CN114196601A - 具有促生、生防及降解有机磷农药微生物菌剂及制备方法 - Google Patents

具有促生、生防及降解有机磷农药微生物菌剂及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物菌剂技术领域，公开了一种具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂及制备方法，所述具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂包括枯草芽孢杆菌GSMSC30266。本发明提供的具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂具有高效降解多种有机磷农药的功能，同时可以促进植物生长，改善土壤环境，抑制多种植物病原菌生长。本发明中的枯草芽孢杆菌通过12C6+离子束辐照选育获得，具有高效降解有机磷农药的特点，不仅可以高效有机磷农药辛硫磷和氧乐果，而且对甲拌磷、对硫磷、毒死蜱和敌百虫都有较好的降解效果，降解率均在65％以上。本发明中的枯草芽孢杆菌菌剂产品生产工艺简单，具有很高的应用推广价值。

Description

具有促生、生防及降解有机磷农药微生物菌剂及制备方法
技术领域
本发明属于微生物菌剂技术领域，尤其涉及一种具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂及制备方法。
背景技术
目前，农药对土壤环境、水环境、大气环境以及整个生态***造成的污染日益严重，尤其以农药污染导致生物体内富集从而对人类健康产生了严重危害。有机磷农药80％以上具有高毒性，例如甲拌磷、对硫磷、甲胺磷等。2003年农业部撤销了对硫磷和甲胺磷等5种高度有机磷农药登记，2013年农业部进展在蔬菜上使用毒死蜱，但是甲拌磷、氧乐果等高毒性、辛硫磷和敌百虫等低毒性的农药仍被允许使用。有机磷农药的长期超量施用，致使目前有机磷农药的污染成为了农业生产环境中最严重的污染源之一。
防治有机磷农药污染，包括发展高效低毒无环境污染的农药、制定合理使用农药的制度，最重要的是研究出降低或消解有机磷农药残留的方法。生物降解是通过生物的作用将农药分解为小分子无毒或低毒化合物，最终降解为水、CO2和矿物质的过程。具有高效和无二次污染的特点。微生物由于其稳定的环境适应能力和强大的代谢功能，更适合用于降解环境中的有机磷农药污染。
枯草芽孢杆菌广泛存在于自然界中，其生长速度快、易存活、营养要求简单、可产生芽孢，抗逆性强、无环境污染，分泌多种酶和抗生素，适合于降解有机磷农药应用。目前，对降解有机磷农药微生物的研究，主要集中在农药降解途径、机理、代谢产物及基因工程菌的建立，对微生物自身功能的研究较少。枯草芽孢杆菌广泛存在于自然界中，其生长速度快、易存活、营养要求简单、可产生芽孢，抗逆性强、无环境污染，分泌多种酶和抗生素，适合于降解有机磷农药应用。目前，对降解有机磷农药微生物的研究，主要集中在农药降解途径、机理、代谢产物及基因工程菌的建立，对微生物自身功能的研究较少。专利：一种具有降解有机磷和防病双重作用的枯草芽孢杆菌中，微生物既有降解有机磷农药的作用，还具有防病的作用；专利：一株具有富磷、降解有机磷及抑制植物病原真菌的沙雷氏菌，同样研究了微生物具有降解有机磷农药和抑制病原真菌的作用。专利：一种具有营养、抑病及降解有机磷农药的枯草芽孢杆菌，研究了微生物除了可以降解有机磷农药，还具有作物营养和抑病的作用；本发明枯草芽孢杆菌具有降解多种有机磷农药功效外，还具有促进植物生长、抑制病原微生物生长的功效。另外，本发明中枯草芽孢杆菌来自于专利：对有机磷具有高效降解作用的枯草芽孢杆菌及其制备方法，该菌株经过12C6+离子束辐照处理，可以快速高效的降解辛硫磷和氧乐果。但现有技术中关于验证枯草芽孢杆菌是否能够有效降解有机磷农药甲拌磷、对硫磷、毒死蜱和敌百虫的方案尚未见报道。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
(1)目前对降解有机磷农药微生物的研究，主要集中在农药降解途径、机理、代谢产物及基因工程菌的建立，对微生物自身功能的研究较少。
(2)现有技术中关于验证枯草芽孢杆菌是否能够有效降解有机磷农药甲拌磷、对硫磷、毒死蜱和敌百虫的方案尚未见报道。
解决以上问题及缺陷的难度为：难以通过单一微生物菌株同时降解多种有机磷农药，降解率均在65％以上；降解有机磷农药的菌株难以同时具备植物促生和防治病害的功效。
解决以上问题及缺陷的意义为：农药在农作物病虫害防治方面起到了巨大的贡献，但农残则对环境和人类健康带来了严重的危害。本发明提供的枯草芽孢杆菌具有降解辛硫磷、氧乐果、甲拌磷、对硫磷、毒死蜱和敌百虫等多种有机磷农药，降解率均在65％以上，同时具有植物促生和病害防治的，功效。另外该菌株为农业部登记的微生物肥料中用允许使用得菌种。本发明制备的有机磷农药降解微生物菌剂具有投入低，治理效果显著，无副作用的特点，缓解了农残对环境的污染，促进了植物生长，预防病害的发生，具有较强的社会效益、环境效益和经济效益，对我国农业绿色健康可持续发展具有十分重要的意义和积极的作用。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂及制备方法。
本发明是这样实现的，一种具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂，所述具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂包括枯草芽孢杆菌，于2018年6月20日保存于甘肃省工业微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GSMSC30266。
本发明的另一目的在于提供一种应用所述具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂的具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂的制备方法，所述具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂的制备方法包括以下步骤：
步骤一，微生物斜面种子的制备：将枯草芽孢杆菌接种于细菌固体斜面培养基，30℃恒温培养48h后，即为种子斜面；
步骤二，微生物液体种子的培养：将枯草芽孢杆菌接种于细菌液体培养基，在温度为30℃，初始pH值为6.0，接种量4％，转速为200r/min震荡培养48h后，即为液体种子；
步骤三，菌株液体扩大培养：将枯草芽孢杆菌接种于50L发酵罐中，培养基为细菌液体培养基，装液量40L，在温度为30℃，初始pH值为6.0，接种量4％，转速300r/min培养36h，枯草芽孢杆菌的菌液中有效活菌数为5×107CFU/mL，即得到具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂。
本发明的另一目的在于提供一种所述具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂在高效降解有机磷农药辛硫磷和氧乐果中的应用，所述具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂对辛硫磷的降解率为93.5％，对氧乐果的降解率为69.6％。
本发明的另一目的在于提供一种所述具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂在高效降解甲拌磷、对硫磷、毒死蜱和敌百虫中的应用，所述具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂在高效降解甲拌磷、对硫磷、毒死蜱和敌百虫中的应用包括：
向无机盐培养基中加入有效成分含量为55％的甲拌磷，使甲拌磷在培养基中的添加量为800μg/mL，按1％的接种量接种枯草芽孢杆菌，置于温度为30℃、转速为200r/min振荡培养72h，12000r/min离心10min，取上清液测定甲拌磷的残留量检测，枯草芽孢杆菌对甲拌磷的降解率为76.3％；
向无机盐培养基中加入有效成分含量为50％的对硫磷，使对硫磷在培养基中的添加量为800μg/mL，按1％的接种量接种枯草芽孢杆菌，置于温度为30℃、转速为200r/min振荡培养72h，12000r/min离心10min，取上清液采用气相色谱-质谱法检测对硫磷的残留量检测，枯草芽孢杆菌对对硫磷的降解率为85.3％；
向无机盐培养基中加入有效成分含量为45％的毒死蜱，使毒死蜱在培养基中的添加量为800μg/mL，按1％的接种量接种枯草芽孢杆菌，置于温度为30℃、转速为200r/min振荡培养72h，12000r/min离心10min，取上清液测定毒死蜱的残留量检测，枯草芽孢杆菌对毒死蜱的降解率为88.6％；
向无机盐培养基中加入有效成分含量为90％的敌百虫，使敌百虫在培养基中的添加量为800μg/mL，按1％的接种量接种枯草芽孢杆菌，置于温度为30℃、转速为200r/min振荡培养72h，12000r/min离心10min，取上清液测定敌百虫的残留量检测，枯草芽孢杆菌对敌百虫的降解率为67.8％。
进一步，所述无机盐培养基为NaCl 0.2g，MgSO40.5g，K2SO40.5g，CaCO3 0.2g，FeSO4·7H2O 0.001g，蒸馏水定容到1000mL，121℃高压蒸汽灭菌20min。
本发明的另一目的在于提供一种应用所述具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂的具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂对植物的促生实验，所述具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂对植物的促生实验包括：
(1)枯草芽孢杆菌对番茄种子萌发的影响
用70％酒精消毒对番茄种子表面消毒1min后，无菌水冲洗3次，再用2％次氯酸钠消毒1min，无菌水冲洗3次，将种子置于铺有一层滤纸，含10mL不同浓度的枯草芽孢杆菌菌液和赤霉素的培养皿中，枯草芽孢杆菌菌液浓度分别为2、4、6、8、10、20、40μg/mL，以无菌水为空白对照；每皿10粒种子，设三个重复；在培养72小时观察记录各组处理的发芽情况。
(2)枯草芽孢杆菌对玉米生长的影响
采用盆栽实验检测菌株对玉米生长的影响，取大田土于180℃，干热灭菌6h，自然冷却后，用于玉米盆栽实验；拌入适量的枯草芽孢杆菌菌液至菌体浓度分别达105、106、107CFU/g土，均匀分装于盆钵中并播入玉米种子，每盆3粒种子，每个处理3个重复，同时以拌入无菌水为对照；在玉米生长30天和60天分别测定株高和叶片数指标。
进一步，所述枯草芽孢杆菌菌液为：枯草芽孢杆菌接种于细菌液体培养基，在温度为30℃，转速为200r/min震荡培养36h即可。
所述细菌液体培养基为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH至7.0；在121℃高压蒸汽灭菌20min。
本发明的另一目的在于提供一种应用所述具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂的具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂对植物的生防实验，所述具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂对植物的生防实验包括：
采用平板对峙法验证枯草芽孢杆菌对病原菌生长抑制效果，分别将枯草芽孢杆菌和病原微生物在细菌培养基和真菌培养基上活化2天；其中，所述病原微生物包括导致番茄早疫病和枯萎病的茄病链格孢和尖孢镰刀菌，玉米茎腐病和玉米枯纹病病株的谷禾镰刀菌和立枯丝核菌。
配制营养琼脂固体培养基，取病原微生物4mm菌饼，放置在培养皿中央部位，在30℃恒温培养24h后，再将枯草芽孢杆菌菌饼，放置在距离病原菌25mm的上下左右4个方位，每个处理3次重复，同时设置空白对照组；30℃恒温培养，待空白对照即将长满整个培养皿时，观察抑菌效果，测定抑菌率。
进一步，所述细菌培养基为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH至7.0；在121℃高压蒸汽灭菌20min；
所述真菌培养基为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，自然pH；马铃薯洗净去皮后称取200g并切成小块，加水煮沸20min，用八层纱布过滤，加热，加入琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000mL，高压121℃灭菌20min后备用。
所述营养琼脂固体培养基为：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH值为7.0；121℃高压灭菌20min后，倒入培养皿中。
进一步，所述抑菌率的测定方法包括：
抑菌率(％)＝(对照生长半径-处理生长半径)/对照生长半径×100％。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂，该微生物具有高效降解多种有机磷农药的功能，同时可以促进植物生长，改善土壤环境，抑制多种植物病原菌生长。
本发明中的枯草芽孢杆菌通过12C6+离子束辐照选育获得，具有高效降解有机磷农药的特点。本发明中的枯草芽孢杆菌不仅可以高效有机磷农药辛硫磷和氧乐果，而且对甲拌磷、对硫磷、毒死蜱和敌百虫都有较好的降解效果，降解率均在65％以上。
本发明中的枯草芽孢杆菌具有植物促生和抑制病原微生物生长的功能，降解土壤中多种有机磷农药残留，减少农药在土壤或蔬菜中的残留危害；同时对由茄病链格孢(Alternaria solani)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、谷禾镰刀菌(Fusariumgraminearum)和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)引起的多种常见土传病害有良好的防治效果，可减少或替代杀菌剂使用。本发明的枯草芽孢杆菌菌剂产品生产工艺简单，具有很高的应用推广价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂的制备方法流程图。
图2是本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌对盆栽玉米生长的影响示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂及制备方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
本发明实施例提供的具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂包括枯草芽孢杆菌，于2018年6月20日保存于甘肃省工业微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GSMSC30266。
如图1所示，本发明实施例提供的具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂的制备方法包括以下步骤：
S101，微生物斜面种子的制备：将枯草芽孢杆菌接种于细菌固体斜面培养基，30℃恒温培养48h后，即为种子斜面；
S102，微生物液体种子的培养：将枯草芽孢杆菌接种于细菌液体培养基，在温度为30℃，初始pH值为6.0，接种量4％，转速为200r/min震荡培养48h后，即为液体种子；
S103，菌株液体扩大培养：将枯草芽孢杆菌接种于50L发酵罐中，培养基为细菌液体培养基，装液量40L，在温度为30℃，初始pH值为6.0，接种量4％，转速300r/min培养36h，枯草芽孢杆菌的菌液中有效活菌数为5×107CFU/mL，即得到具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂。
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
实施例1：具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂
本发明的目的是提供一种生物降解有机磷农药的方法，该微生物具有高效降解多种有机磷农药的功能，同时可以促进植物生长，改善土壤环境，抑制多种植物病原菌生长。
一种具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂，其菌株来自专利：对有机磷具有高效降解作用的枯草芽孢杆菌及其制备方法，具体为：枯草芽孢杆菌GSMSC30266，对辛硫磷的降解率为93.5％，对氧乐果的降解率为69.6％。
所述枯草芽孢杆菌，不仅对有机磷农药辛硫磷和氧乐果具有高效降解效果，对甲拌磷、对硫磷、毒死蜱和敌百虫都有较好的降解效果，具体为：
向无机盐培养基中加入有效成分含量为55％的甲拌磷，使其在培养基中的添加量为800μg/mL，按1％的接种量接种枯草芽孢杆菌，置于温度为30℃、转速为200r/min振荡培养72h，12000r/min离心10min，取上清液国标GB/T 14552-2003测定甲拌磷的残留量检测。枯草芽孢杆菌对甲拌磷的降解率为76.3％；
向无机盐培养基中加入有效成分含量为50％的对硫磷，使其在培养基中的添加量为800μg/mL，按1％的接种量接种枯草芽孢杆菌，置于温度为30℃、转速为200r/min振荡培养72h，12000r/min离心10min，取上清液采用气相色谱-质谱法检测对硫磷的残留量检测，枯草芽孢杆菌对对硫磷的降解率为85.3％；
向无机盐培养基中加入有效成分含量为45％的毒死蜱，使其在培养基中的添加量为800μg/mL，按1％的接种量接种枯草芽孢杆菌，置于温度为30℃、转速为200r/min振荡培养72h，12000r/min离心10min，取上清液采用国标GB/T 19604-2017测定毒死蜱的残留量检测，枯草芽孢杆菌对毒死蜱的降解率为88.6％；
向无机盐培养基中加入有效成分含量为90％的敌百虫，使其在培养基中的添加量为800μg/mL，按1％的接种量接种枯草芽孢杆菌，置于温度为30℃、转速为200r/min振荡培养72h，12000r/min离心10min，取上清液采用国标GB 334-2001测定敌百虫的残留量检测，枯草芽孢杆菌对敌百虫的降解率为67.8％。
所述无机盐培养基为NaCl 0.2g，MgSO40.5g，K2SO40.5g，CaCO30.2g，FeSO4·7H2O0.001g，蒸馏水定容到1000mL。121℃高压蒸汽灭菌20min。
一种具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂，其枯草芽孢杆菌对植物的促生实验为：
(1)枯草芽孢杆菌对番茄种子萌发的影响
用70％酒精消毒对番茄种子表面消毒1min后，无菌水冲洗3次，再用2％次氯酸钠消毒1min，无菌水冲洗3次，将种子置于铺有一层滤纸，含10mL不同浓度的枯草芽孢杆菌菌液和赤霉素的培养皿中，枯草芽孢杆菌菌液浓度分别为2、4、6、8、10、20、40μg/mL，以无菌水为空白对照。每皿10粒种子，设三个重复。在培养72小时观察记录各组处理的发芽情况。结果表明：枯草芽孢杆菌菌液浓度为6μg/mL，番茄发芽率为76.9％，比赤霉素略高。
(2)枯草芽孢杆菌对玉米生长的影响
采用盆栽实验检测菌株对玉米生长的影响，取大田土于180℃，干热灭菌6h，自然冷却后，用于玉米盆栽实验；拌入适量的枯草芽孢杆菌菌液至菌体浓度分别达105、106、107CFU/g土，均匀分装于盆钵中并播入玉米种子，每盆3粒种子，每个处理3个重复，同时以拌入无菌水为对照。在玉米生长30天和60天分别测定株高和叶片数指标。结果表明：添加枯草芽孢杆菌菌液的玉米在生长30天和60天时，株高和茎粗指标均高于对照组；菌液浓度为105CFU/g土时玉米长势最佳。
所述枯草芽孢杆菌菌液为：枯草芽孢杆菌接种于细菌液体培养基，在温度为30℃，转速为200r/min震荡培养36h即可。
所述细菌液体培养基为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH至7.0。在121℃高压蒸汽灭菌20min。
一种具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂，其枯草芽孢杆菌对植物的生防实验为：
采用平板对峙法验证枯草芽孢杆菌对病原菌生长抑制效果。分别将枯草芽孢杆菌和病原微生物在细菌培养基和真菌培养基上活化2天。病原微生物包括导致番茄早疫病和枯萎病的茄病链格孢(Alternaria solani)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，玉米茎腐病和玉米枯纹病病株的谷禾镰刀菌(Fusarium graminearum)和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)。
配制营养琼脂固体培养基，取病原微生物4mm菌饼，放置在培养皿中央部位，在30℃恒温培养24h后，再将枯草芽孢杆菌菌饼，放置在距离病原菌约25mm的上下左右4个方位，每个处理3次重复，同时设置空白对照组；30℃恒温培养，待空白对照即将长满整个培养皿时，观察抑菌效果，测定抑菌率。抑菌率(％)＝(对照生长半径-处理生长半径)/对照生长半径×100％。结果表明：枯草芽孢杆菌对病原微生物均有较好的抑制作用，抑菌率均在75％以上。
所述细菌培养基为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH至7.0。在121℃高压蒸汽灭菌20min。真菌培养基为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，自然pH。马铃薯洗净去皮后称取200g并切成小块，加水煮沸20分钟，用八层纱布过滤，加热，根据实际需要加入琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，高压121℃灭菌20分钟后备用。营养琼脂固体培养基为：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH值为7.0。121℃高压灭菌20min后，倒入培养皿中。
一种具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂，其微生物菌剂的制备方法包括以下步骤：
(1)微生物斜面种子的制备：将枯草芽孢杆菌接种于细菌固体斜面培养基，30℃恒温培养48h后，即为种子斜面。
(2)微生物液体种子的培养：将枯草芽孢杆菌接种于细菌液体培养基，在温度为30℃，初始pH值为6.0，接种量4％，转速为200r/min震荡培养48h后，即为液体种子。
(3)菌株液体扩大培养：将枯草芽孢杆菌接种于50L发酵罐中，培养基为细菌液体培养基，装液量40L，在温度为30℃，初始pH值为6.0，接种量4％，转速300r/min培养36h，枯草芽孢杆菌的菌液中有效活菌数为5×107CFU/mL，即得到一种具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂。
实施例2：枯草芽孢杆菌对有机磷农药的降解作用
(1)对有机磷农药甲拌磷的降解作用
根据专利：对有机磷具有高效降解作用的枯草芽孢杆菌及其制备方法，枯草芽孢杆菌对辛硫磷的降解率为93.5％，对氧乐果的降解率为69.6％。
向无机盐培养基中加入有效成分含量为55％的甲拌磷，使其在培养基中的添加量为800μg/mL，按1％的接种量接种枯草芽孢杆菌，置于温度为30℃、转速为200r/min振荡培养72h，12000r/min离心10min，取上清液，采用国标GB/T14552-2003测定甲拌磷的残留量检测。枯草芽孢杆菌对甲拌磷的降解率为76.3％。
向无机盐培养基中加入有效成分含量为50％的对硫磷，使其在培养基中的添加量为800μg/mL，按1％的接种量接种枯草芽孢杆菌，置于温度为30℃、转速为200r/min振荡培养72h，12000r/min离心10min，取上清液采用气相色谱-质谱法检测对硫磷的残留量检测。
气相色谱-质谱仪：美国安捷伦7890B-5977B型，配HP-5MS型色谱柱(30m×0.25mm，0.25μm)；色谱条件：载气为高纯氮气，流量为1.0mL/min，进样口温度为220℃，进样方式为不分流进样，进样体积为1μL，升温程序：起始温度为50℃，保持1min，以20℃/min升温至160℃，再以15℃/min升温至260℃，保持2min。质谱条件：电子轰击电离源为EI源，碰撞气为高纯氩气，离子源温度：230℃，电子能量为70eV，四极杆温度为150℃，色谱-质谱接口温度：280℃，溶剂延迟：3.0min，采集方式为离子监测模式(MRM)。样品处理：取5g土样品于10mL离心管中，用注射器将1mL丙酮(含100μL氯苯)快速注入水样中，轻轻振荡30s，形成水-丙酮-氯苯的乳浊液体系。将乳浊液体系以4500r/min的转速离心4min，氯苯形成液滴沉淀在离心管底部。用微量注射器吸取沉积相，置于仪器进样瓶中，按上述仪器工作条件下进行气相色谱-质谱分析。枯草芽孢杆菌对甲拌磷的降解率为85.3％。
向无机盐培养基中加入有效成分含量为45％的毒死蜱，使其在培养基中的添加量为800μg/mL，按1％的接种量接种枯草芽孢杆菌，置于温度为30℃、转速为200r/min振荡培养72h，12000r/min离心10min，取上清液采用国标GB/T19604-2017测定毒死蜱的残留量检测，枯草芽孢杆菌对毒死蜱的降解率为88.6％。
向无机盐培养基中加入有效成分含量为90％的敌百虫，使其在培养基中的添加量为800μg/mL，按1％的接种量接种枯草芽孢杆菌，置于温度为30℃、转速为200r/min振荡培养72h，12000r/min离心10min，取上清液采用国标GB 334-2001测定敌百虫的残留量检测，枯草芽孢杆菌对敌百虫的降解率为67.8％。
所述无机盐培养基为NaCl 0.2g，MgSO40.5g，K2SO40.5g，CaCO30.2g，FeSO4·7H2O0.001g，蒸馏水定容到1000mL。121℃高压蒸汽灭菌20min。
表 枯草芽孢杆菌对有机磷农药的降解率
Figure BDA0003471690290000121
Figure BDA0003471690290000131
实施例3：枯草芽孢杆菌对植物的促生效果
(1)枯草芽孢杆菌对番茄种子萌发的影响
用70％酒精消毒对番茄种子表面消毒1min后，无菌水冲洗3次，再用2％次氯酸钠消毒1min，无菌水冲洗3次，将种子置于铺有一层滤纸，含10mL不同浓度的枯草芽孢杆菌菌液和赤霉素的培养皿中，枯草芽孢杆菌菌液浓度分别为2、4、6、8、10、20、40μg/mL，以无菌水为空白对照。每皿10粒种子，设三个重复。在培养72小时观察记录各组处理的发芽情况。表2表明：枯草芽孢杆菌菌液浓度为6μg/mL时，番茄种子发芽率为达到76.9％，比赤霉素组略高。
表 枯草芽孢杆菌对番茄种子发芽率的影响
Figure BDA0003471690290000132
(2)枯草芽孢杆菌对玉米生长的影响
采用盆栽实验检测菌株对玉米生长的影响，取大田土于180℃，干热灭菌6h，自然冷却后，用于玉米盆栽实验；拌入适量的枯草芽孢杆菌菌液至菌体浓度分别达105、106、107CFU/g土，均匀分装于盆钵中并播入玉米种子，每盆3粒种子，每个处理3个重复，同时以拌入无菌水为对照。在玉米生长30天和60天分别测定株高和叶片数指标。图2表明：添加枯草芽孢杆菌菌液的玉米在生长30天和60天时，株高和茎粗指标均高于对照组；菌液浓度为105CFU/g土时玉米长势最佳。
所述枯草芽孢杆菌菌液为：枯草芽孢杆菌接种于细菌液体培养基，在温度为30℃，转速为200r/min震荡培养36h即可。
所述细菌液体培养基为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH至7.0。在121℃高压蒸汽灭菌20min。
实施例4：枯草芽孢杆菌对病原微生物生长的抑制作用
采用平板对峙法验证枯草芽孢杆菌对病原菌生长抑制效果。分别将枯草芽孢杆菌和病原微生物在细菌培养基和真菌培养基上活化2天。病原微生物包括导致番茄早疫病和枯萎病的茄病链格孢(Alternaria solani)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，玉米茎腐病和玉米枯纹病病株的谷禾镰刀菌(Fusarium graminearum)和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)。
配制营养琼脂固体培养基，取病原微生物4mm菌饼，放置在培养皿中央部位，在30℃恒温培养24h后，再将枯草芽孢杆菌菌饼，放置在距离病原菌约25mm的上下左右4个方位，每个处理3次重复，同时设置空白对照组；30℃恒温培养，待空白对照即将长满整个培养皿时，观察抑菌效果，测定抑菌率。抑菌率(％)＝(对照生长半径-处理生长半径)/对照生长半径×100％。表3表明：枯草芽孢杆菌对茄病链格孢、尖孢镰刀菌、谷禾镰刀菌和立枯丝核菌均有较好的抑制作用，抑菌率均在75％以上。
所述细菌培养基为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH至7.0。在121℃高压蒸汽灭菌20min。真菌培养基为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，自然pH。马铃薯洗净去皮后称取200g并切成小块，加水煮沸20分钟，用八层纱布过滤，加热，根据实际需要加入琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，高压121℃灭菌20分钟后备用。营养琼脂固体培养基为：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH值为7.0。121℃高压灭菌20min后，倒入培养皿中。
表3杆菌对病原微生物的抑制效果
Figure BDA0003471690290000151
实施例5：具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂及其制备方法
(1)微生物斜面种子的制备
将枯草芽孢杆菌接种于细菌固体斜面培养基，30℃恒温培养48h后，即为种子斜面。
(2)微生物液体种子的培养
将枯草芽孢杆菌接种于细菌液体培养基，在温度为30℃，初始pH值为6.0，接种量4％，转速为200r/min震荡培养48h后，即为液体种子。
(3)种子液发酵条件的优化
采用4因素3水平正交试验设计方案，4个试验因素为发酵温度(A)、初始pH(B)、接种量(C)和转速(D)。种子液发酵培养基采用蒙金娜有机磷培养基。正交试验因素水平见表4。
表4正交试验设计因素和水平
Figure BDA0003471690290000152
根据正交试验结果，如表5所示，选择最优发酵条件为温度30℃、初始pH值为6.0、接种量4％、转速200r/min，该条件下突变菌株生物量为0.34g，有机磷降解量为164.82mg/L。
所述蒙金娜有机磷培养基为：葡萄糖10g，(NH4)2SO40.5g，NaCl 3g，KCl 0.3g，FeSO4·7H2O 0.03g，MnSO4·H2O 0.03g，MgSO4·7H2O 0.3g，CaCO35g，酵母膏0.4g，蒸馏水1000mL，pH 7.0～7.5。100mL的蒙金娜培养基加入2g琼脂粉，包装，灭菌。用酒精擦净新鲜鸡蛋外壳，用解剖刀切破鸡蛋两端，溜去蛋清后将蛋黄流入已灭菌的锥形瓶中，约加入等量的无菌水，摇匀。待灭菌后的蒙金娜培养基冷却至50℃后，立即加入卵黄液，每100mL的蒙金娜培养基加卵黄稀释液1mL作为有机磷源，混匀后分装于培养皿内凝成平板。
表5正交设计及实验结果
Figure BDA0003471690290000161
(4)菌株液体扩大培养：将枯草芽孢杆菌接种于50L发酵罐中，培养基为细菌液体培养基，装液量40L，在温度为30℃，初始pH值为6.0，接种量4％，转速300r/min培养36h，枯草芽孢杆菌的菌液中有效活菌数为5×107CFU/mL，即得到一种具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂，其特征在于，所述具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂为枯草芽孢杆菌，于2018年6月20日保存于甘肃省工业微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GSMSC30266。
2.一种实施如权利要求1所述具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂的具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂的制备方法包括以下步骤：
步骤一，微生物斜面种子的制备：将枯草芽孢杆菌接种于细菌固体斜面培养基，30℃恒温培养48h后，即为种子斜面；
步骤二，微生物液体种子的培养：将枯草芽孢杆菌接种于细菌液体培养基，在温度为30℃，初始pH值为6.0，接种量4％，转速为200r/min震荡培养48h后，即为液体种子；
步骤三，菌株液体扩大培养：将枯草芽孢杆菌接种于50L发酵罐中，培养基为细菌液体培养基，装液量40L，在温度为30℃，初始pH值为6.0，接种量4％，转速300r/min培养36h，枯草芽孢杆菌的菌液中有效活菌数为5×107CFU/mL，即得到具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂。
3.一种如权利要求1所述具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂在高效降解有机磷农药辛硫磷和氧乐果中的应用，其特征在于，所述具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂对辛硫磷的降解率为93.5％，对氧乐果的降解率为69.6％。
4.一种如权利要求1所述具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂在高效降解甲拌磷、对硫磷、毒死蜱和敌百虫中的应用，其特征在于，所述具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂在高效降解甲拌磷、对硫磷、毒死蜱和敌百虫中的应用包括：
向无机盐培养基中加入有效成分含量为55％的甲拌磷，使甲拌磷在培养基中的添加量为800μg/mL，按1％的接种量接种枯草芽孢杆菌，置于温度为30℃、转速为200r/min振荡培养72h，12000r/min离心10min，取上清液测定甲拌磷的残留量检测；
向无机盐培养基中加入有效成分含量为50％的对硫磷，使对硫磷在培养基中的添加量为800μg/mL，按1％的接种量接种枯草芽孢杆菌，置于温度为30℃、转速为200r/min振荡培养72h，12000r/min离心10min，取上清液采用气相色谱-质谱法检测对硫磷的残留量检测，枯草芽孢杆菌对对硫磷的降解率为85.3％；
向无机盐培养基中加入有效成分含量为45％的毒死蜱，使毒死蜱在培养基中的添加量为800μg/mL，按1％的接种量接种枯草芽孢杆菌，置于温度为30℃、转速为200r/min振荡培养72h，12000r/min离心10min，取上清液测定毒死蜱的残留量检测；
向无机盐培养基中加入有效成分含量为90％的敌百虫，使敌百虫在培养基中的添加量为800μg/mL，按1％的接种量接种枯草芽孢杆菌，置于温度为30℃、转速为200r/min振荡培养72h，12000r/min离心10min，取上清液测定敌百虫的残留量检测。
5.如权利要求4所述具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂在高效降解甲拌磷、对硫磷、毒死蜱和敌百虫中的应用，其特征在于，所述无机盐培养基为NaCl 0.2g，MgSO40.5g，K2SO4 0.5g，CaCO3 0.2g，FeSO4·7H2O 0.001g，蒸馏水定容到1000mL，121℃高压蒸汽灭菌20min。
6.一种应用如权利要求1所述具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂的具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂对植物的促生实验，其特征在于，所述具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂对植物的促生实验包括：
(1)枯草芽孢杆菌对番茄种子萌发的影响
用70％酒精消毒对番茄种子表面消毒1min后，无菌水冲洗3次，再用2％次氯酸钠消毒1min，无菌水冲洗3次，将种子置于铺有一层滤纸，含10mL不同浓度的枯草芽孢杆菌菌液和赤霉素的培养皿中，枯草芽孢杆菌菌液浓度分别为2、4、6、8、10、20、40μg/mL，以无菌水为空白对照；每皿10粒种子，设三个重复；在培养72小时观察记录各组处理的发芽情况；
(2)枯草芽孢杆菌对玉米生长的影响
采用盆栽实验检测菌株对玉米生长的影响，取大田土于180℃，干热灭菌6h，自然冷却后，用于玉米盆栽实验；拌入适量的枯草芽孢杆菌菌液至菌体浓度分别达105、106、107CFU/g土，均匀分装于盆钵中并播入玉米种子，每盆3粒种子，每个处理3个重复，同时以拌入无菌水为对照；在玉米生长30天和60天分别测定株高和叶片数指标。
7.如权利要求6所述具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂对植物的促生实验，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌菌液为：枯草芽孢杆菌接种于细菌液体培养基，在温度为30℃，转速为200r/min震荡培养36h即可；
所述细菌液体培养基为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH至7.0；在121℃高压蒸汽灭菌20min。
8.一种应用如权利要求1所述具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂的具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂对植物的生防实验，其特征在于，所述具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂对植物的生防实验包括：
采用平板对峙法验证枯草芽孢杆菌对病原菌生长抑制效果，分别将枯草芽孢杆菌和病原微生物在细菌培养基和真菌培养基上活化2天；其中，所述病原微生物包括导致番茄早疫病和枯萎病的茄病链格孢和尖孢镰刀菌，玉米茎腐病和玉米枯纹病病株的谷禾镰刀菌和立枯丝核菌；
配制营养琼脂固体培养基，取病原微生物4mm菌饼，放置在培养皿中央部位，在30℃恒温培养24h后，再将枯草芽孢杆菌菌饼，放置在距离病原菌25mm的上下左右4个方位，每个处理3次重复，同时设置空白对照组；30℃恒温培养，待空白对照即将长满整个培养皿时，观察抑菌效果，测定抑菌率。
9.如权利要求8所述具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂对植物的生防实验，其特征在于，所述细菌培养基为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH至7.0；在121℃高压蒸汽灭菌20min；
所述真菌培养基为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，自然pH；马铃薯洗净去皮后称取200g并切成小块，加水煮沸20min，用八层纱布过滤，加热，加入琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000mL，高压121℃灭菌20min后备用；
所述营养琼脂固体培养基为：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH值为7.0；121℃高压灭菌20min后，倒入培养皿中。
10.如权利要求8所述具有促生、生防及降解有机磷农药的微生物菌剂对植物的生防实验，其特征在于，所述抑菌率的测定方法包括：
抑菌率(％)＝(对照生长半径-处理生长半径)/对照生长半径×100％。
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