CN113943355A

CN113943355A - 一种鲈鱼弹状病毒g2-2m重组蛋白及其应用

Info

Publication number: CN113943355A
Application number: CN202111558612.9A
Authority: CN
Inventors: 王文博; 焦铁军; 孟强; 马瑞
Original assignee: Shenzhen Wankesen Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shenzhen Wankesen Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-12-20
Filing date: 2021-12-20
Publication date: 2022-01-18
Anticipated expiration: 2041-12-20
Also published as: CN113943355B

Abstract

本发明将鲈鱼弹状病毒G蛋白的G2蛋白片段与M蛋白的部分蛋白片段进行连接得到G2‑2M重组蛋白，相对于仅选用G2蛋白片段具有更好的免疫原性，能够刺激机体产生更高的中和抗体水平，对于MSRV的预防具有积极的意义。

Description

一种鲈鱼弹状病毒G2-2M重组蛋白及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鲈鱼弹状病毒G2-2M重组蛋白及其应用。

背景技术

大口黑鲈（Micropterus salmoides），俗称加州鲈、黑鲈，原产于北美密西西比河流域，属广温性鱼类，具有生长快、病害少、肉质鲜美、价格高和容易捕捞等众多优点而深受渔民的喜爱。因为大口黑鲈的养殖在国内具有较好的经济效益，在近十几年内已迅速发展成为我国主要的经济养殖鱼种，并被认定为名优品种之一，具有重要的经济价值。鲈鱼易患多种疾病，如烂鳃病、溃疡病、诺卡氏菌病、车轮虫病等。其中，由鲈鱼弹状病毒（Micropterus salmoides rhabdovirus，MSRV）引起的鲈鱼弹状病毒病（Micropterus salmoides rhabdovirus disease）危害最为严重。其流行地域广，发病时间长，发病死亡率可达85%以上，给鲈鱼养殖带来了巨大经济损失。鲈鱼弹状病毒病在我国主养殖区域内（江苏、江西、湖南、湖北、浙江和广东等）均有报道。该病从每年4月开始，持续至11月，主要流行季节为每年4～5月。当水体温度达到25～28℃、溶氧和透明度降低、水质恶化时，鲈鱼鱼种最易感染和爆发鲈鱼弹状病毒病，进而造成鲈鱼大批死亡。病鱼主要症状是烂身、烂鳍、停止摄食，濒死鱼在水面漫游，严重者体色发黑。解剖病鱼可见肝脏严重肿大、充血；脾脏肿大、充血；肾脏肿大等。

MSRV基因组主要编码5个结构蛋白，分别为核蛋白（nucleoprotein N）、磷蛋白（phosphoprotein P）、基质（matrix M）蛋白、糖蛋白（glycoprotein G）以及RNA聚合酶（RNApolymerise L）。G蛋白即糖蛋白，主要负责与宿主细胞受体的结合，是病毒的主要抗原蛋白。根据推导的氨基酸序列推测，G蛋白与其他弹状病毒相似，呈典型的跨膜蛋白，在氨基端有一段疏水性的信号肽，切除信号肽后组成成熟的糖蛋白。亲水性分析，G蛋白含有两个疏水性区域，分别构成信号肽和跨膜区域。G蛋白在病毒表面形成三聚体状的囊膜粒子，与细胞上的受体结合，介导病毒的内吞作用。G蛋白作为病毒最主要的抗原，诱导机体产生中和抗体并刺激细胞免疫，决定了病毒的血清学特征。在研究较为成熟的弹状病毒的研究中发现，M蛋白分子分布于囊膜和核衣壳之间的空隙里，在维持病毒内外两部分连接的稳定结构方面起关键作用，M蛋白与G蛋白的相互作用能够决定弹状外形的组装及病毒的出芽成熟；在基因调控、致病性中也发挥重要作用，且M蛋白中也存在抗原表位，与机体的免疫应答有关。

在MSRV的预防方面，疫苗作为预防病毒感染最有效的方式，在理论研究层面已有相关报道。将抗弹状病毒的糖蛋白G质粒注射鱼体后发现，该糖蛋白质粒可以触发I型IFN抗病毒免疫应答，显著减少病毒感染后肌肉组织受损程度，并且能够抑制病毒复制，所以对MSRV的G蛋白的研究显得尤为重要。Sun-jian LYU等（Zhejiang Univ-Sci B (Biomed & Biotechnol) 2019 20(9):728-739）构建MSRV病毒糖蛋白（G蛋白）的杆状病毒表达***，并利用杆状病毒表达***获得了高丰度的病毒糖蛋白，可结合家蚕用于后续口服疫苗的研发，但并未进行疫苗的开发和免疫效果验证。Zi-Rao Guo等（Fish and Shellfish Immunology 99 (2020) 548-554）报道了一种由MSRV糖蛋白（G蛋白）复合而成的浸渍型单壁碳纳米管负载亚单位疫苗，并评估了其对大口黑鲈的保护作用，其采用原核表达的G蛋白全序列与单壁碳纳米管组合制备得到单壁碳纳米管-糖蛋白，结果表明单壁碳纳米管-糖蛋白（SWCNTs-G）是一种很有前途的浸入式亚单位疫苗候选者，可以对抗MSRV引起的死亡，在SWCNTs的帮助下，供试SWCNTs-G组（40 mg/L）的免疫保护率达到70.1%，相比单纯采用G蛋白提高了30.6%。

目前，MSRV所引起的相关疾病仍旧缺乏有效的治疗方式。如上所述疫苗作为预防病毒感染最有效的方式在MSRV的预防上已有报道，但尚无MSRV亚单位疫苗面市。基于G蛋白的亚单位疫苗的专利申请（ZL202111066165.5），进一步研发出安全高效的针对MSRV的亚单位疫苗，才能解决鲈鱼养殖业与市场的困局，促进水产养殖业的健康发展。

发明内容

为解决以上技术问题，在前期G蛋白重组疫苗研究的基础上，进一步研究鲈鱼弹状亚单位疫苗的其他可能性，以丰富鲈鱼弹状亚单位疫苗，探索更为有效的免疫方案。本发明旨在提供一种包含M蛋白和G蛋白主要抗原表位的G2-2M重组蛋白及其应用，所述重组蛋白具有良好的免疫原性，对于亚单位疫苗的制备具有积极的意义。

为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种鲈鱼弹状病毒G2-2M重组蛋白，其特征在于，所述G2-2M重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：4所示。

一种编码鲈鱼弹状病毒G2-2M重组蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示。

一种用于表达鲈鱼弹状病毒G2-2M重组蛋白的表达载体，所述载体中包括SEQ IDNo：3所示的核苷酸序列。

优选的，所述表达载体是pET32a-G2-2M，其是以pET-32a表达载体为基础构建的表达载体。

一种用于制备鲈鱼弹状病毒G2-2M重组蛋白的基因工程菌株，其是将重组质粒pET32a-G2-2M转化至E. coli BL21（DE3）中得到的重组菌株。

鲈鱼弹状病毒G2-2M重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：重组大肠埃希氏菌E. coli BL21/pET32a-G2-2M株的构建；合成序列为SEQ ID No：3的重组核苷酸序列，将该序列克隆到pET-32a表达载体上相应的酶切位点之间，获得重组质粒pET32a-G2-2M，将所述重组质粒转化至E. coli BL21（DE3）中，即得到重组大肠埃希氏菌E. coli BL21/pET32a-G2-2M株；

步骤二：重组大肠埃希氏菌E. coli BL21/pET32a-G2-2M株的诱导表达：将生产用菌种E. coli BL21/pET32a-G2-2M用接种环挑取少量的菌液，划线接种于LB固体培养基平皿，37℃静置培养16-18小时后，挑单菌落接种于LB液体培养基中，置于37℃、以160-180r/min培养12～16小时作为一级种子；将一级种子以1%体积百分含量接种于LB液体培养基中，置于37℃、以160-180r/min培养14～16小时作为二级种子，将二级种子按1%体积百分含量接种至改良LB培养基，同时加入氨苄青霉素至终浓度100μg/mL，37℃通气发酵培养5～7小时，溶氧30%～40%，至菌液的OD₆₀₀值为1.1～1.3时，加入IPTG至终浓度为0.001mol/L，37℃诱导培养6小时，停止发酵；

步骤三：菌液处理与超声破碎；

步骤四：蛋白的纯化：采用Ni^2＋螯合亲和层析柱进行亲和层析分离得到所述的蛋白，并经透析得到纯化的蛋白。

本发明还请求保护鲈鱼弹状病毒G2-2M重组蛋白在制备弹状病毒亚单位疫苗中的应用，所述G2-2M重组蛋白可以用于鲈鱼的浸浴免疫，其相比G2蛋白而言，能够刺激机体相对更早的产生相应的抗体。

基于以上技术方案，本发明具有如下优点和有益效果：

首先，本发明先期研究的基础上，在有效的免疫蛋白G2蛋白的基础上，通过柔性接头GGGGS将弹状病毒G蛋白的G2蛋白片段与M蛋白的部分蛋白片段进行连接，且具体采用G2-GGGGSGGGGS-M-GGGGS-M的结构形式，即G2蛋白片段与M蛋白片段的摩尔比为1:2，其与弹状病毒囊膜表面M蛋白丰度相对较高的情形相似，能够更好的贴近病毒感染的过程，提高免疫保护性能。

其次，基于动物试验表明，G2-2M重组蛋白相比G2重组蛋白浸浴免疫能够产生更高滴度的中和抗体水平，在免疫后第7天，G2-2M重组蛋白免疫组能产生1:80的中和抗体滴度，相比而言是G2重组蛋白免疫组的两倍，且在第21天，G2-2M重组蛋白免疫组免疫所产生的中和抗体滴度高达1:160，而G2重组蛋白免疫组仅为1:120。基于以上试验结果表明，本发明选取G蛋白的G2蛋白片段及M蛋白的部分蛋白片段连接后，相对于仅选用G2蛋白片段具有更好的免疫原性，能够刺激机体产生更高的中和抗体水平，对于MSRV的预防具有积极的意义。

附图说明

图1：重组质粒pET32a-G2-2M的鉴定。图1中，标记M表示Maker DL 5000；标记1表示目的基因G2-2M的PCR产物；标记2表示重组质粒pET32a-G2-2M的双酶切鉴定。

图2：MSRV-G2-2M重组蛋白的表达SDS-PAGE鉴定。图2中，标记M表示Maker；标记1表示未诱导的E.coli BL21/pET32a-G2-2M培养物；标记2表示诱导后的E.coli BL21/pET32a-G2-2M培养物。

图3：MSRV-G2-2M重组蛋白的WB鉴定。图3中，标记M：Maker；标记1表示未诱导的E.coli BL21/pET32a-G2-2M培养物；标记2表示诱导后的E.coli BL21/pET32a-G2-2M培养物。

图4：浸浴免疫后的中和抗体滴度测定结果。

具体实施方式

实施例1

本实施例阐述重组大肠埃希氏菌E. coli BL21/pET32a-G2-2M株的构建和鉴定。

基因片段和M基因片段的扩增

在前期研究和生物信息学分析的基础上，结合其他弹状病毒的研究，选取了核苷酸序列为SEQ ID No：1的G2基因片段以及核苷酸序列为SEQ ID No：2的M基因片段，设计引物，分别扩增得到相应的基因片段，纯化后分别与pMD19-T载体（质粒）连接，将重组产物命名为pMD19-T-G2和pMD19-T-M。将重组质粒分别转化至大肠埃希氏菌DH5α感受态中，经蓝白斑筛选获取阳性菌株，并提取质粒进行PCR扩增检测及测序鉴定。

重组质粒pET32a-G2-2M的构建、转化与筛选

将重组质粒pMD19-T-G2和pMD19-T-M交由生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，并基于over-lap PCR技术合成序列为SEQ ID No：3的重组核苷酸序列（G2-2M），该重组核苷酸序列的结构为5’-G2-linker1（GGGGSGGGGS）-M-linker2（GGGGS）-M-3’，将该核苷酸序列克隆到pET-32a表达载体上相应的酶切位点之间，获得重组质粒pET32a-G2-2M，其表达得到氨基酸序列为SEQ ID No：4的G2-2M重组蛋白。

将重组质粒pET32a-G2-2M转化至E. coli BL21（DE3）中，涂布含有氨苄的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜。然后挑取单菌落进行针对G2的菌落PCR检测鉴定。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后于凝胶成像仪下观察扩增产物目的条带大小，如图1所示，与预期的片段大小相符的菌落为重组菌E. coli BL21/ pET 32a-G2-2M。

重组质粒pET32a-G2-2M的鉴定

将菌落PCR阳性的菌落接种至含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养液中，于37℃、以180r/min培养12～16小时，按Omega质粒提取试剂盒操作说明进行质粒的提取，测定质粒的浓度后，取8μL质粒溶液、1μL 10×酶切Buffer和各0.5μL限制性内切酶，混匀，37℃酶切5分钟。将酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图1所示，经过酶切得到约900bp的目标基因G2-2M。

实施例2

本实施例阐述MSRV-G2-2M重组蛋白的表达与纯化重组菌E. coli BL21/pET32a-G2-2M的诱导表达。

将生产用菌种E. coli BL21/pET32a-G2-2M用接种环挑取少量的菌液，划线接种于LB固体培养基平皿，37℃静置培养16-18小时后，挑单菌落接种于LB液体培养基中，置于37℃、以160-180r/min培养12～16小时作为一级种子。将一级种子以1%（V/V）接种于LB液体培养基中，置于37℃、以160-180r/min培养14～16小时作为二级种子。将二级种子按1%（V/V）接种至改良LB培养基，同时加入氨苄青霉素至终浓度100μg/mL，37℃通气发酵培养5～7小时，溶氧30%～40%，至菌液的OD₆₀₀值为1.1～1.3时，加入IPTG至终浓度为0.001mol/L，37℃诱导培养6小时，停止发酵。

菌液处理与超声破碎

发酵产物经管式离心机8000r/min室温离心，收集菌体，用PBS（0.015mol/L，pH7.2）洗涤2次，将收集的菌体按湿菌和PBS溶液（0.015mol/L，pH7.2）按照质量体积比1∶9的比例进行重悬，2～8℃高压均质机破碎细菌，细菌连续通过均质机两次以后，将破碎的菌液涂片，使用0.1%结晶紫溶液染色0.5分钟，显微镜下取3～5个视野进行观察，破碎完全时视野内全为细胞碎片而看不到完整的菌体，破碎菌液至细菌的破碎率不再发生变化为止。管式离心机12000r/min室温离心，收集蛋白沉淀。

蛋白的纯化

按每克蛋白沉淀用10mL平衡缓冲液（5mmol/L咪唑，0.5mmol/L氯化钠，8M尿素，20mmol/L Tirs-HCl，pH7.9）的比例进行溶解，室温下200r/min振荡溶解2小时后，4℃10000r/min离心30分钟，收集上清。用所述平衡缓冲液充分平衡金属（镍Ni^2＋）螯合亲和层析柱后，按2倍柱体积上样，再用平衡缓冲液平衡，然后用洗脱缓冲液（0.5mol/L咪唑，0.5mmol/L氯化钠，8M尿素，20mmol/L Tirs-HCl，pH7.9）洗脱，收集蛋白。将纯化好的200mL蛋白置于SnakeSkin™透析袋（10K MWCO），直接完全浸入到10L的复性液中（150mM NaCl、2.5mM KCl、10mM Na₂HPO₄、2mM KH₂PO₄、1%吐温-20、10mM β-环糊精、1M L-半胱氨酸，3mM还原型和1mM氧化型谷胱甘肽，pH7.9）中，4℃透析12h，期间，每6h换液一次，透析结束后，收集透析后的蛋白液4℃保存备用。

内毒素去除

向透析后的蛋白液中，加入Triton X-114至终浓度1.5%，4℃搅拌1小时。处理后将样品温度恢复至30℃维持40分钟，高速离心机17000r/min，离心去除沉淀，收集上清液。上清液按上述方法重复处理三次。

重组蛋白的检测

SDS-PAGE检测：向破菌后上清及重悬沉淀后溶液加入等体积的2×凝胶上样缓冲液，另取不经超声波破碎，直接加入等体积的2×凝胶上样缓冲液。煮沸10分钟，SDS-PAGE电泳检测，分离胶的丙烯酰胺浓度为15%。考马斯亮蓝染色，脱色液脱色至条带清晰为止。同时设立不加IPTG诱导的E. coli BL21/pET32a-G2-2M培养物作为对照。结果如图2所示。

鉴定：先将重组蛋白作SDS-PAGE电泳，方法同上。电泳结束后，取一片胶片置于转膜仪上，200mA条件下转膜1小时。将载有蛋白的PVDF膜置于塑料洗盒中，加入25mL的5%脱脂乳在室温下封闭2小时，倒掉脱脂乳，用TBST洗3次后，加入30mL一抗鼠源组氨酸单克隆抗体（抗体稀释液稀释，比例1∶1000），室温缓慢振荡反应2小时，倒掉一抗，用TBST洗5次后，加入30mL辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗（抗体稀释液稀释，比例1∶2000稀释），室温缓慢振荡反应2小时，倒掉二抗，用TBST洗5次后，将膜放入平皿中，置于暗室。先加入1mL去离子水，再加入DAB显色液（A液和B液各1滴），用移液器反复冲洗膜表面1分钟，至显色完全后，用去离子水冲洗、晾干、成像，显色后在约30KDa有特异性条带，表明样品中存在表达正确的G2-2M蛋白。结果如图3所示。

实施例3

本实施例阐述重组蛋白的免疫效力评价。

重组蛋白浸浴免疫试验

取3～5g健康鲈鱼300尾，分为免疫1组、免疫2组和对照组，每组100尾。免疫1组和免疫2组分别采用G2重组蛋白组溶液（20mg/L，基于ZL202111066165.5制备得到）和G2-2M重组蛋白组溶液（20mg/L）进行浸浴处理，对照组用生理盐水代替，浸泡免疫6小时后转入正常养殖水体。

血清中和抗体效价的测定

分别在免疫后的第3、7、14、21、28d随机从各组中随机选取3条鲈鱼，抽血并分离血清，混合后于-80℃保存，用于抗体中和效价的测定。

血清中和抗体效价的测定方法

（1）采用无血清的M199培养基对血清进行从1:5倍比稀释至1:640，得到试验用血清。

（2）用无血清的M199培养液将FJ985株病毒液稀释为100TCID₅₀/0.1mL，与等量鲈鱼弹状病毒特异性阳性血清混合，置37℃作用1小时，接种于已长成良好单层的CO细胞的96孔板，200μL/孔，分别接种4个孔，同时设阴性血清对照、正常细胞对照和未中和病毒对照，置25℃、含5% CO₂培养箱中培养3日，观察是否出现CPE，以不产生CPE的最高血清稀释度数为该血清的中和抗体滴度。

中和抗体效价的测定结果

在免疫后的3、7、14、21、28d分别对各组鲈鱼进行血清中和抗体效价测定，结果如图4所示，鲈鱼在浸浴免疫后，免疫1组和免疫2组均产生特异性抗体，而对照组未能产生特异性抗体。相比而言，免疫2组（G2-2M）相比免疫1组（G2）能够产生更高滴度的中和抗体水平，在免疫第3天，两组的中和抗体水平接近，而在免疫后第7天，G2-2M免疫组能产生1:80的中和抗体滴度，相比而言是G2蛋白组的两倍，且在第21天，两组均达到最高的平均中和抗体滴度，G2-2M蛋白免疫所产生的中和抗体滴度高达1:160，而G2蛋白组仅为1:120。基于以上试验结果表明，本发明选取G蛋白的G2蛋白片段及M蛋白的部分蛋白片段连接后，相对于仅选用G2蛋白片段具有更好的免疫原性，能够刺激机体产生更高的中和抗体水平，对于MSRV的预防具有积极的意义。

攻毒试验

从以上对照组、免疫1组和免疫2组的鲈鱼中，随机选取50尾，分别以鲈鱼弹状病毒FJ985株进行腹腔注射攻毒，15μL（病毒含量为100TCID₅₀/mL）/尾。攻毒后连续观察14日，计算各组攻毒后的存活率，其中对照组的存活率为2/50，免疫1组的存活率为32/50，免疫2组的存活率为40/50，可见，本发明所制备得到的G2-2M重组蛋白浸浴免疫处理，相比G2重组蛋白具有更好的免疫保护效力。

基于以上试验结果可以看出，G2-2M重组蛋白相比本公司先期研发的G2重组蛋白具有相对更好的免疫原性，其能刺激机体在免疫早期产生相对更高的抗体水平，实现感染早期的免疫保护，对于发病早期的鱼群的防疫具有积极的意义，其能在更短时间内达到合适的抗体水平，对于防范感染早期鱼苗的大量死亡具有积极的意义。

以上记载的仅为本发明的优选实施例，不能以此来限定本发明之权利范围，因此，依据本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。

序列表

<110> 深圳万可森生物科技有限公司

<120> 一种鲈鱼弹状病毒G2-2M重组蛋白及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 420

<212> DNA

<213> 鲈鱼弹状病毒(Micropterus salmoides)

<400> 1

atgaactgtg gatggaataa cgtgttgact gagtcccaag aattcaccac tttgacttca 60

caccctgtta aattggatgc ctactctttc atattaattg acagcatgtt tgagggagga 120

cggtgtcaat caaaagagtg tcctgtggtg ttccatcaag ggatgtggat tgctgatcaa 180

gaagctttcg gattttgcaa agacttggac aaacacaggg gactactttt caaaactgga 240

ttgaggaatt cactgggaga aattgtcaga caagagtgga atctgaattc ggtattccag 300

ccagagatag gaagggaaaa acatttcaag ggtgcctgta aaatgtcgta ctgcgggaat 360

tcaggggtta gattttctga tagagagtgg tttcaattgg gtacgccgtc agacaattga 420

<210> 2

<211> 216

<212> DNA

<213> 鲈鱼弹状病毒(Micropterus salmoides)

<400> 2

atgaaaaaaa ctttaacaga tatcatagaa tatccacgaa agatgcctct gtttaagaag 60

agcaacaaga agtcggctat tacgccatat caagcacctc cgccatactc ggcaaccgca 120

ctcactccga gtgctccgat ggccctgcct gacagtgact acggaatcaa aacaatgatg 180

gtggagttgg acttcaagat catatccagc atcgag 216

<210> 3

<211> 903

<212> DNA

<213> 鲈鱼弹状病毒(Micropterus salmoides)

<400> 3

ccatggactg tggatggaat aacgtgttga ctgagtccca agaattcacc actttgactt 60

cacaccctgt taaattggat gcctactctt tcatattaat tgacagcatg tttgagggag 120

gacggtgtca atcaaaagag tgtcctgtgg tgttccatca agggatgtgg attgctgatc 180

aagaagcttt cggattttgc aaagacttgg acaaacacag gggactactt ttcaaaactg 240

gattgaggaa ttcactggga gaaattgtca gacaagagtg gaatctgaat tcggtattcc 300

agccagagat aggaagggaa aaacatttca agggtgcctg taaaatgtcg tactgcggga 360

attcaggggt tagattttct gatagagagt ggtttcaatt gggtacgccg tcagacaatg 420

gaggtggagg atcaggaggt ggaggatcaa tgaaaaaaac tttaacagat atcatagaat 480

atccacgaaa gatgcctctg tttaagaaga gcaacaagaa gtcggctatt acgccatatc 540

aagcacctcc gccatactcg gcaaccgcac tcactccgag tgctccgatg gccctgcctg 600

acagtgacta cggaatcaaa acaatgatgg tggagttgga cttcaagatc atatccagca 660

tcgagggagg tggaggatca atgaaaaaaa ctttaacaga tatcatagaa tatccacgaa 720

agatgcctct gtttaagaag agcaacaaga agtcggctat tacgccatat caagcacctc 780

cgccatactc ggcaaccgca ctcactccga gtgctccgat ggccctgcct gacagtgact 840

acggaatcaa aacaatgatg gtggagttgg acttcaagat catatccagc atcgagggag 900

ctc 903

<210> 4

<211> 300

<212> PRT

<213> 鲈鱼弹状病毒(Micropterus salmoides)

<400> 4

Met Asp Cys Gly Trp Asn Asn Val Leu Thr Glu Ser Gln Glu Phe Thr

1 5 10 15

Thr Leu Thr Ser His Pro Val Lys Leu Asp Ala Tyr Ser Phe Ile Leu

20 25 30

Ile Asp Ser Met Phe Glu Gly Gly Arg Cys Gln Ser Lys Glu Cys Pro

35 40 45

Val Val Phe His Gln Gly Met Trp Ile Ala Asp Gln Glu Ala Phe Gly

50 55 60

Phe Cys Lys Asp Leu Asp Lys His Arg Gly Leu Leu Phe Lys Thr Gly

65 70 75 80

Leu Arg Asn Ser Leu Gly Glu Ile Val Arg Gln Glu Trp Asn Leu Asn

85 90 95

Ser Val Phe Gln Pro Glu Ile Gly Arg Glu Lys His Phe Lys Gly Ala

100 105 110

Cys Lys Met Ser Tyr Cys Gly Asn Ser Gly Val Arg Phe Ser Asp Arg

115 120 125

Glu Trp Phe Gln Leu Gly Thr Pro Ser Asp Asn Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Met Lys Lys Thr Leu Thr Asp Ile Ile Glu Tyr

145 150 155 160

Pro Arg Lys Met Pro Leu Phe Lys Lys Ser Asn Lys Lys Ser Ala Ile

165 170 175

Thr Pro Tyr Gln Ala Pro Pro Pro Tyr Ser Ala Thr Ala Leu Thr Pro

180 185 190

Ser Ala Pro Met Ala Leu Pro Asp Ser Asp Tyr Gly Ile Lys Thr Met

195 200 205

Met Val Glu Leu Asp Phe Lys Ile Ile Ser Ser Ile Glu Gly Gly Gly

210 215 220

Gly Ser Met Lys Lys Thr Leu Thr Asp Ile Ile Glu Tyr Pro Arg Lys

225 230 235 240

Met Pro Leu Phe Lys Lys Ser Asn Lys Lys Ser Ala Ile Thr Pro Tyr

245 250 255

Gln Ala Pro Pro Pro Tyr Ser Ala Thr Ala Leu Thr Pro Ser Ala Pro

260 265 270

Met Ala Leu Pro Asp Ser Asp Tyr Gly Ile Lys Thr Met Met Val Glu

275 280 285

Leu Asp Phe Lys Ile Ile Ser Ser Ile Glu Gly Ala

290 295 300

Claims

1.一种鲈鱼弹状病毒G2-2M重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No：4所示。

2.一种编码权利要求1所述的鲈鱼弹状病毒G2-2M重组蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：3所示。

3.一种用于表达权利要求1所述的鲈鱼弹状病毒G2-2M重组蛋白的表达载体，所述载体中包括SEQ ID No：3所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的表达载体，所述表达载体是pET32a-G2-2M，其是以pET-32a为基础构建的表达载体。

5.一种用于制备权利要求1所述的鲈鱼弹状病毒G2-2M重组蛋白的基因工程菌株，其是将重组质粒pET32a-G2-2M转化至E. coli BL21（DE3）中得到的重组菌株。

6.一种制备权利要求1所述的鲈鱼弹状病毒G2-2M重组蛋白的方法，其特征在于，包括：

重组大肠埃希氏菌E. coli BL21/pET32a-G2-2M株的构建；

重组大肠埃希氏菌E. coli BL21/pET32a-G2-2M株的诱导表达；

菌液处理与超声破碎；

蛋白的纯化。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述重组大肠埃希氏菌E. coli BL21/pET32a-G2-2M株的构建方法为：合成序列为SEQ ID No：3的重组核苷酸序列，将该重组核苷酸序列克隆到pET-32a表达载体上，获得重组质粒pET32a-G2-2M，将所述重组质粒转化至E. coli BL21中，即得到重组大肠埃希氏菌E. coli BL21/pET32a-G2-2M株。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述重组大肠埃希氏菌E. coli BL21/pET32a-G2-2M株的诱导表达方法为：将菌种E. coli BL21/pET32a-G2-2M接种于LB固体培养基，37℃静置培养16-18小时后，挑单菌落接种于LB液体培养基中，置于37℃、以160-180r/min培养12～16小时作为一级种子；将一级种子以1%体积百分含量接种于LB液体培养基中，置于37℃、以160-180r/min培养14～16小时作为二级种子，将二级种子按1%体积百分含量接种至改良LB培养基，同时加入氨苄青霉素至终浓度100μg/ml，37℃通气发酵培养5～7小时，溶氧30%～40%，至菌液的OD₆₀₀值为1.1～1.3时，加入IPTG至终浓度为0.001mol/L，37℃诱导培养6小时，停止发酵。

9.权利要求1所述的鲈鱼弹状病毒G2-2M重组蛋白在制备弹状病毒亚单位疫苗中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述G2-2M重组蛋白用于提高鱼类的机体免疫力。