CN113960210A

CN113960210A - 一种牵牛子的高效液相色谱指纹图谱的检测方法

Info

Publication number: CN113960210A
Application number: CN202111278891.3A
Authority: CN
Inventors: 秦昆明; 牛淑睿; 余泓; 徐华; 徐长丽; 赵光瑞; 高珣; 沈金阳; 董自波
Original assignee: Jiangsu Ocean University
Current assignee: Jiangsu Ocean University
Priority date: 2021-10-31
Filing date: 2021-10-31
Publication date: 2022-01-21

Abstract

本发明公开了一种牵牛子的高效液相色谱指纹图谱的检测方法，该方法包括以下步骤：步骤1，牵牛子供试品溶液的制备；步骤2，混合对照品溶液的制备；步骤3，将牵牛子供试品溶液和混合对照品溶液分别注入高效液相色谱仪进行测定，得到色谱图；步骤4，将步骤3得到的14批牵牛子指纹图谱数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价***（2009版）》，根据参照图谱进行全峰匹配，标识出共有峰，以中位数法生成对照指纹图谱，确定参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。本发明提供的牵牛子指纹图谱测定方法精密度高、重现性好、指纹图谱相对稳定，可作为评价和控制牵牛子质量的重要方法。

Description

一种牵牛子的高效液相色谱指纹图谱的检测方法

技术领域

本发明涉及一种牵牛子的高效液相色谱指纹图谱的检测方法及其用途。

背景技术

中药牵牛子是旋花科植物裂叶牵牛Pharbitis nil（L.）Choisy 或圆叶牵牛Pharbitis purpurea（L.）Voigt 的干燥成熟种子，有黑丑和白丑之分。其性寒、味苦，具有泻水通便、消痰涤饮、杀虫攻积等功效，临床上常用于治疗腹水肿胀、大小便不畅、喘咳、消化道蠕虫病等。现代研究表明，牵牛子还具有较好的抗肿瘤活性。在质量控制方面，2020版药典仅对牵牛子粉末进行了薄层鉴别，且只有咖啡酸一种对照品，不能完全、客观地反应牵牛子的质量。目前文献中也尚未见到有关牵牛子指纹图谱的报道。

因此，有必要在现有技术的基础上，建立牵牛子的高效液相色谱指纹图谱，通过对不同产地的牵牛子色谱图和对照指纹图谱进行相似度评价，为牵牛子的质量控制提供重要依据。

发明内容

发明目的：提供一种牵牛子的高效液相色谱指纹图谱的检测方法，以更好地评价牵牛子的质量，对牵牛子质量的控制和临床药效的保证具有重要意义。

技术方案：为实现以上目的，本发明采用的技术方案为：

一种牵牛子的高效液相色谱指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：

（1）供试品溶液制备

称取牵牛子饮片粉末，置50mL具塞锥形瓶中，加入体积浓度50~100%甲醇，提取30~60min，过滤，并用甲醇冲洗滤纸，定容，取续滤液用甲醇稀释，过0.22μm滤膜后，即得供试品溶液。

（2）混合对照品溶液制备

精密称定绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C对照品适量，置避光容量瓶中，用甲醇溶解摇匀定容，过0.45μm滤膜后，即得混合对照品品溶液。

（3）高效液相色谱法测定牵牛子的指纹图谱

将按照步骤（1）方法制备的14个批次的牵牛子饮片供试品溶液和按照步骤（2）制备的混合对照品溶液分别注入高效液相色谱仪进行测定，得到指纹图谱数据。

（4）指纹图谱建立和色谱峰指认

将按照步骤（3）方法获得的14批牵牛子供试液的指纹图谱数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价***（2009版）》，以Q4样品的指纹图谱为参照图谱，多点校正后进行全谱峰匹配，共标识出30个共有峰。以中位数法生成对照指纹图谱（R）。以2号峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。并通过对比混合对照品溶液色谱图的保留时间，指认并标注出供试品溶液色谱图中的化学成分。

作为优选方案，以上所述的牵牛子的高效液相色谱指纹图谱的检测方法，步骤(1)供试品溶液制备：称取牵牛子饮片粉末约1g，置50mL具塞锥形瓶中，加入20mL甲醇，超声提取30min，过滤，用5mL甲醇冲洗滤纸，并定容至25ml；取1mL续滤液用1mL甲醇稀释，过0.22μm滤膜后，即得牵牛子饮片供试品溶液。

作为优选方案，以上所述的牵牛子的高效液相色谱指纹图谱的检测方法，步骤（2）混合对照品溶液制备：精密称定绿原酸对照品5.06mg、新绿原酸对照品1.06mg、隐绿原酸对照品1.08mg、咖啡酸对照品0.65mg、异绿原酸A对照品1.40mg、异绿原酸B对照品1.06mg、异绿原酸C对照品1.26mg，置10mL避光容量瓶中，用甲醇溶解摇匀定容，制得含上述对照品质量浓度分别为506μg、106μg、108μg、65μg、140μg、106μg、126μg/mL 的混合对照品溶液。

作为优选方案，以上所述的牵牛子的高效液相色谱指纹图谱的检测方法，步骤（3）色谱条件为：色谱柱为Kromasil 100-5-C₁₈，规格为4.6×250mm，5μm；流动相为 0.1%甲酸水溶液（A），甲醇（B）；流速1mL/min；柱温25℃；检测波长325nm；进样量10μL；梯度洗脱程序为：0-10min，10%~20% B；10~20min，20%~30% B；20~50min，30%~50% B；50~51min，50%~10% B；51~60min，10% B。

本发明所述的牵牛子的高效液相色谱指纹图谱的检测方法，对照指纹图谱中有30个共有峰。其中峰1为新绿原酸，保留时间为15.253min；峰2为绿原酸，保留时间为21.853min；峰3为隐绿原酸，保留时间为23.821min；峰4为咖啡酸，保留时间为25.597min；峰5为异绿原酸B，保留时间为40.734min；峰6为异绿原酸A，保留时间为41.398min；峰7为异绿原酸C，保留时间为47.637min。

本发明所述的牵牛子的高效液相色谱指纹图谱的检测方法，依据指纹图谱相似度数值，可应用于牵牛子的质量控制，要求14批牵牛子饮片指纹图谱的相似度应大于0.90。

本发明提供的牵牛子的高效液相色谱指纹图谱的检测方法的最佳条件筛选过程：

1. 样品提取条件的考察

（1）本发明比较了超声提取和回流提取对样品图谱的影响，结果回流提取和超声提取得到的图谱大体相似，但超声提取图谱响应峰较回流提取多，且个别色谱峰响应值也较大，因此选择环保经济简便的超声提取作为样品提取方式。

（2）本发明比较了不同提取时间对样品图谱的影响，提取时间分别为30min、45min、60min，结果不同提取时间色谱图几乎无差异，超声30min基本能提取完全，因此为节约时间成本，选择30min为提取时间。

（3）本发明比较了不同浓度甲醇溶剂对样品图谱的影响，分别以100%甲醇、70%甲醇和50%甲醇作为提取溶剂，结果70%甲醇和50%甲醇色谱图许多色谱峰存在分离度差和拖尾现象且响应值较低，因此选择100%甲醇作为提取溶剂。

2. 流动相***的选择

本发明分别考察了甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-0.1%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水、甲醇-纯水、乙腈-纯水***对样品图谱的影响。结果在甲醇-0.1%甲酸水溶液的流动相***中，色谱峰的分离效果、出峰时间和峰型较好。因此本发明选择甲醇-0.1%甲酸水为牵牛子指纹图谱测定的流动相***。

3. 检测波长的选择

本发明结合相关文献中的检测波长，分别考察了牵牛子指纹图谱在254nm、296nm和325nm波长下吸收情况，结果在325nm处的响应色谱峰数目最多、各色谱峰响应值相对较大、色谱峰峰型较好、基线平稳，因此选择325nm为检测波长。

4. 流速的选择

本发明比较了在0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min 3个不同流速下的色谱峰分离效果：当流速为0.8 mL/min时，各响应峰保留时间相对较迟，且有许多小杂峰；当流速为1.2 mL/min时各响应峰保留时间相对较早，但个别响应峰分离度较差，且在40min左右出现了柱压过高的现象，因此选择1.0 mL/min为最优流速。

有益效果：

本发明通过大量实验，筛选出牵牛子指纹图谱的最佳流动相组成、梯度洗脱方式等色谱条件和样品提取条件，得到牵牛子标准指纹图谱。牵牛子指纹图谱有30个共有特征峰，这些共有特征峰构成了牵牛子的指纹特征，可作为牵牛子的标准指纹图谱。经过多批样品验证，可以将其应用于牵牛子的质量检测中，从而较全面客观地评价牵牛子饮片的质量，对牵牛子质量的控制和临床药效的保证具有重要意义。

附图说明

图1为混合对照品溶液的色谱图；

图2为14批牵牛子样品特征指纹图谱。

具体实施方式

以下通过具体实施例来对本发明作进一步的说明，但这些实施例只是为了说明本发明，而不是对本发明的限制。

实施例1 牵牛子的高效液相色谱指纹图谱的建立

1. 仪器与试药

SHIMADZU LC-20AD高效液相色谱仪（日本岛津公司），SPD-20A紫外检测器，SIL-20AC自动进样器，CTO-20AC柱温箱，在线脱气机，Labsolutions工作站；METTLER TOLEDOMS105DU十万分之一电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；BSM-120.4 万分之一电子分析天平（上海卓精电子科技有限公司）；FW-40高速多功能粉碎机（上海异研试验设备有限公司）；KQ3200超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

甲醇（分析纯，上海泰坦科技股份有限公司）；甲醇（色谱纯，西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司）；甲酸（色谱纯，上海泰坦科技股份有限公司）；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

14个不同批次的牵牛子饮片分别购自：

安国市聚药堂药业有限公司，生白丑，批号2010002，生黑丑，批号2010003，河北产地；安徽广和中药股份有限公司，生黑丑，批号200208，河北保定产地；亳州市京皖中药饮片厂，生白丑，批号201001，安徽亳州产地；亳州中强中药饮片有限公司，生黑丑，批号210105，安徽亳州产地；安徽尚德中药饮片有限公司，生白丑，批号181201，生黑丑，批号181201，江苏产地；亳州市永刚饮片厂有限公司，生白丑，批号201210，生黑丑，批号200826，河南开封产地；亳州市永刚饮片厂有限公司，生白丑，批号170614，生黑丑，批号171128，辽宁产地；四川省中兴药业有限公司，生白丑，批号190601，生黑丑，批号190601，四川产地；广东汇群中药饮片股份有限公司，生白丑，批号20190301，浙江产地。

2. 一种牵牛子的高效液相色谱指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：

（1）供试品溶液制备：称取上述14批牵牛子饮片粉末约1g，置50mL具塞锥形瓶中，加入20mL甲醇，超声提取30min，过滤，用5mL甲醇冲洗滤纸，并定容至25ml；取1mL续滤液用1mL甲醇稀释，过0.22μm滤膜后，即得牵牛子饮片供试品溶液。

（2）混合对照品溶液制备：精密称定绿原酸对照品5.06mg、新绿原酸对照品1.06mg、隐绿原酸对照品1.08mg、咖啡酸对照品0.65mg、异绿原酸A对照品1.40mg、异绿原酸B对照品1.06mg、异绿原酸C对照品1.26mg，置10mL避光容量瓶中，用甲醇溶解摇匀定容，依次制得质量浓度分别为506μg/mL、106μg/mL、108μg/mL、65μg/mL、140μg/mL、106μg/mL、126μg/mL 的绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C的混合对照品溶液。

（3）将按照步骤（1）方法制备的14个批次的牵牛子饮片供试品溶液和按照步骤（2）制备的混合对照品溶液分别注入高效液相色谱仪进行测定，色谱条件为：色谱柱为Kromasil 100-5-C18，规格为4.6×250mm，5μm；流动相为 0.1%甲酸水溶液（A），甲醇（B）；流速1mL/min；柱温25℃；检测波长325nm；进样量10μL；梯度洗脱程序为：0-10min，10%~20% B；10~20min，20%~30% B；20~50min，30%~50% B；50~51min，50%~10% B；51~60min，10% B。对照品的指纹图谱如图1所示：峰1为新绿原酸，保留时间为15.253min；峰2为绿原酸，保留时间为21.853min；峰3为隐绿原酸，保留时间为23.821min；峰4为咖啡酸，保留时间为25.597min；峰5为异绿原酸B，保留时间为40.734min；峰6为异绿原酸A，保留时间为41.398min；峰7为异绿原酸C，保留时间为47.637min。供试品的指纹图谱如图2所示。

（4）将步骤（3）获得的14批牵牛子供试品溶液的指纹图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价***（2009版）》，以Q4样品的指纹图谱为参照图谱，多点校正后进行全谱峰匹配，共标识出30个共有峰。以中位数法生成对照指纹图谱（R）。以2号峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。相似度评价后发现14批牵牛子供试液的指纹图谱相似度均大于0.97。

实施例2 方法学考察

1. 专属性考察

取一批牵牛子粉末（Q2），按照实施例1中的步骤（1）供试品制备条件与步骤（2）色谱条件分别制备牵牛子指纹图谱空白样品和供试品样品，按照步骤（3）色谱条件进行检测，记录空白色谱图和供试品色谱图，结果表明空白溶剂没有造成干扰的色谱峰，因此该方法专属性检测合格。

2. 精密度试验

取一批牵牛子粉末（Q2），按照实施例1中步骤（1）供试品制备条件制备指纹图谱供试品溶液，按照步骤（3）色谱条件连续进样6次，记录色谱图。以分离度较好且峰面积较大绿原酸为参照峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD(%)（n=6），结果各共有峰相对保留时间 RSD 值均小于 0.2%，相对峰面积 RSD 值均小于 1.4%，表明仪器精密度良好。

3. 重复性试验

取同一批牵牛子粉末（Q2）6份，按照实施例1中步骤（1）供试品制备条件制备指纹图谱供试品溶液，按照步骤（3）色谱条件进样分析，记录色谱图。以绿原酸为参照峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD(%)（n=6）。各共有峰相对保留时间 RSD 值均小于0.3%，相对峰面积 RSD 值均小于 1.4%，表明该方法重复性良好。

4. 稳定性试验

取步骤（1）条件下的指纹图谱供试品溶液Q2，于室温放置0，2，4，8，12，24h后，按按照步骤（3）色谱条件进样分析，记录色谱图。以绿原酸为参照峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD(%)（n=6）。各共有峰相对保留时间 RSD 值均小于 0.07%，相对峰面积 RSD 值均小于 2.2%，表明供试品溶液24h内稳定性良好。

以上试验结果证明，该牵牛子指纹图谱测定方法稳定可靠，指纹图谱相对稳定，可作为评价和控制牵牛子质量的重要方法。

Claims

1.一种牵牛子的高效液相色谱指纹图谱的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）供试品溶液的制备

称取牵牛子饮片粉末，置50mL具塞锥形瓶中，加入体积浓度50~100%甲醇，提取30~60min，过滤，并用甲醇冲洗滤纸，定容，取续滤液用甲醇稀释，过0.22μm滤膜后，即得供试品溶液；

（2）混合对照品溶液制备

精密称定绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C对照品适量，置避光容量瓶中，用甲醇溶解摇匀定容，过0.45μm滤膜后，即得混合对照品品溶液；

（3）高效液相色谱法测定牵牛子的指纹图谱

将按照步骤（1）方法制备的14个批次的牵牛子饮片供试品溶液和按照步骤（2）制备的混合对照品溶液分别注入高效液相色谱仪进行测定；

（4）指纹图谱建立和色谱峰指认

将按照步骤（3）方法获得的14批牵牛子供试液的指纹图谱数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价***2009版》，以中位数法生成对照指纹图谱R；以2号峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；并通过对比混合对照品溶液色谱图的保留时间，指认供试品溶液色谱图中的化学成分。

2.根据权利要求1所述的牵牛子的高效液相色谱指纹图谱的检测方法，其特征在于，步骤（1）供试品溶液制备：称取牵牛子饮片粉末1g，置50mL具塞锥形瓶中，加入20mL甲醇，超声提取30min，过滤，用5mL甲醇冲洗滤纸，并定容至25ml；取1mL续滤液用1mL甲醇稀释，过0.22μm滤膜后，即得牵牛子饮片供试品溶液。

3.根据权利要求1所述的牵牛子的高效液相色谱指纹图谱的检测方法，其特征在于，步骤（2）混合对照品溶液制备：精密称定绿原酸对照品5.06mg、新绿原酸对照品1.06mg、隐绿原酸对照品1.08mg、咖啡酸对照品0.65mg、异绿原酸A对照品1.40mg、异绿原酸B对照品1.06mg、异绿原酸C对照品1.26mg，置10mL避光容量瓶中，用甲醇溶解摇匀定容，依次制得质量浓度分别为506μg/mL、106μg/mL、108μg/mL、65μg/mL、140μg/mL、106μg/mL、126μg/mL 的绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C的混合对照品溶液。

4.根据权利要求1所述的牵牛子的高效液相色谱指纹图谱的检测方法，其特征在于，

步骤（3）的色谱条件为：

色谱柱为Kromasil 100-5-C18，规格为4.6×250mm，5μm；流动相为 0.1%甲酸水溶液为A相，甲醇为B相；流速1mL/min；柱温25℃；检测波长325nm；进样量10μL；梯度洗脱程序为：0-10min，10%~20% B；10~20min，20%~30% B；20~50min，30%~50% B；50~51min，50%~10% B；51~60min，10% B。

5.根据权利要求1所述的牵牛子的高效液相色谱指纹图谱的检测方法，其特征在于，对照指纹图谱中有30个共有峰，峰1为新绿原酸，保留时间为15.253min；峰2为绿原酸，保留时间为21.853min；峰3为隐绿原酸，保留时间为23.821min；峰4为咖啡酸，保留时间为25.597min；峰5为异绿原酸B，保留时间为40.734min；峰6为异绿原酸A，保留时间为41.398min；峰7为异绿原酸C，保留时间为47.637min。

6.根据权利要求1所述的牵牛子的高效液相色谱指纹图谱的检测方法，其特征在于，指纹图谱相似度大于0.90。