CN102747034A - 一种用于体外分离纯化有核细胞的方法和试剂盒 - Google Patents
一种用于体外分离纯化有核细胞的方法和试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102747034A CN102747034A CN201110097289XA CN201110097289A CN102747034A CN 102747034 A CN102747034 A CN 102747034A CN 201110097289X A CN201110097289X A CN 201110097289XA CN 201110097289 A CN201110097289 A CN 201110097289A CN 102747034 A CN102747034 A CN 102747034A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- suspension
- centrifugal
- added
- test kit
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
一种用于体外分离纯化有核细胞的试剂盒，包括各自隔离包装的沉淀液、纯化液和悬浮液，其中沉淀液是溶于生理盐水的羟乙基淀粉，其重量体积浓度为6％，纯化液是聚蔗糖泛影钠，悬浮液是生理盐水。本发明还提供了所述试剂盒的使用方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于体外分离纯化骨髓、脐带血或外周血中有核细胞的方法和试剂盒。
背景技术
干细胞是具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，是机体的起源细胞，是形成人体各种组织器官的原始细胞。干细胞可以从骨髓、脐带血和外周血中分离纯化干细胞，单个核细胞常用的分离方法主要有以下几种：6％羟乙基淀粉沉降法、甲基纤维素沉降法、Ficoll分离法、Percoll分离法、3％明胶分离法、氯化铵溶解红细胞法，直接离心法等。常用的单核细胞的分离方法为Ficoll或Percoll直接分离法。即将血液稀释后直接加于分离液上经密度梯度离心获得单个核细胞。Ficoll和Percoil均为常用的淋巴细胞分离液，有人曾对这两种分离液对比研究，认为Ficoll分离获得的单个核细胞最为纯净。
现有技术中从骨髓、脐带血和外周血中分离纯化干细胞的方法存在着干细胞活率及回收率较低等缺点，本研究预实验发现，采用Ficoll和Percoll直接分离法操作时间长、不同批次的Fieoll或Pcrcoll、不同的血液样本、同一样本同样操作，收集的单个核细胞的数量多少不一，影响单个核细胞的稳定收集。
我们的实验通过对比研究认为，采用6％羟乙基淀粉结合Ficoll用于分离血液中单核细胞提高了单核细胞的回收率和活率。
发明内容
本发明提供了一种用于体外分离纯化骨髓、脐带血或外周血中有核细胞的方法和试剂盒以及该试剂盒的使用方法。
本发明所述的试剂盒包括各自隔离包装的沉淀液、纯化液和悬浮液，其中沉淀液是溶于生理盐水的羟乙基淀粉，其重量体积浓度为6％，纯化液是聚蔗糖泛影钠，悬浮液是生理盐水。所谓隔离包装是指沉淀液、纯化液和悬浮液各自密封在互不相通的容器中，优选地，各自独立包装。
本发明所述的试剂盒，其中所述的沉淀液∶纯化液∶悬浮液的体积比为(2-5)∶(3-9)∶1。
本发明的试剂盒其中所述试剂盒中还包括使用说明书，所述说明书载明了所述试剂盒的使用方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将经过抗凝处理的骨髓/脐带血/外周血倒入沉淀液试剂瓶中，拧紧瓶盖颠倒混匀5次，拧松瓶盖，静置22-25分钟；
(2)用10ml的移液管将上清液转到50ml的离心管中，每管25ml，尽量不要吸到红细胞沉淀，并配平。
(3)将两个离心管4℃，离心力710xg(转速2000rpm)，5分钟离心，离心完毕后，弃去上清，用手指轻轻震开沉淀，每管加25ml生理盐水重悬细胞。
(4)将纯化液按每管25ml加到另外两个50ml新的离心管中，将第3步中的细胞悬液用移液管缓慢加到纯化液的液面上，保证两种液体之间的液面清晰，然后，4℃，离心力710xg(转速2000rpm)，20分钟离心，关闭离心机刹车功能。
(5)离心后，吸取中间层细胞，加到新的离心管中，用50ml注射用生理盐水稀释，4℃，配平。离心力400xg(转速1500rpm)，8分钟离心洗涤细胞两次。
(6)将洗后的细胞加到悬浮液中，备用。
本发明所述的试剂盒，用于体外分离纯化骨髓/脐带血/外周血中有核细胞。它利用细胞与无机盐离子联合聚集沉淀的原理，采用逆向收集法分离纯化有核细胞。本发明的试剂盒通常在2-8℃保存。
本发明所述的试剂盒，使用的样品类型为骨髓/脐带血/外周血，可以按照通用的方法收集所需的骨髓/脐带血/外周血样本；确保骨髓/脐带血/外周血收集后转入一次性抗凝血袋；骨髓/脐带血/外周血收集后应在6小时内进行分离纯化有核细胞。
本发明所述的试剂盒，回收率可以达到》90％，分离的有核细胞活率≥96％，最大程度地维持了干细胞在体外微环境的恒定。
本发明还公开了所述试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)将经过抗凝处理的骨髓/脐带血/外周血倒入沉淀液试剂瓶中，拧紧瓶盖颠倒混匀5次，拧松瓶盖，静置22-25分钟；
(2)用10ml的移液管将上清液转到50ml的离心管中，每管25ml，尽量不要吸到红细胞沉淀，并配平。
(3)将两个离心管4℃，离心力710xg(转速2000rpm)，5分钟离心，离心完毕后，弃去上清，用手指轻轻震开沉淀，每管加25ml生理盐水重悬细胞。
(4)将纯化液按每管25ml加到另外两个50ml新的离心管中，将第3步中的细胞悬液用移液管缓慢加到纯化液的液面上，保证两种液体之间的液面清晰，然后，4℃，离心力710xg(转速2000rpm)，20分钟离心，关闭离心机刹车功能。
(5)离心后，吸取中间层细胞，加到新的离心管中，用50ml注射用生理盐水稀释，4℃，配平。离心力400xg(转速1500rpm)，8分钟离心洗涤细胞两次。
(6)将洗后的细胞加到悬浮液中，备用。
本发明的细胞活率是采用如下方法进行检测的：
1.吸管吸取90微升分离后的有核细胞悬液。
2.加入0.2％的台盼蓝染色液10微升，混匀。
3.静置3分钟。
4.吸取混合溶液，滴一滴至细胞计数板，均匀铺开后，显微镜下观察。
5.显微镜200倍下人工计数，蓝染的细胞为死细胞(A)，无染色的细胞为活细胞(B)。有核细胞活率＝B/(A+B)*100％
具体实施方式
实施例1
细胞处理试剂盒(骨髓、脐带血、外周血)S100型的制备方法
沉淀液的制备：羟乙基淀粉2.40g溶解在生理盐水40ml中，浓度为6％，37℃水浴，从水浴锅温度稳定在37℃开始计时8小时，37℃水浴8小时后，从水浴锅中取出，室温半小时，保存。
纯化液的制备：HISTOPAQUE1077液(聚蔗糖泛影钠)60ml，从冰箱温度稳定在4℃开始计时8小时。4℃8小时后，从4度冰箱中取出，室温半小时，保存。
悬浮液的制备：用量筒量取20ml生理盐水，保存。
细胞处理试剂盒(骨髓、脐带血、外周血)S100型说明书
【产品名称】
通用名：细胞处理试剂盒
英文名：Cell Isolation Kit
【包装规格】S100型：沉淀液(羟乙基淀粉2.40g溶解在生理盐水40ml中，浓度为6％)40ml；纯化液(聚蔗糖泛影钠)60ml；悬浮液(生理盐水)20ml
【预期用途】用于体外分离纯化骨髓/脐带血/外周血中有核细胞
【作用原理】利用细胞与无机盐离子联合聚集沉淀的原理，采用逆向收集法分离纯化有核细胞。
【主要组成组份】沉淀液：羟乙基淀粉、生理盐水；纯化液：聚蔗糖泛影钠和生理盐水；悬浮液：生理盐水
【贮存条件及有效期】2-8℃保存，有效期24个月。
【适用仪器】低温离心机、离心管和移液管要求使用一次性产品(使用者自备，推荐使用无菌产品)。
【样本要求】
◆本方法推荐的样品类型为骨髓/脐带血/外周血
◆按照通用的方法收集所需的骨髓/脐带血/外周血样本；
◆确保骨髓/脐带血/外周血收集后转入一次性抗凝血袋；
◆骨髓/脐带血/外周血收集后应在6小时内进行分离纯化有核细胞
◆微生物污染的样本对测定结果的影响尚未确定。
【试验方法】
本试剂盒可分离纯化骨髓/脐带血/外周血中有核细胞。细胞活率检测
1吸管吸取90微升分离后的有核细胞悬液。
2加入0.2％的台盼蓝染色液10微升，混匀。
3静置3分钟。
4吸取混合溶液，滴一滴至细胞计数板，均匀铺开后，显微镜下观察。
5显微镜200倍下人工计数，蓝染的细胞为死细胞(A)，无染色的细胞为活细胞(B)。
有核细胞活率＝B/(A+B)*100％
【操作步骤】
1将经过抗凝处理的骨髓/脐带血/外周血倒入沉淀液试剂瓶中，拧紧瓶盖颠倒混匀5次，拧松瓶盖，静置22-25分钟。
2用10ml的移液管将上清液转到两个50ml的离心管中，不要吸到红细胞沉淀，并配平。
3将两个离心管4℃，离心力710xg(转速2000rpm)，5分钟离心，离心完毕后，弃去上清，用手指轻轻震开沉淀，每管加25ml生理盐水重悬细胞。
4将纯化液按每管25ml加到另外两个50ml新的离心管中，将第3步中的细胞悬液用移液管缓慢加到纯化液的液面上，保证两种液体之间的液面清晰，然后，4℃，离心力710xg(转速2000rpm)，20分钟离心，关闭离心机刹车功能。
5离心后，吸取中间层细胞，加到新的离心管中，用50ml注射用生理盐水稀释，4℃，配平。离心力400xg(转速1500rpm)，8分钟离心洗涤细胞两次。
6将洗后的细胞加到悬浮液中，备用。
【正常参考值】分离的有核细胞活率≥96％。
【注意事项】
◆本品用于体外分离纯化骨髓/脐带血/外周血中有核细胞；
◆操作前应仔细阅读使用说明书，严格按说明书的操作程序进行；
◆各试剂使用前应观察有无浑浊，如有则应更换试剂，严格控制每步离心的时间和温度。
Claims (5)
1.一种用于体外分离纯化骨髓、脐带血或外周血中有核细胞的试剂盒，包括各自隔离包装的沉淀液、纯化液和悬浮液，其中沉淀液是溶于生理盐水的羟乙基淀粉，其重量体积浓度为6％，纯化液是聚蔗糖泛影钠，悬浮液是生理盐水。
2.如权利要求1的试剂盒，其中所述的沉淀液、纯化液和悬浮液各自独立包装。
3.如权利要求2的试剂盒，其中所述的沉淀液∶纯化液∶悬浮液的体积比为(2-5)∶(3-9)∶1。
4.如权利要求1-3的任一权利要求所述的试剂盒，其中所述试剂盒中还包括使用说明书，所述说明书载明了所述试剂盒的使用方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将经过抗凝处理的骨髓/脐带血/外周血倒入沉淀液试剂瓶中，拧紧瓶盖颠倒混匀5次，拧松瓶盖，静置22-25分钟；
(2)用10ml的移液管将上清液转到50ml的离心管中，每管25ml，尽量不要吸到红细胞沉淀，并配平；
(3)将两个离心管4℃，离心力710xg(转速2000rpm)，5分钟离心，离心完毕后，弃去上清，用手指轻轻震开沉淀，每管加25ml生理盐水重悬细胞；
(4)将纯化液按每管25ml加到另外两个50ml新的离心管中，将第3步中的细胞悬液用移液管缓慢加到纯化液的液面上，保证两种液体之间的液面清晰，然后，4℃，离心力710xg(转速2000rpm)，20分钟离心，关闭离心机刹车功能；
(5)离心后，吸取中间层细胞，加到新的离心管中，用50ml注射用生理盐水稀释，4℃，配平。离心力400xg(转速1500rpm)，8分钟离心洗涤细胞两次；
(6)将洗后的细胞加到悬浮液中，备用。
5.如权利要求1-4的试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)将经过抗凝处理的骨髓/脐带血/外周血倒入沉淀液试剂瓶中，拧紧瓶盖颠倒混匀5次，拧松瓶盖，静置22-25分钟；
(2)用10ml的移液管将上清液转到50ml的离心管中，每管25ml，尽量不要吸到红细胞沉淀，并配平；
(3)将两个离心管4℃，离心力710xg(转速2000rpm)，5分钟离心，离心完毕后，弃去上清，用手指轻轻震开沉淀，每管加25ml生理盐水重悬细胞；
(4)将纯化液按每管25ml加到另外两个50ml新的离心管中，将第3步中的细胞悬液用移液管缓慢加到纯化液的液面上，保证两种液体之间的液面清晰，然后，4℃，离心力710xg(转速2000rpm)，20分钟离心，关闭离心机刹车功能；
(5)离心后，吸取中间层细胞，加到新的离心管中，用50ml注射用生理盐水稀释，4℃，配平。离心力400xg(转速1500rpm)，8分钟离心洗涤细胞两次；
(6)将洗后的细胞加到悬浮液中，备用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110097289XA CN102747034A (zh) | 2011-04-19 | 2011-04-19 | 一种用于体外分离纯化有核细胞的方法和试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110097289XA CN102747034A (zh) | 2011-04-19 | 2011-04-19 | 一种用于体外分离纯化有核细胞的方法和试剂盒 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102747034A true CN102747034A (zh) | 2012-10-24 |
Family
ID=47027526
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201110097289XA Pending CN102747034A (zh) | 2011-04-19 | 2011-04-19 | 一种用于体外分离纯化有核细胞的方法和试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102747034A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104480070A (zh) * | 2014-11-28 | 2015-04-01 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种人外周血单个核细胞的分离方法 |
| CN111896340A (zh) * | 2020-06-24 | 2020-11-06 | 四川大学华西医院 | 一种可用于流式细胞检测的简便pbmc分离方法 |
| CN112251404A (zh) * | 2020-11-02 | 2021-01-22 | 贵州北科生物科技有限公司 | 一种外周血单个核细胞的分离方法 |
| CN113980894A (zh) * | 2021-12-27 | 2022-01-28 | 深圳博雅感知医疗科技有限公司 | 制备骨髓浓缩细胞的方法及其用于治疗卵巢早衰的用途 |
-
2011
- 2011-04-19 CN CN201110097289XA patent/CN102747034A/zh active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104480070A (zh) * | 2014-11-28 | 2015-04-01 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种人外周血单个核细胞的分离方法 |
| CN111896340A (zh) * | 2020-06-24 | 2020-11-06 | 四川大学华西医院 | 一种可用于流式细胞检测的简便pbmc分离方法 |
| CN112251404A (zh) * | 2020-11-02 | 2021-01-22 | 贵州北科生物科技有限公司 | 一种外周血单个核细胞的分离方法 |
| CN113980894A (zh) * | 2021-12-27 | 2022-01-28 | 深圳博雅感知医疗科技有限公司 | 制备骨髓浓缩细胞的方法及其用于治疗卵巢早衰的用途 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Roos et al. | [8] Purification and cryopreservation of phagocytes from human blood | |
| Bøyum et al. | Separation of leucocytes: improved cell purity by fine adjustments of gradient medium density and osmolality | |
| US4004975A (en) | Method of isolating and cryopreserving human white cells from whole blood | |
| EP3434759A1 (en) | Method and kit isolating microorganisms from culture | |
| CN102764133A (zh) | 一种可直接分离血浆的真空采血管及其方法 | |
| WO2012026970A2 (en) | Centrifuge and separation vessel therefore | |
| JP2017523432A (ja) | 全血サンプルの安定化 | |
| CN102747034A (zh) | 一种用于体外分离纯化有核细胞的方法和试剂盒 | |
| CN102321583B (zh) | 一种通过阶梯离心分离脐带血造血干细胞的方法 | |
| CN104031831B (zh) | 一种血细胞分离管和单个核细胞的分离方法 | |
| CN102212514B (zh) | 一种用于血液采集容器的血液促凝剂 | |
| CN102604890A (zh) | 脐带血间充质干细胞分离液及分离流程 | |
| CN108577863A (zh) | 一种全自动全血采集分离*** | |
| CN104990780B (zh) | 一种制作细胞块的方法 | |
| CN105454220B (zh) | 一种胎盘保存方法、胎盘保存液及其制备方法 | |
| Plaza et al. | Evaluation of platelet function during extended storage in additive solution, prepared in a new container that allows manual buffy-coat platelet pooling and leucoreduction in the same system | |
| CN102844121A (zh) | 离心分离管 | |
| CN102747036A (zh) | 体外分离纯化有核细胞且能去除红细胞的方法和试剂盒 | |
| Solves et al. | Volume reduction in routine cord blood banking | |
| CN102680717A (zh) | 输血相容性检测室内质控品试剂盒及其生产工艺 | |
| CN102747035A (zh) | 一种体外分离有核细胞且能去除红细胞的方法和试剂盒 | |
| CN108588009A (zh) | 一种分离并激活人外周血极小胚胎样干细胞的方法 | |
| CN103900890A (zh) | 一种采用纳米膜浓缩法提取尿微囊泡的方法 | |
| CN207649987U (zh) | 适用于水体中悬浮颗粒物和浮游生物的分离*** | |
| CN106860480A (zh) | 一种血小板及含有血小板的制剂的制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20121024 |