CN114187968A - 基于ngs技术的无菌检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物信息领域,具体地,本发明涉及基于NGS技术的无菌检测方法。本发明提供的方法基于NGS技术进行无菌检测,样品无需培养,通过MDA单细胞基因组扩增技术,可对极微量的样品进行扩增测序,产生大量的测序数据,即使样品中微生物的含量很低,也能在测序数据中通过数据分析检测到,本发明可检测低至10CFU的微生物种类,检测周期只需24‑48小时,解决了传统药典规定的无菌检测方法周期长和灵敏度低的问题。
Description
技术领域
本发明涉及生物信息领域,具体地,本发明涉及基于NGS(Next GenerationSequencing,二代测序)技术的无菌检测方法。
背景技术
无菌检查法是指检查药品、医疗器具、原料、辅料及适用于药典要求无菌检查的其它制品是否无菌的一种方法。传统的无菌检测方法主要有药典无菌检查法、三磷酸腺苷(ATP)生物发光法、核酸扩增法等,但是不同的方法各有特点,也有各自的局限性(宋光艳,冯震,潘盈盈,流式细胞技术在药品无菌检查中的应用研究.中国药师,2012.21(2):p.342-345.)。在药品和医疗器械等生产、流通和监管领域,无菌检测是保障药品质量,降低药品不良反应的必要手段,特别是对于高风险的无菌制剂,无菌检测具有重要意义。
无菌检测技术对于医药领域特别是目前火热的细胞治疗领域至关重要。近年来随着细胞治疗技术的快速发展,细胞治疗产品已逐步走向临床运用,基于细胞治疗的要求,细胞治疗产品一般需要在制备完成后48小时后回输患者,而针对细胞制剂的无菌检查,按照药典规定的培养法,检测周期往往需要7-14天,已不能满足当前的实际需要,迫切需要新的快速无菌检测技术(Gu,W.,S.Miller,and C.Y.Chiu,Clinical Metagenomic Next-Generation Sequencing for Pathogen Detection.Annu Rev Pathol,2019.14:p.319-338.)。
二代测序技术(Next Generation Sequencing,NGS)的发展极大地推进了生物医学领域的基础研究和疾病治疗,例如基于NGS的16S/18S/Internal Transcribed Spacer(ITS)测序技术在细菌种属鉴定方面的应用,以及基于NGS的宏基因组测序技术在人体肠道微生物研究方面的应用等(Janda,J.M.and S.L.Abbott,16S rRNA gene sequencing forbacterial identification in the diagnostic laboratory:pluses,perils,andpitfalls.J Clin Microbiol,2007.45(9):p.2761-4.)。虽然NGS技术在微生物科研和临床研究方面早有应用案例,但是目前也存在不少限制。例如部分细菌之间DNA同源性<50%,但是却几乎具有99%到100%的16S rRNA,因此通过16S/18S/ITS测序并不能很准确地区分细菌的种属。此外,常规样品预处理和DNA扩增技术难以检测样品中极微量的DNA。
目前,还没有基于微量DNA扩增的NGS技术用于药典要求无菌检测的文献报道,也暂无可用于药典要求的无菌检测相关的样品前处理和基于生物信息的无菌判断标准等的报道。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此,本发明提供确定待测产品是否被微生物污染的方法,基于NGS技术进行无菌检测,样品无需培养,通过MDA单细胞基因组扩增技术,可对极微量的样品进行扩增测序,产生大量的测序数据,即使样品中微生物的含量很低,也能在测序数据中通过数据分析检测到,本发明可检测低至10CFU的微生物种类(细菌或真菌),检测周期只需24-48小时,解决了传统药典规定的无菌检测方法周期长(7-14天)和灵敏度低(100CFU)问题。
为此,本发明第一方面提供一种确定待测产品是否被微生物污染的方法。根据本发明的实施例,所述方法包括:
(1)从待测产品分离测试样品,并获取核酸样本;
(2)对所述核酸样本进行扩增,获得扩增产物;
(3)基于所述扩增产物,构建测序文库;
(4)对所述测序文库进行测序,以获得测序结果,所述测序结果由多个测序读段构成;
(5)利用已知的背景生物基因组信息,对所述测序结果进行过滤处理,以获得经过过滤处理的测序结果;和
(6)利用已知微生物的基因组信息,基于所述经过过滤处理的测序结果,确定所述待测产品是否被所述已知微生物污染。
本发明提供的确定待测产品是否被微生物污染的方法,能够准确地对检测到的微生物进行定性(物种水平)和定量,能够克服传统方法(药典法、常规测序分析法等)检测假阳性高和不能准确鉴定微生物种属的问题。
根据本发明实施例的确定待测产品是否被微生物污染的方法,还可以具有以下附加技术特征的至少之一:
根据本发明的实施例,所述待测产品包括生物样本、药品、医药原料、医药辅料、医疗器械、食品、化妆品和保健品;
任选地,所述药品包括细胞药物、抗体药物、化学药品。
根据本发明的实施例,所述待测产品还可以是适用于药典要求无菌检查的其它制品。
根据本发明的实施例,所述待测产品中含有已知的生物体或者所述生物体的一部分,所述已知生物体的基因组信息构成所述背景生物基因组信息的至少一部分。
根据本发明的实施例,所述背景生物基因组信息为人参考基因组信息;或者,所述产品含有益生菌,所述背景基因组信息为所述益生菌的基因组信息。
根据本发明的实施例,所述人参考基因组的版本选自hg38、hg19、hg18,优选为hg38。
根据本发明的实施例,所述待测产品为水溶液,直接作为测试样品;
或者,所述待测产品为水溶性固体,制备所述待测产品的水溶液作为测试样品;
或者,所述待测产品为非水溶性固体,利用乳化剂使所述非水溶性固体乳化,获得测试样品。
根据本发明的实施例,所述核酸样本是采用下列方法中至少之一获得的:
(a)对所述测试样品进行溶菌酶处理;和
(b)对所述测试样品进行加热处理,所述加热是在65℃~90℃下进行的。
根据本发明的实施例,所述溶菌酶的用量以及处理温度可根据需要进行选择,所述加热的时间可根据需要进行选择,只要保证测试样品中的微生物能够完全裂解,基因组DNA能够释放出即可。
根据本发明的实施例,所述基因组扩增是通过MDA法、MALBAC法、DOC-PCR法中的一种或多种联合进行的,优选采用MDA法。
根据本发明的实施例,所述测序是在DNBSEQ-T7、MGISEQ-2000、HiSeq 4000或HiSeq X Ten测序***中的至少之一进行的。
根据本发明的实施例,所述测序的测序量不少于1G。
根据本发明的实施例,所述过滤处理包括:
(i)将所述测序结果与所述背景生物基因组信息进行比对,以获得能够与所述背景生物基因组信息比对上的匹配测序读段;和
(ii)从所述测序结果中去除所述匹配测序读段,以获得经过过滤处理的所述测序结果。
根据本发明的实施例,所述过滤处理进一步包括:
(ⅲ)将所述匹配测序读段与已知内源生物基因组信息进行比对,以获得比对上的内源生物测序读段;和
(ⅳ)将所述内源生物测序读段补入经过过滤处理的所述测序结果中,以获得经过过滤处理的所述测序结果。
根据本发明的实施例,所述已知内源生物基因组为与所述背景生物基因组发生基因重组。
在本发明的一些实施例中,所述方法还包括在进行所述过滤处理之前,对所述测序结果的数据进行预处理和碱基矫正,该过程可保证后续分析结果的准确性。
在本发明的一些实施例中,对所述测序结果的数据进行预处理和碱基矫正的过程主要是过滤低质量reads(测序读段),过滤含有接头污染的reads,并通过双末端reads之间的重叠部分碱基深度差异及碱基质量情况比较,对reads中潜在的错误碱基进行校正。
根据本发明的实施例,在步骤(6)中,进一步包括:
(6-1)确定与所述已知微生物基因组信息比对上的测序读段数目;
(6-2)基于步骤(6-1)获得的所述测序读段数目,确定所述已知微生物的污染指数,所述污染指数与所述步骤(6-1)获得的所述测序读段数目呈正相关;
(6-3)基于所述污染指数与预定阈值的差异,确定所述产品是否被所述已知微生物污染。
根据本发明的实施例,所述污染指数是通过以下公式确定的,
RPM=a*1000000/b,
其中,RPM表示所述污染指数,a为在步骤(6-1)获得的所述测序读段数目,b是步骤(5)中获得的经过过滤处理的测序结果中测序读段的总数目。
根据本发明的实施例,所述预定阈值不低于10。
本发明第二方面提供本发明第一方面所述的方法在进行无菌检查的制品中鉴定微生物种类的用途。
现有的无菌检测或微生物检测手段主要有以下方案:
1)药典无菌检查法,无菌检查法现行版为《中国药典》(2015版)无菌检查法。简言之,在严格遵守无菌环境下通过特定培养基对样品进行微生物培养,鉴定样品中是否存在细菌或真菌污染(中国药典[S].2015年版.四部.136-140.)。
2)三磷酸腺苷(ATP)生物发光法,利用ATP与荧光素-荧光素酶复合物的反应来测定是否存在ATP。因为每种微生物细胞中的ATP含量是恒定的,所以样品中ATP含量与样品中微生物的数量有关(Decool,A.,et al.,Detection of bacterial adenosinetriphosphate through bioluminescence,applied to a rapid sterility test ofinjectable preparations.Analytica Chimica Acta,1991.255(2),423–425.)。
3)核酸扩增法,即通过核酸体外扩增技术,定性、定量的检测样品中的微量核酸(王晓冲,周继昌,李军,等.实时荧光定量PCR方法应用于药品无菌快速检测的研究[J].中国现代应用药学,2013,30(12):1333-1337.)。该方法在分子生物和生物分析等领域是一项重要的技术,其在临床医学、检验医学及食品安全等相关的各个领域发挥着重要的作用。
4)基于常规NGS技术的环境微生物鉴定,采用高通量测序技术,通过宏基因组测序或16S/18S/ITS测序手段,鉴定环境(如肠道、生殖道、土壤等)微生物的种类。
但上述方法均存在缺点,具体如下:
1)药典无菌检查法,需要对待检验样品中的微生物进行培养,可能存在样品中微生物无法培养的问题,且即使可培养,培养周期也较长(一般需7-14天),检测灵敏度小于100CFU(注:CFU是指按国家标准方法规定,在需氧情况下,37℃培养48h,能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数)。
2)三磷酸腺苷(ATP)生物发光法,该方法无法进行微生物的种属鉴定,准确度较低,检测灵敏度小于1000CFU。
3)核酸扩增法,由于核酸扩增过程中可能存在扩增偏向性,因而导致假阳性较高,灵敏度介于10-100CFU。
4)基于常规NGS技术的环境微生物鉴定,通过16S、18S等测序无法准确地鉴定微生物的种类,常规建库测序也无法达到药典无菌检测的灵敏度要求,无法用于药典要求的细胞制剂或药品无菌检测领域。
近年来通过单细胞扩增技术对于极微量的DNA载体进行扩增和建库测序,例如基于多重置换扩增(multiple displacement amplification,MDA)和多次退火环状循环扩增(multiple annealing and looping-based amplification cycles,MALBAC)的单细胞DNA测序技术已经用于科研领域(Spits,C.,et al.,Whole-genome multiple displacementamplification from single cells.Nat Protoc,2006.1(4):p.1965-70;Chen,M.,etal.,Comparison of multiple displacement amplification(MDA)and multipleannealing and looping-based amplification cycles(MALBAC)in single-cellsequencing.PLoS One,2014.9(12):p.e114520.)
为克服现有技术的缺点与不足,本发明通过大量的实验条件摸索,发明了一种基于NGS的快速无菌检测方法,通过MDA扩增的DNA建库技术,具有扩增偏向性小,扩增灵敏度高的特点,只需要样品中极微量的DNA即可进行扩增,解决了传统方法灵敏度低的问题。该方法能够达到比药典法更高的无菌检测灵敏度,同时该方法能够显著的缩短检测时间,整个检测周期只需24-48小时,克服了传统检测方法速度与准确性不能兼得的问题。本发明提出了一种基于测序的生物制品无菌检测样本的前处理方法;本发明还提出了一种基于NGS的无菌检测的结果判断标准。
本发明基于NGS的全基因组测序和全面的微生物标记分子数据库,并通过自主搭建的生物信息学分析方法,能够准确地对检测到的微生物进行定性(物种水平)和定量,能够克服传统方法(药典法、常规测序分析法等)检测假阳性高和不能准确鉴定微生物种属的问题。
本发明可带来的有益效果如下:
1)本发明提出的一种基于NGS的无菌检测样品前处理方法,具有样品无需培养、速度快的特点,解决了传统方法(如药典无菌检查)需要进行微生物培养,周期长的问题,且对于目前药典法无法培养的微生物也能进行检测。
2)本发明提出的基于MDA扩增的DNA建库技术,具有扩增偏向性小,扩增灵敏度高的特点,只需要样品中极微量的DNA即可进行扩增,解决了传统方法(如核酸扩增法、ATP生物发光)灵敏度低的问题。
3)本发明提出的基于数据过滤与矫正、数据库比对等多步骤的生物信息算法,能够精确进行微生物的种属鉴定,并能够根据检测的reads丰度进行定量,解决了传统方法精确度不够,不能进行种属鉴定等问题。
4)本发明提出的一种基于NGS的快速无菌检测方法,是唯一同时具备高灵敏度、种属鉴定、无需培养、快速的微生物检测技术,可用于药典要求无菌检测的临床生物制品特别是细胞制剂的快速无菌检测。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出,部分将从下面的描述中变得明显,或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解,其中:
图1显示了本发明提供的确定待测产品是否被微生物污染的方法的流程示意图;
图2显示了本发明实施例的微生物检测生物信息分析的流程示意图;
图3a显示了不同处理方法下,大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌以及白色念珠菌的全基因组扩增产物含量测定结果;
图3b显示了模式细菌全基因组扩增产物电泳图,1-5泳道为大肠埃希氏菌(1、5、10、50、100CFU);6-10泳道为铜绿假单胞菌(1、5、10、50、100CFU);11-15泳道为金黄色葡萄球菌(1、5、10、50、100CFU);16-20泳道为枯草芽孢杆菌(1、5、10、50、100CFU);21-25泳道为生孢梭菌(1、5、10、50、100CFU);26-30泳道为白色念珠菌(1、5、10、50、100CFU);31-35泳道为核梭杆菌(1、5、10、50、100CFU);36泳道为无菌水阴性对照;
图4显示了核梭杆菌(029)、白色念珠菌(B)、大肠埃希氏菌(D)、金黄色葡萄球菌(J)、枯草芽孢杆菌(K)、生孢梭菌(S)以及铜绿假胞杆菌(T)在1CFU、5CFU、10CFU、50CFU、100CFU的菌种数量下以及阴性对照组(无菌水)的测序样品数据量;
图5显示了核梭杆菌(029)、白色念珠菌(B)、大肠埃希氏菌(D)、金黄色葡萄球菌(J)、枯草芽孢杆菌(K)、生孢梭菌(S)以及铜绿假胞杆菌(T)在1CFU、5CFU、10CFU、50CFU、100CFU的菌种数量下以及阴性对照组(无菌水)的测序样品数据质量Q20比例情况;
图6显示了不同梯度菌种数量灵敏度检测结果;
图7显示了不同梯度菌种数量灵敏度检测覆盖度结果;
图8显示了不同梯度灵敏度检测的不同菌种基因组平均覆盖深度结果;
图9显示了大肠埃希氏菌(D)和金黄色葡萄球菌(J)以不同浓度比例混合时,混合样本检测情况;
图10显示了大肠埃希氏菌(D)和金黄色葡萄球菌(J)以不同浓度比例混合时,混合样本检测基因组覆盖度情况。
具体实施方式
本发明提供一种确定待测产品是否被微生物污染的方法,基于NGS技术进行无菌检测,样品无需培养,通过MDA单细胞基因组扩增技术,可对极微量的样品进行扩增测序,产生大量的测序数据,即使样品中微生物的含量很低,也能在测序数据中通过数据分析检测到,本发明可检测低至10CFU的微生物种类,检测周期只需24-48小时,解决了传统药典规定的无菌检测方法周期长(7-14天)和灵敏度低(100CFU)问题。
为此,本发明提供一种确定待测产品是否被微生物污染的方法。如附图1所示,展示了本发明提供的确定待测产品是否被微生物污染的方法的总体流程。根据本发明的实施例,所述方法包括:
(1)从待测产品分离测试样品,并获取核酸样本;
(2)对所述核酸样本进行扩增,获得扩增产物;
(3)基于所述扩增产物,构建测序文库;
(4)对所述测序文库进行测序,以获得测序结果,所述测序结果由多个测序读段构成;
(5)利用已知的背景生物基因组信息,对所述测序结果进行过滤处理,以获得经过过滤处理的测序结果;和
(6)利用已知微生物的基因组信息,基于所述经过过滤处理的测序结果,确定所述待测产品是否被所述已知微生物污染。
在本发明的一些实施例中,所述待测产品包括生物样本、药品、医药原料、医药辅料、医疗器械、食品、化妆品和保健品;
任选地,所述药品包括细胞药物、抗体药物、化学药品。
在本发明的一些实施例中,对于水溶液待测产品,可直接作为待检液;对于水溶性固体,采用无菌PBS/生理盐水稀释液溶解或按标签说明复溶;对于非水溶性样品,采用适量含聚山梨酯80或其他适宜乳化剂的稀释液溶解。上述所用试剂的浓度可根据本领域常规的浓度进行选择。
在本发明的一些实施例中,获得液体形式的测试样品后,还可以采用不大于0.22μm的薄膜过滤,然后采用无菌PBS/生理盐水冲洗薄膜,收集冲洗液,使其达到浓缩微生物的目的,并最终增加基于NGS的微生物检测灵敏度。
通过对待检样品的处理,待测样品无需培养,也可达到并超过药典无菌检查培养法的检测灵敏度,并对目前暂不能培养的微生物也能进行检测。
在本发明的一些实施例中,所述核酸样本是采用下列方法中至少之一获得的:
(a)对所述测试样品进行溶菌酶处理;和
(b)对所述测试样品进行加热处理,所述加热是在65℃~90℃下进行的。
在本发明的一些实施例中,所述溶菌酶的用量以及处理温度可根据需要进行选择,所述加热的时间可根据需要进行选择,只要保证测试样品中的微生物能够完全裂解,基因组DNA能够释放出即可。
与动物细胞不同,微生物(细菌/真菌)具有细胞壁,这会增加细胞DNA的裂解难度,影响基因组扩增,在本发明的一些实施例中,先采用溶菌酶处理待检样品,再采用高温(例如,70℃)的方法裂解微生物,可促进细菌/真菌裂解和基因组DNA释放。
在本发明的一些实施例中,所述基因组扩增是通过MDA法、MALBAC法、DOC-PCR法中的一种或多种联合进行的,优选采用MDA法。
在本发明的一些实施例中,在基因组扩增步骤,本发明采用基于MDA的全基因组扩增方法,通过在微生物DNA模板中加入Phi29聚合酶、Phi29聚合酶Buffer、随机引物和dNTP,6-8小时,可完成低至1个微生物细胞的全基因组扩增。
在本发明的一些具体的实施例中,所述背景生物基因组为人参考基因组hg38,所述已知内源生物基因组为人基因组中内源性病毒序列。
在本发明的一些实施例中,所述测序是在DNBSEQ-T7、MGISEQ-2000、HiSeq 4000或HiSeq X Ten测序***中的至少之一进行的。
在本发明的一些实施例中,所述测序的测序量不少于1G。
在本发明的一些实施例中,所述过滤处理包括:
(i)将所述测序结果与人参考基因组hg38进行比对,以获得能够与人参考基因组hg38比对上的匹配测序读段;和
(ii)从所述测序结果中去除所述匹配测序读段,以获得经过过滤处理的所述测序结果。
所述过滤处理进一步包括:
(ⅲ)将所述匹配测序读段与人基因组中内源性病毒序列进行比对,以获得比对上的内源生物测序读段;和
(ⅳ)将所述内源生物测序读段补入经过过滤处理的所述测序结果中,以获得经过过滤处理的所述测序结果。
附图2展示了对测序结果进行生物信息分析的具体过程。首先,对测序数据进行预处理和碱基矫正。对于测序***下机的原始数据(Raw reads),由于仪器***误差的原因,测序碱基中存在一定的错误率。因此,为了后续微生物鉴定的准确性,需要对原始下机数据进行预处理和碱基矫正,以提高后续比对的准确性和物种鉴定的准确性。预处理的过程主要是过滤低质量reads,过滤含有接头污染的reads,并通过双末端reads之间的重叠部分碱基深度差异及碱基质量情况比较,对reads中潜在的错误碱基进行校正。
对于上述预处理和碱基矫正得到的数据(称为Clean reads),通过比对软件(如Bowtie2、SOAP2或BWA等,优选Bowtie2)比对到人类参考基因组hg38。对于比对上hg38的reads,进一步的比对到人基因组中内源性病毒序列,并将能够比对到内源性病毒参考序列的reads输出。接着,将比对上内源性病毒序列的reads与比对不上hg38参考序列的reads合并,得到过滤后的总数据(Filtered data)。最后,将Filtered data与微生物分子标记数据库MetaPhAn2做比对得到Bam文件,通过统计准确鉴定测序数据中涉及的微生物种类。本方法中提到的比对流程和比对数据库,能够全面地考虑微生物的种类和特定标签序列,从而快速、准确鉴定微生物种类。
在本发明的一些实施例中,提出了一个无菌检测的检测阈值标准。对上述比对得到的Bam文件进行统计分析,得到比对上的每个物种的reads数,并通过总reads数进行归一化,得到每百万的总reads中比对到特定物种的reads数(RPM,Reads Per Million),具体计算公式如下:
RPM=比对上某一个微生物的所有reads数*1000000/所有微生物reads总数;
注:所有微生物reads总数指去除比对上宿主(hg38)序列,但保留内源病毒序列后的所有reads数。
通过对药典法规定的7种微生物(核梭杆菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌)的重复实验测试,在检测灵敏度为10CFU的条件下,只有当RPM大于或等于10时,才能检测出全部微生物,而在RPM<10时,则有少数样品检测结果为阴性(参见实施例2和实施例3),因此,最终确定RPM大于等于10作为检测阳性(10CFU灵敏度条件下)的判断标准。
本发明提供的方法能够对样品中微生物的微量的DNA进行全基因组扩增,能够对低至10CFU的细菌和真菌进行检测。本发明提供的生物信息处理方法。该方法的特点是能够快速、准确地分析待检样品中的微生物种类,并统计其覆盖度和深度,对微生物进行定性和定量检测。本发明提供的基于NGS的检测方法,无需培养、快速、高通量、准确度高、灵敏度高等,只要是药典要求需要进行无菌检测的产品或材料,包括但不限于细胞制剂、药品、医疗器械等药典要求无菌检测的制品,都适用该方法。
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1基于MDA法进行微生物微量DNA的全基因组扩增
为比较采用不同微生物裂解方法,本实施案例采用分别取4μL包含100CFU的大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌,同时采用4μL Nuclease-free water作为阴性对照,分别按照方法1:加入3μL溶菌酶,65℃处理10分钟;方法2:90℃处理10分钟;方法3:加入溶菌酶65℃处理10分钟,然后90℃处理5分钟。经过不同处理方法后的样品,短暂离心收集管壁液体至管底,加入40μL华大智造MGIEasy单细胞全基因组扩增试剂盒的扩增反应混合液(Amplification Reaction Buffer 39μL,Amplification Enzyme 1μL),震荡混匀。将PCR管置于PCR仪上,进行全基因组PCR扩增反应。按照30℃,4-8小时,65℃,5分钟进行反应。反应结束后全基因组扩增产物进行凝胶电泳检测和浓度测定,比较不同样本处理方法基因组扩增差异。全基因组扩增产物检测结果(图3a)显示,经过溶菌酶和加热处理后的微生物,能获得相对更多的基因组扩增产物,且基因组完整性不受影响。
为了检测基于NGS技术的微量微生物检测灵敏度,采用分别取4μL包含1CFU、5CFU、10CFU、50CFU、100CFU大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、核梭杆菌,同时采用4μL Nuclease-free water作为阴性对照,向装有待检测样品和阴性对照样本PCR管中加入3μL溶菌酶。短暂离心收集管壁液体至管底,将PCR管置于PCR仪上,按照65℃,10min进行细胞裂解反应。细胞裂解反应结束后,取出PCR管瞬时离心后,加入3μL中和缓冲液,短暂离心收集管壁液体,加入40μL全基因组扩增反应混合液(Amplification Reaction Buffer 39μL,Amplification Enzyme 1μL),震荡混匀。将PCR管置于PCR仪上,进行全基因组PCR扩增反应。按照30℃,4-8小时,65℃,5分钟进行反应。反应结束后全基因组扩增产物进行凝胶电泳检测和浓度测定,置于-20℃冰箱储存备用。全基因组扩增电泳检测结果如附图3b所示,结果表明,通过全基因组PCR扩增,低至10CFU的不同种类细菌均可获得全基因组DNA产物。
实施例2微生物样本检测的灵敏度试验
共取6种细菌和一种真菌(核梭杆菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌),每种微生物设置5个梯度的菌种数量,微生物数量分别对应1CFU、5CFU、10CFU、50CFU、100CFU以及阴性对照组(无菌水),方案如表1所示。每个样品DNA经MDA扩增后,经DNBSEQ-T7测序***进行高通量测序,测序策略采用PE100(即双末端测序,每条读段长度100bp),每个样品测序数据量不小于1Gb。获得每个样品的测序数据。
表1不同单个菌种的检测灵敏度测试(菌种后的括号内为该菌的代号)
接着,生物信息分析流程如下:
1)对每个样品的测序数据进行过滤和碱基矫正,去除低质量的测序数据和含有接头污染的reads,得到高质量的clean data。样品过滤后的Q20和数据量分别见图4和图5;
2)将过滤后的clean data比对到人参考基因组hg38,得到比对上hg38的reads以及比对不到hg38的reads,将比对不上的reads命名为序列文件1;
3)将比对上hg38的reads进一步比对人的内源性病毒序列,得到比对上内源性病毒序列的reads(序列文件2)。
4)将序列文件1和序列文件2合并,得到总的reads(序列文件3),并比对到微生物分子标记数据库MetaPhAn2。
5)将比对上数据库的序列进行统计,对应得到不同的微生物种类中比对上的reads数,即每百万总reads中比对上特定微生物的reads数(Reads Per Million,RPM)。
6)将序列文件3比对到鉴定到的菌种的参考基因组上,得到比对的Bam文件,并采用bamdst软件统计每个菌种的覆盖度和平均覆盖深度。通过这七种微生物不同梯度样品量的测试,发现在灵敏度要求在10CFU的条件下,仅当RPM≧10时,才能检测出所有微生物,而当RPM小于10时,则其中有2种微生物(金黄色葡萄球菌、白色念珠菌)检测结果为阴性(多次重复均为阴性),检测灵敏度和覆盖度情况见图6-8。由图可见,当且仅当RPM≧10时,所有模式菌种最低检测限均低至10CFU,由此可将RPM≧10作为该灵敏度下的检测阈值判定标准。
实施例3混合微生物NGS法准确性检测试验
为了测试不同微生物混合情况下,对于其中的微生物检测灵敏度,采用大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌按照不同比例进行混合,并对混合微生物进行DNA提取、MDA扩增和测序,测序数据量不小于1G,数据分析流程和软件参数与实施例2中单个微生物灵敏度检测的分析过程一致。具体实验方案如下表:
表2不同混合菌种的检测灵敏度测试(菌种后的括号内为该菌的代号)
菌种 | 样品 | 方案 |
大肠埃希氏菌(D),金黄色葡萄球菌(J) | DJ-0 | D和J按照100比0CFU混合 |
大肠埃希氏菌(D),金黄色葡萄球菌(J) | DJ-0.1 | D和J按照999比1CFU混合 |
大肠埃希氏菌(D),金黄色葡萄球菌(J) | DJ-0.5 | D和J按照995比5CFU混合 |
大肠埃希氏菌(D),金黄色葡萄球菌(J) | DJ-1 | D和J按照99比1CFU混合 |
大肠埃希氏菌(D),金黄色葡萄球菌(J) | DJ-2 | D和J按照98比2CFU混合 |
由图9和图10可知,在大肠埃希氏菌中混入不同比例(依次为:0%、0.1%、0.5%、1%、2%)的金黄色葡萄球菌,除了0%的未混入金黄色葡萄球菌的样品外,其它样品最终通过NGS的方法均能检测到小于10CFU的金黄色葡萄球菌。大肠埃希氏菌(D)和金黄色葡萄球菌(J)在不同的浓度下均能检测到基因组的覆盖。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外,在不相互矛盾的情况下,本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种确定待测产品是否被微生物污染的方法,其特征在于,包括:
(1)从待测产品分离测试样品,并获取核酸样本;
(2)对所述核酸样本进行扩增,获得扩增产物;
(3)基于所述扩增产物,构建测序文库;
(4)对所述测序文库进行测序,以获得测序结果,所述测序结果由多个测序读段构成;
(5)利用已知的背景生物基因组信息,对所述测序结果进行过滤处理,以获得经过过滤处理的测序结果;和
(6)利用已知微生物的基因组信息,基于所述经过过滤处理的测序结果,确定所述待测产品是否被所述已知微生物污染。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述待测产品包括生物样本、药品、医药原料、医药辅料、医疗器械、食品、化妆品和保健品;
任选地,所述药品包括细胞药物、抗体药物、化学药品。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述待测产品中含有已知的生物体或者所述生物体的一部分,所述已知生物体的基因组信息构成所述背景生物基因组信息的至少一部分;
任选地,所述背景生物基因组信息为人参考基因组信息;或者,所述产品含有益生菌,所述背景基因组信息为所述益生菌的基因组信息。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述待测产品为水溶液,直接作为测试样品;
或者,所述待测产品为水溶性固体,制备所述待测产品的水溶液作为测试样品;
或者,所述待测产品为非水溶性固体,利用乳化剂使所述非水溶性固体乳化,获得测试样品。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述过滤处理包括:
(i)将所述测序结果与所述背景生物基因组信息进行比对,以获得能够与所述背景生物基因组信息比对上的匹配测序读段;和
(ii)从所述测序结果中去除所述匹配测序读段,以获得经过过滤处理的所述测序结果。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述过滤处理进一步包括:
(ⅲ)将所述匹配测序读段与已知内源生物基因组信息进行比对,以获得比对上的内源生物测序读段;和
(ⅳ)将所述内源生物测序读段补入经过过滤处理的所述测序结果中,以获得经过过滤处理的所述测序结果;
任选地,所述已知内源生物基因组为与所述背景生物基因组发生基因重组。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,在步骤(6)中,进一步包括:
(6-1)确定与所述已知微生物基因组信息比对上的测序读段数目;
(6-2)基于步骤(6-1)获得的所述测序读段数目,确定所述已知微生物的污染指数,所述污染指数与所述步骤(6-1)获得的所述测序读段数目呈正相关;
(6-3)基于所述污染指数与预定阈值的差异,确定所述产品是否被所述已知微生物污染。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述污染指数是通过以下公式确定的,
RPM=a*1000000/b,
其中,RPM表示所述污染指数,a为在步骤(6-1)获得的所述测序读段数目,b是步骤(5)中获得的经过过滤处理的测序结果中测序读段的总数目。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述预定阈值不低于10。
10.权利要求1~9中任一项所述的方法在进行无菌检查的制品中鉴定微生物种类的用途。
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