CN113917136A - 抗双链脱氧核糖核酸抗体免疫球蛋白g的检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种抗双链脱氧核糖核酸抗体免疫球蛋白G的检测方法,一:将含有抗双链脱氧核糖核酸抗体病人样本血清加入双链脱氧核糖核酸抗原片双链脱氧核糖核酸反应区上,与抗原片双链脱氧核糖核酸反应区上短膜虫上双链脱氧核糖核酸反应,抗双链脱氧核糖核酸抗体与双链脱氧核糖核酸结合,没结合物质洗涤去除;二,在抗原片反应区加入异硫氰酸荧光素标记的羊抗人免疫球蛋白G溶液反应,产生免疫复合物,洗涤去除未反应物质;三,在反应后抗原片反应区加封片剂,盖盖玻片,荧光观察到短膜虫细胞核与动基体有均质或环状的双链脱氧核糖核酸抗体荧光物;敏感度高、特异性强、准确性好、成本低、操作简便及适用性广,用于临床病程、治疗效果监测及判断预后。
Description
技术领域
本发明涉及生物体外诊断检测技术,尤其涉及一种抗双链脱氧核糖核酸抗体免疫球蛋白G的检测方法。
背景技术
本发明抗双链脱氧核糖核酸(DNA)抗体免疫球蛋白G(IgG)的检测方法用于体外定性检测人血清中的抗双链DNA抗体,辅助诊断***性红斑狼疮。
***性红斑狼疮是一种累及多***、多器官的自身免疫性疾病。其中,狼疮肾炎是***性红斑狼疮的主要并发症,在***性红斑狼疮患者中有很高的发病率。自身抗体在狼疮肾炎的发展过程中起着重要作用,可形成循环免疫复合物沉积于肾脏,与肾脏固有抗原结合,激活自身免疫反应,导致狼疮肾炎发生。
抗双链DNA抗体是***性红斑狼疮的特异性抗体,也是***性红斑狼疮诊断的重要依据,还是疾病活动性特别是肾脏损伤的标志。
抗dsDNA抗体与***性红斑狼疮的关系密切,且随疾病的活动度而升降,病情好转者其滴度多下降甚或转阴。目前认为能结合补体的抗双链DNA抗体,在***性红斑狼疮,特别是并发肾炎(狼疮性肾炎)者的发病机制中起重要作用。***性红斑狼疮并发的肾炎是由抗双链DNA介导的一种免疫复合物病。由于抗双链DNA抗***性红斑狼疮有较高的敏感性,目前,本领域诊断***性红斑狼疮的标准中,都已将抗双链DNA作为诊断指标。除用于***性红斑狼疮的诊断外,也可用于临床病程和治疗效果的监测,对判断预后也有一定价值。以短膜虫虫体为包被基质,其上只含有一个单纯的、完整的dsDNA分子,不含有任何其他物质,特异性好。因此,有待进一步完善抗双链脱氧核糖核酸(DNA)抗体免疫球蛋白G(IgG)的检测方法。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种抗双链脱氧核糖核酸抗体免疫球蛋白G的检测方法,其适用于双链脱氧核糖核酸(DNA)抗体的检测,可以用于***性红斑狼疮的诊断,也可用于临床病程和治疗效果的监测,对判断预后也有一定价值。
本发明的目的是由以下技术方案实现的。
本发明抗双链脱氧核糖核酸(DNA)抗体免疫球蛋白G(IgG)的检测方法,其包括以下步骤:
第一步:将含有抗双链脱氧核糖核酸(DNA)抗体病人样本血清加入到双链脱氧核糖核酸(DNA)抗原片的双链脱氧核糖核酸(DNA)反应区上,与抗原片双链脱氧核糖核酸(DNA)反应区上短膜虫上的双链脱氧核糖核酸(DNA)进行第一次反应,特异性的抗双链脱氧核糖核酸(DNA)抗体将与双链脱氧核糖核酸(DNA)结合,其余没有结合上的物质通过洗涤液洗涤去除;
第二步,在完成第一步反应的抗原片反应区再加入异硫氰酸荧光素标记的羊抗人免疫球蛋白G(IgG)溶液进行二次反应,产生免疫复合物;该免疫复合物为双链脱氧核糖核酸(DNA)-特异性的抗双链脱氧核糖核酸(DNA)抗体-异硫氰酸荧光素标记的羊抗人免疫球蛋白G(IgG);用洗涤液洗涤去除未进行该次反应的物质;
第三步,在进行第一次和第二次反应后的抗原片反应区加入封片剂,然后盖上盖玻片,在荧光显微镜下观察结果,观察到短膜虫细胞核与动基体有均质或环状的双链脱氧核糖核酸抗体荧光物,完成检测。
前述的抗双链脱氧核糖核酸(DNA)抗体免疫球蛋白G(IgG)的检测方法,其中,所述所述双链脱氧核糖核酸抗原片是在载玻片上粘附短膜虫溶液;
所述异硫氰酸荧光素标记的羊抗人免疫球蛋白G溶液为0.01至0.05mol/L磷酸盐缓冲液中加入体积浓度为0.01至0.05%的异硫氰酸荧光素标记的羊抗人免疫球蛋白G和5至10%牛血清白蛋白构成的混合液体;
所述封片剂为0.01至0.05mol/L磷酸盐缓冲液加入体积浓度为50至80%丙三醇和1至5%的4',6-二脒基-2-苯基吲哚的混合溶液;
所述第一步中使用的洗涤液为在0.01至0.05mol/L磷酸盐缓冲液中加入体积浓度为0.1至0.5%的聚山梨酯混合而成;
所述第二步中使用的洗涤液为在0.01至0.05mol/L磷酸盐溶液中加入体积浓度为0.1至0.5%的聚山梨酯混合而成。
前述的抗双链脱氧核糖核酸抗体免疫球蛋白G的检测方法,其中:所述短膜虫溶液采用短膜虫培养基经过培养,用磷酸盐缓冲液洗涤沉淀后用固定液重悬,该重悬后的短膜虫溶液涂抹在载玻片上;
所述载玻片采用分子量50000的体积浓度为0.1至0.5%的多聚左旋赖氨酸溶液浸泡,浸泡完后在40℃烤干备用。
前述的抗双链脱氧核糖核酸抗体免疫球蛋白G的检测方法,其中:所述短膜虫溶液采用的短膜虫培养基为按照体积浓度取用1±0.2%胰蛋白胨、0.1±0.5%酵母提取物、0.01±0.05%肝提取物、1至2%蔗糖、1±0.5%三乙醇胺、10±5%血晶素、1±0.5%胎牛血清、余量为去离子水的混合液体;
重悬固定液为含有体积浓度为20至60%甲醛的磷酸盐缓冲液,该磷酸盐缓冲液的浓度为0.01mol/L,pH值为7.4。
本发明抗双链脱氧核糖核酸(DNA)抗体免疫球蛋白G(IgG)的检测方法的有益效果,其适用于双链脱氧核糖核酸(DNA)抗体的检测,可以用于***性红斑狼疮的诊断,也可用于临床病程和治疗效果的监测,对判断预后也有一定价值。其短膜虫虫体为包被基质,其上只含有一个单纯的、完整的dsDNA分子,不含有任何其他物质,特异性好,可用于***性红斑狼疮的诊断,也可用于临床病程和治疗效果的监测,对判断预后也有一定价值。具有敏感度高、特异性强、准确性好、成本低、操作简便以及适用性广的优点。
具体实施方式
对本发明抗双链脱氧核糖核酸(DNA)抗体免疫球蛋白G(IgG)的检测方法的特征及所达成的功效有更进一步的了解与认识,用以较佳的实施例详细的说明如下。
本发明抗双链脱氧核糖核酸(DNA)抗体免疫球蛋白G(IgG)的检测方法,其包括以下步骤:
第一步:将含有抗双链脱氧核糖核酸(DNA)抗体病人样本血清加入到双链脱氧核糖核酸(DNA)抗原片的双链脱氧核糖核酸(DNA)反应区上,与抗原片双链脱氧核糖核酸(DNA)反应区上短膜虫上的双链脱氧核糖核酸(DNA)进行第一次反应,特异性的抗双链脱氧核糖核酸(DNA)抗体将与双链脱氧核糖核酸(DNA)结合,其余没有结合上的物质通过洗涤液洗涤去除;
第二步,在完成第一步反应的抗原片反应区再加入异硫氰酸荧光素标记的羊抗人免疫球蛋白G(IgG)溶液进行二次反应,产生免疫复合物;该免疫复合物为双链脱氧核糖核酸(DNA)-特异性的抗双链脱氧核糖核酸(DNA)抗体-异硫氰酸荧光素标记的羊抗人免疫球蛋白G(IgG);用洗涤液洗涤去除未进行该次反应的物质;
第三步,在进行第一次和第二次反应后的抗原片反应区加入封片剂,然后盖上盖玻片,在荧光显微镜下观察结果,观察到短膜虫细胞核与动基体有均质或环状的双链脱氧核糖核酸抗体荧光物,完成检测。
本发明抗双链脱氧核糖核酸(DNA)抗体免疫球蛋白G(IgG)的检测方法,其中:
所述双链脱氧核糖核酸抗原片是在载玻片上粘附短膜虫溶液;所述异硫氰酸荧光素标记的羊抗人免疫球蛋白G溶液为0.01至0.05mol/L磷酸盐缓冲液中加入体积浓度为0.01至0.05%的异硫氰酸荧光素标记的羊抗人免疫球蛋白G和5至10%牛血清白蛋白构成的混合液体;所述封片剂为0.01至0.05mol/L磷酸盐缓冲液加入体积浓度为50至80%丙三醇和1至5%的4',6-二脒基-2-苯基吲哚的混合溶液;所述第一步中使用的洗涤液为在0.01至0.05mol/L磷酸盐缓冲液中加入体积浓度为0.1至0.5%的聚山梨酯混合而成;所述第二步中使用的洗涤液为在0.01至0.05mol/L磷酸盐溶液中加入体积浓度为0.1至0.5%的聚山梨酯混合而成。
所述短膜虫溶液采用短膜虫培养基经过培养,用磷酸盐缓冲液洗涤沉淀后用固定液重悬,该重悬后的短膜虫溶液涂抹在载玻片上;所述载玻片采用分子量50000的体积浓度为0.1至0.5%的多聚左旋赖氨酸溶液浸泡,浸泡完后在40℃烤干备用。
所述短膜虫溶液采用的短膜虫培养基为按照体积浓度取用1±0.2%胰蛋白胨、0.1±0.5%酵母提取物、0.01±0.05%肝提取物、1至2%蔗糖、1±0.5%三乙醇胺、10±5%血晶素、1±0.5%胎牛血清、余量为去离子水的混合液体;重悬固定液为含有体积浓度为20至60%甲醛的磷酸盐缓冲液,该磷酸盐缓冲液的浓度为0.01mol/L,pH值为7.4。
实施例一:
1、制备双链脱氧核糖核酸(DNA)抗原片:
双链脱氧核糖核酸(DNA)抗原片中的短膜虫采用短膜虫培养基(由0.8%胰蛋白胨,0.1%酵母提取物、0.02%肝提取物、1.5%蔗糖、0.5%三乙醇胺、5%血晶素、0.5%胎牛血清以及余量的去离子水混合)经过2天培养,将培养后的短膜虫离心去除上清液,然后用0.01mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液洗涤5次,沉淀后去除上清液,将短膜虫沉淀用固定液(含有体积浓度为40%甲醛的0.01mol/L pH7.4的磷酸盐液体)重悬,所述重悬后的短膜虫溶液涂抹在载玻片上,干燥密封保存。
2、制备异硫氰酸荧光素标记的羊抗人IgG:
在0.05mol/L的磷酸盐缓冲液中加入体积浓度为0.02%的异硫氰酸荧光素标记的羊抗人免疫球蛋白G(IgG)和10%牛血清白蛋白。
3、制备封片剂:在0.05mol/L磷酸盐缓冲液中加入体积浓度为70%的丙三醇和5%的4',6-二脒基-2-苯基吲哚混合而成。
4、洗涤液制备:在0.02mol/L磷酸盐溶液中加入体积浓度为0.1%聚山梨酯混合而成。
实施例二:
用本发明抗双链脱氧核糖核酸(DNA)抗体免疫球蛋白G(IgG)的检测方法检测***性红斑狼疮患者样本。
1、样本血清:***性红斑狼疮患者血清96例,***性红斑狼疮诊断标准符合美国风湿病学会***性红斑狼疮分类标准,健康体检者血清100例。
第一步:将含有抗双链脱氧核糖核酸(DNA)抗体病人样本血清加入到双链脱氧核糖核酸(DNA)抗原片的双链脱氧核糖核酸(DNA)反应区上,与抗原片双链脱氧核糖核酸(DNA)反应区上短膜虫上的双链脱氧核糖核酸(DNA)进行第一次反应,特异性的抗双链脱氧核糖核酸(DNA)抗体将与双链脱氧核糖核酸(DNA)结合,其余没有结合上的物质通过洗涤液洗涤去除;
第二步,在完成第一步反应的抗原片反应区再加入异硫氰酸荧光素标记的羊抗人免疫球蛋白G(IgG)溶液进行二次反应,产生免疫复合物;该免疫复合物为双链脱氧核糖核酸(DNA)-特异性的抗双链脱氧核糖核酸(DNA)抗体-异硫氰酸荧光素标记的羊抗人免疫球蛋白G(IgG);用洗涤液洗涤去除未进行该次反应的物质;
2、第三步,在进行第一次和第二次反应后的抗原片反应区加入封片剂,然后盖上盖玻片,在荧光显微镜下观察结果,观察到短膜虫细胞核与动基体有均质或环状的双链脱氧核糖核酸抗体荧光物,完成检测。
3、检测结果:实验表明本发明抗双链脱氧核糖核酸(DNA)抗体免疫球蛋白G(IgG)的检测方法的特异性为97%,敏感性为89.6%。通过本发明抗双链脱氧核糖核酸(DNA)抗体免疫球蛋白G(IgG)的检测方法检测双链脱氧核糖核酸抗体,有利于诊断和治疗***性红斑狼疮。
本实施例中未将进行说明的内容为现有技术,故,不再进行赘述。
本发明抗双链脱氧核糖核酸(DNA)抗体免疫球蛋白G(IgG)的检测方法的优点:以短膜虫虫体为包被基质,因为它有一个大的含有纯净环状dsDNA线粒体(动基体),它的抗原浓度比起其它***性红斑狼疮检测基质人喉表皮样癌细胞和肝细胞核抗原浓度高10倍,更重要的是它不含有任何其他各类抗原,因此具有极高的特异性。短膜虫结构简单、阴阳性差别显著,荧光结果一目了然,结果容易观察。临床上与其它***性红斑狼疮诊断方法结合在一起,可以提高***性红斑狼疮的检出率降低假阳性。
以上所述,仅是本发明的较佳实施例而已,并非对本发明作任何形式上的限制,凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (4)
1.一种抗双链脱氧核糖核酸抗体免疫球蛋白G的检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
第一步:将含有抗双链脱氧核糖核酸抗体病人样本血清加入到双链脱氧核糖核酸抗原片的双链脱氧核糖核酸反应区上,与抗原片双链脱氧核糖核酸反应区上短膜虫上的双链脱氧核糖核酸进行第一次反应,特异性的抗双链脱氧核糖核酸抗体将与双链脱氧核糖核酸结合,其余没有结合上的物质通过洗涤液洗涤去除;
第二步,在完成第一步反应的抗原片反应区再加入异硫氰酸荧光素标记的羊抗人免疫球蛋白G溶液进行二次反应,产生免疫复合物;该免疫复合物为双链脱氧核糖核酸-特异性的抗双链脱氧核糖核酸抗体-异硫氰酸荧光素标记的羊抗人免疫球蛋白G;用洗涤液洗涤去除未进行该次反应的物质;
第三步,在进行第一次和第二次反应后的抗原片反应区加入封片剂,然后盖上盖玻片,在荧光显微镜下观察结果,观察到短膜虫细胞核与动基体有均质或环状的双链脱氧核糖核酸抗体荧光物,完成检测。
2.根据权利要求1所述的抗双链脱氧核糖核酸抗体免疫球蛋白G的检测方法,其特征在于,所述双链脱氧核糖核酸抗原片是在载玻片上粘附短膜虫溶液;
所述异硫氰酸荧光素标记的羊抗人免疫球蛋白G溶液为0.01至0.05mol/L磷酸盐缓冲液中加入体积浓度为0.01至0.05%的异硫氰酸荧光素标记的羊抗人免疫球蛋白G和5至10%牛血清白蛋白构成的混合液体;
所述封片剂为0.01至0.05mol/L磷酸盐缓冲液加入体积浓度为50至80%丙三醇和1至5%的4',6-二脒基-2-苯基吲哚的混合溶液;
所述第一步中使用的洗涤液为在0.01至0.05mol/L磷酸盐缓冲液中加入体积浓度为0.1至0.5%的聚山梨酯混合而成;
所述第二步中使用的洗涤液为在0.01至0.05mol/L磷酸盐溶液中加入体积浓度为0.1至0.5%的聚山梨酯混合而成。
3.根据权利要求2所述的抗双链脱氧核糖核酸抗体免疫球蛋白G的检测方法,其特征在于:所述短膜虫溶液采用短膜虫培养基经过培养,用磷酸盐缓冲液洗涤沉淀后用固定液重悬,该重悬后的短膜虫溶液涂抹在载玻片上;
所述载玻片采用分子量50000的体积浓度为0.1至0.5%的多聚左旋赖氨酸溶液浸泡,浸泡完后在40℃烤干备用。
4.根据权利要求3所述的抗双链脱氧核糖核酸抗体免疫球蛋白G的检测方法,其特征在于:所述短膜虫溶液采用的短膜虫培养基为按照体积浓度取用1±0.2%胰蛋白胨、0.1±0.5%酵母提取物、0.01±0.05%肝提取物、1至2%蔗糖、1±0.5%三乙醇胺、10±5%血晶素、1±0.5%胎牛血清、余量为去离子水的混合液体;
重悬固定液为含有体积浓度为20至60%甲醛的磷酸盐缓冲液,该磷酸盐缓冲液的浓度为0.01mol/L,pH值为7.4。
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---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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WW01 | Invention patent application withdrawn after publication | ||
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Application publication date: 20220111 |