CN109633001B - 酒女贞子的指纹图谱检测方法 - Google Patents

酒女贞子的指纹图谱检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了酒女贞子指纹图谱的检测方法，酒女贞子指纹图谱建立包括以下步骤：步骤1、供试品溶液的制备；步骤2、混合对照品溶液的制备：步骤3、分别精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图；步骤4，将步骤3中获得的酒女贞子指纹图谱仪器导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价***，选择不同批次酒女贞子的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成酒女贞子的对照指纹图谱；计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积。本发明所提供的酒女贞子指纹图谱，能全面，客观地表征酒女贞子的质量。本发明提供的指纹图谱的检测方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点。

Description

酒女贞子的指纹图谱检测方法
技术领域
本发明属于中药检测技术领域，具体地说，涉及一种酒女贞子的指纹图谱检测方法。
背景技术
女贞子为木犀科植物女贞Ligustrum lucidum Ait.的干燥成熟果实。其性甘、苦，凉。归肝、肾经。有滋补肝肾，明目乌发的功效。用于肝肾阴虚，眩晕耳鸣，腰膝酸软，须发早白，目暗不明，内热消渴，骨蒸潮热。酒蒸法是女贞子的常规炮制方法，女贞子酒制品滋补肝肾作用较生品更佳。
随着中药的广泛应用，其有效性、安全性问题引起了广泛关注，建立高品质的质量标准以保证药材的质量是一项长期而艰巨的任务。目前，中药质量控制的方法只对其中少数已知成分进行分析，无法体现中医药的整体性特点，必须发展中药质量控制的新方法，建立现代质量控制标准的新体系，中药指纹图谱技术应运而生。中药指纹图谱可以分析中药中有效成分和无效成分的种类和其量分布的信息，符合中医药整体性和模糊性的特点。
现行相关药品标准中，仅对酒女贞子饮片中特女贞苷这一单一成分有含量测定，因此采用高效液相色谱法建立一种酒女贞子指纹图谱对于准确控制酒女贞子的质量具有重要意义。
发明内容
发明目的：本发明的目的是克服现有技术的不足，开发一种酒女贞子的指纹图谱检测方法，通过本发明的方法可以保证酒女贞子的质量稳定性、一致性和可控性，从而确保酒女贞子的安全性和有效性。
技术方案：为实现以上目的，本发明采用的技术方案为：
一种酒女贞子的指纹图谱检测方法，包括以下步骤：
步骤1、酒女贞子供试品溶液的制备：
称取酒女贞子饮片待用，打粉，称取粉末置于具塞锥形瓶中，加入甲醇，称重，超声处理后补足失重，离心后取上清液用0.45μm有机微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；
步骤2、对照品溶液的制备：
分别取特女贞苷、红景天苷、酪醇、木犀草苷、芦丁和毛蕊花糖苷对照品适量，精密称定，分别置于容量瓶中，加甲醇分别配成对照品储备液；然后分别精密吸取特女贞苷、红景天苷、酪醇、木犀草苷、芦丁和毛蕊花糖苷的对照品溶液适量，加甲醇定容至20ml，制成特女贞苷、红景天苷、酪醇、木犀草苷、芦丁和毛蕊花糖苷的混合对照品溶液；
步骤3、分别精密吸取步骤1的酒女贞子供试品溶液和步骤2的混合对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；
步骤4，将步骤3中获得的酒女贞子供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价***2004A；选择不同批次酒女贞子的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成酒女贞子的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；并根据混合对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分。
作为优选方案，以上所述的一种酒女贞子的指纹图谱检测方法，其特征在于，
步骤1、酒女贞子供试品溶液的制备方法为：
取酒女贞子饮片待用，打粉，精密称取过4号筛(65目)的粉末1.0g，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定质量，超声提取30min，室温放置，再称定质量，用甲醇补足失重，12000r/min离心3min，取上清液，过0.45μm有机微孔滤膜，即得。
作为优选方案，以上所述的一种酒女贞子的指纹图谱检测方法，步骤2、混合对照品溶液的制备：分别取特女贞苷、红景天苷、酪醇、木犀草苷、芦丁和毛蕊花糖苷对照品适量，精密称定，置于10ml容量瓶中，加甲醇配成浓度分别为290μg/ml的特女贞苷、117μg/ml的红景天苷、143μg/ml的酪醇、285μg/ml的木犀草苷、276μg/ml的芦丁、540μg/ml的毛蕊花糖苷的对照品储备液；分别精密特女贞苷、红景天苷、酪醇、木犀草苷、芦丁和毛蕊花糖苷对照品溶液适量，加甲醇定容至20ml，制成每1ml含特女贞苷14.5μg、红景天苷6.8μg、酪醇7.2μg、木犀草苷14.2μg、芦丁13.8μg、毛蕊花糖苷27.0μg的混合对照品溶液。
作为优选方案，以上所述的一种酒女贞子的指纹图谱检测方法，步骤3、高效液相色谱仪检测的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.1％磷酸水作为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱，流速为0.5～1.5ml·min-1，柱温25～40℃，检测波长200～360nm；
作为优选方案，以上所述的一种酒女贞子的指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤3高效液相色谱仪检测的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以含0.1％磷酸水作为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱，流速为0.8ml·min-1，柱温30℃，检测波长254nm。
作为优选方案，以上所述的一种酒女贞子的指纹图谱检测方法，其特征在于，梯度洗脱优选如下表：
时间/min 流动相A体积百分比 流动相B体积百分比
0 95 5
20 88 12
40 83 17
55 77 23
95 67 33
105 0 100
作为优选方案，以上所述的一种酒女贞子的指纹图谱检测方法，色谱柱为色谱柱为Purospher STAR LP RP-18endcapped，4.6*250mm，5μm。
作为优选方案，以上所述的一种酒女贞子的指纹图谱检测方法，得到的酒女贞子指纹图谱中有10个共有峰，各共有峰的保留时间分别为：共有峰1的保留时间为25.385min；共有峰2的保留时间为27.623min；共有峰3的保留时间为37.849min；共有峰4的保留时间为48.670min；共有峰5的保留时间为57.478min；共有峰6的保留时间为58.276min；共有峰7的保留时间为59.004min；共有峰8的保留时间为61.698min；共有峰9的保留时间为80.021min；共有峰10的保留时间为85.180min。
其中，1号峰为红景天苷，2号峰为酪醇，5号峰为芦丁，6号峰为木犀草苷，7号峰为毛蕊花糖苷，8号峰为特女贞苷。
指纹图谱检测条件的优化实验：
(1)不同流动相的选择：
本发明通过大量实验筛选了纯水-乙腈、纯水-甲醇、0.1％磷酸水-乙腈、0.1％磷酸水-甲醇、0.1％冰醋酸水-乙腈和0.1％冰醋酸水-甲醇等流动相***进行检测，检测结果显示选择含0.1％体积磷酸的水和乙腈作为流动相，***基线平稳、峰形、各峰分离度情况最好。故选择以含0.1％磷酸体积的水作为流动相A，以乙腈为流动相B为最佳流动相；在确定流动相基础上，为了达到更好的分离度，本发明筛选了梯度洗脱方式，实验结果表明，不同的梯度洗脱方式，对各化合物的分离度影响大，本发明通过调整不同时间段的分离度和色谱峰数目，优选得到最佳的梯度洗脱方式为：流动相B的比例变化为：0～20min，5％～12％乙腈；20～40min，12％～17％乙腈；40～55min，17％～23％乙腈；55～95min，23％～33％乙腈；95～105min，33％～100％乙腈。
(2)不同检测波长的选择：
本发明通过大量实验筛选了不同波长230nm、254nm、280nm下色谱检测结果，检测结果显示在254nm下各特征峰强度较好，故选择254nm作为检测波长，如图1所示。
(3)不同流速的选择：
本发明分别在流速0.8ml·min-1、1.0ml·min-1、1.2ml·min-1下进行检测，检测结果显示流速在0.8ml·min-1下各特征峰分离度较好，故选择流速为0.8ml·min-1。
本发明的有益效果是：
(1)本发明所建立的酒女贞子指纹图谱，能有效地表征酒女贞子的质量，有利于全面监控药物的质量。
(2)本发明建立的指纹图谱，可注重各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既可避免因测定个别化学成分而判定酒女贞子质量的片面性，又可减少为质量达标而人为处理的可能性。
(3)本发明方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好的优点。
附图说明
图1为酒女贞子供试品在254nm下的色谱图。
图2为对照品溶液在254nm下的色谱图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
以下实施例所用仪器
日本岛津公司Shimadzu LC-20AB高效液相色谱***，包括在线脱气机，自动进样器Prominence SIL-20A，二极管阵列检测器SPD-M20A和柱温箱CTO-20A；ME204E电子分析天平(梅特勒-托利多国际股份有限公司，精确到十万分之一)；BSM220.4分析天平(上海卓精公司，精确到万分之一)；GVS型超声波清洗器(深圳市够威科技有限公司)；TGL-16C高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)。
以下实例所用试药如下：特女贞苷分析标准品(批号5937，纯度99.5％)、红景天苷对照品(批号4256，纯度99.7％)、酪醇对照品(批号1487，纯度99.7％)均购自上海诗丹德标准技术服务有限公司。芦丁、槲皮素、木犀草苷、木犀草素毛蕊花糖苷对照品均购自南京森贝伽生物科技有限公司。乙腈为色谱纯，水为超纯水，磷酸为分析纯。酒女贞子(南京海源中药饮片有限公司，批号180509、180409、180309、180109、171209、171109、171010、170910、170810、170710)，其它试剂(分析纯)。
实施例1
一种酒女贞子的指纹图谱检测方法，其包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备
分别取10批待测酒女贞子(南京海源中药饮片有限公司，批号180509、180409、180309、180109、171209、171109、171010、170910、170810、170710)待用，打粉，密称取过4号筛(65目)的粉末1.0g，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定质量，在功率250w，频率40KHz的条件下超声处理30min，室温放置，再称定质量，用甲醇补足失重，12000r/min离心3min，取上清液，过0.45μm有机微孔滤膜，即得。
(2)对照品溶液的制备
分别取特女贞苷、红景天苷、酪醇、木犀草苷、芦丁和毛蕊花糖苷对照品适量，精密称定，置于10ml容量瓶中，加甲醇配成浓度分别为290μg/ml的特女贞苷、117μg/ml的红景天苷、143μg/ml的酪醇、285μg/ml的木犀草苷、276μg/ml的芦丁、540μg/ml的毛蕊花糖苷的对照品储备液；分别精密特女贞苷、红景天苷、酪醇、木犀草苷、芦丁和毛蕊花糖苷对照品溶液适量，加甲醇定容至20ml，制成每1ml含特女贞苷14.5μg、红景天苷6.8μg、酪醇7.2μg、木犀草苷14.2μg、芦丁13.8μg、毛蕊花糖苷27.0μg的混合对照品溶液。
(3)分别精密吸取步骤1的10批酒女贞子供试品溶液和步骤2的混合对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；
(4)将步骤3中获得的10批酒女贞子供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价***2004A；选择10批次酒女贞子的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成酒女贞子的对照指纹图谱，相似度评价结果见表2。计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；并根据混合对照品溶液色谱图(图2所示，红景天苷保留时间为26.300min、酪醇保留时间为28.666min、芦丁保留时间为57.377min、木犀草苷保留时间为58.991min、毛蕊花糖苷保留时间为59.624min、特女贞苷61.699min)的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分。
色谱条件及***适用性
色谱柱：Purospher STAR LP RP-18endcapped，4.6*250mm，5μm。
流动相：A相：0.1体积％磷酸水；B相：乙腈；检测波长：254nm，流速：0.8ml·min-1，柱温：30℃；梯度洗脱程序如下表1：
表1梯度洗脱程序
时间/min 流动相A体积百分比 流动相B体积百分比
0 95 5
20 88 12
40 83 17
55 77 23
95 67 33
105 0 100
。
表2 10批酒女贞子供试品溶液相似度评价结果
Figure BDA0001922243790000051
Figure BDA0001922243790000061
获得的指纹图谱共有10个共有峰，通过对对照品溶液和供试品溶液同时检测，各共有峰的保留时间分别为：共有峰1，保留时间为25.385min；共有峰2，保留时间为27.623min；共有峰3，保留时间为37.849min；共有峰4，保留时间为48.670min；共有峰5，保留时间为57.478min；共有峰6，保留时间为58.276min；共有峰7，保留时间为59.004min；共有峰8，保留时间为61.698min；共有峰9，保留时间为80.021min；共有峰10，保留时间为85.180min。其中，1号峰为红景天苷，2号峰为酪醇，5号峰为芦丁，6号峰为木犀草苷，7号峰为毛蕊花糖苷，8号峰为特女贞苷。
实施例2指纹图谱检测的方法学研究：
1、方法学考察
1.1精密度考察
取批号为180509的酒女贞子，按照上述实施例1的供试品制备方法，制备得到供试品溶液，连续进样6次，每次进样量10μL，按上述实施例1色谱条件检测，测定其HPLC色谱图，对色谱图中10个共有指纹峰进行考察，结果表明，共有指纹峰的保留时间RSD均小于2.5％，共有峰峰面积RSD均小于2.6％，说明仪器精密度较好。
1.2稳定性考察
取批号为180509的酒女贞子，按照上述实施例1的供试品制备方法制备供试品溶液，按上述实施例1中的色谱条件分别于0,2,4,8,12,24h进样，记录色谱图，对色谱图中10个共有指纹峰进行考察，结果表明，共有指纹峰的保留时间RSD均小于2.0％，共有峰峰面积RSD均小于2.4％，说明供试品溶液在24h内稳定性较好。
1.3重复性考察
取批号为180509的酒女贞子样品6份，按照上述实施例1供试品制备方法制备供试品溶液，分别测定，记录色谱图，对色谱图中6个共有指纹峰进行考察，结果表明，共有指纹峰的保留时间RSD均小于2.1％，共有峰峰面积RSD均小于2.0％，说明该方法重复性良好。
由以上实验结果表明，本发明建立的酒女贞子指纹图谱检测方法，精密度、稳定性和重复性好，能有效地表征酒女贞子的质量，有利于全面监控其质量。

Claims (5)

1.一种酒女贞子的指纹图谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、酒女贞子供试品溶液的制备：
称取酒女贞子饮片待用，打粉，称取粉末置于具塞锥形瓶中，加入甲醇，称重，超声处理后补足失重，离心后取上清液用0.45μm有机微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；
步骤2、对照品溶液的制备：
分别取特女贞苷、红景天苷、酪醇、木犀草苷、芦丁和毛蕊花糖苷对照品适量，精密称定，分别置于容量瓶中，加甲醇分别配成对照品储备液；然后分别精密吸取特女贞苷、红景天苷、酪醇、木犀草苷、芦丁和毛蕊花糖苷的对照品溶液适量，加甲醇定容至20ml，制成特女贞苷、红景天苷、酪醇、木犀草苷、芦丁和毛蕊花糖苷的混合对照品溶液；
步骤3、分别精密吸取步骤1的酒女贞子供试品溶液和步骤2的混合对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；
色谱条件为：色谱柱为Purospher STAR LP RP-18 endcapped，4.6*250mm，5μm，以含0.1%磷酸的水作为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱，流速为0.8ml·min-1，柱温30℃，检测波长254nm；
梯度洗脱如下表：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
步骤4，将步骤3中获得的酒女贞子供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价***2004A；选择不同批次酒女贞子的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成酒女贞子的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；并根据混合对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分。
2.根据权利要求1所述的一种酒女贞子的指纹图谱检测方法，其特征在于，
步骤1、酒女贞子供试品溶液的制备方法为：
取酒女贞子饮片待用，打粉，精密称取过4号筛的粉末1.0g，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定质量，超声提取30min，室温放置，再称定质量，用甲醇补足失重，12000r/min离心3min，取上清液，过0.45μm有机微孔滤膜，即得。
3.根据权利要求1所述的一种酒女贞子的指纹图谱检测方法，其特征在于，
步骤2、混合对照品溶液的制备：
分别取特女贞苷、红景天苷、酪醇、木犀草苷、芦丁和毛蕊花糖苷对照品适量，精密称定，置于10ml容量瓶中，加甲醇配成浓度分别为290μg/ml的特女贞苷、117μg/ml的红景天苷、143μg/ml的酪醇、285μg/ml的木犀草苷、276μg/ml的芦丁、540μg/ml的毛蕊花糖苷的对照品储备液；分别精密特女贞苷、红景天苷、酪醇、木犀草苷、芦丁和毛蕊花糖苷对照品溶液适量，加甲醇定容至20ml，制成每1ml含特女贞苷14.5μg、红景天苷6.8μg、酪醇7.2μg、木犀草苷14.2μg、芦丁13.8μg、毛蕊花糖苷27.0μg的混合对照品溶液。
4.根据权利要求1所述的一种酒女贞子的指纹图谱检测方法，其特征在于，得到的酒女贞子指纹图谱中有10个共有峰，各共有峰的保留时间分别为：共有峰1的保留时间为25.385min；共有峰2的保留时间为27.623min；共有峰3的保留时间为37.849min；共有峰4的保留时间为48.670min；共有峰5的保留时间为57.478min；共有峰6的保留时间为58.276min；共有峰7的保留时间为59.004min；共有峰8的保留时间为61.698min；共有峰9的保留时间为80.021min；共有峰10的保留时间为85.180min。
5.根据权利要求4所述的一种酒女贞子的指纹图谱检测方法，其特征在于，其中，1号峰为红景天苷，2号峰为酪醇，5号峰为芦丁，6号峰为木犀草苷，7号峰为毛蕊花糖苷，8号峰为特女贞苷。
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