15中。
图16A-图16D示出了1ppm柠檬酸与1ppm柠檬酸钠的比较。从图16A与图16的比较可以看出，PENNYK肽的脱酰胺物质显示出较差的分辨率，并且当使用1ppm柠檬酸钠时看到一些前沿。此外，图16C的顶部质谱与图16D的顶部质谱的比较显示，图16C(1ppm柠檬酸)中出现的主峰的几种加合物在图16D(1ppm柠檬酸钠)中不存在或以显著较低的水平存在(例如，Na和K)。图16C和图16D的底部质谱查看色谱图的基线区域以评估基线噪声强度。
图17A-图17D示出了1ppm柠檬酸与1ppm异柠檬酸盐的比较。从图17A与图17B的比较可以看出，PENNYK肽的脱酰胺物质显示出较差的分辨率，并且当使用1ppm异柠檬酸盐时看到一些前沿。此外，图17C的顶部质谱与图17D的顶部质谱的比较显示，图17C(1ppm柠檬酸)中出现的主峰的几种加合物在图17D(1ppm异柠檬酸盐)中不存在或以显著较低的水平存在(例如，Na和K)。图17C和图17D的底部质谱查看色谱图的基线区域以评估基线噪声强度。
图18A-图18D示出了1ppm柠檬酸与1ppm柠檬酸二铵的比较。从图18A与图18B的比较可以看出，PENNYK肽的脱酰胺物质显示出较差的分辨率，并且当使用1ppm柠檬酸二铵时看到一些前沿。此外，图18C的顶部质谱与图18D的顶部质谱的比较显示，图18C(1ppm柠檬酸)中出现的主峰的几种加合物在图18D(1ppm柠檬酸二铵)中不存在或以显著较低的水平存在(例如，Na和K)。图18C和图18D的底部质谱查看色谱图的基线区域以评估基线噪声强度。
图19A-图19D示出了1ppm柠檬酸与1ppm柠檬酸三铵的比较。从图19A与图19B的比较可以看出，PENNYK肽的脱酰胺物质显示出较差的分辨率，并且当使用1ppm柠檬酸三铵时看到一些前沿。此外，图19C的顶部质谱与图19D的顶部质谱的比较显示，图19C(1ppm柠檬酸)中出现的主峰的几种加合物在图19D(1ppm柠檬酸三铵)中不存在或以显著较低的水平存在(例如，Na和K)。图19C和图19D的底部质谱查看色谱图的基线区域以评估基线噪声强度。
图20A-图20D示出了1ppm柠檬酸与1ppm亚甲基二膦酸的比较。从图20A与图20B的比较可以看出，当使用1ppm亚甲基二膦酸时，PENNYK肽的脱酰胺物质显示出相当的肩峰分辨率。此外，图20C的顶部质谱与图20D的顶部质谱的比较显示，图20C(1ppm柠檬酸)中出现的主峰的几种加合物在图20D(1ppm亚甲基二膦酸)中不存在。图20C和图20D的底部质谱查看色谱图的基线区域以评估基线噪声强度。
图21A-图21D示出了1ppm柠檬酸与5μM Agilent InfinityLab添加剂的比较。从图21A与图21B的比较可以看出，PENNYK肽的脱酰胺物质显示出相当的分辨率，但杂质的强度较低，但当使用5μM Agilent InfinityLab添加剂时，看到主峰的更好分辨率。这可能是抑制的假象，因为仅看到峰的顶部部分并且因此它是较窄的峰。此外，图21C的顶部质谱与图21D的顶部质谱的比较显示，图21C(1ppm柠檬酸)中出现的主峰的几种加合物在图21D(5μMAgilent InfinityLab添加剂)中不存在(基线由于强的质谱污染而增加-参见实施例2)。图21C和图21D的底部质谱查看色谱图的基线区域以评估基线噪声强度。
本领域技术人员将认识到或者仅使用常规实验便能确定本文所述具体程序的许多等同形式。此类等同形式被认为是在本技术的范围内并由以下权利要求书所涵盖。本申请通篇引用的所有参考文献、发布专利和公布的专利申请的内容据此以引用方式并入。

Claims (32)

1.一种分析包含分析物的样品的方法，所述方法包括：
将包含所述分析物的所述样品进样到包含浓度在约1ppm至约10ppm之间的金属螯合剂添加剂的流动相中；
使用液相色谱分离所述分析物；以及
使用质谱仪、紫外检测器或它们的组合分析所述分析物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述金属螯合剂添加剂选自由以下项组成的组：柠檬酸、柠檬酸钠、异柠檬酸盐、柠檬酸二铵和柠檬酸三铵。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述金属螯合剂添加剂为柠檬酸。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述流动相中柠檬酸的浓度为约1ppm。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述流动相中柠檬酸的浓度为约10ppm。
6.一种分析包含完整蛋白质的样品以进行肽图分析的方法，所述方法包括：
将所述样品中的所述完整蛋白质还原为氨基酸直链；
酶促处理所述氨基酸直链以产生肽混合物；
将包含所述肽混合物的所述样品进样到包含柠檬酸的流动相中；
使用反相液相色谱分离所述肽混合物；以及
使用质谱仪、紫外检测器、荧光检测器或它们的组合分析所分离的肽。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述肽混合物中的至少一种肽包含带电氨基酸残基。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述肽混合物中的至少一种肽具有净电荷。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述净电荷为负的。
10.根据权利要求6所述的方法，其中所述蛋白质为单克隆抗体。
11.根据权利要求6所述的方法，其中所述蛋白质为合成蛋白质或重组蛋白质。
12.根据权利要求6所述的方法，其中所述氨基酸为天冬氨酸、谷氨酸或异天冬氨酸。
13.根据权利要求6所述的方法，其中所述肽混合物包含PENNYK肽和所述PENNYK肽的脱酰胺形式。
14.根据权利要求6所述的方法，其中所述氨基酸用胰蛋白酶、Lys-C、Asp-N或它们的组合进行酶促处理。
15.根据权利要求6所述的方法，其中色谱性能在约2天至约3天的时段内保持，其中平均USP拖尾值为约0.95至约1.30。
16.根据权利要求6所述的方法，其中色谱性能在约48次连续进样内保持，其中平均USP拖尾值为约0.95至约1.30。
17.根据权利要求6所述的方法，其中所述肽混合物包含肽和所述肽的脱酰胺物质。
18.根据权利要求6所述的方法，其中所述流动相中柠檬酸的浓度为约1ppm至约10ppm。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述流动相中柠檬酸的浓度为约1ppm。
20.根据权利要求6所述的方法，其中所述流动相还包括甲酸、乙酸、水、乙腈、甲醇、异丙醇、正丙醇、三氟乙酸、二氟乙酸或它们的组合。
21.根据权利要求6所述的方法，所述方法还包括在分离所述肽混合物之前用柠檬酸钝化反相色谱柱。
22.一种分析包含脂肪酸的样品的方法，所述方法包括：
将包含所述脂肪酸的所述样品进样到包含柠檬酸的流动相中；
使用反相液相色谱分离所述脂肪酸；以及
使用质谱仪、紫外检测器或它们的组合分析所分离的脂肪酸。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述脂肪酸包括月桂酸。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述流动相中柠檬酸的浓度为约1ppm至约10ppm。
25.一种用于分析样品的套件，所述套件包括：
液相色谱柱；
包含柠檬酸流动相添加剂的小瓶；以及
用于在用于分析包含分析物的样品的方法中使用所述柠檬酸流动相添加剂的说明书，其中所述方法包括：
将所述柠檬酸流动相添加剂添加到流动相中；
将包含所述分析物的所述样品进样到包含柠檬酸的所述流动相中；
使用液相色谱分离所述分析物；以及
使用质谱仪、紫外检测器或它们的组合分析所分离的分析物。
26.根据权利要求25所述的套件，其中所述液相色谱柱为反相液相色谱柱。
27.根据权利要求25所述的套件，其中将所述柠檬酸流动相添加剂以约1ppm至约10ppm的浓度添加到所述流动相中。
28.根据权利要求25所述的套件，其中所述分析物为脂肪酸。
29.根据权利要求25所述的套件，其中所述分析物为完整蛋白质。
30.根据权利要求29所述的套件，其中所述方法还包括：
将所述完整蛋白质还原为氨基酸直链；以及
酶促处理所述氨基酸直链以产生肽混合物。
31.一种用于分析样品的套件，所述套件包括：
液相色谱柱；
包含金属螯合剂流动相添加剂的小瓶；以及
用于在用于分析包含分析物的样品的方法中使用所述金属螯合剂流动相添加剂的说明书，其中所述方法包括：
将所述金属螯合剂流动相添加剂添加到流动相中以获得浓度在约1ppm至约10ppm之间的所述金属螯合剂流动相添加剂；
将包含所述分析物的所述样品进样到包含所述金属螯合剂的所述流动相中；
使用液相色谱分离所述分析物；以及
使用质谱仪、紫外检测器、荧光检测器或它们的组合分析所分离的分析物。
32.根据权利要求31所述的套件，其中所述金属螯合剂流动相添加剂选自由以下项组成的组：柠檬酸、柠檬酸钠、异柠檬酸盐、柠檬酸二铵、柠檬酸三铵和甲酸铵。
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