CN113549575A - 一种高产蛋白酶的枯草芽孢杆菌fm-20菌株及其应用 - Google Patents

一种高产蛋白酶的枯草芽孢杆菌fm-20菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高产蛋白酶的枯草芽孢杆菌FM‑20菌株及其应用，该菌株已于2021年5月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.22509；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该枯草芽孢杆菌FM‑20菌株具有产蛋白酶的高活力，能够降低含氮、含硫物质以粪便的形式排放，还能够抑制大肠杆菌等有害菌的活动，且可耐受胃酸和胆盐以及高温，安全性好，无毒无污染，可用作禽类的饲料添加剂。

Description

一种高产蛋白酶的枯草芽孢杆菌FM-20菌株及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种高产蛋白酶的枯草芽孢杆菌FM-20菌株及其应用。
背景技术
家禽养殖过程中的***物会产生大量的有害气体，其中氨气(NH3)、硫化氢(H2S)对家禽的生产性能影响最大。舍内的氨气和硫化氢含量达到一定浓度后，会使鸡群抗病能力急剧下降，尤其在冬春季节，禽舍内温度低、湿度大、通风效果差，氨气、硫化氢等有害气体浓度偏高，更加影响了鸡群的生产性能和健康水平。同时鸡场的有害气体最终排放到大气中还会加剧环境污染的程度。
研究者们采用调整畜禽日粮结构控制臭气的产生，如应用酶制剂、植物型提取物、微生态制剂，以及硫酸亚铁等化合物、大豆低聚糖等功能性寡糖，并通过采用沸石粉等吸附剂吸附、天然芳香油等香料掩蔽型方式减少污染气体、改善鸡舍内环境，以期提高肉鸡生长性能和健康水平。
目前，发展潜力最大，研究最多的减少有害气体产生的方法主要是微生物法。近年来，芽孢杆菌益生菌受到较多的关注，是微生态制剂研究的一个热点。
发明内容
针对氨气、硫化氢等有害气体影响鸡群的生产性能和健康水平的技术问题，本发明提供一种高产蛋白酶的枯草芽孢杆菌FM-20菌株及其应用。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
第一方面，本发明实施例提供一种高产蛋白酶的枯草芽孢杆菌FM-20菌株，其分类名称为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，于2021年5月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.22509；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
氨气、硫化氢等有害气体主要是家禽***物中未被消化的营养物质和一些有机化合物在微生物的作用下产生的。因此，提高蛋白消化率，减少家禽粪便中含氮、含硫物质的残留量，可有效减少氨气、硫化氢等有害气体的排放。本发明所提供的枯草芽孢杆菌FM-20菌株从健康肉鸡粪便中经干酪素平板初筛、液体摇瓶发酵法复筛而得，属于芽孢杆菌属，其产生的蛋白酶、淀粉酶等外源性酶类能够增强禽类动物的肠道功能，促进其对营养物质的消化吸收，提高其消化***的蛋白酶活力，从而提高蛋白质等营养物质的消化吸收率，降低含氮、含硫物质以粪便的形式排放，有效减少鸡舍内空气中氨气、硫化氢的含量。同时，该枯草芽孢杆菌FM-20菌株还能抑制大肠杆菌等有害菌的活动，减少蛋白质转化为氨、胺和其他有害物质或气体，减少空气污染。并且该枯草芽孢杆菌FM-20菌株可耐受胃酸和胆盐以及菌剂加工过程中的高温环境，且安全性好，无毒无污染，可用作禽类的饲料添加剂。其16SrDNA序列如下所示(SEQ ID No.1)：
TGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAA。
该枯草芽孢杆菌FM-20菌株的筛选方法具体包括以下步骤：
①取健康肉鸡的粪便经热处理后梯度稀释，涂布在蛋白酶鉴别培养基上培养24h，挑取生长良好、有明显透明圈的单菌落，从中挑取水解圈直径与菌落直径的比值大于2.0的菌株，作为初筛菌株；
②从步骤①得到的初筛菌株转接到NA培养基斜面上培养24h活化菌株，将活化后的菌株分别接种到NB培养液中，摇床培养48h后离心，取上清液；用打孔器在已灭菌的蛋白酶鉴别培养基平板上均匀打孔，将得到的上清液分别取75μL注入孔中，于37℃恒温培养24h，选出水解圈直径与菌落直径的比值在2.0以上的菌株；
③通过蛋白酶活力测定、抑氨特性试验、抑硫特性试验、对大肠杆菌病原菌的抑制试验及抑菌物质性质的初步鉴定、耐胆酸盐特性试验、人工胃液耐受性试验、人工肠液耐受性试验、高温耐受性试验筛选得到所述枯草芽孢杆菌FM-20菌株。
第二方面，本发明实施例还提供上述枯草芽孢杆菌FM-20菌株在减少禽类***物中氨气和硫化氢排放中的应用。
本发明提供的枯草芽孢杆菌FM-20菌株具有较高的产蛋白酶活力，可达到202.3U/mL，并且其产生的抑菌物质还能抑制大肠杆菌等有害菌的活动，减少蛋白质转化为氨、胺和其他有害物质或气体，且可耐受胃酸和胆盐以及高温，可通过拌入饲料或混入饮用水中等方式给予禽类动物服用，以减少其粪便中氨气和硫化氢的排放量，减少空气污染，改善舍内环境。
第三方面，本发明实施例还提供上述枯草芽孢杆菌FM-20菌株的发酵产物，所述发酵产物由所述枯草芽孢杆菌FM-20菌株发酵制得。发酵所得产物可进一步加工成可用于饲料或饮用水中的产品。
优选地，所述发酵产物的制备方法包括：将所述枯草芽孢杆菌FM-20菌株在NA培养基上培养16-24h，将培养后的菌株接种至NB培养液中，在35-37℃、180-220r/min摇床培养24-48h，离心，取上清液。该发酵上清液中含有枯草芽孢杆菌FM-20菌株的发酵产物，可拌入饲料中饲喂动物，也可加入禽类动物的日常饮用水中。
优选地，所述离心为10000r/min，4℃离心5min。
第四方面，本发明实施例还提供一种菌剂，所述菌剂由上述枯草芽孢杆菌FM-20菌株经发酵后制得。该菌剂可作为饲料添加剂使用，以减少禽类***物中氨气和硫化氢的排放。
该菌剂的制备方法可采用如下方式：将所述枯草芽孢杆菌FM-20菌株发酵，获得菌泥，将所述菌泥干燥后与填充料混合或分别与填充料混合后干燥后，即得所述菌剂。
具体可采用如下操作过程：
将所述枯草芽孢杆菌FM-20菌株在NA培养基上培养16～24h，将培养后的菌株接种至NB培养液中，在35～37℃、180～220r/min摇床培养24～48h，经离心获得菌泥，经喷雾干燥获得高浓度菌粉，加入填充料混合后，即得所述菌剂；
或者将所述枯草芽孢杆菌FM-20菌株在NA培养基上培养16～24h，将培养后的菌株接种至NB培养液中，在35～37℃、180～220r/min摇床培养24～48h，发酵液经离心获得菌泥，将所得菌泥与填充料混合，闪蒸干燥获得菌剂。
该菌剂中的填充料可选自麸皮、米糠或稻糠中的至少一种，也可以采用其他常见的菌剂赋形剂。
第五方面，本发明实施例还提供一种饲料添加剂，所述饲料添加剂中包括上述菌剂以及饲料中可接受的其他营养成分。
所述其他营养成分包括益生菌、矿物质、维生素、中草药提取物中的至少一种。
附图说明
图1为实施例1中FM-20菌株的菌落形态；
图2为实施例1中FM-20菌株的芽孢染色；
图3为实施例1中FM-20菌株的菌体染色；
图4为实施例1中FM-20菌株的***发育树。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本发明实施例提供了一种高产蛋白酶的枯草芽孢杆菌FM-20菌株，该菌株通过以下步骤筛选得到：
1、产蛋白酶芽孢杆菌的分离和筛选
1.1培养基配方
蛋白酶鉴别培养基：牛肉膏5g、干酪素30g、NaCl 5g、琼脂20g、加入蒸馏水1000mL，pH值自然。
NA培养基：10mg/ml蛋白胨、3mg/ml牛肉膏、5mg/ml氯化钠、20mg/ml琼脂，余量为蒸馏水，pH7.2～7.4。
NB培养液：10mg/ml蛋白胨、3mg/ml牛肉膏、5mg/ml氯化钠，余量为蒸馏水，pH为7.2～7.4。
LA培养基：10mg/ml蛋白胨、5mg/ml酵母浸膏、10mg/ml氯化钠，20mg/ml琼脂，pH7.0～7.2，余量为蒸馏水。
所有培养基均用蒸馏水配制，121℃20min高压蒸汽灭菌。
1.2产蛋白酶芽孢杆菌的分离和初筛
取健康肉鸡的粪便样品1.0g置于9.0mL无菌水的试管中，经80℃加热处理15min。混匀后取1.0mL进行梯度稀释，得到一系列不同浓度的稀释液。分别取10-3、10-4、10-5、10-6稀释度的稀释液0.1mL涂布到蛋白酶鉴别培养基平板上，置于37℃恒温箱培养24h。选取菌落数30-300的平板，从中挑取生长良好、有明显透明圈的单菌落，即产蛋白酶菌株。共筛选得到56株菌株，其中22株菌株的水解圈直径与菌落直径的比值大于2.0。将该22株菌株的菌落转接到NA培养基斜面上，编号FM-1～FM-22(FM-20的水解圈直径与菌落直径的比值最大，达到5.6)，置于37℃恒温培养24h，4℃保存备用。
1.3产蛋白酶功能菌株的复筛
将初筛得到22株菌株转接到NA培养基斜面上，置于37℃恒温培养24h活化菌株。将活化后的菌株分别接种到NB培养液中，37℃，220r/min摇床培养48h后，以10000r/min，4℃离心5min，取上清液。用打孔器在已灭菌的蛋白酶鉴别培养基平板上均匀打孔，将上述上清液分别取75μL注入孔中，于37℃恒温培养24h，筛选出水解圈直径与菌落直径的比值在2.0以上的菌株，即具有较强的产蛋白酶的能力的菌株，作为复筛菌株，其中FM-20的水解圈直径与菌落直径的比值最大，达到3.8。
1.4产蛋白酶功能菌株发酵液产酶活力测定
将复筛菌株中透明圈较大的15株菌株转接到NA培养基斜面上，置于37℃恒温培养24h以活化菌株。将活化后的菌株接种到NB培养液中，37℃，220r/min摇床培养48h后，以10000r/min，4℃离心5min，取上清液。采用福林-酚法对所得的发酵上清液进行蛋白酶活力测定。
蛋白酶活力测定：采用“GB/T 28715-2012饲料添加剂中性酸性蛋白酶活力的测定分光光度法”中福林-酚法测定。
结果表明，有3株菌株酶活力较高，即FM-2、FM-8和FM-20菌株，其中FM-20菌株产蛋白酶活力最大，达到202.3U/mL。
1.5芽孢杆菌减少氨、硫化氢释放量的特性研究
1.5.1芽孢杆菌抑氨的特性试验
(1)称取新鲜鸡粪50g共四份，分别加入到250mL的三角瓶中，其中三份以10％接种量(即每100g鸡粪接种10mL发酵液上清，下同)接入FM-2、FM-8和FM-20发酵液上清，以不接菌的新鲜鸡粪为对照；
(2)量取20mL硼酸吸收溶液置于50mL的三角瓶中，并滴入指示剂(以甲基红﹕亚甲基蓝＝2﹕1为指示剂)用于吸收NH3；
(3)将装有新鲜鸡粪的250mL三角瓶与装有吸收溶液的50mL三角瓶用胶管连接，整个***密封性良好。放置于25℃恒温培养，分别于24h和48h分别测定一次；
(4)吸收液吸收NH3后，溶液由蓝紫色变为绿色，用已标定的0.05N的盐酸进行滴定，使吸收液恢复之前透明的蓝紫色，根据盐酸的用量得出氨气量。结果如表1所示。
表1肉鸡粪便中接入不同菌株的氨排放量
Figure BDA0003171514660000071
Figure BDA0003171514660000081
结果显示，3株菌株均具有较强抑氨作用。
1.5.2芽孢杆菌抑硫的特性试验
(1)称取新鲜鸡粪50g共四份，分别加入到250mL的三角瓶中，其中三份以10％接种量接入FM-2、FM-8和FM-20发酵液上清，以不接菌的新鲜鸡粪作为对照；
(2)量取20mL H2S吸收溶液即碱性锌氨络盐溶液置于50mL的三角瓶中，用于吸收H2S；
(3)将装有新鲜鸡粪的250mL三角瓶与装有吸收溶液的50mL三角瓶用胶管连接，整个***密封性良好。放置于25℃恒温培养，分别于24h和48h分别测定一次；
(4)取10mL H2S吸收液(原液或者稀释一定倍数)放置于试管中，向试管中加入1mL对氨基二甲基苯胺溶液后摇匀，1min后加入1滴FeCl3溶液，摇匀后反应30min，再加入1滴磷酸二氢铵溶液终止反应。在760nm波长下测定各溶液的吸光度，记录数据，计算硫化氢排放量。结果如表2所示。
表2肉鸡粪便中接入不同菌株的硫化氢排放量
Figure BDA0003171514660000082
结果显示，FM-20、FM-8均具有较强的抑制硫化氢排放的作用，但是FM-2不明显。
1.6芽孢杆菌对大肠杆菌病原菌的抑制试验及抑菌物质性质的初步鉴定
1.6.1芽孢杆菌对大肠杆菌病原菌的抑制试验
将5.0mL无菌水依次倒入活化好的大肠杆菌病原菌斜面试管内，用灭菌竹签轻轻将病原菌刮下，形成的菌悬液再倒入原无菌水的试管中，用漩涡振荡器振荡1min后，倒入盛有100mL、约50℃的NA培养基的三角瓶中。混匀后立刻倒入双碟平板(直径9cm)，每个平板倒入约15mL，冷却后备用即为病原菌平板。
将已筛选得到的FM-2、FM-8和FM-20菌株转接到NA培养基斜面上，置于37℃恒温培养24h-36h活化菌株。将活化后的菌株接种到NB培养液中，35-38℃，180-220r/min摇床48h后，以10000r/min，4℃离心5min，取上清液。取100μL上清液点于病原菌平板上(事先用无菌打孔器在含大肠杆菌病原菌平板上按一定间距打孔，待用)，静置20min后置于35-37℃恒温培养24-48h，观察抑菌圈的大小。
结果表明，所筛选的FM-2、FM-8和FM-20菌株均表现出对大肠杆菌病原菌的抑制作用，其中FM-20抑菌圈最大，直径达到32.5mm。
1.6.2抑菌物质性质的初步鉴定
(1)溶剂萃取
将FM-2、FM-8和FM-20菌株活化后用NB培养基进行静置液体发酵。取48h发酵液四份，每份100mL，离心后分别用1/3体积的氯仿、***、乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取液在通风处内自然挥发至干燥，分别用5.0mL蒸馏水溶解后，用琼脂打孔扩散法在病原菌平板上测定萃取液、萃余液及硫酸铵沉淀物对大肠杆菌的抗菌活性，并以蒸馏水作为阴性对照和用发酵液作阳性对照。
结果发现4种有机溶剂的萃取液均无明显抑菌活性，萃余液仍有明显的抑菌活性，而硫酸铵盐析沉淀物均有较高的抑菌活性，见表3。
表3抗菌萃取物对大肠杆菌的抑制作用
Figure BDA0003171514660000101
注：“++”表示抑菌圈较大，“+”表示有抑菌圈，“±”表示抑菌圈不明显，“-”表示无抑菌圈
(2)硫酸铵盐析
分别取FM-2、FM-8和FM-20菌株的48h发酵液200mL，离心后在不断搅拌情况下缓慢添加硫酸铵至80％饱和度，沉淀过夜，倾去上清液，沉淀用50mL蒸馏水溶解后放入300-800Da的透析袋中用蒸馏水透析过夜。用琼脂打孔扩散法在病原菌平板上测定透析液抗菌活性，在同一平板上同时作蒸馏水的阴性对照和用发酵液作阳性对照。
结果显示，硫酸铵盐析沉淀物均有较高的抑菌活性，见表4。
表4硫酸铵盐析沉淀物的抑菌活性
Figure BDA0003171514660000102
注：++表示抑菌圈较大，+表示抑菌圈一般，-表示无抑菌圈
(3)抑菌物对胰蛋白酶的敏感性试验
将FM-2、FM-8和FM-20菌株的发酵上清液分装于EP管中，加入2.0％的胰蛋白酶溶液，以加生理盐水的发酵上清液作对照，37℃恒温孵育0h、0.5h、1.0h、1.5h、2.0h，用琼脂打孔扩散法观察经胰蛋白酶处理不同时间的发酵液的抑菌效果。结果见表5。
表5FM-20菌株抗菌物对胰蛋白酶的敏感性
Figure BDA0003171514660000111
FM-20菌株发酵上清液加入胰蛋白酶后，随时间的增加，发酵液抑菌活性逐渐降低，直至消失。而发酵液中加入生理盐水作为对照，并未随时间增加而失去抑菌活性。
(4)高压蒸汽灭菌试验
经高压蒸汽灭菌后，FM-2、FM-8和FM-20菌株的抑菌活性完全丧失，产生白色的沉淀，说明FM-2、FM-8和FM-20菌株产生的抑菌物对高温高压很敏感。
由以上结果初步分析，FM-2、FM-8和FM-20菌株产生的抑菌物为抗菌蛋白或抗菌肽。
1.7芽孢杆菌菌株的益生特性试验
1.7.1芽孢杆菌菌株耐胆酸盐特性试验
采用“十”字划线接种法将FM-2、FM-8和FM-20菌株接入到含胆酸盐为0.3％的NA固体平板培养基中，37℃培养，5d后观察。结果发现，FM-2、FM-20菌株在含0.3％胆酸盐NA平板上生长良好，FM-8菌株没有生长，对胆酸盐没有耐受性。
1.7.2芽孢杆菌菌株对人工胃液耐受性试验
取9.5-10.5％的盐酸16.4mL，加水稀释，使pH值分别达到2.0、3.0、4.0；每100mL液体中加入1.0g胃蛋白酶，混匀，用0.22μm微孔滤膜无菌过滤，待用。
将活化好的FM-2、FM-8和FM-20菌株按1.0％(v/v)的接种量分别接入上述不同pH的人工胃液，37℃，220r/min摇床培养，在0h、2h、4h进行活菌平板菌落计数。结果表明，表明FM-2和FM-20菌株对胃液环境均有较强的耐受能力。
1.7.3芽孢杆菌菌株对人工肠液耐受性试验
取KH2PO4 6.8g，加水500mL溶解，用0.4％的氢氧化钠溶液调pH值至6.8，加水稀释至1000mL，每100mL上述液体中加入1.0g胰蛋白酶，混匀，用0.22μm微孔滤膜无菌过滤，待用。
将活化好的FM-2、FM-8和FM-20菌株按1.0％(v/v)的接种量接入到上述人工肠液，37℃，220r/min摇床培养，在0h、2h、4h、6h进行活菌平板菌落计数。试验结果表明，人工肠液对FM-2和FM-20菌株的生长影响很小，这说明FM-2和FM-20菌株对人工肠液的耐受能力很强。FM-8菌株对人工肠液的耐受性不强。
1.8芽孢杆菌菌株高温耐受性试验
将FM-2、FM-8和FM-20菌株接种LB培养基，37℃培养48h形成大量芽孢后进行下列试验：置于80℃水浴中温育，分别于温育前、温育40min时取样测定细菌芽孢存活率；置于90℃水浴中温育，分别于温育前、温育20min后取样测定细菌芽孢存活率；置于100℃水浴中温育，分别于温育前、温育10min后取样测定细菌芽孢存活率。
试验结果表明，菌株FM-2、FM-8和FM-20经80℃水浴40min后几乎全部存活，90℃水浴20min有74.65％-75.75％存活，100℃水浴10min仍有42.00％-50.62％存活。表明所筛选的FM-2、FM-8和FM-20菌株对高温有较强的耐受力。
2、枯草芽孢杆菌FM-20菌株的种属鉴定
将各方面性能较为良好的菌株FM-20进行种属的鉴定。
2.1FM-20菌株的菌落和菌体形态特征
该菌株菌落呈不规则形状，边缘不整齐，表面不光滑有皱褶，不产生色素；
革兰氏阳性，菌体杆状，芽孢呈椭圆形中生(如图1～图3所示)。
2.2FM-20菌株的16S rDNA测序结果
表6FM-20菌株与参比菌株的16S rDNA序列相似性
Figure BDA0003171514660000131
FM-20菌株的***发育树如图4所示。
由以上结果可知，与菌株FM-20的16S rDNA序列同源相似性最高的9株标准菌株均属于芽孢杆菌属，其中菌株FM-20与Bacillus subtilis的16S rDNA序列相应的同源相似度为100％，其他种属Bacillus cabrialesii、Bacillus tequilensis、Bacillusmojavensis、Bacillus vallismortis、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillusatrophaeus、Bacillus licheniformis、Bacillus aerius、Bacillus stratosphericus与菌株FM-20序列的同源相似度为97.12～99.93％，因此可初步判断菌株FM-20属于芽孢杆菌属。
2.3FM-20菌株的生理生化特性
该菌株呈接触酶阳性；可利用葡萄糖、甘露醇，不利用葡萄糖产气；V-P反应、明胶液化、酪素水解、硝酸盐还原及淀粉水解反应阳性，脲酶反应阴性；可耐受10％NaCl，硝酸盐还原反应阳性。
综上所述，结合16S rDNA序列分析及生理生化鉴定结果，鉴定FM-20鉴定为一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株。
将该枯草芽孢杆菌FM-20菌株于2021年5月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.22509；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例2
本实施例提供了一种枯草芽孢杆菌FM-20菌株的发酵产物，该发酵产物的制备方法为：将实施例1所得枯草芽孢杆菌FM-20菌株在NA培养基上培养24h，将培养后的菌株接种至NB培养液中，在37℃、220r/min摇床培养48h，离心，取上清液，即得。
实施例3
本实施例提供了一种菌剂，由实施例1所得枯草芽孢杆菌FM-20菌株经发酵后制得。其制备方法为：
将实施例1所得枯草芽孢杆菌FM-20菌株在NA培养基上培养24h，将培养后的菌株接种至NB培养液中，在35～37℃、200r/min摇床培养48h，经碟片式离心机离心获得菌泥，经喷雾干燥获得高浓度菌粉，加入麸皮混合后，即得所述菌剂(1.12×1010CFU/g)。
实施例4
本实施例提供了一种菌剂，由实施例1所得枯草芽孢杆菌FM-20菌株经发酵后制得。其制备方法为：
将实施例1所得枯草芽孢杆菌FM-20菌株在NA培养基上培养24h，将培养后的菌株接种至NB培养液中，在35～37℃、200r/min摇床培养48h，将发酵液经离心获得菌泥，将所得菌泥与麸皮混合，闪蒸干燥获得菌剂(1.19×1010CFU/g)。
实施例5
本实施例提供了枯草芽孢杆菌FM-20菌株作为饲料添加剂在减少禽类***物中氨气和硫化氢排放中的应用。
1、试验过程
取14日龄健康罗斯308肉鸡，随机分为两组，将实施例3所得菌剂按0.1％(w/w)的添加量加入到鸡饲料中作为试验组，另设仅食用相同饲料且不添加该菌剂的鸡群作为对照组，预饲期7d，试验期21d，进行常规饲养管理。分别测定对照组和试验组肉鸡的生长性能和健康水平，同时检测两组肉鸡粪便中蛋白酶活力、总氮和氨态氮含量、氨气和硫化氢48h释放量、鸡舍空气中氨气和硫化氢含量、空气中微生物含量。
2、试验结果与分析
2.1饲喂试验结果
表1饲喂试验效果
Figure BDA0003171514660000151
从表1可知，饲喂试验中，试验组比对照组11.37％((P<0.05)，腹泻率降低76.07％(P<0.01)，死亡率降低35.31％(P<0.01)。
2.2肉鸡粪便中消化酶活力、总氮及氨态氮的测定结果
表2肉鸡粪便中蛋白酶活力检测结果
Figure BDA0003171514660000152
从表2中可以看出，饲喂FM-20芽孢微生态制剂7d、14d、21d后，试验组肉鸡粪便中的蛋白酶活力分别提高56.06％、60.42％、61.44％，与对照组相比，分别提高52.37％、44.89％、36.96％；试验组肉鸡粪便中的总氮分别下降41.79％、47.76％、49.25％，与对照组相比，分别下降45.07％、52.05％、54.05％；试验组肉鸡粪便中的氨态氮分别下降71.82％、76.82％、79.55％，与对照组相比，分别下降76.15％、84.06％、87.14％。
2.3舍内氨气和硫化氢气体检测结果
测定时间选在人员活动较少的时间，提前密闭门窗，使鸡舍处于封闭式状态。
表3不同测定时间肉鸡鸡舍气体浓度值
Figure BDA0003171514660000161
从表3可知，鸡舍内氨气、硫化氢等有害气体的含量随着日龄的增加略有增加。饲喂FM-20芽孢微生态制剂7d、14d、21d后，试验组舍内氨气含量分别下降61.84％、62.50％、63.16％，与对照组相比，分别下降64.20％、67.98％、70.05％；试验组舍内硫化氢含量分别下降60％、60.77％、62.31％，与对照组相比，分别下降67.50％、70％、71.18％。同时试验中发现，下午测定氨气、硫化氢的含量相对于上午的测定数值明显增高，且清粪后，氨气及硫化氢的含量值会明显降低。结果说明，鸡群的活动及清粪会对鸡舍内有害气体的含量造成明显影响。
2.4新鲜粪便有害气体释放量检测结果
表4肉鸡粪便有害气体释放量
Figure BDA0003171514660000171
从表3可知，鸡舍内氨气、硫化氢等有害气体的含量随着日龄的增加略有增加。饲喂FM-20芽孢微生态制剂7d、14d、21d后，与对照组相比试验组新鲜粪便48h氨气释放量分别下降23.33％、30.90％、32.06％；与对照组相比，试验组新鲜粪便48h硫化氢释放量分别下降16.92％、14.69％、15.99％。
2.5鸡舍内空气中微生物含量
表5肉鸡鸡舍细菌总数和大肠杆菌属
Figure BDA0003171514660000172
表5可以看出，饲喂FM-20芽孢微生态制剂7d、14d、21d后，试验组舍内细菌总数分别下降48.96％、48.17％、48.37％，与对照组相比，分别下降56.94％、56.49％、57.33％；试验组舍内大肠杆菌数分别下降75.74％、74.56％、72.19％，与对照组相比，分别下降78.31％、77.95％、77.83％。
实施例6
本发明实施例提供了一种饲料添加剂，该饲料添加剂中包括用实施例3或4所得菌剂。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河北农业大学
<120> 一种高产蛋白酶的枯草芽孢杆菌FM-20菌株及其应用
<130> 2021.7.13
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1422
<212> DNA
<213> FM-20
<400> 1
tgcaagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt tagcggcgga cgggtgagta 60
acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg gaaaccgggg ctaataccgg 120
atggttgttt gaaccgcatg gttcaaacat aaaaggtggc ttcggctacc acttacagat 180
ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcaa cgatgcgtag 240
ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga 300
ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg ccgcgtgagt 360
gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa gaacaagtac cgttcgaata 420
gggcggtacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc 480
ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagggc tcgcaggcgg 540
tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg agggtcattg gaaactgggg 600
aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg 660
tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta actgacgctg aggagcgaaa 720
gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta 780
agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg 840
gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag 900
catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cctctgacaa 960
tcctagagat aggacgtccc cttcgggggc agagtgacag gtggtgcatg gttgtcgtca 1020
gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg atcttagttg 1080
ccagcattca gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga 1140
tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggacagaa 1200
caaagggcag cgaaaccgcg aggttaagcc aatcccacaa atctgttctc agttcggatc 1260
gcagtctgca actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg 1320
cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga gtttgtaaca 1380
cccgaagtcg gtgaggtaac cttttaggag ccagccgccg aa 1422

Claims (10)

1.一种高产蛋白酶的枯草芽孢杆菌FM-20菌株，其特征在于，其分类名称为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，于2021年5月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.22509；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌FM-20菌株在减少禽类***物中氨气和硫化氢排放中的应用。
3.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌FM-20菌株的发酵产物，其特征在于，所述发酵产物由所述枯草芽孢杆菌FM-20菌株发酵制得。
4.根据权利要求3所述的枯草芽孢杆菌FM-20菌株的发酵产物，其特征在于，所述发酵产物的制备方法包括：将所述枯草芽孢杆菌FM-20菌株在NA培养基上培养16～24h，将培养后的菌株接种至NB培养液中，在35～37℃、180～220r/min摇床培养24～48h，离心，取上清液。
5.根据权利要求4所述的枯草芽孢杆菌FM-20菌株的发酵产物，其特征在于，所述离心为10000r/min，4℃离心5min。
6.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂由权利要求1所述的枯草芽孢杆菌FM-20菌株经发酵后制得。
7.根据权利要求6所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂的制备方法为：将所述枯草芽孢杆菌FM-20菌株发酵，获得菌泥，将所述菌泥干燥后与填充料混合或将菌泥与填充料混合后干燥，即得所述菌剂。
8.根据权利要求7所述的菌剂，其特征在于，所述填充剂包括麸皮、米糠或稻糠中的至少一种。
9.一种饲料添加剂，其特征在于，所述饲料添加剂中包括权利要求6所述的菌剂以及饲料中可接受的其他营养成分。
10.根据权利要求9所述的饲料添加剂，其特征在于，所述其他营养成分包括益生菌、矿物质、维生素、中草药提取物中的至少一种。
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