CN113853438A - 用于生产发酵产物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：(a)形成包含该含淀粉材料和水的浆料；(b)用α‑淀粉酶将该含淀粉材料转化为糊精；(c)使用产碳水化合物源的酶糖化这些糊精以形成糖；(d)使用发酵生物发酵这些糖；(e)回收发酵产物以形成全酒糟；(f)将该全酒糟分离为液体级分酒糟水和固体级分湿滤饼；(g)水解该酒糟水；(h)将一部分经水解的该酒糟水再循环到步骤(a)；其中在步骤(g)中使用葡糖淀粉酶和/或聚半乳糖醛酸酶水解该酒糟水。

Description

用于生产发酵产物的方法
序列表的引用
本申请含有计算机可读形式的序列表，将其通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及从含淀粉材料生产发酵产物(特别是如乙醇)的方法，其中该方法的后端的水解酒糟水(即回糟(backset))被再循环到该方法的前端的浆料槽。
背景技术
在干磨乙醇厂的后端(蒸馏后)，富含纤维、油、蛋白质、残余未发酵糖和酵母细胞的全酒糟被分级分离(典型地使用滗析离心机进行)成酒糟水(液体级分)和湿滤饼(固体级分)。酒糟水要么被分配到一系列的蒸发器以生产糖浆，要么作为回糟流回到乙醇厂的前端(浆料槽)，以与浆料的配方中的现磨含淀粉材料(例如玉米或小麦)和淡水进行组合。
由于固/液分离后的酒糟水中不可溶固形物含量高，乙醇厂(参见例如图1)通常在后端加工中存在问题。酒糟水固形物大多数是纤维、蛋白质和高分子糖类，这些物质贡献不可溶固形物中的大部分，限制糖浆中的总固形物，从而造成蒸发器出现粘度高的问题，并导致结垢。
WO 2002/38786涉及乙醇方法，其中通过添加有效量的选自α-淀粉酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、纤维素酶、果胶酶或其混合物的稀释酶(thinning enzyme)，来降低液化醪液、酒糟水、蒸发的酒糟水的冷凝物和/或糖浆的粘度。
希望提供在回糟向方法前端的再循环利用方面有改善的发酵产物生产方法。
附图说明
图1示意性地示出了干磨乙醇生产方法。
图2显示本发明中酶促水解对乙醇产率的影响。
具体实施方式
本发明涉及从含淀粉材料生产发酵产物(尤其是乙醇)的方法，其中回糟被再循环到该方法的前端，特别是被再循环到浆料槽。
酒糟水固形物大多数是纤维、蛋白质和高分子糖类，这些物质贡献不可溶固形物中的大部分，限制糖浆中的总固形物，从而造成蒸发器出现粘度高的问题，并导致结垢。通过水解这些不溶性固形物来降低酒糟水的粘度，将会：
-使得可以生产具有更高的总固形物含量的糖浆；
-减少蒸发器结垢；和
-提高发酵产物的收率。
本发明人出乎意料地发现，当使用选定的酶类来水解酒糟水(例如水解酒糟水中的不溶性固形物)时，可以更有效地将回糟输送到方法前端(例如浆料槽)，从而导致对所需的淡水的依赖性降低。此外，发酵产物的收率(即乙醇收率)也得到提高，如实施例1所示。
在第一方面，本发明涉及从含淀粉材料生产发酵产物(特别是乙醇)的方法，该方法包括：
(a)形成包含该含淀粉材料和水的浆料；
(b)用α-淀粉酶将该含淀粉材料转化为糊精；
(c)使用产碳水化合物源的酶糖化这些糊精以形成糖；
(d)使用发酵生物发酵这些糖；
(e)回收发酵产物以形成全酒糟；
(f)将该全酒糟分离为液体级分酒糟水和固体级分湿滤饼；
(g)水解该酒糟水；
(h)将一部分经水解的该酒糟水再循环到步骤(a)；
其中在步骤(g)中使用葡糖淀粉酶和/或聚半乳糖醛酸酶水解该酒糟水。
在步骤(h)中没有被再循环的那部分经水解的该酒糟水(即作为回糟)可进行蒸发形成糖浆和冷凝物。在一个实施例中，冷凝物被再循环到步骤(a)。
在一个实施例中，在步骤(g)中，在20℃-80℃范围内、如30℃-70℃范围内、特别是40℃-60℃范围内、尤其是50℃左右的温度下水解酒糟水。在一个实施例中，酒糟水的干固体(DS)含量在10％-50％(W/W)的范围内，如在20％-45％(w/w)的范围内，特别是在30％-40％(w/w)的范围内，尤其是在35％(w/w)左右。在一个实施例中，在步骤(g)中，将酒糟水水解0.1-10小时，如1-5小时，特别是2小时左右。
本发明方法的方法流程可与本文图1所示的方法流程相似或相同。
可以将5vol％-90vol％之间、如10％-80％之间、如15％-70％之间、如20％-60％之间的经水解的该酒糟水(作为回糟)再循环到步骤(a)。再循环的经水解的该酒糟水(即，回糟)可以占步骤(a)中形成的浆料的约1vol.％-70vol.％、优选15vol.％-60vol.％、尤其是从约30vol.％至50vol.％。
步骤(a)-(d)
在步骤(b)中用α-淀粉酶将含淀粉材料转化为糊精之前，将含淀粉材料的粒度减少，优选通过辗磨特别是干磨(例如锤磨)来减少，并形成包含含淀粉材料和水的浆料。
该水性浆料可以含有含淀粉材料的从10-55wt.％干固体，优选25-45wt.％干固体，更优选30-40wt.％干固体。
可将步骤(a)中的浆料加热到高于初始糊化温度，并且加入α-淀粉酶，优选细菌α-淀粉酶，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)α-淀粉酶。在一个实施例中，步骤(a)中的温度可在40℃-60℃之间。
在一个实施例中，在步骤(b)之前但在步骤(a)之后，将浆料进行喷射蒸煮以使浆料糊化，然后再在步骤(b)中用α-淀粉酶处理。喷射蒸煮可以在95℃-140℃之间的温度下进行约1-15分钟、优选进行约3-10分钟、尤其是约5分钟左右。
步骤(b)的温度高于初始糊化温度，如在70℃-100℃之间，如在80℃-95℃之间，如85℃-93℃，如大约88℃或91℃。步骤(b)典型地可以进行0.1-12小时，如1-5小时。
在一个优选的实施例中，在步骤(a)和/或步骤(b)中存在和/或添加蛋白酶。
在一个实施例中，步骤(a)-(b)作为三步热浆料方法进行。将浆料加热到70℃-100℃之间，优选80℃-90℃之间，如85℃，或者更优选85℃-95℃之间，例如88℃或91℃。可加入α-淀粉酶以引发液化(稀释)。然后在95℃-140℃之间、如110℃-145℃之间、优选120℃-140℃之间、优选105℃-125℃之间、如125℃-135℃之间、如130℃左右的温度下，对浆料进行喷射蒸煮1-15分钟、优选3-10分钟、尤其是5分钟左右的时间。然后将浆料冷却到60℃-95℃，优选80℃-90℃，特别是85℃左右，并且加入(更多的)α-淀粉酶以完成水解(二次液化)，例如水解0.1-12小时，如1-5小时。步骤(a)和/或(b)中的pH可为4-7，优选4.5-6.5，特别是5-6之间。经辗磨并液化的含淀粉材料通常称为“醪液(mash)”。
可使用本领域熟知的条件来进行步骤(c)中的糖化。例如，糖化可持续长达从约24小时至约72小时。在一个实施例中，在30℃-65℃之间、典型地约60℃的温度下，在40-90分钟完成预糖化步骤(b’)，随后在同时糖化发酵步骤(SSF)中的发酵过程中进行完全的糖化。糖化典型地在20℃-75℃、优选40℃-70℃、如60℃左右的温度下并且在4-5之间、一般约pH4.5的pH下进行。
发酵产物生产、尤其是乙醇生产中最广泛使用的方法为同时糖化发酵(SSF)，其中糖化没有保温(holding)阶段。这意味着发酵生物(如酵母)和酶类可以一起加入。发酵步骤(d)或同时糖化和发酵(SSF)(即，步骤(c)和(d))典型地在从25℃至40℃、如从28℃至35℃、如从30℃至34℃、优选约32℃左右的温度进行。发酵步骤(d)或同时糖化和发酵(SSF)(即，步骤(c)和(d))典型地进行6至120小时，特别是24至96小时。
当生产乙醇时，发酵生物典型地为酵母，如酵母菌属(Saccharomyces)的菌株，特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株。
其它发酵产物可以在本领域技术人员熟知的、适合于所讨论的发酵生物的条件和温度发酵。根据本发明，可以在发酵过程中向上或向下调节温度。
在一个实施例中，在发酵或SSF过程中添加蛋白酶。
发酵产物，如尤其是乙醇，可以在发酵之后回收，例如通过蒸馏来回收。
含淀粉材料作为起始材料
根据本发明，可使用任何合适的含淀粉材料。通常基于期望的发酵产物(在此是乙醇)来选择起始材料。适用于本发明的方法的含淀粉起始材料的实例包括谷类、块茎或谷物。具体地，含淀粉材料可为玉米、小麦、大麦、黑麦、买罗高粱、西米、木薯(cassava)、树薯(tapioca)、高粱、燕麦、水稻、豌豆、豆类、或甘薯、或它们的混合物。还考虑了糯型(waxytype)与非糯型(non-waxy type)的玉米与大麦。
在优选的实施例中，含淀粉起始材料是玉米。
在优选的实施例中，含淀粉起始材料是小麦。
在优选的实施例中，含淀粉起始材料是大麦。
在优选的实施例中，含淀粉起始材料是黑麦。
在优选的实施例中，含淀粉起始材料是买罗高粱。
在优选的实施例中，含淀粉起始材料是西米。
在优选的实施例中，含淀粉起始材料是木薯。
在优选的实施例中，含淀粉起始材料是树薯。
在优选的实施例中，含淀粉起始材料是高粱。
在优选的实施例中，含淀粉起始材料是水稻，
在优选的实施例中，含淀粉起始材料是豌豆。
在优选的实施例中，含淀粉起始材料是豆类。
在优选的实施例中，含淀粉起始材料是甘薯。
在优选的实施例中，含淀粉起始材料是燕麦。
发酵
在发酵培养基中进行发酵。发酵培养基包括发酵底物，即被发酵生物代谢的碳水化合物源。根据本发明，发酵培养基可以包含发酵生物的营养素和生长刺激剂。营养素和生长刺激剂在发酵领域中广泛使用，并且包括氮源例如氨；尿素、维生素和矿物质或其组合。
发酵生物
术语“发酵生物”是指适用于发酵过程中并且能够生产所希望的发酵产物的任何生物，包括细菌和真菌生物，尤其是酵母。尤其适合的发酵生物能够使糖(例如葡萄糖或麦芽糖)直接或间接发酵成(即，转化成)所希望的发酵产物(例如乙醇)。发酵生物的实例包括真菌生物，例如酵母。优选的酵母包括酵母属菌株，特别是酿酒酵母。
在发酵(例如SSF)期间，有活力的发酵生物的适合的浓度在本领域是熟知的，或可以由本领域的技术人员容易地确定。在一个实施例中，将发酵生物(如乙醇发酵酵母(例如，酿酒酵母))添加至发酵培养基，使得每mL的发酵培养基的有活力的发酵生物(如酵母)计数在从105至1012，优选从107至1010的范围内，尤其是约5x 107个。
可商购的酵母的实例包括例如RED STARTM和ETHANOLRED酵母(可获得自富酶泰斯公司/乐斯福公司(Fermentisis/Lesaffre)，美国)、FALI(可获得自弗莱希曼酵母公司(Fleischmann’s Yeast)，美国)、SUPERSTART和THERMOSACCTM新鲜酵母(可获得自乙醇技术公司(Ethanol Technology)，威斯康星州，美国)、BIOFERM AFT和XR(可获得自NABC-北美生物制品公司(North American Bioproducts Corporation)，佐治亚州，美国)、GERT STRAND(可获得自格特·斯特兰德公司(Gert Strand AB)，瑞典)以及FERMIOL(可获得自帝斯曼特殊产品公司(DSM Specialties))。
发酵产物
术语“发酵产物”意指通过包括使用发酵生物进行的发酵步骤在内的方法生产的产物。根据本发明考虑的发酵产物包括醇(例如，乙醇、甲醇、丁醇；多元醇如甘油、山梨醇和肌醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、琥珀酸、葡糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H2和CO2)；抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B12、β-胡萝卜素)；和激素。在优选的实施例中，发酵产物是乙醇，例如，燃料乙醇；饮用乙醇，即中性饮用酒精；或用于消费性醇工业(例如，啤酒和酒)、乳品工业(例如，发酵的乳制品)、皮革工业和烟草工业的工业乙醇或产物。优选的啤酒类型包含爱尔啤酒(ale)、烈性黑啤酒(stout)、波特啤酒(porter)、拉格啤酒(lager)、苦啤酒(bitter)、麦芽酒(maltliquor)、低麦芽啤酒(happoushu)、高醇啤酒、低醇啤酒、低热量啤酒或清淡啤酒。优选地，本发明的方法是用于生产醇，例如乙醇。根据本发明获得的发酵产物(例如乙醇)可以用作典型地与汽油共混的燃料。然而，在乙醇的情况下，它还可以用作饮用乙醇。
发酵产物的回收
发酵或SSF之后，可以将发酵产物与发酵培养基分开。可以蒸馏浆料以提取所希望的发酵产物(例如，乙醇)。可替代地，可以通过微滤或膜过滤技术从发酵培养基中提取所希望的发酵产物。还可以通过汽提或本领域熟知的其他方法来回收发酵产物。
在步骤(g)中用于水解酒糟水的酶类
根据本发明，在步骤(g)中水解酒糟水。
葡糖淀粉酶
在一个实施例中，在步骤(g)中用葡糖淀粉酶水解酒糟水。该葡糖淀粉酶可以是任何葡糖淀粉酶，包括例如任何在步骤(a)、(b)、(c)和(d)中加入的葡糖淀粉酶，下文有描述。在一个实施例中，葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)是GH15酶，特别是源自栓菌属(Trametes)如瓣环栓菌(Trametes cingulata)的葡糖淀粉酶，尤其是本文SEQ ID NO:1所示的葡糖淀粉酶。
在一个实施例中，葡糖淀粉酶与本文SEQ ID NO:1具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％序列同一性。
聚半乳糖醛酸酶
在一个实施例中，在步骤(g)中用聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)水解酒糟水。聚半乳糖醛酸酶也称为内切聚半乳糖醛酸酶、内切半乳糖醛酸酶、内切D-半乳糖醛酸酶，学名为(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖水解酶(内切型)。该酶催化果胶酸盐和其他半乳糖醛酸聚糖中的(1→4)-α-D-半乳糖苷酸键的随机水解。该酶的不同形式对该底物的甲基酯化具有不同的耐受度。
该聚半乳糖醛酸酶可以是任何聚半乳糖醛酸酶。在一个实施例中，聚半乳糖醛酸酶源自曲霉属(Aspergillus)的菌株，例如棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、白曲霉(Aspergillus kawachii)或黑曲霉(Aspergillusniger)或塔宾曲霉(Aspergillus tubigensis)的菌株。
在一个实施例中，聚半乳糖醛酸酶是WO 2018/127486的SEQ ID NO:5(其通过引用整体并入本文)所示的黑曲霉聚半乳糖醛酸酶或者包含与其具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％序列同一性的氨基酸序列的聚半乳糖醛酸酶。
在一个实施例中，聚半乳糖醛酸酶是WO 2018/204483的SEQ ID NO:1017(其通过引用整体并入本文)所示的棘孢曲霉聚半乳糖醛酸酶或者包含与其具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％序列同一性的氨基酸序列的聚半乳糖醛酸酶。
在一个实施例中，聚半乳糖醛酸酶是WO 2020/002574的SEQ ID NO:17(其通过引用整体并入本文)所示的棘孢曲霉聚半乳糖醛酸酶或者包含与其具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％序列同一性的氨基酸序列的聚半乳糖醛酸酶。
在一个实施例中，聚半乳糖醛酸酶是WO 2010/046471的SEQ ID NO:7577(其通过引用整体并入本文)所示的棘孢曲霉聚半乳糖醛酸酶或者包含与其具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％序列同一性的氨基酸序列的聚半乳糖醛酸酶。
在一个实施例中，聚半乳糖醛酸酶是WO 2020/002574(其通过引用整体并入本文)中所描述的塔宾曲霉聚半乳糖醛酸酶或者包含与其具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％序列同一性的氨基酸序列的聚半乳糖醛酸酶。
在一个实施例中，聚半乳糖醛酸酶是WO 1994/14966(其通过引用整体并入本文)中所描述的塔宾曲霉聚半乳糖醛酸酶或者包含与其具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％序列同一性的氨基酸序列的聚半乳糖醛酸酶。
在一个实施例中，聚半乳糖醛酸酶是WO 2018204483的SEQ ID NO:1018(其通过引用整体并入本文)所示的棘孢曲霉聚半乳糖醛酸酶或者包含与其具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％序列同一性的氨基酸序列的聚半乳糖醛酸酶。
在一个优选实施例中，聚半乳糖醛酸酶源自嗜热子囊菌属(Thermoascus)的菌株，例如坚脆嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceus)的菌株。
在一个实施例中，聚半乳糖醛酸酶是WO 2014/059541的SEQ ID NO:404(其通过引用整体并入本文)所示的坚脆嗜热子囊菌聚半乳糖醛酸酶或者包含与其具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％序列同一性的氨基酸序列的聚半乳糖醛酸酶。
α-淀粉酶
在一个实施例中，在步骤(g)中进一步用α-淀粉酶水解酒糟水。该α-淀粉酶可以是任何α-淀粉酶。在一个实施例中，α-淀粉酶是真菌酸性α-淀粉酶。在一个优选的实施例中，α-淀粉酶源自根毛霉属(Rhizomucor)的菌株，如微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)的菌株，如具有淀粉结合域(SBD)的微小根毛霉α-淀粉酶，如具有接头和SBD(特别是黑曲霉葡糖淀粉酶和接头)的微小根毛霉α-淀粉酶。在一个优选的实施例中，α-淀粉酶是本文SEQ IDNO:2所示的α-淀粉酶。
在一个实施例中，α-淀粉酶与本文SEQ ID NO:2具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％序列同一性。
在一个实施例中，α-淀粉酶是本文SEQ ID NO:2所示的α-淀粉酶的具有以下取代或取代的组合中的至少一个的变体：D165M；Y141W；Y141R；K136F；K192R；P224A；P224R；S123H+Y141W；G20S+Y141W；A76G+Y141W；G128D+Y141W；G128D+D143N；P219C+Y141W；N142D+D143N；Y141W+K192R；Y141W+D143N；Y141W+N383R；Y141W+P219C+A265C；Y141W+N142D+D143N；Y141W+K192R V410A；G128D+Y141W+D143N；Y141W+D143N+P219C；Y141W+D143N+K192R；G128D+D143N+K192R；Y141W+D143N+K192R+P219C；G128D+Y141W+D143N+K192R；或G128D+Y141W+D143N+K192R+P219C(使用SEQ ID NO:2进行编号)。
在一个优选的实施例中，α-淀粉酶源自微小根毛霉，具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)，优选如本文SEQ ID NO:2所披露的α-淀粉酶，优选具有以下取代中的一个或多个：G128D、D143N，优选G128D+D143N(使用SEQ ID NO:2进行编号)。
在一个实施例中，α-淀粉酶变体与本文SEQ ID NO:2的多肽的成熟部分具有至少70％、如至少75％、优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、甚至更优选至少93％、最优选至少94％、并且甚至最优选至少95％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、但小于100％的同一性。
支链淀粉酶
在一个实施例中，在步骤(g)中用普鲁兰酶(E.C.3.2.1.41)进一步水解酒糟水。该普鲁兰酶可以是任何普鲁兰酶。在一个优选的实施例中，普鲁兰酶源自芽孢杆菌属(Bacillus)如脱支芽孢杆菌(Bacillus deramificans)的菌株，特别是本文SEQ ID NO:3所示的普鲁兰酶。
在一个实施例中，普鲁兰酶与本文SEQ ID NO:3具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％序列同一性。
昆布多糖酶
在一个实施例中，在步骤(g)中用昆布多糖酶(E.C.3.2.1.6)进一步水解酒糟水。该昆布多糖酶可以是任何昆布多糖酶。在一个实施例中，昆布多糖酶源自曲霉属(Aspergillus)的菌株，如棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的菌株。
在步骤(g)中用于水解酒糟水的酶类的组合
根据本发明，在步骤(g)中用酶类的组合水解酒糟水。
在一个优选的实施例中，步骤(g)中用葡糖淀粉酶和α-淀粉酶的组合水解酒糟水，如上文所提到的葡糖淀粉酶和α-淀粉酶，特别是SEQ ID NO:1所示的葡糖淀粉酶和具有以下取代的、SEQ ID NO:2所示的α-淀粉酶：G128D+D143N。
在一个实施例中，在步骤(g)中用葡糖淀粉酶和普鲁兰酶的组合水解酒糟水。
在一个实施例中，在步骤(g)中用聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase)和昆布多糖酶的组合水解酒糟水。
在步骤(a)和/或步骤(b)中存在的和/或添加的α-淀粉酶
根据本发明，在步骤(a)和/或步骤(b)中存在的和/或添加α-淀粉酶。在步骤(a)和/或步骤(b)中存在的和/或添加的α-淀粉酶可以是任何α-淀粉酶。优选的是细菌α-淀粉酶，其在高温下通常是稳定的。
细菌α-淀粉酶
术语“细菌α-淀粉酶”意指在EC 3.2.1.1项下分类的任何细菌α-淀粉酶。根据本发明使用的细菌α-淀粉酶可例如源自芽孢杆菌属(有时也称作地芽孢杆菌属)的菌株。在实施例中，该芽孢杆菌属α-淀粉酶源自解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌的菌株，但是也可源自其他芽孢杆菌属菌种。
细菌α-淀粉酶的具体实例包括WO 99/19467中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ IDNO:4的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，WO 99/19467中的SEQ ID NO:5的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶，以及WO 99/19467中的SEQ ID NO:4的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(所有序列都通过引用由此并入)。在一个实施例中，α-淀粉酶与WO 99/19467中的SEQ ID NO:3、4或5所示的任何序列具有至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。
在一个实施例中，α-淀粉酶与本文SEQ ID NO:4的成熟部分具有至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。
在优选的实施例中，α-淀粉酶源自嗜热脂肪芽孢杆菌。嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可为成熟野生型或其成熟变体。该成熟嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可以在重组产生过程中是天然地截短的。例如，嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可以被截短的，使得其为485至495个氨基酸长，如长度在491个氨基酸左右，例如使得其缺乏功能性淀粉结合域(与WO 99/19467中的SEQ ID NO:3相比)或本文的SEQ ID NO:4。
芽孢杆菌α-淀粉酶还可为变体和/或杂合体。这样的变体的实例可见于以下任一者中：WO 96/23873、WO 96/23874、WO 97/41213、WO 99/19467、WO 00/60059、以及WO 02/10355(所有文件都通过引用由此并入)。具体的α-淀粉酶变体在美国专利号6,093,562、6,187,576、6,297,038和7,713,723(通过引用并入本文)中披露，包括具有以下缺失的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(常常称作BSGα-淀粉酶)变体，这些变体在位置R179、G180、I181和/或G182处具有一个或两个氨基酸的缺失，优选WO 96/23873中披露的双缺失–参见例如第20页，第1-10行(通过引用并入本文)，优选与WO 99/19467中披露的SEQ ID NO:3或本文的SEQID NO:4所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的氨基酸序列相比对应于位置I181和G182的缺失，或使用WO 99/19467(该参考文件通过引用并入本文)中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ IDNO:4用于编号的氨基酸R179和G180的缺失。甚至更优选的是芽孢杆菌属α-淀粉酶，尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，它与WO 99/19467中披露的SEQ ID NO:3或本文的SEQ ID NO:4所示的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比具有对应于位置181和182的缺失的双缺失，并任选地进一步包括N193F取代(也表示为I181*+G182*+N193F)。细菌α-淀粉酶还可在对应于WO99/19467中的SEQ ID NO:4所示的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶中的S239、或WO 99/19467中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ ID NO:4的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的S242和/或E188P变体的位置处具有取代。
在实施例中，该变体是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的S242A、E或Q变体，优选S242Q变体(使用本文的SEQ ID NO:4进行编号)。
在实施例中，变体是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的E188变体，优选E188P变体(使用本文的SEQ ID NO:4进行编号)。
在本发明的一个实施例中，细菌α-淀粉酶，优选源自芽孢杆菌属，尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株，特别是如WO 99/019467中作为SEQ ID NO:3披露或者本文的SEQ ID NO:4的嗜热脂肪芽孢杆菌，其在位置R179、G180、I181和/或G182处缺失一个或两个氨基酸，特别是R179和G180缺失、或I181和G182缺失，进一步地具有以下突变列表中的突变。
在优选的实施例中，嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶具有I181+G182双缺失，以及任选地具有N193F取代，并进一步包括选自以下列表的突变：
Figure BDA0003290675420000141
Figure BDA0003290675420000151
在一个优选的实施例中，α-淀粉酶选自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的组：
-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；
-181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
-I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；
-I181*+G182*+N193F+V59A+E129V+K177L+R179S+Q254S+M284V
-I181*+G182*+N193F+V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；以及
-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用本文的SEQ ID NO:4用于编号)。
应理解的是，当提及嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶及其变体时，它们通常以截短的形式产生。特别地，截短可为这样使得WO 99/19467中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ ID NO:4中所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或其变体在C-末端截短并且典型地为约491个氨基酸长，如480至-495个氨基酸长，或使得其缺乏功能性淀粉结合结构域。
在一个优选实施例中，α-淀粉酶变体可为与WO 99/19467中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ ID NO:4所示的序列具有至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％序列同一性的酶。
在实施例中，将该细菌α-淀粉酶，例如，芽孢杆菌属α-淀粉酶，如尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，或其变体，以在0.01-10KNU-A/g DS之间，例如，0.02-5KNU-A/g DS，如0.03和3KNU-A，优选0.04和2KNU-A/g DS，如尤其是0.01和2KNU-A/g DS之间的浓度剂量添加至液化。在一个实施例中，将细菌α-淀粉酶，例如芽孢杆菌属α-淀粉酶，如尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、或其变体，以在0.0001-1mg EP(酶蛋白)/g DS、例如0.0005-0.5mgEP/g DS、如0.001-0.1mg EP/g DS之间的浓度投加到步骤(a)和/或(b)中。
液化中存在和/或添加的蛋白酶
根据本发明，在步骤(a)和/或(b)中，蛋白酶任选地与α-淀粉酶一起存在和/或添加。
蛋白酶根据其催化机制分为以下几组：丝氨酸蛋白酶(S)、半胱氨酸蛋白酶(C)、天冬氨酸蛋白酶(A)、金属蛋白酶(M)以及未知或还未分类的蛋白酶(U)，参见Handbook ofProteolytic Enzymes[蛋白水解酶手册],A.J.Barrett,N.D.Rawlings,J.F.Woessner(编辑),Academic Press[学术出版社](1998)，特别是概述部分。
在优选的实施例中，根据本发明使用的热稳定的蛋白酶是“金属蛋白酶”，其定义为属于EC 3.4.24(金属内肽酶)；优选EC 3.4.24.39(酸性金属蛋白酶)。
为了确定给定的蛋白酶是否是金属蛋白酶，参照上述“Handbook of ProteolyticEnzymes[蛋白水解酶手册]”以及其中指示的原则。可以对所有类型的蛋白酶进行这样的确定，而不论其是天然存在的或野生型蛋白酶；还是基因工程化的或合成的蛋白酶。
可以使用任何适合的测定来测量蛋白酶活性，其中采用一种底物，该底物包括与所讨论的蛋白酶的特异性相关的肽键。测定pH值和测定温度同样适用于所讨论的蛋白酶。测定pH值的实例是pH 6、7、8、9、10或11。测定温度的实例是30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃或80℃。
蛋白酶底物的实例为酪蛋白，例如Azurine-Crosslinked Casein(天青精交联的酪蛋白，AZCL-酪蛋白)。参见“材料与方法”一节中的测定
在一个实施例中，蛋白酶是真菌来源的。
蛋白酶可以是例如野生型蛋白酶的变体。在一个优选实施例中，蛋白酶是金属蛋白酶的热稳定的变体。在一个实施例中，在本发明的方法中使用的热稳定的α-淀粉酶是真菌来源的，例如真菌金属蛋白酶，例如源自嗜热子囊菌属(Thermoascus)的菌株，优选橙色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)的菌株，尤其是橙色嗜热子囊菌CGMCC No.0670(分类为EC 3.4.24.39)。
在一个实施例中，热稳定的蛋白酶是橙色嗜热子囊菌CGMCC No.0670蛋白酶的变体。合适的蛋白酶变体在WO 2011/072191中披露，包括实施例1的表1-6中披露的变体，该专利通过引用并入本文。在一个优选的实施例中，蛋白酶是WO 2010/008841中的SEQ ID NO:1和本文的SEQ ID NO:7所示的金属蛋白酶的成熟部分的热稳定的变体，进一步地具有选自以下列表的突变：
D79L+S87P+A112P+D142L；
D79L+S87P+D142L；或
A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L。
在一个实施例中，蛋白酶变体与WO 2010/008841中的SEQ ID NO:1的多肽的成熟部分或本文的SEQ ID NO:7具有至少75％的同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％的同一性。
在一个实施例中，蛋白酶是细菌来源的。
在一个优选的实施例中，蛋白酶是源自热球菌属(Pyrococcus)细菌的菌株、如激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)的菌株的热稳定蛋白酶。
在一个实施例中，蛋白酶是如美国专利号6,358,726-B1(宝酒造公司(TakaraShuzo Company))中的SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:8所示的一种。
在另一个实施例中，(热稳定的)蛋白酶是在本文的SEQ ID NO:8所披露的蛋白酶，或是与美国专利号6,358,726-B1中的SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:8具有至少70％同一性、如至少80％、如至少85％、如至少90％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％或100％序列同一性的蛋白酶。
步骤(a)和/或(b)中存在和/或添加的葡糖淀粉酶
根据本发明，葡糖淀粉酶可任选地在步骤(a)和/或(b)中存在和/或添加。在一个优选的实施例中，葡糖淀粉酶与α-淀粉酶和/或蛋白酶一起添加或分开添加。在一个实施例中，葡糖淀粉酶是热稳定的葡糖淀粉酶，例如在85℃下具有至少20％、至少30％、优选至少35％的相对活性热稳定性的葡糖淀粉酶，如WO 2011/127802(通过引用并入本文)的实例4(热稳定性)中所描述进行测定。
在一个优选的实施例中，葡糖淀粉酶是源自青霉菌属(Penicillium)的菌株的葡糖淀粉酶，如本文的SEQ ID NO:9所示的葡糖淀粉酶。
所设想到的本文的SEQ ID NO:9的草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)葡糖淀粉酶变体包括WO 2013/053801(通过引用并入本文)中披露的葡糖淀粉酶变体。具体实例包括包含以下取代的组合中的至少一个组合的葡糖淀粉酶变体：
P11F+T65A+Q327F；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或
P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T。
该葡糖淀粉酶能以0.1-100微克EP/g，如0.5-50微克EP/g，如1-25微克EP/g，如2-12微克EP/g DS的量添加。
糖化步骤(c)和/或发酵步骤(d)中存在和/或添加的产碳水化合物源的酶
根据本发明，在糖化步骤(c)和/或发酵步骤(d)期间存在和/或添加产碳水化合物源的酶。
在优选的实施例中，产碳水化合物源的酶是真菌起源的葡糖淀粉酶，优选来自曲霉属，优选黑曲霉、泡盛曲霉、或米曲霉的菌株；或木霉属的菌株，优选里氏木霉；或篮状菌属的菌株，优选埃默森篮状菌(T.emersonii)，或粘褶菌属的菌株，优选篱边粘褶菌或密粘褶菌；或密孔菌属(Pycnoporus)的菌株，优选血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)。
葡糖淀粉酶
根据本发明，糖化步骤(b)和/或发酵步骤(d)中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶可源自任何适合的来源，例如，源自微生物或植物。优选的葡糖淀粉酶是真菌或细菌来源的，选自由以下组成的组：曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等人,1984,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]3(5),第1097-1102页)，或其变体，如WO 92/00381、WO 00/04136和WO 01/04273中披露的那些(来自诺维信公司(Novozymes)，丹麦)；WO84/02921中披露的泡盛曲霉葡糖淀粉酶；米曲霉葡糖淀粉酶(Agric.Biol.Chem.[农业与生物化学](1991),55(4),第941-949页)，或其变体或片段。其他曲霉属葡糖淀粉酶变体包括具有增强的热稳定性的变体：G137A和G139A(Chen等人(1996),Prot.Eng.[蛋白质工程]9,499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等人(1995),Prot.Eng.[蛋白质工程]8,575-582)；N182(Chen等人(1994),Biochem.J.301[生物化学杂志],275-281)；二硫键、A246C(Fierobe等人,1996,Biochemistry[生物化学],35:8698-8704)；和在A435和S436位置引入Pro残基(Li等人,1997,Protein Engng.[蛋白质工程]10,1199-1204)。
其他葡糖淀粉酶包括罗耳阿太菌(Athelia rolfsii)(以前命名为罗尔伏革菌(Corticium rolfsii))葡糖淀粉酶(参见美国专利号4,727,026和Nagasaka等人(1998)“Purification and properties of the raw-starch-degrading glucoamylases fromCorticium rolfsii[来自罗尔伏革菌的粗淀粉降解葡糖淀粉酶的纯化及性质]”Appl.Microbiol.Biotechnol.[应用微生物学与生物技术]50:323-330)，篮状菌属葡糖淀粉酶，特别是源自埃默森篮状菌(WO 99/28448)、雷塞氏篮状菌(美国专利号Re.32,153)、杜氏篮状菌(Talaromyces duponti)、以及嗜热篮状菌(美国专利号4,587,215)。在一个优选的实施例中，糖化和/或发酵中使用的葡糖淀粉酶是WO 99/28448中作为SEQ ID NO:34(通过引用并入本文)披露的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶。
设想到的真菌葡糖淀粉酶包括均在WO 2006/069289中披露的瓣环栓菌，纸质大纹饰孢(Pachykytospora papyracea)；和大白桩蘑(Leucopaxillus giganteus)；和WO2007/124285中披露的红边隔孢伏革菌(Peniophora rufomarginata)；或其混合物。根据本发明还涵盖杂合葡糖淀粉酶。实例包括WO 2005/045018中披露的杂合葡糖淀粉酶。具体实例包括实例1的表1和表4中披露的杂合葡糖淀粉酶(这些杂合体通过引用特此并入)。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶源自密孔菌属的菌株，特别地如WO 2011/066576中所描述的密孔菌属的菌株(SEQ ID NO 2、4或6)；或源自粘褶菌属的菌株，特别地如WO2011/068803中所描述的粘褶菌属的菌株(SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14或16)或黑层孔属的菌株，特别地如WO 2012/064351中作为SEQ ID NO:2披露的黑层孔属物种的菌株(所有参考文献通过引用特此并入本文)。
还设想到了与上述酶序列的成熟部分中的任一个具有至少60％，如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％序列同一性的葡糖淀粉酶。
在一个实施例中，糖化步骤(c)和/或发酵步骤(d)中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶进一步包含α-淀粉酶。在优选的实施例中，α-淀粉酶是真菌α-淀粉酶，尤其是酸性真菌α-淀粉酶。
在一个实施例中，葡糖淀粉酶是一种共混物，包含WO 99/28448中作为SEQ ID NO:34披露的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶和在WO 2006/069289中作为SEQ ID NO:2以及本文作为SEQ ID NO:1披露的瓣环栓菌葡糖淀粉酶。
在一个实施例中，葡糖淀粉酶是一种共混物，其包含WO 99/28448中作为SEQ IDNO:34披露的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶、在WO 06/69289中作为SEQ ID NO:2和本文作为SEQID NO:1披露的瓣环栓菌葡糖淀粉酶、以及在WO 2006/069290的表5中作为V039和本文作为SEQ ID NO:2披露的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶。
在一个实施例中，葡糖淀粉酶是一种共混物，其包含WO 99/28448中作为SEQ IDNO:34披露的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶、WO 2006/69289中披露和在本文中作为SEQ ID NO:1披露的瓣环栓菌葡糖淀粉酶，以及在WO 2006/069290的表5中作为V039或本文中作为SEQID NO:2披露的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶。
在一个实施例中，葡糖淀粉酶是一种共混物，其包含在WO 2011/068803中作为SEQID NO:2所示的篱边粘褶菌(Gloeophyllum sepiarium)葡糖淀粉酶以及WO 2013/006756的SEQ ID NO:3和本文的SEQ ID NO:2披露的、具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合域(SBD)、并具有以下取代的微小根毛霉：G128D+D143N。
还设想到这样的实施例，其中α-淀粉酶源自根毛霉属的菌株，优选微小根毛霉，如WO 2013/006756中的SEQ ID NO:3所示的α-淀粉酶，或者具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合域(SBD)的微小根毛霉α-淀粉酶具有以下取代或取代的组合中的至少一者：D165M；Y141W；Y141R；K136F；K192R；P224A；P224R；S123H+Y141W；G20S+Y141W；A76G+Y141W；G128D+Y141W；G128D+D143N；P219C+Y141W；N142D+D143N；Y141W+K192R；Y141W+D143N；Y141W+N383R；Y141W+P219C+A265C；Y141W+N142D+D143N；Y141W+K192R V410A；G128D+Y141W+D143N；Y141W+D143N+P219C；Y141W+D143N+K192R；G128D+D143N+K192R；Y141W+D143N+K192R+P219C；G128D+Y141W+D143N+K192R；或G128D+Y141W+D143N+K192R+P219C(使用WO 2013/006756中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ ID NO:2进行编号)。
在一个优选的实施例中，葡糖淀粉酶共混物包含篱边粘褶菌葡糖淀粉酶(例如，WO2011/068803中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:15)和微小根毛霉α-淀粉酶。
在一个优选的实施例中，葡糖淀粉酶共混物包含如在WO 2011/068803中作为SEQID NO:2或本文的SEQ ID NO:15所示的篱边粘褶菌葡糖淀粉酶，以及WO 2013/006756的SEQID NO:3和本文的SEQ ID NO:16披露的、具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)、并具有以下取代的微小根毛霉：G128D+D143N。
在实施例中，葡糖淀粉酶可以按如下量添加到糖化和/或发酵中：0.0001-20AGU/gDS，优选0.001-10AGU/g DS，尤其是在0.01-5AGU/g DS之间，例如0.1-2AGU/g DS。
包含葡糖淀粉酶的可商购产品包括AMG 200L；AMG 300L；SANTMSUPER、SANTMEXTRAL、SPIRIZYMETMPLUS、SPIRIZYMETMFUEL、SPIRIZYMETMB4U、SPIRIZYMETMULTRA、SPIRIZYMETMEXCEL、SPIRIZYME ACHIEVETM和AMGTME(来自诺维信公司(Novozymes A/S))。
糖化步骤(c)和/或发酵步骤(d)中存在和/或添加的纤维素分解组合物
根据本发明，在糖化步骤(c)、发酵步骤(d)或同时糖化发酵(SSF)中可存在和/或添加纤维素分解组合物。
纤维素分解组合物包括β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶。
合适的纤维素分解组合物的实例可见于WO 2008/151079、WO 2011/057140和WO2013/028928中，这些专利通过引用并入本文。
在实施例中，纤维素分解组合物源自木霉属(Trichoderma)、腐质霉属(Humicola)或金孢子菌属(Chrysosporium)的菌株。
在优选的实施例中，纤维素分解组合物源自里氏木霉(Trichoderma reesei)、特异腐质霉(Humicola insolens)和/或卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporiumlucknowense)。
在一个优选的实施例中，纤维素分解组合物源自里氏木霉的菌株。
在实施例中，该纤维素分解组合物以0.0001-3mg EP/g DS，优选0.0005-2mg EP/gDS，优选0.001-1mg/g DS，更优选0.005-0.5mg EP/gDS，并且甚至更优选0.01-0.1mg EP/gDS剂量添加。
在以下段落中进一步总结了本发明：
1.一种从含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括：
(a)形成包含该含淀粉材料和水的浆料；
(b)用α-淀粉酶将该含淀粉材料转化为糊精；
(c)使用产碳水化合物源的酶糖化这些糊精以形成糖；
(d)使用发酵生物发酵这些糖；
(e)回收发酵产物以形成全酒糟；
(f)将该全酒糟分离为液体级分酒糟水和固体级分湿滤饼；
(g)水解该酒糟水；
(h)将一部分经水解的该酒糟水再循环到步骤(a)；
其中在步骤(g)中使用葡糖淀粉酶和/或聚半乳糖醛酸酶水解该酒糟水。
2.如段落1所述的方法，其中没有被再循环的那部分经水解的该酒糟水(即作为回糟)可进行蒸发形成糖浆和冷凝物。
3.如段落2所述的方法，其中该冷凝物被再循环到步骤(a)。
4.如段落1-3中任一项所述的方法，其中5vol％-90vol％之间、如10％-80％之间、如15％-70％之间、如20％-60％之间的该经水解的酒糟水被再循环到步骤(a)。
5.如段落1-4中任一项所述的方法，其中该被再循环的经水解的该酒糟水(即，回糟)占步骤(a)中形成的浆料的约1vol.％-70vol.％、优选15vol.％-60vol.％、尤其是从约30vol.％至50vol.％。
6.如段落1-5中任一项所述的方法，其中步骤(c)和步骤(d)同时进行或相继地进行。
7.如段落1-6中任一项所述的方法，其中步骤(a)中添加α-淀粉酶。
8.如段落1-7中任一项所述的方法，其中在步骤(g)中用葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)、优选GH15酶、特别是源自栓菌属(Trametes)如瓣环栓菌(Trametescingulata)的葡糖淀粉酶、尤其是本文SEQ ID NO:1所示的葡糖淀粉酶来水解该酒糟水。
9.如段落8所述的方法，其中该葡糖淀粉酶与本文SEQ ID NO:1具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％序列同一性。
10.如段落1-9中任一项所述的方法，其中在步骤(g)中用α-淀粉酶水解该酒糟水，该α-淀粉酶特别是真菌酸性α-淀粉酶活性，如根毛霉属(Rhizomucor)α-淀粉酶，如微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)的菌株，如具有淀粉结合域(SBD)的微小根毛霉α-淀粉酶，如具有接头和SBD特别是黑曲霉(Aspergillus niger)葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶，具体地是本文SEQ ID NO:2所示的α-淀粉酶。
11.如段落10所述的方法，其中该真菌酸性α-淀粉酶与本文SEQ ID NO:2具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％序列同一性。
12.如段落1-11中任一项所述的方法，其中在步骤(g)中用于水解该酒糟水的聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)优选地源自曲霉属(Aspergillus)的菌株，特别是棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的菌株。
13.如段落1-12中任一项所述的方法，进一步地其中在步骤(g)中用普鲁兰酶(E.C.3.2.1.41)来水解该酒糟水，该普鲁兰酶特别是源自芽孢杆菌属(Bacillus)如脱支芽孢杆菌的菌株的普鲁兰酶，特别是本文SEQ ID NO:3所示的普鲁兰酶。
14.如段落13所述的方法，其中该普鲁兰酶与本文SEQ ID NO:3具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％序列同一性。
15.如段落1-14中任一项所述的方法，进一步地其中在步骤(g)中用昆布多糖酶(E.C.3.2.1.6)来水解该酒糟水，该昆布多糖酶特别是源自曲霉属的菌株，如曲霉属的菌株，例如棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、白曲霉(Aspergillus kawachii)或黑曲霉(Aspergillus niger)或塔宾曲霉(Aspergillustubigensis)的菌株，或者源自嗜热子囊菌属(Thermoascus)、例如坚脆嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceus)的菌株。
16.如段落1-15中任一项所述的方法，其中在步骤(g)中用葡糖淀粉酶和α-淀粉酶的组合来水解该酒糟水。
17.如段落1-16中任一项所述的方法，其中在步骤(g)中用葡糖淀粉酶和普鲁兰酶的组合来水解该酒糟水。
18.如段落1-17中任一项所述的方法，其中在步骤(g)中用聚半乳糖醛酸酶和昆布多糖酶的组合来水解该酒糟水。
19.如段落1-18中任一项所述的方法，其中在步骤(g)中，在20℃-80℃范围内、如30℃-70℃范围内、特别是40℃-60℃范围内、尤其是50℃左右的温度下水解该酒糟水。
20.如段落1-19中任一项所述的方法，其中该酒糟水的干固体(DS)含量在10％-50％(W/W)的范围内，如在20％-45％(w/w)的范围内，特别是在30％-40％(w/w)的范围内，尤其是在35％(w/w)左右。
21.如段落1-20中任一项所述的方法，其中在步骤(g)中，将该酒糟水水解0.1-10小时，如1-5小时，特别是2小时左右。
22.如段落1-21中任一项所述的方法，其中方法流程与本文图1所示的方法流程相似或相同。
23.如段落1-22中任一项所述的方法，其中在步骤(a)和/或步骤(b)中存在和/或添加蛋白酶。
24.如段落1-23中任一项所述的方法，其中步骤(b)中的温度高于初始糊化温度，如在70℃-100℃之间，如在80℃-90℃之间，如85℃左右。
25.如段落1-24中任一项所述的方法，其中在步骤(b)之前且在步骤(a)之后进行喷射蒸煮步骤。
26.如段落25所述的方法，其中喷射蒸煮在95℃-140℃之间的温度下进行约1-15分钟，优选进行约3-10分钟，尤其是约5分钟左右。
27.如段落1-26中任一项所述的方法，其中步骤(a)和/或(b)中的pH为4-7，优选4.5-6.5，特别是5-6之间。
28.如段落1-27中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的温度为40℃-60℃。
29.如段落1-29中任一项所述的方法，在步骤(a)之前，进一步包括以下步骤：将该含淀粉材料的粒度减少，优选地通过干磨(例如通过锤磨)来减少。
30.如段落1-29中任一项所述的方法，在糖化步骤(c)之前，进一步包括预糖化步骤(b’)，在30℃-65℃之间的温度下进行40-90分钟。
31.如段落1-30中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的糖化是在从20℃-75℃、优选从40℃-70℃、如60℃左右的温度下，并且在4-5之间的pH下进行。
32.如段落1-31中任一项所述的方法，其中发酵步骤(d)或同时糖化发酵(SSF)(即，步骤(c)和(d))在从25℃-40℃，如从28℃-35℃、如从30℃-34℃、优选约32℃左右的温度下进行。
33.如段落1-32中任一项所述的方法，其中发酵步骤(d)或同时糖化发酵(SSF)(即，步骤(c)和(d))持续6-120小时，特别是24-96小时。
34.如段落1-33中任一项所述的方法，其中步骤(b)(即，液化)进行0.1-12小时，如1-5小时。
35.如段落1-34中任一项所述的方法，其中步骤(b)(即，液化)用细菌α-淀粉酶、如细菌α-淀粉酶、特别是脂肪嗜热芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)α-淀粉酶、如本文SEQ ID NO:4所示的α-淀粉酶或其变体来进行。
36.如段落1-35中任一项所述的方法，其中步骤(f)中的分离通过离心、优选倾滗式离心机，过滤、优选使用压滤机、螺旋压榨机、板框压榨机，重力浓缩机或脱水机(decker)来进行。
37.如段落1-36中任一项所述的方法，其中该含淀粉材料是谷类。
38.如段落1-37中任一项所述的方法，其中该含淀粉材料选自由以下组成的组：玉米、小麦、大麦、木薯、高粱、黑麦、马铃薯、豆类、蜀黍、豌豆、稻、西米、甜薯、木薯粉、燕麦或它们的任何组合。
39.如段落1-38中任一项所述的方法，其中该发酵产物选自由以下组成的组：醇(例如，乙醇、甲醇、丁醇、1,3-丙二醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸、葡糖酸盐、乳酸、丁二酸、2,5-二酮-D-葡糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H2和CO2)，和更复杂的化合物，包括例如抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B12、β-胡萝卜素)；和激素。
40.如段落1-39中任一项所述的方法，其中该发酵产物是乙醇。
本文所描述和要求保护的发明并不局限于本文披露的具体实施例的范围，因为这些实施例旨在作为本发明的几个方面的例示性说明。任何等同的实施例都旨在处于本发明的范围之内。实际上，除了本文所示和描述的那些之外，本发明的各种修改因前述说明而对本领域的技术人员变得清楚。此类修改也旨在落入所附权利要求的范围内。在冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。本文引用了多个参考，其披露内容通过引用以其全部内部并入本文。进一步通过以下实例来描述本发明，这些实例不应理解为限制本发明的范围。
材料与方法
葡糖淀粉酶共混物10(GAB10)是瓣环栓菌(Trametes cingulata)葡糖淀粉酶(本文的SEQ ID NO:1)和微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)α-淀粉酶(本文的SEQ ID NO:2)的共混物(比率大约为10:1)
葡糖淀粉酶TC(GATC)：瓣环栓菌葡糖淀粉酶(本文的SEQ ID NO:1)
葡糖淀粉酶DX(GADX)：黑曲霉(Aspergillus niger)葡糖淀粉酶(本文的SEQ IDNO:5)和脱支芽孢杆菌普鲁兰酶(本文的SEQ ID NO:3)(AGU:NPUN比率1:2)
昆布多糖酶AC(LAC)：棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)昆布多糖酶(E.C.3.2.1.6)，具有聚半乳糖醛酸酶和半纤维素副活性。
聚半乳糖醛酸酶UF(PGUF)：棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)聚半乳糖醛酸酶。
酵母：
ETHANOL REDTM：从美国富酶泰斯公司/乐斯福公司(Fermentis/Lesaffre)获得的酿酒酵母。
方法
同一性：参数“同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。
出于本发明的目的，可以通过程序“比对”确定两个氨基酸序列之间的同一性程度以及两个核苷酸序列之间的同一性程度，该程序是尼德尔曼-翁施比对(Needleman-Wunschalignment)(即总体对比)。使用该程序进行多肽以及核苷酸序列的比对。使用缺省评分矩阵BLOSUM50进行多肽比对，以及使用缺省同一性矩阵进行核苷酸比对。对多肽而言，缺口第一个残基的罚分为-12，对核苷酸而言该罚分为-16。对多肽而言，缺口另外残基的罚分为-2，对核苷酸而言该罚分为-4。
“比对”是FASTA包版本v20u6的一部分(参见W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988),“Improved Tools for Biological Sequence Analysis[用于生物序列分析的改进的工具]”,PNAS 85:2444-2448，和W.R.Pearson(1990)“Rapid and Sensitive SequenceComparison with FASTP and FASTA[使用FASTP和FASTA进行的快速且灵敏的序列比较]”Methods in Enzymology[酶学方法]183:63-98)。FASTA蛋白比对使用史密斯-沃特曼算法(Smith-Waterman algorithm)进行，对缺口大小没有限制(参见“Smith-Watermanalgorithm[史密斯-沃特曼算法]”,T.F.Smith和M.S.Waterman(1981)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]147:195-197)。
蛋白酶测定
AZCL-酪蛋白测定
边搅拌边将蓝色底物AZCL-酪蛋白的0.2％溶液悬浮于pH 9的Borax/NaH2PO4缓冲液中。边搅拌边将该溶液分散在微量滴定板(每孔100微升)上，添加30微升酶样品并且将这些板在艾本德热混器(Eppendorf Thermomixer)中在45℃和600rpm下孵育持续30分钟。使用变性的酶样品(100℃煮沸持续20分钟)作为空白对照。孵育之后通过将微量滴定板转移到冰上来终止该反应并且通过在4℃以3000rpm离心持续5分钟将着色的溶液与固体分离。将60微升的上清液转移到微量滴定板并且使用伯乐酶标仪(BioRad Microplate Reader)测量在595nm处的吸光度。
葡糖淀粉酶活性(AGU)
能以葡糖淀粉酶单位(AGU)来测量葡糖淀粉酶活性。
诺维信葡糖淀粉酶单位(AGU)被定义为在以下标准条件下每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶的量：37℃，pH 4.3，底物：麦芽糖23.2mM，缓冲液：乙酸盐0.1M，反应时间5分钟。
可使用自动分析仪***。将变旋酶添加到葡萄糖脱氢酶试剂中，使得存在的任何α-D-葡萄糖变为β-D-葡萄糖。葡萄糖脱氢酶在以上提到的反应中与β-D-葡萄糖特异性地反应，形成NADH，使用光度计在340nm下测定该NADH作为原始葡萄糖浓度的量度。
AMG孵育：
底物： 麦芽糖23.2mM
缓冲液： 乙酸盐0.1M
pH： 4.30±0.05
孵育温度： 37℃±1℃
反应时间： 5分钟
酶工作范围： 0.5-4.0AGU/mL
显色反应：
GlucDH： 430U/L
变旋酶： 9U/L
NAD： 0.21mM
缓冲液： 磷酸盐0.12M；0.15M NaCl
pH： 7.60±0.05
孵育温度： 37℃±1℃
反应时间： 5分钟
波长： 340nm
更详细描述这种分析方法的文件夹(EB-SM-0131.02/01)可以从丹麦的诺维信公司索取获得，将该文件夹通过引用特此包括在内。
酸性α-淀粉酶活性(AFAU)
能以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)测量酸性α-淀粉酶活性，其相对于酶标准品确定。1AFAU定义为在下述标准条件下每小时降解5.260mg淀粉干物质的酶量。
酸性α-淀粉酶，其为内切α-淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)，水解淀粉分子内部区域中的α-1,4-糖苷键以形成具有不同链长的糊精和寡糖。与碘形成的颜色的强度和淀粉浓度成正比。使用反向比色法在指定的分析条件下将酶活性确定为淀粉浓度的降低。
Figure BDA0003290675420000311
标准条件/反应条件：
Figure BDA0003290675420000312
更详细地描述这种分析方法的文件夹EB-SM-0259.02/01可以从丹麦的诺维信公司索取得到，通过引用将该文件夹包括在此。
α-淀粉酶活性(KNU)
可以使用马铃薯淀粉作为底物确定α-淀粉酶活性。此方法是基于由酶分解改性的马铃薯淀粉，并且该反应通过将淀粉/酶溶液的样品与碘溶液混合来追踪。最初形成黑蓝色，但淀粉分解期间蓝色变弱并且逐渐变为红褐色，将其与有色玻璃标准品比较。
1个Kilo Novoα-淀粉酶单位(KNU)定义为在标准条件(即，在37℃+/-0.05；0.0003M Ca2+；和pH 5.6下)下，糊精化5260mg淀粉干物质默克公司(Merck)可溶性淀粉的酶量。
更详细地描述这种分析方法的文件夹EB-SM-0009.02/01可以从丹麦的诺维信公司索取获得，将该文件夹通过引用特此包括在内。
α-淀粉酶活性(KNU-A)
相对于已知强度的酶标准品，以KNU(A)千诺维信单位(A)测量α淀粉酶活性。
样品中的α淀粉酶和试剂盒中的α-葡糖苷酶将底物(4,6-亚乙基(G7)-对硝基苯基(G1)-α,D-麦芽庚糖苷(亚乙基-G7PNP))水解成葡萄糖和黄色的对硝基苯酚。
通过Konelab 30观察对硝基苯酚的形成速率。这是反应速率及由此酶活性的表达。
Figure BDA0003290675420000321
该酶是具有酶分类号EC 3.2.1.1的α-淀粉酶。
Figure BDA0003290675420000331
关于确定KNU-A活性的文件夹EB-SM-5091.02-D可从丹麦诺维信公司索取获得，将该文件夹通过引用特此包括在内。
FAU(F)的测定
相对于已知强度的酶标准品测量FAU(F)真菌α-淀粉酶单位(Fungal Alpha-Amylase Units(Fungamyl))。
Figure BDA0003290675420000332
更详细描述这种标准方法的文件夹(EB-SM-0216.02)可以从丹麦的诺维信公司索取获得，将该文件夹通过引用特此包括在内。
支链淀粉酶活性(NPUN)的确定
相对于诺维信支链淀粉酶标准品测量NPUN中的内切-支链淀粉酶活性。一个支链淀粉酶单位(NPUN)定义为在标准条件(0.7％红色普鲁兰(red pullulan)(麦格酶公司(Megazyme)，pH 5，40℃，20分钟)下每分钟释放1微摩尔葡萄糖的酶量。使用红色普鲁兰以NPUN/ml测量该活性。
将1mL稀释的样品或标准品在40℃孵育2分钟。添加0.5mL 2％红色普鲁兰、0.5MKCl、50mM柠檬酸(pH 5)并混合。将管在40℃下孵育20分钟并且通过添加2.5ml 80％乙醇终止。将管在室温下静置10-60分钟，随后以4000rpm离心10分钟。然后在510nm下测量上清液的OD并使用标准曲线计算活性。
本发明将在以下实例中进行更详细的描述，这些实例被提供用以说明本发明而决不意图限制本发明要求的范围。本文引用的所有参考文献针对在本文中进行的描述通过引用具体结合。
实例1
本实验研究了使用酶促水解的酒糟水作为回糟再循环到乙醇方法的前端时对乙醇产率的影响。
实验程序
向干磨乙醇厂工业生产的浓缩糖浆(即经蒸发的酒糟水)添加3ppm青霉素和500ppm尿素，并用40％v/v H2SO4调节至pH 5。梅特勒－托利多(Mettler-Toledo)卤素水分天平(HB43S)测出干固体含量为34.10％。将大约5g的该工业醪液添加至15mL锥形离心管(Fisher)。每个实验重复进行4次：所有4个处理均进行50小时后进行HPLC分析。根据产品规格(表1)投加酶，并使用以下方程求出待添加至发酵中的原液的体积。
Figure BDA0003290675420000341
将水投加每个样品中，使得每个处理的总添加体积相等。
表1.酶剂量
Figure BDA0003290675420000342
Figure BDA0003290675420000351
向各根管投加酶，在50℃下温育2小时，每隔15分钟漩涡混合。温育后，让各根管冷却，然后加入酵母开始发酵。每根管投加100μl的再水化酵母泥(5.5g Fermentis ETHANOLRED酵母于100mL 35℃自来水中在32℃下温育30分钟)。加入酵母后，将各根管在水浴中在32℃下温育。各根管每天漩涡混合两次。温育后，加入50μl的40％v/v H2SO4停止样品的反应，在具有转子GH3.8的Beckman Coulture台式离心机(Allegra 6R)中在1570x g(3000rpm)下离心10分钟，然后通过0.45μm针头过滤器(Whatman)过滤到HPLC小瓶中，放入1.5ml艾本德管(Eppendorf)管。将各样品再次在Microfuge 18(Beckman Coulture)中在18000x g(14000rpm)下离心10分钟，以去除更多的颗粒物。将各样品在流动性缓冲液(5mMH2SO4)中进行1:2稀释，然后送去进行HPLC分析。
HPLC分析：
Figure BDA0003290675420000352
该方法使用针对糊精(DP4+)、麦芽三糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖、乙酸、乳酸、甘油以及乙醇的校准标准品对若干种分析物进行定量。使用4点校准(包括原点)。
乙醇发酵的结果在图2中显示。
Figure IDA0003290675470000011
Figure IDA0003290675470000021
Figure IDA0003290675470000031
Figure IDA0003290675470000041
Figure IDA0003290675470000051
Figure IDA0003290675470000061
Figure IDA0003290675470000071
Figure IDA0003290675470000081
Figure IDA0003290675470000091
Figure IDA0003290675470000101
Figure IDA0003290675470000111
Figure IDA0003290675470000121
Figure IDA0003290675470000131
Figure IDA0003290675470000141
Figure IDA0003290675470000151
Figure IDA0003290675470000161
Figure IDA0003290675470000171
Figure IDA0003290675470000181
Figure IDA0003290675470000191

Claims (23)

1.一种从含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括：
(a)形成包含该含淀粉材料和水的浆料；
(b)用α-淀粉酶将该含淀粉材料转化为糊精；
(c)使用产碳水化合物源的酶糖化这些糊精以形成糖；
(d)使用发酵生物发酵这些糖；
(e)回收发酵产物以形成全酒糟；
(f)将该全酒糟分离为液体级分酒糟水和固体级分湿滤饼；
(g)水解该酒糟水；
(h)将一部分经水解的该酒糟水再循环到步骤(a)；
其中在步骤(g)中使用葡糖淀粉酶和/或聚半乳糖醛酸酶水解该酒糟水。
2.如权利要求1所述的方法，其中将没有被再循环的那部分经水解的酒糟水(即作为回糟)进行蒸发形成糖浆和冷凝物。
3.如权利要求2所述的方法，其中该冷凝物被再循环到步骤(a)。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中将5vol％-90vol％之间、如10％-80％之间、如15％-70％之间、如20％-60％之间的经水解的该酒糟水作为回糟再循环到步骤(a)。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中再循环的经水解的该酒糟水(即，回糟)占步骤(a)中形成的浆料的约1vol.％-70vol.％、优选15vol.％-60vol.％、尤其是从约30vol.％至50vol.％。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中步骤(c)和步骤(d)同时进行或相继地进行。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中在步骤(a)中添加α-淀粉酶。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中在步骤(g)中用葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)、优选GH15酶、特别是源自栓菌属如瓣环栓菌的葡糖淀粉酶、尤其是本文SEQID NO:1所示的葡糖淀粉酶来水解该酒糟水。
9.如权利要求8所述的方法，其中该葡糖淀粉酶与本文SEQ ID NO:1具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％序列同一性。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，进一步地，其中在步骤(g)中用α-淀粉酶水解该酒糟水，该α-淀粉酶特别是真菌酸性α-淀粉酶活性，如根毛霉属α-淀粉酶，如微小根毛霉的菌株，如具有淀粉结合域(SBD)的微小根毛霉α-淀粉酶，如具有接头和SBD特别是黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶，具体地是本文SEQ ID NO:2所示的α-淀粉酶。
11.如权利要求10所述的方法，其中该真菌酸性α-淀粉酶与本文SEQ ID NO:2具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％序列同一性。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中在步骤(g)中用于水解该酒糟水的聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)优选地源自曲霉属的菌株，例如棘孢曲霉、烟曲霉、白曲霉或黑曲霉或塔宾曲霉的菌株，或者源自嗜热子囊菌属、例如坚脆嗜热子囊菌的菌株。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，进一步地，其中在步骤(g)中用普鲁兰酶(E.C.3.2.1.41)来水解该酒糟水，该普鲁兰酶特别是源自芽孢杆菌属如脱支芽孢杆菌的菌株的普鲁兰酶，特别是本文SEQ ID NO:3所示的普鲁兰酶。
14.如权利要求13所述的方法，其中该普鲁兰酶与本文SEQ ID NO:3具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％序列同一性。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，进一步地，其中在步骤(g)中用昆布多糖酶(E.C.3.2.1.6)来水解该酒糟水，该昆布多糖酶特别是源自曲霉属的菌株，如棘孢曲霉的菌株。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中在步骤(g)中用葡糖淀粉酶和α-淀粉酶的组合水解该酒糟水。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中在步骤(g)中用葡糖淀粉酶和普鲁兰酶的组合水解该酒糟水。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中在步骤(g)中用聚半乳糖醛酸酶和昆布多糖酶的组合水解该酒糟水。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中在步骤(g)中，在20℃-80℃范围内、如30℃-70℃范围内、特别是40℃-60℃范围内、尤其是50℃左右的温度下水解该酒糟水。
20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中该酒糟水的干固体(DS)含量在10％-50％(W/W)的范围内，如在20％-45％(w/w)的范围内，特别是在30％-40％(w/w)的范围内，尤其是在35％(w/w)左右。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中在步骤(g)中，将该酒糟水水解0.1-10小时，如1-5小时，特别是2小时左右。
22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中方法流程与本文图1所示的方法流程相似或相同。
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中在步骤(a)和/或(b)中存在和/或添加蛋白酶。
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