CN109425673A - 经改进的用于阴离子化合物的液相色谱法 - Google Patents

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Abstract

本公开总体上涉及经改进的用于阴离子化合物的液相色谱法，其特别可与质谱联用。所述方法包括向携带样品的流动相中加入添加剂。流动相添加剂可有效改善所获得数据中靶标分析物的峰形，并/或消除或至少减少离子抑制。所述方法特别适合阴离子化合物，例如磷酸化化合物。

Description

经改进的用于阴离子化合物的液相色谱法
技术领域
本公开总体上涉及经改进的液相色谱法。具体而言，本公开涉及经改进的总体上使用液相色谱-质谱(LC-MS)***用于分离和分析化合物的方法。所述方法特别适合阴离子化合物，例如磷酸化化合物。
背景技术
在液相色谱(LC)***中，由一种或多种溶剂组成的流动相在高***压力下被驱动通过分离单元，分离单元通常以色谱柱的形式提供。在高效LC(HPLC)***和超高效LC(UHPLC)***中，***压力可高达例如约1200bar。所述柱含有固定相，其在LC中通常以颗粒(例如二氧化硅珠)的填充床的形式提供。颗粒被配制和/或官能化以分离样品中不同的分析物或组分(例如化学化合物)。当样品流经柱时，样品接触固定相。样品的不同组分对固定相具有不同的亲和力。这导致不同的组分在液体流经柱时彼此分离。结果，不同的组分在不同时间从柱出口洗脱。因此，来自柱的液体输出包含一系列带，每条带由样品的不同组分组成。也就是说，这些带分别由样品的不同组分组成，所述组分是通过柱彼此分离的。
流动相和其中携带的一系列带从柱出口流到检测器，所述检测器被配置为检测每条单独的带。作为一个例子，检测器可以包括液体流经的流动池、光源和光检测器，所述光检测器被配置为对流经流动池的液体进行基于光学的测量(例如吸光度)。然后，可以利用检测器产生的电信号来产生色谱图。通常，色谱图将信号强度标绘为保留时间的函数，或者标绘为保留体积的函数。数据曲线显示为与检测器所检测到的一系列单独的带相对应的一系列峰值。在分析色谱中，色谱图用于鉴定样品中的组分，并指示它们在样品中的相对浓度。或者，在制备色谱中，可利用柱的分离能力来纯化样品，例如从样品中所含的其他化合物中离析靶标化合物。
LC***可以与质谱(MS)***联用，从而形成混合型LC-MS***。质谱(MS)***通常包含用于离子化所研究样品的组分的离子源、基于气相离子不同的质荷比(或m/z比，或更简单的“质量”)分离气相离子的质量分析仪、用于对分离的离子进行计数的离子检测器、以及用于根据需要处理来自离子检测器的输出信号以产生用户可解释的质谱的电子器件。通常，质谱是指示检测到的离子的相对丰度(例如，离子信号强度，例如对于每个检测到离子的离子计数数)作为其m/z比的函数的一系列峰。在混合型LC-MS***中，从LC柱洗脱的经分离的化合物被引入MS***的离子源中。化合物在离子源中被离子化，所得到的离子被转移到质量分析仪中，并在分辨质量的基础上进行检测。因此，混合型LC-MS***能够从样品获得三维(3D)LC-MS数据，其特征在于：洗脱时间(或采集时间或保留时间)、离子丰度和通过MS分选的m/z比。
历史上，利用有机溶剂和极性固定相(例如二氧化硅或氧化铝)进行LC。利用这种“正相色谱”，更多极性分析物结合到极性固定相上。这些分析物被柱保留，稍后洗脱。非极性分析物结合较弱，因此较早从柱中洗脱。从二十世纪八十年代开始，反相色谱(RPC)被广泛使用。在RPC中，使用水性溶剂或极性溶剂，并用疏水基团例如十八烷基链(C-18)官能化二氧化硅。在RPC中，洗脱顺序是相反的或颠倒的。非极性分析物将被非极性固定相保留较长时间，稍后洗脱。相反，极性较大的分析物不与官能化的二氧化硅结合，因此在极性流动相中较早洗脱。
在生命科学中，RPC的一个问题是：重要的极性或离子生物分子即使与疏水柱的相互作用也非常小，并且倾向于在柱空隙体积附近洗脱。Pesek,JJ,Matyska,MT在：Wang,PG,He,H(编),Hydrophilic Interaction Chromatography(HILIC)and AdvancedApplications,CRC Press,Boca Raton,FL 2011,第1-26页，第2页。为了克服这个问题，已经开发了离子配对技术或亲水相互作用色谱(HILIC)***。使用诸如四丁基氢氧化铵或N,N二甲基己胺(DMHA)的试剂，与RPC联用的离子配对技术已取得一定成功。此外，已知离子配对试剂会污染LC***和柱，而且决不可能被完全洗掉，这迫使用户将LC***和柱专门用于一种特定应用。参见Cordell等人2008J Chrom B 871 115-124。另一方面，HILIC使用极性溶剂和同样为极性的固定相。溶剂通常含有大量有机溶剂例如乙腈，这导致极性亲水分析物与固定相的更多相互作用。然而，尚未开发出科学界广泛接受的稳健的HILIC柱和方法，部分原因如下一节所述。
对于带高负电荷的生物分子例如核苷酸或具有多于一个羧酸基团的有机酸，在LC/MS实验中通常观察到差的峰形。参见Pesek等人2011J Sep Sci 34 1-8。这个问题是重要的，因为良好的峰形能够提供(1)不同分析物之间良好的分辨率和(2)准确的定量。使用纳米-LC/MS***证明了：差的峰形是由存在微量金属(特别是铁)引起的，所述微量金属通常从色谱***内的各种来源中以很低的浓度发现。参见Myint等2009Anal Chem81 7766-7772。Myint等人使用多胺键合的聚合物基apHeraTM NH2柱来分离有机酸和磷酸化代谢物。用螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)冲洗柱后，他们发现峰形显著改善。然而，在多次使用柱后，EDTA被冲出***，峰形恶化。他们推测恶化归因于铵盐或有机溶剂中的金属杂质。Myint等人通过将EDTA共注入流动相中克服了这个问题。Myint等人在7769。
使用二氧化硅氢化物固定相的其他工作者研究了向流动相中加入EDTA以螯合***中的金属，作为改善色谱法的手段。Pesek JJ等人,2011J Sep Sci 34 3509-3516。他们研究了(i)用EDTA冲洗***，(ii)向流动相中加入EDTA，或(iii)用EDTA制备样品。EDTA的加入导致靶标分析物的峰形得到改善。
然而，EDTA可保留在HILIC柱上并引起靶标化合物的离子抑制(参见本文中的图1A-1B和图2A-2B，以及Pesek JJ等人，2011)。此外，当流动相中含有EDTA时，质谱仪不能以正离子模式使用，因为其在正离子模式分析中具有高离子化效率，从而使得该方法局限于使用质谱仪进行负离子模式分析。
发明内容
为了全面或部分地解决上述需求和/或本领域技术人员可能已经观察到的其他需求，本公开提供了方法、工艺、***、设备、仪器和/或装置，如在下文所述实现方式中举例描述的那样。
根据一个实施方式，本公开提供了一种通过与质谱联用的液相色谱分析样品中的一种或多种分析物的方法，所述方法包括：提供填充有固定相的液相色谱柱；提供包含一种或多种溶剂和亚撑二磷酸(medronic acid)添加剂的流动相；将所述样品注入所述流动相中；通过使含有所述样品的所述流动相流经所述液相色谱柱，在分离所述液相色谱柱中的所述一种或多种分析物的条件下进行色谱；和利用质谱仪分析一种或多种分离的分析物。
在上述方法中，液相色谱柱可以是高效液相色谱(HPLC)柱。
或者，液相色谱柱可以是超高效液相色谱(UHPLC)柱。
在上述方法中，液相色谱柱可以是亲水相互作用液相色谱(HILIC)柱。
在另一个实施方式中，液相色谱柱可以是反相液相色谱(RPLC)柱。
在一个实施方式中，可以使用以离子配对模式运行的反相液相色谱(RPLC)柱来进行所述方法。
在又一个实施方式中，液相色谱柱可以是尺寸排斥柱。
根据另一个实施方式，本公开提供了一种通过与质谱联用的液相色谱分析样品中的一种或多种分析物的方法，所述方法包括：提供填充有固定相的亲水相互作用液相色谱(HILIC)柱；提供包含一种或多种溶剂和焦磷酸添加剂的流动相；将所述样品注入所述流动相中；通过使含有所述样品的所述流动相流经所述液相色谱柱，在分离所述液相色谱柱中的所述一种或多种分析物的条件下进行色谱；和利用质谱仪分析一种或多种分离的分析物。
在上述方法中，质谱仪可以以正模式分析和负模式分析运行。
在这些方法中，亚撑二磷酸或焦磷酸可以以约1.0μM至约10.0μM的浓度存在。或者，它们可以以约0.25μM至约25.0μM；约0.5μM至约15.0μM；约0.5μM至约2.5μM；约2.0μM至约5.0μM；约5.0μM至约10.0μM存在。
优选地，亚撑二磷酸或焦磷酸以约2.5μM至约7.5μM的浓度存在。
在上述方法中，可以在样品分析之前将亚撑二磷酸或焦磷酸预注射到柱上作为塞子。
或者，亚撑二磷酸或焦磷酸可以与样品一起共注射。
优选地，将亚撑二磷酸或焦磷酸加入一种或所有洗脱剂溶剂中。
在一个替代性实施方式中，可以通过单独的LC通道(例如使用四元泵)引入亚撑二磷酸或焦磷酸，而不是将添加剂加入流动相溶剂中。
在上述方法中，分析物可以是阴离子化合物。
阴离子化合物可以是磷酸化化合物、硫酸化合物或羧酸化化合物。
在一个实施方式中，磷酸化化合物可以是磷酸肽。
在一个替代性实施方式中，阴离子化合物可以是杀虫剂、药物或其代谢物。
在上述方法中，流动相可以含有两种或更多种溶剂，所述溶剂在色谱期间产生浓度梯度，并且亚撑二磷酸或焦磷酸的浓度在色谱期间保持恒定。
或者，流动相可以含有两种或更多种溶剂，所述溶剂在色谱期间产生浓度梯度，并且亚撑二磷酸或焦磷酸的浓度在色谱期间发生变化。
在上述方法中，流动相可以包含极性溶剂和非极性溶剂。
在一个实施方式中，流动相可以包含水和有机化合物。在一个实施方式中，流动相中的有机化合物可以是乙腈。
在一个替代性实施方式中，流动相可以包含至少两种溶剂，并且根据等度洗脱模式使含有样品的流动相流经液相色谱柱。
在另一个替代性实施方式中，流动相可以包含至少两种溶剂，并且根据梯度洗脱模式使含有样品的流动相流经液相色谱柱。
本领域技术人员在查阅以下附图和详细描述之后，本发明的其他设备、装置、***、方法、特征和优点对其而言将是或者将变得是很明显的。所有这些另外的***、方法、特征和优点旨在包含在本说明书内，在本发明的范围内，并由所附权利要求保护。
附图说明
参考以下附图可以更好地理解本发明。附图中的组分不一定按比例，而是将重点放在阐释本发明的原理上。在附图中，在不同的各视图中，相似的参考数字表示相应的部分。
图1A示出了向流动相中加入EDTA对有机酸：琥珀酸、苹果酸和柠檬酸/异柠檬酸的峰形的影响。
图1B示出了向流动相中加入EDTA对有机酸：α-酮戊二酸(α-KG)、L-谷氨酰胺和谷氨酸的峰形的影响。
图1C示出了整个分析运行中EDTA的色谱图。
图2A示出了向流动相中加入EDTA对磷酸化生物分子：一磷酸腺苷(AMP)、二磷酸腺苷(ADP)和三磷酸腺苷(ATP)的峰形的影响。
图2B示出了向流动相中加入EDTA对磷酸化生物分子：三磷酸鸟苷(GTP)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)和葡萄糖-1-磷酸(G-1-P)/葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)的峰形的影响。
图2C示出了整个分析运行中EDTA的色谱图。
图3A示出了向流动相中加入焦磷酸对几种有机酸和磷酸化生物分子的峰形的影响。
图3B示出了向流动相中加入焦磷酸对几种其它有机酸和磷酸化生物分子的峰形的影响。
图3C示出了整个分析运行中焦磷酸的色谱图。
图4A示出了向流动相中加入亚撑二磷酸对几种有机酸和磷酸化生物分子的峰形的影响。
图4B示出了向流动相中加入亚撑二磷酸对几种其它有机酸和磷酸化生物分子的峰形的影响。
图4C示出了单独的亚撑二磷酸的色谱图。
图5A示出了：在不锈钢(SSTL)***中，向流动相中加入亚撑二磷酸对有机酸和磷酸化生物分子的峰形的影响。
图5B示出了：在不锈钢(SSTL)***中，向流动相中加入亚撑二磷酸对有机酸和磷酸化生物分子的峰形的影响。
图6A示出了提高亚撑二磷酸(添加剂)的浓度对有机酸的峰形的影响。
图6B示出了提高亚撑二磷酸(添加剂)的浓度对磷酸化生物分子的峰形的影响。
图7A示出了：亚撑二磷酸并不如离子配对试剂一样残留(linger)在LC***中。
图7B示出了放大比例的第五次添加剂后(post-additive)运行。
图8示出了：含有磷酸基团的杀虫剂(例如草甘膦和氨基甲膦酸(AMPA))对样品流动路径中的金属敏感。
图9示出了向流动相中加入亚撑二磷酸对几种杀虫剂的峰形和信号的影响。
图10A示出了：含有和不含添加剂亚撑二磷酸时，各种单磷酸化磷酸肽的LC性能。
图10B示出了：含有和不含添加剂亚撑二磷酸时，各种双磷酸化磷酸肽的LC性能。
图10C示出了：含有和不含添加剂亚撑二磷酸时，各种三磷酸化磷酸肽或四磷酸化磷酸肽的LC性能。
图11示出了本文所公开方法的流程图。具体地，将样品注入包含溶剂和添加剂(例如，亚撑二磷酸、焦磷酸)的流动相中，然后进入填充有固定相的液相色谱柱；通过使含有样品的流动相流经液相色谱柱，在分离液相色谱柱中的一种或多种分析物的条件下进行色谱；和分析一种或多种分离的分析物。最后，通过质谱分析分离的分析物。
具体实施方式
亚撑二磷酸的IUPAC名称是甲烷二基双(膦酸)。其他名称是甲烷二膦酸；亚甲基双(膦酸)；亚甲基二膦酸盐；亚甲基二膦酸；膦酰甲基膦酸；和MDP。焦磷酸的IUPAC名称是二磷酸和μ-氧化-双(二羟氧氧化磷(μ-oxido-bis(dihydroxidooxidophosphorus))。
在本文中，范围可以表示为从“约”一个特定值和/或至“约”另一个特定值。当表示这样的范围时，另一方面包括自某一特定值始和/或至另一特定值止。类似地，当使用先行词“约”表示值为近似值时，应理解，特定值形成另一方面。还应当理解，每个范围的端点在与另一个端点有关和与另一个端点无关时，都是有意义的。还应当理解，本文公开了许多值，并且除了值本身之外，每个值还在本文中被公开为“约”该特定值。例如，如果公开了值“10”，则“约10”也被公开。还应当理解，两个特定单位之间的每个单位也被公开。例如，如果公开了10和15，则还公开了11、12、13和14。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然描述了优选的方法、装置和材料，但在本公开的实践或试验中可以使用与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料。本文引用的所有参考文献均通过引用整体并入。
液相色谱-质谱(LC-MS)是一种用于回答越来越多的重大的临床和生物学问题的重要分析技术。带电分子例如核苷酸和肽是与这些问题和难题特别相关的分子。然而，由于若干技术原因，带负电分子诸如核苷酸或磷酸肽的LC-MS分离和分析一直很困难。一些技术例如添加离子配对试剂可污染LC***和柱，而且不能被洗掉，这迫使用户将LC***和柱专门用于一种特定应用。困扰带负电分子的LC-MS的另一个问题是峰形差。差的峰形会降低解析不同分析物的能力，并干扰准确的定量。以前，研究人员将LC-MS***中的微量金属污染确定为带负电分子峰形差的原因。为了克服痕量金属污染的问题，他们用EDTA冲洗***或者向流动相中加入EDTA。遗憾的是，EDTA被保留在某些类型的柱上，从而导致靶标化合物的离子抑制。向流动相中加入EDTA还限制了使用LC-MS***进行负离子模式分析。
为了克服这些问题，本公开提供了一种通过与质谱联用的液相色谱来分析样品中的分析物的方法。所述方法包括：提供填充有固定相的液相色谱柱，并提供包含一种或多种溶剂和亚撑二磷酸添加剂的流动相。在所述方法中，将样品注入流动相中，并通过使含有样品的流动相流经液相色谱柱，在分离液相色谱柱中的分析物的条件下进行色谱。最后，在质谱(MS)***中分析一种或多种分离的分析物，所述***通常包括离子源、质量分析仪和离子检测器。
例如，来自LC柱的输出(即含有分离的分析物的流动相)可被引入MS***的离子源中。离子源使分析物离子化，所产生的分析物离子被转移到MS***的质量分析仪中，在质量分析仪中，根据分析物离子的不同m/z比对分析物离子进行分选。然后通过MS***的离子检测器检测经质量鉴别的离子，所述离子检测器测量每个检测到的m/z比的丰度。通过LC/MS***处理来自离子检测器的信号输出以产生LC/MS数据。如本领域技术人员所理解的，LC/MS数据可以作为提取离子色谱图(EIC)呈现。对于选定的m/z比，EIC是作为采集时间(也被称为保留时间或洗脱时间)的函数的离子丰度(信号强度)的图，其可以针对总采集时间的选定跨度进行过滤。
出乎意料的是，上述方法涉及令人惊讶的发现：向流动相中加入亚撑二磷酸会导致带负电分子的峰形显著改善，观察到最低程度的信号抑制或没有信号抑制。更具体地说，向流动相中加入亚撑二磷酸能够改善多种带负电分子(包括核苷酸、磷酸肽和杀虫剂)的峰形和信号强度。与EDTA或离子配对试剂不同的是，在多次色谱运行后，亚撑二磷酸添加剂易于从LC/MS***中清除，并且不显示残留信号。此外，溶剂***中具有亚撑二磷酸添加剂的LC-MS可以使用质谱仪以正模式分析和负模式分析运行。因此，使用含有亚撑二磷酸添加剂的流动相的LC-MS方法令人惊讶地提供了用于带负电分析物的改善的峰形和分辨率。发明人还检测了焦磷酸作为流动相添加剂。然而，焦磷酸随着时间的推移水解成正磷酸是确定的。参见Nelson,AK 1964Hydrolysis Rates of Solutions of Pyrophosphoric Acid JChemical&Engineering Data 9(3)357-357。这使得焦磷酸作为某些应用的添加剂不如亚撑二磷酸理想，因为焦磷酸溶液随时间的降解可能会导致不一致的结果。此外，观察到：亚撑二磷酸添加剂相较于等摩尔的焦磷酸添加剂提供了改善的分析物信号的增强。图3A、3B、4A和4B中示出了这个优点。与等摩尔浓度的焦磷酸相比，亚撑二磷酸提供了更优的α-酮戊二酸、单磷酸腺苷和L-谷氨酰胺的增强。与等摩尔浓度的焦磷酸相比，亚撑二磷酸对谷氨酸和苹果酸的抑制也较小。
通常，可以在LC柱上游的任何点，将亚撑二磷酸加入流动相或用于形成流动相的各种溶剂之一中。在一个典型的非排他性实施方式中，流动相包含至少两种溶剂，例如水和有机化合物(例如乙腈、甲醇等)。在这种情况下，将溶剂混合在一起以形成流动相，其中在色谱运行期间两种(或更多种)溶剂的相对浓度是固定的(即等度模式)或随时间变化(即梯度模式)。为此，LC***可以包括混合器，所述混合器可以是将由不同溶剂储存器供应的溶剂流合并的简单的三通连接，或者可以是设计为增强混合的均匀性的更复杂的配置。LC***可被配置用于高压混合或低压混合。
在高压混合配置中，各个泵的入口(在泵的低压侧)可经由各个溶剂供应线(例如导管、管道等)与各个溶剂储存器连通。溶剂混合器位于泵的下游(即在泵的高压出口侧)，并经由通向混合器的各个入口的各个出口线连接到泵的出口。例如，一个泵可以在高压下输出溶剂A，而另一个泵可以在高压下输出溶剂B。然后在下游混合器中合并所得的高压溶剂流，从而在下游混合器的出口处形成多溶剂(例如溶剂A+溶剂B)流动相。溶剂的相对浓度(混合比)可以通过来自各个泵的各种溶剂各自的流速来控制，例如在往复式活塞泵的情况下通过控制活塞速度。因此，如本领域技术人员所理解的，根据等度或梯度操作模式，可以通过控制泵来控制用作流动相的复合溶剂的混合比。混合器位于样品注射器和LC柱的上游。泵在高***压力下驱动流动相从混合器到LC柱。样品注射器将样品塞注入混合器和LC柱之间的高压流动相流动路径中。
作为一个非排他性实例，如本领域技术人员所理解的，样品注射器可以是或者包括多端口注射阀，所述多端口注射阀包括样品可被初始装载到其中的样品环。注射阀可以从样品被装载到样本环中之处的样品装载位置(例如，处于或接近大气压)切换到样本注射位置，在此处，样本可从样本环转移到高压流动相流动路径。如本领域技术人员所理解的，注射阀的转换可能需要相对于注射阀的流体端口移动(旋转或线性平移)注射阀的流体通道以建立不同的流动路径。
在刚刚描述的高压混合配置中，可将添加剂加入一个或多个溶剂储存器中，或者加入一个或多个通向泵入口的溶剂供应线中，或者加入一个或多个从泵通向混合器的出口线中，或直接加入混合器中。或者，可将添加剂加入样品中，使得添加剂与样品一起通过样品注射器注入流动相流动路径中。
在低压混合配置(作为高压混合配置的替代方式)中，混合器位于泵的上游(即在泵的低压入口侧)。例如，混合器的形式可以是位于溶剂储存器和泵之间的比例阀。比例阀的入口经由各个溶剂供应线连接到溶剂储存器，并且比例阀的出口经由公共流动相输送线连接到泵的入口。比例阀被配置为接收来自各个溶剂储存器的各种溶剂的流，混合溶剂，并且以选定的混合比将所得到的复合溶剂(流动相)输出到泵的入口。通过比例阀建立的混合比在等度模式的情况下可以是恒定的或者在梯度模式的情况下随时间变化。因此，如本领域技术人员所理解的，根据等度或梯度操作模式，可以通过控制比例阀来控制用作流动相的复合溶剂的混合比。泵接收来自比例阀的流动相，并在高***压力下驱动流动相到LC柱。样品注射器将样品塞注入泵出口和LC柱之间的高压流动相流动路径中。
在刚刚描述的低压混合配置中，可将添加剂加入一个或多个溶剂储存器中，或者加入一个或多个通向比例阀入口的溶剂供应线中，或者加入从比例阀通向泵的公共流动相输送线中，或直接加入比例阀中。或者，可将添加剂加入样品中，使得添加剂与样品一起通过样品注射器注入流动相流动路径中。
如上所述，可通过以适当的方式将LC柱与离子源流动偶联，将来自LC柱的输出引入MS***的离子源中。在一个典型但非排他性实施方式中，MS***的离子源中提供的离子化装置是电喷雾离子化(ESI)装置。然而，可以替代地使用适合与LC仪器偶联并适合被分析的样品类型的其他类型的离子化装置，特别是其他类型的大气压离子化(API)装置。其他类型的API离子化装置的实例包括但不限于其他喷雾型装置(例如，热喷雾离子化装置等)、大气压化学离子化(APCI)装置、大气压光离子化(APPI)装置、大气压等离子体基装置等。
在一个典型但非排他性的实施方式中，MS***中提供的质量分析仪是飞行时间(TOF)分析仪或多极(例如四极)分析仪(例如线性多极电极组件或三维Paul阱)。可适于执行本文公开的方法的质量分析仪的其他实例包括但不限于静电阱(例如Kingdon，Knight和阱)、离子回旋共振(ICR)或Penning阱(例如在傅里叶变换离子回旋共振质谱(FT-ICR或FTMS)中使用的)、电场扇形仪器、磁场扇形仪器等。
在一些实施方式中，MS***可以被配置用于串联MS或MSn。例如，MS***可以包括第一质量分析仪(例如，四极质量过滤器)，接着是离子碎裂装置，接着是第二(最终)质量分析仪(例如，四极质量分析仪或TOF分析仪)。例如，根据从离子源接收的离子，可以调整第一质量分析仪以使仅一种质量(m/z比)的前体(母体)离子向前传递到离子碎裂装置。离子碎裂装置被配置为使前体离子破裂成碎片离子(产物离子或子离子)。然后通过第二质量分析仪分析(质量解析)并通过离子检测器检测碎片离子，由此产生碎片离子谱。离子碎裂装置可被配置为执行例如碰撞诱导解离(CID)、电子捕获解离(ECD)、电子转移解离(ETD)、红外多光子解离(IRMPD)等。如本领域技术人员所理解的，这些类型的配置的实例包括通常被标记为QqQ和QqTOF的那些。
如本领域技术人员所理解的，取决于实施方式，MS***可以包括位于离子源和(最终)质量分析仪之间的离子处理流中的一个或多个中间离子处理装置。除了如上所述的质量分析仪/过滤器和离子碎裂装置之外，这种中间离子处理装置可以包括例如离子导向器、离子阱、基于离子漏斗的装置以及被配置为执行各种离子束操纵功能(例如聚焦、成形、转向、偏转、冷却(加热)、加速、减速、限幅(slicing)等)的各种离子束光学器件。
取决于实施方式，质谱仪中提供的离子检测器可以是例如电子倍增器(EM)、光电倍增器、微通道板(MCP)检测器、法拉第杯(Faraday cup)等。
LC/MS***还可以包括配置为控制、监测和/或计时(timing)LC/MS***的各种装置的操作的***控制器(例如，计算装置)。控制器的一个或多个模块可以是例如计算机工作站、台式计算机、膝上型计算机、便携式计算机、平板计算机、手持式计算机、移动计算设备、个人数字助理(PDA)、智能手机等，或者体现在例如计算机工作站、台式计算机、膝上型计算机、便携式计算机、平板计算机、手持式计算机、移动计算设备、个人数字助理(PDA)、智能手机等之中。控制器可以包括一个或多个电子处理器、存储器、数据库等。控制器可以被配置为接收来自离子检测器的离子测量信号，并根据需要执行与数据采集和信号分析有关的任务以生成表征所分析样品的LC/MS数据(例如色谱图、质谱、3D图或伪3D热图等)。控制器还可以被配置为提供和控制用户界面，所述用户界面提供用户可以与之交互的LC/MS数据和其他数据的屏幕显示。控制器还可以被配置为执行数据处理算法，例如用于LC/MS数据的解卷积。控制器可以包括一个或多个读取装置，所述读取装置上或中可以装载非暂时性或有形的计算机可读(机器可读)介质，所述介质包括用于执行本文公开的任何方法的全部或部分的指令。为了所有这些目的，控制器可以经由有线或无线通信链路与LC/MS***的各种组件进行电通信。同样为了这些目的，如本领域技术人员所理解的，控制器可以包括一种或多种类型的硬件、固件和/或软件。
应该理解的是，LC和MS***及其各种组件的操作和设计对于本领域技术人员而言通常是已知的，因此在本文中无需详述。相反，上文已经简述了某些组件和功能方面，以便于理解目前公开的主题。
下文描述了通过LC/MS分析样品中的一种或多种分析物的方法的非限制性实例。
实施例1
EDTA作为流动相添加剂
如在背景中所讨论的，文献中有关于使用EDTA来改善LC的性能的报道。参见Pesek等人2011和Myint等人2009。为了研究这一点，进一步进行了几个实验。在HILIC柱上，在pH9.0下，使用10mM乙酸铵，在洗脱剂中含有或不含5μM EDTA的情况下分析有机酸(琥珀酸、苹果酸、柠檬酸/异柠檬酸、α-酮戊二酸(α-KG)、L-谷氨酰胺和谷氨酸(Sigma Aldrich,St.Louis,MO))的样品(15ng)。连接毛细管是PEEK衬里的，1290二元泵偶联到6545Q-TOF仪器(Agilent Technologies,Inc.,Santa Clara,CA)。溶剂A由在水中的10mM乙酸铵(pH9.0)组成。溶剂B由在90:10乙腈/水中的10mM乙酸铵(pH 9.0)组成。对于每个实验，流速为0.25ml/min，将3μl样品体积注射到柱上。装载样品溶液后，用90％溶剂B调节柱2分钟，然后利用溶剂A应用梯度。梯度洗脱曲线为：从90％B到40％B，10分钟；然后用20％B洗涤3分钟。接着用90％B平衡柱8分钟，随后进行分析。在6545Q-TOF***上采集全MS(MS1)数据，质量范围为50-1000m/z，采集速率为1个谱/s。将仪器设置为负模式进行分析。结果如图1A-1C所示。添加EDTA时，苹果酸和柠檬酸的峰形得到改善，但是由于EDTA的离子抑制，所有代谢物的信号强度均降低。
在另一组实验中，在HILIC柱上，在pH 9.0下，使用10mM乙酸铵，在洗脱剂中含有或不含5μM EDTA的情况下分析磷酸化生物分子的样品(15ng)。具体来说，研究了一磷酸腺苷(AMP)、二磷酸腺苷(ADP)、三磷酸腺苷(ATP)、三磷酸鸟苷(GTP)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)、葡萄糖-1-磷酸(G-1-P)/葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)进行了研究(Sigma Aldrich)。结果如图2A-2C所示。添加EDTA时，磷酸化化合物的峰形得到改善，但是由于EDTA的离子抑制，所有代谢物的信号强度均降低。
实施例2
焦磷酸作为流动相添加剂
在HILIC柱上，使用含有10mM乙酸铵(pH 9.0)的流动相，在洗脱剂中含有或不含5μM焦磷酸的情况下分析样品(15ng)。连接毛细管是PEEK衬里的，1290二元泵偶联到6545Q-TOF仪器。结果如图3A-3B所示。在流动相中添加5μM焦磷酸时，磷酸化化合物和有机酸展示出更好的峰形。令人惊讶的是，添加EDTA时所观察到的离子抑制效应在使用焦磷酸作为添加剂时没有观察到。
实施例3
甲撑二磷酸作为流动相添加剂
在HILIC柱上，使用含有10mM乙酸铵(pH 9.0)的流动相，在洗脱剂中含有或不含5μM亚撑二磷酸的情况下分析样品(15ng)。连接毛细管是PEEK衬里的，1290二元泵偶联到6545Q-TOF仪器。结果如图4A-4B所示。在流动相中添加5μM亚撑二磷酸时，磷酸化化合物和有机酸展示出更好的峰形。令人惊讶的是，添加EDTA时所观察到的离子抑制效应在这里没有观察到。更重要的是，亚撑二磷酸产生了比焦磷酸更好的结果，因此作为更好的流动相添加剂起作用。
使用第二液相色谱***，在HILIC柱上，在不锈钢(SSTL)硬件中，使用10mM乙酸铵(pH 9.0)，在使用或不使用5μM亚撑二磷酸作为流动相溶剂的情况下分析15ng样品。除了柱和质谱仪之间的连接毛细管是PEEK之外，所有的连接毛细管都是SSTL。5次连续运行之后，转换流动相。结果如图5A-5B所示。在SSTL***中，与上述结果类似，添加亚撑二磷酸改善了峰形和信号强度。磷酸化化合物(特别是二磷酸核苷和三磷酸核苷以及NADP)的结果显著改善。
实施例4
深入研究亚撑二磷酸作为流动相添加剂
在这组实验中，在HILIC柱上，使用10mM乙酸铵(pH 9.0)，使用指定浓度的添加剂A(亚撑二磷酸)分析1ng有机酸或磷酸化生物分子的样品。参见图6A-6B。连接毛细管是PEEK衬里的，1290二元泵偶联到6490iFunnel QQQ仪器(Agilent Technologies,Inc.)。试剂和色谱条件与实施例1中描述的相同。建立MRM方法以在6490iFunnel QQQ***上获取数据。将仪器设置为负模式进行分析。5次连续运行之后，转换流动相。结果如图6A-6B所示。随着流动相溶剂中亚撑二磷酸浓度的增加，靶标分析物的信号强度和峰形也提升。对于浓度较高的一些阴离子化合物，观察到信号强度的离子抑制。
与离子配对试剂不同，多次运行后，亚撑二磷酸不继续显示信号。在流动相中含有亚撑二磷酸时，3次运行(75分钟)后，将LC仪器放置过夜，再进行3次运行(75分钟)。然后将流动相转换至不含亚撑二磷酸的流动相，进行5次运行(125分钟)。结果如图7A-7B所示。
实施例5
使用亚撑二磷酸作为流动相添加剂时的柱性能
在Water的BEH AmideXP柱(SSTL硬件)、SSTL硬件中填充有HILIC颗粒的SSTL柱、PEEK衬里的SSTL硬件中填充有HILIC颗粒的PEEK衬里的柱上分析1ng杀虫剂[草铵膦、草甘膦、氨甲基膦酸(AMPA)]。使用不含添加剂的10mM乙酸铵(pH 9.0)作为流动相溶剂并在6490iFunnel QQQ仪器上分析。结果如图8所示。这些结果显示：含磷酸的杀虫剂(例如草甘膦和AMPA)对样品流动路径中的金属敏感。这是很明显的，因为观察到在BEH AmideXP和SSTL柱上分析的草甘膦和AMPA的信号降低且峰形差。而PEEK衬里的SSTL柱产生的峰形和强度比具有SSTL硬件的其他两种柱要好得多。相反，对于不含磷酸根基团的草铵膦，信号和峰形一般不受影响。接下来，在PEEK衬里的SSTL柱上，使用10mM乙酸铵(pH 9.0)，在6490QQQ仪器上分析1ng杀虫剂。结果如图9所示。正如所预期的那样，对于草甘膦和AMPA，向流动相溶剂中加入5μM亚撑二磷酸时，峰形和信号强度得到改善。有趣的是，我们观察到对草铵膦信号的轻微离子抑制。
实施例6
使用亚撑二磷酸进行磷酸肽分析的柱性能
使用反相液相色谱在AdvBio肽柱(2.1×100mm)上分析5pmol(2.5μl)磷酸肽混合物(Sigma Aldrich,p/n MSP1L,MSP3L)。溶剂A由MilliQ净化水和0.1％甲酸组成。溶剂B由乙腈和0.1％甲酸组成。对于每个实验，流速为0.25ml/min，将2.5μl样品体积注射到柱上。装载样品溶液后，用3％溶剂B调节柱2分钟，然后利用溶剂A应用梯度。梯度洗脱曲线为：从3％B到38％B，10分钟；然后用90％B洗涤3分钟。接着用3％B平衡柱8分钟，随后进行分析。在6550iFunnel Q-TOF***(Agilent Technologies,Inc.)上采集全MS(MS1)数据，质量范围为400-1250m/z，采集速率为1个谱/s。将仪器设置为正模式进行分析。将运行重复5次。这些结果清楚显示：向流动相溶剂中加入亚撑二磷酸促进了在不存在添加剂的情况下检测不到的磷酸肽的检测。肽序列的粗体文本表示磷酸化的残基。结果如图10A-10C所示。图10A中示出了如下结果：VLHSG(pS)R，SEQ ID NO:1；RDSLG(pT)YSSR，SEQ ID NO:2；EVQAEQPSS(pS)SPR，SEQ ID NO:3；ADEP(pS)SEESDLEIDK，SEQ ID NO:4；FEDEGAGFEES(pS)ETGDYEEK，SEQ IDNO:5。图10B中示出了如下结果：RS(pY)(pS)RSR，SEQ ID NO:6；(pT)KLI(pT)QLRDAK，SEQ IDNO:7；ADEPS(pS)EE(pS)DLEIDK，SEQ ID NO:8；ELSN(pS)PLRENSFG(pS)PLEFR，SEQ ID NO:9；SPTEYHEPV(pY)ANPFYRPT(pT)PQR，SEQ ID NO:10。图10C中示出了如下结果：SL(pS)(pY)(pS)PVER，SEQ ID NO:11；LQG(pS)GV(pS)LA(pS)K，SEQ ID NO:12；PP(pY)(pS)RVI(pT)QR，SEQ ID NO:13；ADEP(pS)(pS)EE(pS)DLEIDK，SEQ ID NO:14；和(pS)RSR(pS)Y(pT)PE(pY)R，SEQ ID NO:15。
图11示出了本文所公开方法的流程图。在该方法中，液相色谱柱填充有固定相。将样品注入流动相中并引入液相色谱柱中。流动相包含溶剂和添加剂(例如，亚撑二磷酸、焦磷酸)。当流动相流过固定相时，样品在液相色谱柱中分离成一种或多种分析物。当分析物离开柱时，通过质谱分析它们。
序列表
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在本文中使用时，术语“流体”在一般意义上用于指可流过导管的任何物质。因此，除非另有规定或上下文另外指出，术语“流体”一般可以指液体、气体或超临界流体。
在本文中使用时，术语“液体”通常涵盖具有单一化合物组成的液体，或两种或更多种不同液体(例如两种或更多种不同溶剂)的混合物。液体可以是溶液、悬浮液、胶体或乳液。液体中可以存在固体颗粒和/或气泡。
在本文中使用时，本说明书以及权利要求书中所使用的动词“包含”、“包括”及其变体以其非限制性含义使用，用来表示包括该词之后的项目，但并不排除没有具体提及的项目。
在整个说明书中，词语“包含”、“包括”或其变体应被理解为意味着包括所述要素、整体或者步骤，或者要素、整体或者步骤的组，但是不排除任何其他要素、整体或步骤，或要素、整体或步骤的组。本公开可以适当地“包括/包含权利要求中描述的步骤、要素和/或试剂”，“由权利要求中描述的步骤、要素和/或试剂组成”或“基本上由权利要求中描述的步骤、要素和/或试剂组成”。
还应指出：权利要求可被撰写为排除任何任选的要素。因此，这种陈述旨在作为与权利要求要素的引述相关的如“只”、“仅”等的这样的排他性术语的使用的前置基础，或“否定性”限制的使用的前置基础。
应该理解：在不脱离本发明的范围的情况下，可以改变本发明的各个方面或细节。此外，前面的描述仅仅是为了说明的目的，而不是为了限制的目的，本发明由权利要求限定。
序列表
<110> 安捷伦科技有限公司
<120> 经改进的用于阴离子化合物的液相色谱法
<130> 20170060-01
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
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<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> PHOSPHORYLATION
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> PHOSPHORYLATION
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> PHOSPHORYLATION
<400> 12
Leu Gln Gly Ser Gly Val Ser Leu Ala Ser Lys
1 5 10
<210> 13
<211> 10
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> synthetic sequence
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> PHOSPHORYLATION
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> PHOSPHORYLATION
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> PHOSPHORYLATION
<400> 13
Pro Pro Tyr Ser Arg Val Ile Thr Gln Arg
1 5 10
<210> 14
<211> 15
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> synthetic sequence
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> PHOSPHORYLATION
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> PHOSPHORYLATION
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> PHOSPHORYLATION
<400> 14
Ala Asp Glu Pro Ser Ser Glu Glu Ser Asp Leu Glu Ile Asp Lys
1 5 10 15
<210> 15
<211> 11
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> synthetic sequence
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> PHOSPHORYLATION
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> PHOSPHORYLATION
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> PHOSPHORYLATION
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> PHOSPHORYLATION
<400> 15
Ser Arg Ser Arg Ser Tyr Thr Pro Glu Tyr Arg
1 5 10

Claims (10)

1.一种通过与质谱联用的液相色谱分析样品中的一种或多种分析物的方法，所述方法包括：
提供填充有固定相的液相色谱柱；
提供包含一种或多种溶剂和甲撑二磷酸添加剂的流动相；
将所述样品注入所述流动相中；
通过使含有所述样品的所述流动相流经所述液相色谱柱，在分离所述液相色谱柱中的所述一种或多种分析物的条件下进行色谱；和
利用质谱仪分析一种或多种分离的分析物。
2.权利要求1所述的方法，其中所述甲撑二磷酸添加剂当所述一种或多种分析物全部被分离时都存在。
3.权利要求1所述的方法，其中所述甲撑二磷酸添加剂只有当所述一种或多种分析物中的一些被分离时才存在。
4.权利要求1所述的方法，其中所述液相色谱柱选自由如下组成的组：
亲水相互作用液相色谱(HILIC)柱；
反相液相色谱(RPLC)柱；
以离子配对模式运行的反相液相色谱(RPLC)柱；和
尺寸排斥柱。
5.权利要求1所述的方法，其中所述质谱以正模式分析和负模式分析运行。
6.权利要求1所述的方法，其中所述甲撑二磷酸以选自如下的浓度存在：约1.0μM至约10.0μM和约2.5μM至约7.5μM。
7.权利要求1所述的方法，其中所述流动相含有两种或更多种溶剂，所述溶剂在所述色谱期间产生浓度梯度，并且亚撑二磷酸的浓度在所述色谱期间保持恒定。
8.权利要求1所述的方法，其中所述流动相含有两种或更多种溶剂，所述溶剂在所述色谱期间产生浓度梯度，并且亚撑二磷酸的浓度在所述色谱期间发生变化。
9.权利要求1所述的方法，其中所述分析物选自由如下组成的组：阴离子化合物；磷酸化化合物；硫酸化化合物；羧酸化化合物；磷酸肽；杀虫剂、药物或其代谢物。
10.权利要求1所述的方法，其中所述流动相选自由如下组成的组：
所述流动性包含极性溶剂和非极性溶剂；
所述流动相包含水和有机化合物；
所述流动相包含至少两种溶剂，并且根据等度洗脱模式使含有所述样品的所述流动相流经所述液相色谱柱；和
所述流动相包含至少两种溶剂，并且根据梯度洗脱模式使含有所述样品的所述流动相流经所述液相色谱柱。
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