CN113917031A - Uhplc-ms/ms法测定补肺活血胶囊在体内血药浓度的方法 - Google Patents

Uhplc-ms/ms法测定补肺活血胶囊在体内血药浓度的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种UHPLC‑MS/MS法测定补肺活血胶囊在体内血药浓度的方法，包括对照溶液的制备：取补骨脂苷、异补骨脂苷、毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、补骨脂素、异补骨脂素、3‑羟基‑9，10‑二甲氧基紫檀烷、新补骨脂异黄酮分别溶解并定容；定容后混合并逐级稀释成系列浓度的混合对照溶液；测试样品的制备：取测试者血液制成血浆样品并加入内标溶液为测试样品；UHPLC‑MS/MS测定：利用超高效液相色谱和二级质谱对混合对照溶液和测试样品进行定性、定量测定。本发明筛选了补肺活血胶囊中45种活性物质的血药浓度，并筛选出其中8种可能与补肺活血胶囊临床治疗作用的发挥密切相关的成分。所采用的UHPLC‑MS/MS法能够快速、专属性强、重复性好的检测补肺活血胶囊的血药浓度，适应于补肺活血胶囊的药物动力学研究和临床试验。

Description

UHPLC-MS/MS法测定补肺活血胶囊在体内血药浓度的方法
技术领域
本发明属于分子技术领域，具体涉及一种UHPLC-MS/MS法测定补肺活血胶囊在体内血药浓度的方法。
背景技术
补肺活血胶囊由黄芪、赤芍及补骨脂三味中药组成，具有益气活血、补肺固肾的功效，用于肺心病(缓解期)属气虚血瘀证，近年来也常用于慢性阻塞性肺炎(COPD)，以及新型冠状病毒肺炎(COVID-19)恢复期的治疗，并已列入多个省市的COVID-19恢复期治疗用药推荐目录。现代药理研究表明，补肺活血胶囊能够调节机体IL-6、IL-1β、IL-10等炎性因子水平，减少胶原纤维在肺组织中沉积，改善肺通气功能，缓解由慢性呼吸疾病所引起的咳嗽气促，心悸气短等症状。
CN107505418A公开了一种补肺活血胶囊HPLC指纹图谱的构建方法及标准指纹图谱，此发明针对补肺活血胶囊中的毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芍药苷、异补骨脂素、补骨脂素的含量进行测定并提供指纹图谱；为补肺活血胶囊的标准化研究提供了科学依据。但本发明只测量了其中5种成分的含量。
CN107456479A公开了一种补骨脂配方颗粒的制备及检测方法，此发明能够提供补骨脂配方颗粒产品的检测方法，建立补骨脂配方颗粒特征图谱，测定补骨脂配方颗粒指标成分的含量及转移率；但本发明也只测量了补骨脂苷、异补骨脂苷、补骨脂素、异补骨脂素4种成分的含量。
上述两个发明都只针对补肺活血胶囊中的部分成分含量进行测量并建立指纹图谱，并没有对成分进行全面的测量。现代医学认为，药物分子必先入血，才能到达作用靶点，从而发挥药效。因此，研究入血成分及其在体内的代谢规律对于揭示中药复方的药效物质基础具有重要意义。已有研究显示，中药以复方形式用于临床因各药味间多成分相互作用，其药代动力学规律也将随之改变。目前不乏关于黄芪、补骨脂及赤芍单味药的入血成分及其药代动力学研究，但少见有关补肺活血胶囊主要化学组分体内过程研究。
发明内容
鉴于目前现有技术对补肺活血胶囊的成分在血浆中的药物动力学特征研究的不足，本发明提出了一种UHPLC-MS/MS法测定补肺活血胶囊在体内血药浓度的方法。
本发明提供了一种UHPLC-MS/MS法测定补肺活血胶囊在体内血药浓度的方法，包括以下步骤：
对照溶液的制备：取补骨脂苷、异补骨脂苷、毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、补骨脂素、异补骨脂素、3-羟基-9，10-二甲氧基紫檀烷、新补骨脂异黄酮分别溶解并定容；定容后混合并逐级稀释成系列浓度的混合对照溶液；
测试样品的制备：取测试者血液制成血浆样品并加入内标溶液为测试样品；
UHPLC-MS/MS测定：利用超高效液相色谱和二级质谱对混合对照溶液和测试样品进行定性、定量测定。
具体地，超高效液相色谱的色谱条件为：
色谱柱为ACQUITYUPLCBEHC18柱；
流动A相为0.1％甲酸水，流动B相为0.1％乙腈；
梯度洗脱程序：
0-2min，95-88％A；
2-4min，88-85％A；
4-8min，85-65％A；
8-9min，65-60％A；
9-12min，60-40％A；
12-13min，40-15％A；
13-14min，15-95％A；
14-15min，95％A；
柱温35℃，流速0.4mL·min-1，进样量4μL。
具体地，二级质谱的质谱条件为：
离子化模式：ESI+/ESI-；
检测方式：多反应检测；
电喷雾电压：4500V；
雾化气压力：413.7kPa；
气帘气压力：137.9kPa；
辅助气流速：413.7kPa；
离子源温度：400℃；
碰撞气：Low。
此质谱条件是基于本发明针对的监测物质优化而定，采用其他参数无法正常完成本发明。
优选地，对照溶液的溶剂为甲醇。
优选地，取测试者血液制成血浆样品的步骤为：采集测试者血液并置于预先涂有肝素钠溶液的试管中离心，离心后取上清液。
进一步优选地，所述内标溶液为克拉霉素和氯霉素的混合甲醇溶液。
进一步优选地，加入内标溶液的同时加入乙腈。
进一步优选地，血浆样品加入内标溶液和乙腈，离心，移取上清液浓缩至干，加入甲醇复溶，离心，取上清液即为测试样品。
优选地，超高效液相色谱的仪器为Waters ACQUITY UPLC***。
优选地，二级质谱的仪器为QTRAP 6500三重四极杆线性离子阱质谱仪***。
在样品前处理过程中，本实验比较了甲醇、乙腈和乙酸乙酯：正己烷(8:1)3种前处理方法。
具体处理方法为：取三份相同的含药血浆样品，分别用甲醇、乙腈及乙酸乙酯：正己烷(8:1)处理后，采用经验证的液质方法进样分析。以补骨脂苷为判断依据，测得峰面积分别为656697、685118、541805。因此实验最终选择乙腈作为沉蛋白溶剂。
结果显示，3种溶剂下成分溶出量无显著差异，依据以上峰面积比较，得知相同条件下乙腈处理后测得成分峰面积较大。但乙腈沉淀蛋白较为完全，样品回收提取率较高，峰形良好。实验初期采用水(A)-乙腈(B)为流动相时，发现目标成分峰形拖尾严重，如图18、图19所示，在水相中加入0.1％的甲酸后，峰形得以改善，因此实验最终选择采用乙腈作为蛋白沉淀剂，0.1％甲酸水(A)-乙腈(B)作为流动相。
本发明的有益效果：
1.本发明是针对补肺活血胶囊中45种活性物质，通过实验筛选出其中8种与补肺活血胶囊临床治疗作用的发挥密切相关的成分；剔除并没有实际发挥功效的活性成分，为UHPLC-MS/MS法测定补肺活血胶囊打下基础；目前尚没有以此种方式进行筛选的先例。
2.本发明针对补肺活血胶囊中筛选出的8种活性成分，为了超高效液相色谱串联质谱法能够一次性的针对这8种活性成分进行快速准确检测，对其中的流动相的选择、对照样品的选择、质谱监测方式等多种条件进行重新选择，这些条件无法从别的检测目标中直接的挪用。
3.在本发明选择的条件和筛选出的对照样品组下进行UHPLC-MS/MS能够快速、专属性强、重复性好的检测补肺活血胶囊的血药浓度，适应于补肺活血胶囊的药物动力学研究和临床试验。
附图说明
图1-图8分别依次为补骨脂苷、异补骨脂苷、毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、补骨脂素、异补骨脂素、3-羟基-9，10-二甲基紫檀烷、新补骨脂异黄酮的化学结构。
图9为大鼠血浆中8种主要成分及内标的MRM图。
图10-图17分别依次为补骨脂苷、异补骨脂苷、毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、补骨脂素、异补骨脂素、3-羟基-9，10-二甲基紫檀烷、新补骨脂异黄酮的血药浓度-时间曲线(
Figure BDA0003300510780000041
n＝8)。
图18为以纯水-乙腈为流动相的液质图。
图19为以0.1％甲酸水-乙腈为流动相的液质图。
图9中：A.空白血浆；B.空白血浆+混合对照品+内标溶液；C.补肺活血胶囊含药血浆；1.补骨脂苷；2.异补骨脂苷；3.毛蕊异黄酮苷；4.芒柄花苷；5.补骨脂素；6.异补骨脂素；7.3-羟基-9，10-二甲氧基紫檀烷；8.新补骨脂异黄酮；IS1.氯霉素；IS2.克拉霉素。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
仪器：
Waters ACQUITY UPLC***(包括四元泵溶剂，在线脱气机和自动进样器；Waters公司，Milford，USA)。
QTRAP 6500三重四极杆线性离子阱质谱仪***(美国AB SCIEX)，配有电喷雾离子源及Analyst 1.6.3软件。
MS105、ML204电子分析天平(METTLER-TOLEDO公司)。
Anke GL-16GⅡ型离心机(上海安亭科学仪器厂)；WH-微型涡旋混合仪(上海沪西分析仪器厂有限公司)。
Millipore Q纯水***(美国Millipore公司)。
药品与试剂：
补骨脂苷(批号：Y07A7S12664)、异补骨脂苷(批号：Y27A9S60238)、毛蕊异黄酮苷(批号：Y27F9H54731)、芒柄花苷(批号：R28O8F46957)、补骨脂素(批号：C22A9Q68562)、异补骨脂素(批号：C05M10Q82078)、3-羟基-9，10-二甲氧基紫檀烷(批号：Y28M10H84302)、新补骨脂异黄酮(批号：ZN1112BD13)、克拉霉素(批号：Y31M7C12157)均购自上海源叶生物科技有限公司；
氯霉素(批号：A1608010)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
以上对照品纯度均≥98％。
羧甲基纤维素钠(批号：20181019)购于国药集团化学试剂有限公司；
补肺活血胶囊(批号：022004)由广东雷允上药业有限公司提供；
甲醇、乙腈为色谱纯(Merck公司，德国)；
甲酸为色谱纯(ACS，美国)；
超纯水为实验室自制。
实施例1动物实验前期准备
实验动物：雄性Wistar大鼠，SPF级，体重250～280g，由南京中医药大学实验动物中心提供，合格证号SCXK(浙)2019-0001。饲养温度为20-25℃，环境湿度为(45±10)％。
色谱条件：色谱柱为ACQUITYUPLCBEHC18柱(100mm×2.1mm，1.7μm)；流动相为0.1％甲酸水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱程序：0-2min，95-88％A；2-4min，88-85％A；4-8min，85-65％A；8-9min，65-60％A；9-12min，60-40％A；12-13min，40-15％A；13-14min，15-95％A；14-15min，95％A。柱温35℃，流速0.4mL·min-1，进样量4μL。
质谱条件：离子化模式：ESI+/ESI-；检测方式：多反应检测(MRM)；电喷雾电压：4500V；雾化气压力：413.7kPa；气帘气压力：137.9kPa；辅助气流速：413.7kPa；离子源温度：400℃；碰撞气：Low；8种被测物质和2种内标物质的MRM参数见表1。
表1大鼠血浆中8种被测物质和2种内标物质质谱参数
Figure BDA0003300510780000061
对照品溶液的制备：
1.混合对照品溶液的制备称取补骨脂苷、异补骨脂苷、毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、补骨脂素、异补骨脂素、3-羟基-9，10-二甲氧基紫檀烷、新补骨脂异黄酮对照品适量，加甲醇溶解，定容，配制成一定浓度的对照品储备液。分别精密量取对照品储备液适量，混合制成含补骨脂苷(3250ng·mL-1)、异补骨脂苷(2792ng·mL-1)、毛蕊异黄酮苷(27.73ng·mL-1)、芒柄花苷(34.93ng·mL-1)、补骨脂素(2295ng·mL-1)、异补骨脂素(3767ng·mL-1)、3-羟基-9，10-二甲氧基紫檀烷(32.13ng·mL-1)、新补骨脂异黄酮(15.83ng·mL-1)的混合对照品储备溶液，用甲醇逐级稀释成系列浓度的混合对照品溶液。置于4℃冰箱中保存备用。
具体的系列浓度为：
补骨脂苷(3250、1625、812.5、406.2、203.1、101.6、50.78、25.39、12.70、6.348、3.174、1.587、0.7934ng·mL-1)；
异补骨脂苷(2792、1396、697.9、349.0、174.5、87.24、43.62、21.81、10.90、5.452、2.726、1.363、0.6816ng·mL-1)；
毛蕊异黄酮苷(27.73、13.87、6.933、3.467、1.733、0.8667、0.4333、0.2167、0.1083、0.05417、0.0271、0.01354、0.006836ng·mL-1)；
芒柄花苷(34.93、17.46、8.732、4.367、2.183、1.092、0.5458、0.2729、0.1364、0.06823、0.03411、0.01706、0.008529ng·mL-1)；
补骨脂素(2295、1148、573.8、286.9、143.4、71.72、35.86、17.93、8.965、4.482、2.241、1.121、0.5603ng·mL-1)；
异补骨脂素(3766、1883、941.7、470.8、235.4、117.7、58.85、29.43、14.71、7.357、3.678、1.839、0.9196ng·mL-1)；
3-羟基-9，10-二甲氧基紫檀烷(32.13、16.07、8.033、4.017、2.008、1.004、0.5021、0.2510、0.1255、0.06276、0.03138、0.01569、0.007845ng·mL-1)；
新补骨脂异黄酮(15.83、7.915、3.9575、1.97875、0.9894、0.4947、0.2473、0.1237、0.06184、0.0309、0.01546、0.007729、0.003865ng·mL-1)。
在本发明中，任意浓度的单标溶液均可实现混标溶液的配制。
2.内标溶液的制备称取克拉霉素和氯霉素对照品适量，置于10mL容量瓶中，甲醇溶解并定容，配制成一定浓度的内标溶液储备液。吸取内标溶液储备液适量，甲醇稀释制得浓度分别为197.6ng·mL-1和58.80ng·mL-1的混合内标溶液。置于4℃冰箱中保存备用。
3.给药及血浆样品的采集
雄性SD大鼠16只，适应性喂养一周后，随机分为空白组与给药组。禁食(自由饮水)12h后，给药组按临床等效剂量(0.38g/kg)灌胃补肺活血胶囊混悬液(称取补肺活血胶囊药粉，加入0.5％羧甲基纤维素钠溶液制成浓度为0.038g/mL的混悬液)，空白组灌服等体积的生理盐水。分别于给药后5min、10min、15min、30min、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、10h、12h、24h经眼眶静脉丛采血400μL，血浆样品置于预先涂有10μL0.1％肝素钠溶液的EP管中，4000r·min-1条件下离心10min，取上清液即为血浆样品，置-80℃冰箱保存备用。
4.血浆样品处理
大鼠血浆样品于4℃冰箱中解冻后，涡旋2min，精密吸取200μL，加入混合内标溶液10μL、乙腈590μL，涡旋混匀2min，静置5min，离心10min(4℃，13500r·min-1)，移取上清液于37℃离心浓缩至干，加入50％甲醇50μL复溶，离心10min(4℃，13500r·min-1)，取上清液即为血浆样品供试液。
实施例2动物实验前期准备
1.专属性：分别取大鼠空白血浆、空白血浆加对照品和内标、给药后的大鼠血浆样品加内标，按“血浆样品处理”方法处理，并前述条件进行UHPLC-MS/MS分析，得到空白血浆、空白血浆+对照品、给药后血浆样品色谱图，结果见图9。结果显示各待测成分与内标未受到血浆中杂质及内源性物质的干扰，且待测成分与内标可实现完全分离，表明所建立的方法专属性良好。
2.标准曲线和线性范围：精密量取200μL大鼠空白血浆，加入50μL系列浓度的对照品溶液、10μL内标溶液和540μL乙腈后，按“血浆样品处理”方法处理并配制成系列浓度的血浆样品，并按前述条件进行UHPLC-MS/MS分析。以各成分质量浓度(ng·mL-1)为横坐标(X)，相应样品峰面积与内标峰面积比值为纵坐标(Y)，采用加权最小二乘法进行回归运算，权重为1/X2，绘制标准曲线。结果表明，各化合物在相应范围内线性关系良好(R2＞0.99)，符合生物样本分析方法的要求。各待测成分的标准曲线方程、相关系数和线性范围见表2。
表2待测成分的线性方程、定量限和线性范围
Figure BDA0003300510780000081
3.精密度和准确度：取大鼠空白血浆200μL，加入低、中、高3个质量浓度的对照品溶液，得到含补骨脂苷、异补骨脂苷、毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、补骨脂素、异补骨脂素、3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷、新补骨脂异黄酮低、中、高3个质量浓度的质控样品(QC)。按“血浆样品处理”方法处理血浆样品，并按前述条件进行UHPLC-MS/MS分析。于同日内连续进样6次，计算日内精密度；连续测定3d，计算日间精密度。准确度以相对误差(RE)表示，精密度以RSD表示。结果表明(表3)，血浆中8种待测成分日内、日间准确度在88.63％～111.3％、精密度RSD均低于12％，表明本方法满足生物样品测定的要求。
表3大鼠血浆中8种成分的精密度与准确度分析(n＝6)
Figure BDA0003300510780000091
4.提取回收率和基质效应：取上述低、中、高3个质量浓度的QC样品，每个质量浓度平行配制6份，按“血浆样品处理”方法处理血浆样品，并按前述条件进行UHPLC-MS/MS分析，记录成分峰面积与内标峰面积比值(A)；另取大鼠空白血浆，以相同方法方法处理后加入QC样品，进样分析，记录成分峰面积与内标峰面积比值(B)，提取回收率(％)＝A/B×100％；另取甲醇水溶液代替空白血浆，其余操作如上，得到成分峰面积与内标峰面积比值(C)，基质效应(％)＝A/C×100％。结果表明，血浆中补骨脂苷、异补骨脂苷、毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、补骨脂素、异补骨脂素、3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷、新补骨脂异黄酮的提取回收率在85.65％-106.65％，基质效应在88.17％-103.70％，表明大鼠血浆中的内源性物质对待测成分的检测影响较小，且血浆中样品的提取回收率符合测定的要求，结果见表4。
表4测定的8种成分的提取回收率与基质效应(n＝6)
Figure BDA0003300510780000092
Figure BDA0003300510780000101
5.稳定性：精密量取空白血浆200μL，配制成低、中、高3个质量浓度的QC样品，每个质量浓度平行配制6份，分别考察室温下放置2h再处理、血浆样品处理后放置于自动进样器中12h、反复冻融循环3次、以及血浆样品-80℃下放置21天的稳定性。结果表明，血浆中补骨脂苷、异补骨脂苷、毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、补骨脂素、异补骨脂素、3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷、新补骨脂异黄酮在上述4种储存条件下的RSD均小于11％，说明血浆样品在上述条件下放置均稳定，结果见表5。
表5测定的8种成分稳定性考察结果(n＝6)
Figure BDA0003300510780000102
Figure BDA0003300510780000111
实施例3药物动力学研究
大鼠单次灌胃补肺活血胶囊后，采用经验证的UHPLC-MS/MS方法测定各时间点的血药浓度，以时间为横坐标(X)，大鼠血药浓度为纵坐标(Y)作图，得8种成分的平均血药浓度-时间曲线图，如图10-图17所示。采用DAS 3.2.8软件进行非房室模型拟合，计算达峰时间(Tmax)、最大血药浓度(Cmax)血药浓度-时间曲线下面积(AUC)、消除半衰期(t1/2z)、平均驻留时间(MRT)等药动学参数，结果如表6所示。结果显示，补肺活血胶囊中8种成分按达峰时间(Tmax)由快到慢排列，依次为：毛蕊异黄酮苷＜芒柄花苷＜新补骨脂异黄酮＜补骨脂素＜异补骨脂素＜3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷＜异补骨脂苷＜补骨脂苷；按消除半衰期(t1/2z)排列，依次为：补骨脂苷＞3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷＞异补骨脂苷＞芒柄花苷＞新补骨脂异黄酮＞毛蕊异黄酮苷＞补骨脂素＞异补骨脂素。本实验研究的8种成分均可在0.21～1.56h达到峰值血药浓度1.02～1509.33μg·L-1，表明各成分吸收均较快；补骨脂苷、异补骨脂苷、补骨脂素及异补骨脂素在大鼠体内药物暴露量远大于其它各成分；另外，补骨脂素、异补骨脂素及3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷的药时曲线存在“双峰”现象。
表6大鼠灌胃补肺活血胶囊后8种成分的药动学参数(
Figure BDA0003300510780000121
n＝8)
Figure BDA0003300510780000122
药理研究显示，补肺活血胶囊可明显降低慢性阻塞性肺疾病及特发性肺纤维化患者机体内炎性因子水平，增强机体免疫力，改善肺通气功能，促进肺功能修复。方中黄芪含有黄酮类、皂苷类、多糖类等化学成分，具有免疫调节、抑制肺肿瘤组织蛋白通路的表达，减轻肺损伤程度。补骨脂中含有的香豆素类、黄酮类、单萜酚类等多种化合物，可降低肌成纤维细胞中活性氧的生成、抑制肺内炎症细胞浸润。赤芍中所含的芍药苷类成分可有效改善毛细血管微循环，促进血液流通，增加冠状动脉血流量，有抗炎、抗菌以及抗氧化等疗效。上述成分可能与补肺活血胶囊治疗肺心病及COPD作用的发挥存在潜在联系。
据此，发明前期基于UHPLC-MS/MS技术，在临床等效剂量的情况下，尝试对大鼠灌胃补肺活血胶囊后含药血浆中上述3味药材中45种成分的血药浓度进行测定，但除补骨脂中主要活性成分补骨脂苷、异补骨脂苷、补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮和黄芪中主要活性成分毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷外，其余各成分在大鼠含药血浆中含量均低于检测限，推测上述8种成分可能与补肺活血胶囊临床治疗作用的发挥密切相关。
具体45种成分分别为：
芍药苷、芍药内酯苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、没食子酰芍药苷、没食子酸、丹皮酚、没食子酸甲酯、9对羟基苯甲酸、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ、黄芪甲苷、异黄芪皂苷Ⅰ、异黄芪皂苷Ⅱ、异黄芪皂苷Ⅳ、毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、芒柄花素、毛蕊异黄酮、环黄芪醇、大豆甾醇B、山奈酚、槲皮素、3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷、7,2'-二羟基-3,4'二甲氧基异黄烷、异鼠李素、齐墩果酸、补骨脂苷、异补骨脂苷、补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂甲素(补骨脂二氢黄酮)、补骨脂宁、补骨脂定、异补骨脂查尔酮、补骨脂二氢黄酮甲醚、Corylifol A、补骨脂酚、8-甲氧基补骨脂素(花椒毒素)、补骨脂查尔酮、(S)-异补骨脂二氢黄酮、4'-O-甲基补骨脂查尔酮B、补骨脂色烯查尔酮。
本发明首次采用UHPLC-MS/MS法建立了测定大鼠灌胃补肺活血胶囊后血浆中8种主要活性组分血药浓度的方法，经方法学考察符合生物样品测定的要求，并对上述8种成分大鼠体内药动学特征进行了研究，为阐释补肺活血胶囊的药效物质基础提供了支撑，也为补肺活血胶囊临床给药方案的设计提供了依据。

Claims (10)

1.一种UHPLC-MS/MS法测定补肺活血胶囊在体内血药浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤：
对照溶液的制备：取补骨脂苷、异补骨脂苷、毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、补骨脂素、异补骨脂素、3-羟基-9，10-二甲氧基紫檀烷、新补骨脂异黄酮分别溶解并定容；定容后混合并逐级稀释成系列浓度的混合对照溶液；
测试样品的制备：取测试者血液制成血浆样品并加入内标溶液为测试样品；
UHPLC-MS/MS测定：利用超高效液相色谱和二级质谱对混合对照溶液和测试样品进行定性、定量测定。
2.根据权利要求1所述的UHPLC-MS/MS法测定补肺活血胶囊在体内血药浓度的方法，其特征在于，超高效液相色谱的色谱条件为：
色谱柱为ACQUITYUPLCBEHC18柱；
流动A相为0.1％甲酸水，流动B相为0.1％乙腈；
梯度洗脱程序：
0-2min，95-88％A；
2-4min，88-85％A；
4-8min，85-65％A；
8-9min，65-60％A；
9-12min，60-40％A；
12-13min，40-15％A；
13-14min，15-95％A；
14-15min，95％A；
柱温35℃，流速0.4mL·min-1，进样量4μL。
3.根据权利要求1所述的UHPLC-MS/MS法测定补肺活血胶囊在体内血药浓度的方法，其特征在于，二级质谱的质谱条件为：
离子化模式：ESI+/ESI-；
检测方式：多反应检测；
电喷雾电压：4500V；
雾化气压力：413.7kPa；
气帘气压力：137.9kPa；
辅助气流速：413.7kPa；
离子源温度：400℃；
碰撞气：Low。
4.根据权利要求1所述的UHPLC-MS/MS法测定补肺活血胶囊在体内血药浓度的方法，其特征在于，对照溶液的溶剂为甲醇。
5.根据权利要求1所述的UHPLC-MS/MS法测定补肺活血胶囊在体内血药浓度的方法，其特征在于，取测试者血液制成血浆样品的步骤为：采集测试者血液并置于预先涂有肝素钠溶液的试管中离心，离心后取上清液。
6.根据权利要求1所述的UHPLC-MS/MS法测定补肺活血胶囊在体内血药浓度的方法，其特征在于，所述内标溶液为克拉霉素和氯霉素的混合甲醇溶液。
7.根据权利要求6所述的UHPLC-MS/MS法测定补肺活血胶囊在体内血药浓度的方法，其特征在于，加入内标溶液的同时加入乙腈。
8.根据权利要求5-7任一所述的UHPLC-MS/MS法测定补肺活血胶囊在体内血药浓度的方法，其特征在于，血浆样品加入内标溶液和乙腈，离心，移取上清液浓缩至干，加入甲醇复溶，离心，取上清液即为测试样品。
9.根据权利要求1所述的UHPLC-MS/MS法测定补肺活血胶囊在体内血药浓度的方法，其特征在于，超高效液相色谱的仪器为Waters ACQUITY UPLC***。
10.根据权利要求1所述的UHPLC-MS/MS法测定补肺活血胶囊在体内血药浓度的方法，其特征在于，二级质谱的仪器为QTRAP 6500三重四极杆线性离子阱质谱仪***。
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Denomination of invention: Method for Determining the Blood Concentration of Bufei Huoxue Capsules in vivo by UHPLC-MS/MS

Effective date of registration: 20230329

Granted publication date: 20220607

Pledgee: Industrial and Commercial Bank of China Limited Yunfu Yun'an Branch

Pledgor: GUANGDONG LEIYUNSHANG PHARMACEUTICAL Co.,Ltd.

Registration number: Y2023980036720