CN113884592A - 一种检测干血斑中卡马西平药物浓度的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测干血斑中卡马西平药物浓度的方法。该方法具体步骤为：取全血约30μL滴于空白DBS卡并于室温晾干后，以6‑mm圆型打孔器打孔取样，加入50.0μL内标工作液约3200 g离心2 min并超声5 min进行初步提取，再加入200μL乙腈混匀超声10 min并于16000 g离心10 min再次提取并沉淀蛋白，取上清液加入等体积超纯水混匀后进行LC‑MS/MS分析。检测结果准确度高，灵敏度好，无明显浓度依赖。同时本发明降低了对采血人员、采血设备、采血环境、采血量、样品运输及储存环境的要求。应用于临床前动物试验，可提高动物福利，节约试验成本；应用于临床，配合互联网医院，可节省公共医疗资源，节约患者时间和交通成本，降低院感风险。

Description

一种检测干血斑中卡马西平药物浓度的方法
技术领域
本发明属于血药浓度检测技术领域，具体涉及到一种体外检测干血斑中卡马西平药物浓度的方法。
背景技术
卡马西平(Carbamazepine)是一种能够有效治疗癫痫、三叉神经痛、舌咽神经痛及躁狂-抑郁症的精神类药物。长期服用可有效抑制病情的发作及恶化，但临床研究发现其体内代谢个体间差异大，有效血药浓度范围窄，毒副作用明显且与血药浓度密切相关。因此服药期间应尤其关注卡马西平血药浓度，及时调整用药方案，避免药效的降低或毒副作用的产生。
目前卡马西平血药浓度检测多采用传统检测基质如血浆、血清以及全血。传统检测基质均需至专业机构，由专业人员进行采集、分离，并通过冷链运输至检测中心进行检测。由于检测周期过长，检测频次较高，血液采集量较大，严重影响了患者的工作和生活，既加重了患者的心理及身体负担，又难以实现卡马西平血药浓度的及时监控。尤其当面临疫情以及一些自然灾害时，患者前往医院进行检测存在较大安全隐患，且难以实现及时、多次的检测。
文献报道中卡马西平生物样品前处理方法有蛋白沉淀法，液液萃取法，固相萃取法，配体结合法等。蛋白沉淀法是其中最为简单的方法，但其所需样品量较高且处理后样品溶液成分较为复杂，往往会影响化合物基质效应及定量下限。
发明内容
为克服现有技术的缺陷，本发明实施了一种检测干血斑中卡马西平药物浓度的方法。
本发明所述一种检测干血斑中卡马西平药物浓度的方法，具体步骤为：
步骤一、DBS标样和质控样本制备：
配制浓度为0.0500～2000ng/mL的校准标样和质控全血样品，垂直滴加在 DBS卡采样孔中心位置，使上样后血斑呈圆形且正反两面颜色一致，于室温通风环境充分晾干后，即得干血斑样品，密封保存；
步骤二、DBS样品采集：
取约10～50μL全血样品，垂直滴加在DBS卡采样孔中心位置，使上样后血斑呈圆形且正反两面颜色一致，于室温通风环境放置2～24h充分晾干后，转移至室温、2～8℃或-60℃以下密封保存。
步骤三、DBS样品取样：
采用3～6-mm圆形打孔器，对DBS样品进行一次或多次打孔取样并转移至干净EP管中。取样前后需以打孔器对干净滤纸或DBS卡空白部位进行至少两次打孔，以避免样品间产生交叉污染。
步骤四、DBS样品处理：
取20.0～100μL奥卡西平内标工作液(溶剂为：甲醇含量0％～50％水溶液) 加入盛有干血斑样品的EP管中，约2000～16000g条件下离心1～10min并超声 1～10min后，加入100～500μL乙腈混匀。再次超声1～20min，并于约3200～16000 g离心5～15min后，移取上清液加入等体积超纯水进行稀释，涡旋混匀后待分析。
步骤五、DBS样品的定量测定：
DBS校准标样，质控样品，随未知DBS样品依步骤三和步骤四同时处理，处理后样品于液相质谱联用仪进行分析。采用内标法，分别以校准标样浓度和校准标样中卡马西平与奥卡西平的面积比为横纵坐标，以最小二乘法进行线性拟合绘制标准曲线，并将未知样品中卡马西平与奥卡西平面积比代入计算即得未知样品中卡马西平的浓度。
液相方法如下：
色谱柱：Poroshell 120SB-C18(2.7μm，3.0*100mm)
流动相：流动相为A相和B相混合溶液。A相为含0.1％甲酸的5％乙腈水； B相为含0.1％甲酸的95％乙腈水。
洗脱程序：以0.6mL/min的流速进行梯度洗脱。梯度(以B相为例)为： 0.00～0.20min，35％～35％；0.20～1.20min，35％～85％；1.20～2.00min，85％～85％； 2.00～2.10min,85％～35％；2.10～3.00min，35％～35％。
质谱方法如下：
离子源为电喷雾离子源(ESI源)；离子化模式为正离子模式：离子源电压为 5000～5500V；离子源温度为450～600℃；喷雾气，加热气，气帘气，碰撞气均为氮气；喷雾气压力为30～80psi，加热气压力为30～80psi，气帘气压力为20～50psi；碰撞气压力为6～12psi；扫描方式为多反应监测；用于卡马西平及内标奥卡西平定量分析的离子对分别为：237.1>194.2，253.1>180.1，碰撞电压分别为27eV， 41eV。
本发明的有益效果如下：
相较于传统方法，DBS样品采集过程更为安全方便，可肢端采血替代静脉采血，采血量更少，对受试个体更为友好。采样时无需专业人员及特定环境，更无需准确定量。本发明可应用于临床前药代动力学试验与药物安全评价，既能提高动物福利，又能节省实验成本；同时本发明也可应用于临床血药浓度检测，患者可居家自行采样，既节省了公共医疗资源，降低了疫情暴露和传播风险，又节省了患者的时间和交通支出。
DBS样品存储及运输可直接在室温或低温(2～8℃)条件下进行，能够大幅度节省样品运输及储存成本，降低因温度失控带来的样品稳定性风险。患者可直接通过普通物流或冷链进行样品投递；
同时DBS样品前处理过程更为简单，无需使用精密移液装置对样品进行精确定量，采用极少的样品量，以简单的蛋白沉淀方法即可得到较为干净的处理后样品，获得更好的定量下限以及高准确度，高重现性的无明显基质效应和浓度依赖的结果；
综上：本发明可应用于临床前药代动力学试验和药物安全评价，在提高动物福利的同时，节省实验成本。本发明也可应用于临床血药浓度检测，降低患者不必要的外出带来的疫情风险，节省公共医疗资源，同时大幅度缩短患者血药浓度检测周期，帮助患者及时调整用药方案，避免因药效降低导致的病情复发和恶化以及血药浓度升高导致的毒副作用的发生。
附图说明
图1是本发明实施例卡马西平标准曲线典型图谱；
图2是本发明实施例中定量下限样品(LLOQ，卡马西平浓度为0.500ng/mL) 中卡马西平(上)和奥卡西平(下)的典型图谱；
图3是本发明实施例中双空白样品(Blank)中卡马西平(上)和奥卡西平(下) 的典型图谱；
图4是本发明实施例中运行定量上限样品后空白样品(Carryover Blank)中卡马西平(上)和奥卡西平(下)的典型图谱；
图5是SD大鼠灌胃给药2mg/kg卡马西平后，血浆样品与DBS样品浓度相关图，其中不同形状符号代表不同动物号；
图6是SD大鼠灌胃给药2mg/kg卡马西平后，血浆样品与DBS样品药时曲线对比图，其中“○”代表血浆样品，“△”代表DBS样品。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明中所述的适量，为本领域内普通技术人员根据国家技术规范和生产实际情况所决定的用量。本发明中所述的原料如无特殊说明，均为商业购得。
实施例
1、药品和试剂
待测物对照品卡马西平(批号：100142-201706，含量：100.0％)和内标物对照品奥卡西平(批号：100657-201102，含量：99.8％)购自中国食品药品检定研究院；DBS卡WhatmanTM 903Protein Saver Card((批号：10534612)购自GE Heathcare Ltd.；超纯水由密理博超纯水仪制备；甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)、异丙醇(色谱纯)和甲酸(色谱纯)购自Thermo Fisher Scientific Inc.；Sprague Dawley大鼠源自昭衍(苏州)新药研究中心有限公司SPF级动物房；空白SD 大鼠全血(抗凝剂为K2EDTA)由昭衍(苏州)新药研究中心有限公司自行采集。
2、仪器和条件
液质联用***由岛津LC-30A液相***与AB Sciex TripleQuadTM 6500三重四级杆串联质谱组成；冷冻离心机采用Eppendorf 5910R；超声振荡器采用宁波新芝生物科技股份有限公司SB-800DT。
液相条件：
色谱柱采用Agilent Poroshell 120SB-C18(2.7μm，3.0*100mm)；流动相A相为含0.1％甲酸的5％乙腈水；流动相B相为含0.1％甲酸的95％乙腈水；梯度洗脱程序如下表1所示：
表1梯度洗脱程序
时间(min) 流速(mL/min) ％A ％B
0.00 0.60 65 35
0.20 0.60 65 35
1.20 0.60 15 85
2.00 0.60 15 85
2.10 0.60 65 35
3.00 0.60 65 35
质谱条件：
使用带有ESI源的TripleQuad 6500质谱，采用正离子MRM模式进行扫描。源参数及化合物参数如下表2和表3所示：
表2：源参数:
Figure BDA0003281753970000051
表3：化合物参数:
Figure BDA0003281753970000052
3、溶液和样品配制
以甲醇为溶剂，配制卡马西平浓度为1.00mg/mL的标曲及质控储备液， 2～8℃储存。以50％甲醇水为溶剂，分别将卡马西平标曲储备液稀释为10.0、20.0、 40.0、100、200、1000、1800和2000ng/mL的卡马西平标准曲线工作液，将卡马西平质控储备液稀释为10.0、30.0、400和1600ng/mL的卡马西平质控工作液。以SD大鼠全血(K2EDTA抗凝)20倍稀释工作液配制浓度分别为0.500、 1.00、2.00、5.00、10.0、50.0、90.0、100ng/mL的卡马西平标准曲线全血样品及浓度分别为0.500、1.50、20.0和80.0ng/mL的卡马西平质控全血样品。以甲醇为溶剂，配制浓度为1.00mg/mL的奥卡西平内标储备液，2～8℃储存。以50％甲醇水为溶剂将奥卡西平内标储备液稀释为2.00ng/mL的奥卡西平内标工作液。
4、DBS样品配制
取30.0μL标准曲线及质控全血样品，垂直滴加在DBS卡片指定位置。滴加过程中应避免枪头与DBS卡相接触，以免造成血斑分布不均或DBS卡破损。同时滴加血斑应尽量呈规则圆形。卡片于室温通风环境下静置不少于2h，待血斑完全晾干后，转移至2～8℃冰箱密封保存。
5、DBS样品处理
采用6-mm直径圆形打孔器，对晾干后DBS样品进行取样并转移至干净EP管中。取50.0μL内标工作液加入盛有干血斑样品的EP管中，约3200g条件下离心2 min并超声5min后，加入200μL乙腈混匀。再次超声至少10min，并于2～8℃，约 16000g离心10min后，移取上清液加入等体积超纯水进行稀释，涡旋混匀后于 LC-MS/MS进样5μL分析。
6、方法学验证
6.1线性
标准曲线需包含8个非零浓度点，要求至少6个非零浓度点及75％的标曲点 (包括LLOQ与ULOQ)须符合以下要求：除LLOQ样品的准确度偏差(相对误差，Bias％)介于±20.0％之间外，其余样品的Bias％均需介于±15.0％之间，且相关系数平方值(决定系数)r2≥0.98。
结果：标准曲线采用最小二乘法线性拟合，化合物在0.500～100ng/mL线性良好(典型标准曲线图如图1所示)，r2均大于0.98。六个分析批各校准点均满足准确度要求，各校准点批间准确度偏差：-5.35％～4.60％。
6.2精密度和准确度
以一条标准曲线、4个浓度(LLOQ、QCL、QCM及QCH)水平，每个浓度水平各5份样品，组成1个分析批，至少运行3个分析批评价准确度与精密度。每个浓度水平的批内及批间准确度偏差应介于±15％之间，LLOQ应介于±20％之间；批内及批间精密度应不超过15％，LLOQ应不超过20％。
结果：批内准确度偏差：-5.95％～8.25％；批间准确度偏差：-3.09％～5.46％；批内精密度：2.51％～11.06％；批间精密度：5.62％～8.64％。
6.3灵敏度
灵敏度要求标准曲线最低非零浓度点(LLOQ)信噪比不小于5，且批内，批间准确度偏差应介于±20％之间，批内，批间精密度不超过20％。
结果：本发明LLOQ为0.500ng/mL，响应如图2所示，计算信躁比为27。批内准确度偏差最大值为-5.88％，批内精密度最大值为9.86％，批间准确度偏差为-0.35％，批间精密度为9.03％。
6.4提取回收率
以LQC、MQC、HQC浓度水平DBS样品与空白DBS样品提取后加标配制的LQC、MQC、HQC浓度水平样品相对比，各浓度点化合物提取回收率变异系数应小于15％。
结果：卡马西平LQC、MQC、HQC浓度平均提取回收率106.1％，变异系数为11.2％。
6.5基质效应
至少选用六批不同个体的空白基质，计算每批基质LQC，HQC浓度水平，基质存在下的峰面积与不含基质的相应浓度峰面积的比值，即基质因子，内标归一化后的基质因子的变异系数不得大于15％
结果：内标归一化后LQC基质因子为1.29，变异系数为4.15％；内标归一化后HQC基质因子为1.04，变异系数为3.40％。
6.6选择性
取至少六个不同来源的空白基质，内源性组分响应应低于目标分析物(卡马西平)定量下限的20％，内标(奥卡西平)响应的5％；
结果：空白基质中未见目标分析物卡马西平和内标奥卡西平的干扰峰(代表图谱如图3所示)，方法选择性良好；
6.7残留
高浓度样品之后空白样品中的残留应不超过LLOQ响应的20％且不超过内标响应的5％。
结果：如图4所示未见残留峰。
6.8采样量的影响
配制高、低浓度全血样品，分别上样10.0μL、20.0μL、30.0μL、40.0μL和 50.0μL，以新鲜配制的标准曲线上样30.0μL考察其准确度，各浓度点准确度偏差应介于±15.0％之间。
结果表明：上样量不同(10μL～50μL)高、低浓度干血斑样品准确度偏差均介于±15.0％之间。
6.9红细胞容积比的影响
以购得已知HCT值的全血为基准，离心后加入部分血浆或移除部分血浆，重新混匀后得到HCT值分别为0.30、0.35、0.40、0.45、0.50的空白大鼠全血。以不同HCT值空白大鼠全血为基质配制高、低浓度水平质控样品，以红细胞容积比为 0.48的全血做DBS标曲及质控样品，待考察样品准确度应介于85.0％～115％。
结果：红细胞容积比在0.35～0.50间时，高、低浓度水平质控样品准确度均符合要求。
6.10取样位置的影响
配制高、低浓度水平干血斑样品，分别在干血斑中央位置及与四周取样，以新鲜配制的DBS样品中央位置取样做标准曲线进行定量分析，待考察样品准确度偏差应介于±15％之间，精密度应不大于15％。
结果表明：不同取样位置高、低浓度水平DBS样品准确度偏差分别为0.95％、4.13％；精密度分别为3.96％、2.04％。
6.11稳定性
配制低、高浓度水平干血斑样品，分别于室温、2～8℃、-60℃以下密封保存一定时间后，以新鲜配制的DBS样品做标准曲线进行定量分析，待考察样品平均准确度偏差应介于±15％之间。
结果表明：室温密封条件下，卡马西平DBS样品在20天内稳定性良好，低、高浓度水平准确度偏差分别为-6.67％、-11.50％。；
2～8℃密封条件下，卡马西平DBS样品在55天内稳定性良好，低、高浓度水平准确度偏差分别为-11.33％、-6.56％；
-60℃以下密封条件下，卡马西平DBS样品在55天内稳定性良好，低、高浓度水平准确度偏差分别为-6.00％、-4.75％。
6.12SD大鼠干血斑样品与SD大鼠血浆样品间浓度差异
选择雌、雄Sprague Dawley大鼠各三只，灌胃给药2mg/kg卡马西平，分别于给药前(0h)、给药后0.25h、0.5h、0.75h、1h、1.5h、2h、6h和12h进行颈静脉取血约0.3mL。取其中约90μL滴于DBS卡上(平行3份，每份约30μL)并于室温晾干后，转移至2～8℃冰箱密封保存。其余全血放入盛有K2EDTA抗凝剂的采血管，并在1h内以2000g转速于2～8℃条件下进行离心，取上层血浆样品于洁净EP管并置于-60℃超低温冰箱保存。
采用经过***验证的LC-MS/MS方法进行血浆样品与干血斑样品定量分析。以测得颈静脉血浆样品浓度为横坐标，颈静脉DBS样品浓度为纵坐标，绘制血浆样品与干血斑样品浓度相关分布图(图5)，并进行线性拟合得曲线y＝0.86757x +13.3878，r2＝0.9887。使用WinNonlin对所得样品数据进行统计分析，并绘制药时曲线。由图6可知DBS样品与血浆样品药时曲线趋势完全一致，利用非房室模型法(NCA)分别计算DBS样品与血浆样品Cmax、Tmax、T1/2并计算二者偏差，分别为：1.45％、-0.01％、9.29％。可知采用干血斑法与血浆样品检测法测得血药浓度无明显差异。
本发明开发了一种检测干血斑中卡马西平药物浓度的方法。该方法操作简单，采血量小，对受试个体友好，测量结果准确度高，重现性好且与血浆样品测量结果相关性好。适用于临床前药代动力学研究和药物安全性评价。
同时该方法采样过程安全便捷，无需特定人员、环境与设备，更无需定量操作。可由患者自行采集指尖血DBS样品，并通过常规物流邮寄至检测中心，得到检测结果后，在医生远程指导下，即可及时高效的调整用药方案。既能有效控制病情的发作与恶化，又能减少不良反应或其他毒副作用的发生。
本发明未详细说明的部分采用现有技术可实现，在此不做赘述。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，不能以此限定本发明的保护范围，即大凡依本发明权利要求书及发明内容所做的简单的等效变化与修改，皆仍属于本发明专利申请的保护范围。

Claims (9)

1.一种检测干血斑中卡马西平药物浓度的方法，其特征在于：
步骤一、DBS标样和质控样本制备：
配制已知浓度的校准标样和质控全血样品，垂直滴加在DBS卡采样孔中心位置，使上样后血斑呈圆形且正反两面颜色一致，于室温通风环境充分晾干后，即得DBS标样和质控样本，密封保存；
步骤二、DBS样品采集：
取适量全血样品，垂直滴加在DBS卡采样孔中心位置，使上样后血斑呈圆形且正反两面颜色一致，于室温通风环境充分晾干后，即得干血斑样品，密封保存；
步骤三、DBS样品取样：
采用圆形打孔器，对DBS样品进行一次或多次打孔取样并转移至干净EP管中；取样前后需以打孔器对干净滤纸或DBS卡空白部位进行至少两次打孔，以避免样品间产生交叉污染；
步骤四、DBS样品处理：
取20.0~100 μL内标工作液加入盛有干血斑样品的EP管中， 2000~16000 g条件下离心1~10 min并超声1~10 min后，加入100~500 μL乙腈混匀；再次超声1~20 min，并于3200~16000 g离心5~15 min后，移取上清液加入等体积超纯水进行稀释，涡旋混匀后待分析；
步骤五、DBS样品的定量测定：
DBS校准标样、质控样品，随未知DBS样品依步骤三、步骤四同时处理，处理后样品于液相质谱联用仪进行分析；采用内标法，分别以校准标样浓度和校准标样中卡马西平与奥卡西平的面积比为横纵坐标，以最小二乘法进行线性拟合绘制标准曲线，并将未知样品中卡马西平与奥卡西平面积比代入计算即得未知样品中卡马西平的浓度。
2.根据权利要求1所述一种检测干血斑中卡马西平药物浓度的方法，其特征在于：步骤一中已知浓度校准标样浓度范围为0.0500~2000 ng/mL。
3.根据权利要求1所述一种检测干血斑中卡马西平药物浓度的方法，其特征在于：步骤二中全血来源个体为选自但不限于大鼠、小鼠、兔的啮齿类动物或选自但不限于犬，猴，人的非啮齿类哺乳动物，全血上样量为10~50 μL。
4.根据权利要求1所述一种检测干血斑中卡马西平药物浓度的方法，其特征在于：步骤一和步骤二中晾干时间为2~24 h。
5.根据权利要求1所述一种检测干血斑中卡马西平药物浓度的方法，其特征在于：步骤一和步骤二中保存环境可根据所需保存时间不同，选择室温、2~8℃或-60℃密封保存。
6.根据权利要求1所述一种检测干血斑中卡马西平药物浓度的方法，其特征在于：步骤三中打孔器直径为3~6-mm。
7.根据权利要求1所述一种检测干血斑中卡马西平药物浓度的方法，其特征在于：步骤四中内标工作液为含有奥卡西平的甲醇/水溶液（甲醇含量为0%~50%）。
8.根据权利要求1所述一种检测干血斑中卡马西平药物浓度的方法，其特征在于：步骤五中液相方法如下：
色谱柱：Poroshell 120 SB-C18，规格2.7 μm，3.0*100 mm；
流动相：流动相为A相和B相混合溶液；A相为含0.1%甲酸的5%乙腈水； B相为含0.1%甲酸的95%乙腈水；
洗脱程序：以0.6 mL/min的流速进行梯度洗脱；梯度（以B相为例）为：0.00~0.20 min，35%~35%；0.20~1.20 min，35%~85%；1.20~2.00 min，85%~85%；2.00~2.10 min,85%~35%；2.10~3.00 min，35%~35%。
9.根据权利要求1所述一种检测干血斑中卡马西平药物浓度的方法，其特征在于：步骤五中质谱方法如下：
离子源为电喷雾离子源；离子化模式为正离子模式：离子源电压为5000~5500 V；离子源温度为450~600℃；喷雾气，加热气，气帘气，碰撞气均为氮气；喷雾气压力为30~80 psi，加热气压力为30~80 psi，气帘气压力为20~50 psi；碰撞气压力为6~12 psi；扫描方式为多反应监测；用于卡马西平及内标奥卡西平定量分析的离子对分别为：237.1>194.2，253.1>180.1，碰撞电压分别为27 eV，41 eV。
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