JP5767438B2 - 粒状でんぷんからエタノールへの転化方法 - Google Patents
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Description
a)植物原料から得られる粒状でんぷんを含むスラリーとアルファ−アミラーゼとを、前記粒状でんぷんのでんぷんゼラチン化温度未満の温度で接触させ、オリゴ糖を生成する工程、及び内生植物の糖質加水分解酵素によりオリゴ糖を加水分解する工程、及び
b)少なくとも10%のグルコースを含むマッシュを生成する工程を含む。
a)粒状でんぷんを含むスラリーと、粒状でんぷんを可溶化するアルファ−アミラーゼとを接触させる工程であって、前記接触がpH3.5からpH7.0、前記粒状でんぷんのでんぷんゼラチン化温度未満の温度で、5分間から24時間行われ、20%より多いグルコースを含むマッシュ基質を得る工程、及び
b)発酵微生物及びでんぷん加水分解酵素の存在下、10℃から40℃の温度で、10時間から250時間基質を発酵し、エタノールを生成する工程
を含む。さらに上述のいずれかの態様の実施形態において、当該方法は、エタノールの回収を含む。またさらに上記態様の別の実施形態において、当該方法は、列挙される工程の最初、途中、又は最後のいずれの段階で行われるか特定されない追加的な工程を含むことが出来る。
「発酵」の語は、微生物による有機物質の酵素的及び嫌気的分解を示し、それにより、より単純な有機化合物が生成される。発酵は嫌気的条件下で起こる一方、厳密な嫌気的条件にその語が専ら限定されることは意図されず、酸素存在下でも発酵は起こる。
粒状でんぷん−
粒状でんぷんは、小麦、コーン、ライムギ、ソルガム(ミロ)、米、キビ、大麦、ライ小麦、キャッサバ(タピオカ)、ジャガイモ、サツマイモ、サトウダイコン、サトウキビ、及び大豆及びエンドウ豆等のマメ科植物を含むが、限定されない植物原料から得られることが出来る。好ましい植物原料は、コーン、大麦、小麦、米、ミロ及びそれらの組み合わせを含む。特に好ましい植物原料は、コーン(トウモロコシ)から得られる。植物原料は、ハイブリッド品種及び遺伝仕組み換えの品種(例えば、異種遺伝子を含む遺伝子組み換えコーン、大麦又は大豆)を含み得る。葉、幹、殻、外皮、塊茎、穂軸、粒等の植物部位を含むがこれらに限られない植物のいずれの部分も粒状でんぷんの提供に使用され得る。いくつかの実施形態において、例えば、コーンわらの全体が使用され得るように、本質的に植物全体が使用され得る。1つの実施形態において、全穀は粒状でんぷん源として使用され得る。好ましい全穀は、コーン、小麦、ライムギ、大麦、ソルガム及びそれらの組み合わせを含む。他の実施形態において、粒状でんぷんは、繊維、内胚乳及び/又は胚芽成分を含む細分化された穀物部分から得られることが出来る。コーン及び小麦等の植物原料を細分化する方法は、当該技術分野で知られている。いくつかの実施形態において、異なる資源から得られた植物原料は、本願発明に係る方法で使用される粒状でんぷん(例えば、コーン及びミロ又はコーン及び大麦)を得るために同時に混合され得る。
アルファ−アミラーゼは、単一酵素、ハイブリッド酵素、又はアルファ−アミラーゼの混合物とすることが出来る。本願発明に包含されるいくつかの実施形態において、前記アルファ−アミラーゼは、E.C.番号、E.C.3.2.1.1−3及び特にE.C.3.2.1.1を有する微生物酵素である。任意の適したアルファ−アミラーゼが、本願発明に係る方法に使用され得る。いくつかの実施形態において、前記アルファ−アミラーゼは、細菌株に由来し、他の実施形態において前記アルファ−アミラーゼは、真菌株から由来する。別の実施形態において、前記好ましいアルファ−アミラーゼは、細菌性アルファ−アミラーゼである。他の実施形態において、前記アルファ−アミラーゼは、酸安定性アルファ−アミラーゼである。適したアルファ−アミラーゼは、組み換え(ハイブリッド及び変異体)及び変種アルファ−アミラーゼ(WO99/19467及びWO97/41213)と同様に自然発生のアルファ−アミラーゼとすることが出来る。特に好ましい実施形態において、前記アルファ−アミラーゼは、バチルス属に由来する。好ましいバチルス属は、バチルス・ズブチリス(B.subtilis)、バチルス・ステアロサーモフィラス(B.stearothermophilus)、バチルス・レンタス(B.lentus)、バチルス・リシェニフォルミス(B.licheniformis)、バチルス・コアグランス(B.coagulans)、及びバチルス・アミロリクエファシエンス(B.amyloliquefaciens)を含む(米国特許第5,093,257号、米国特許第5,763,385号、米国特許第5,824,532号、米国特許第5,958,739号、米国特許第6,008,026号、米国特許第6,361,809号、米国特許第6,867,031号、WO96/23874、WO96/39528及びWO05/001064)。特に好ましいアルファ−アミラーゼは、バチルス属バチルス・ステアロサーモフィラス、バチルス・アミロリクエファシエンス及びバチルス・リシェニフォルミスに由来する(米国特許第6,187,576号、米国特許第6,093,562号、米国特許第5,958,739号、US2006/0014265及びWO99/19467)。
植物は、アルファ−アミラーゼ(EC3.1.1.1);ベータ−アミラーゼ(EC3.1.1.2)、アミログルコシダーゼ(グルコアミラーゼ)(EC3.1.1.3)及びでんぷんホスホリラーゼ(EC2.4.1.1)等の自然発生のでんぷん分解酵素を有する。さらに、植物はアミラーゼ、グルコアミラーゼ等のでんぷん分解酵素をコードする異種遺伝子を含むように遺伝子操作されていることが出来る(WO03/018766及びWO05/096804)。自然発生又は挿入ポリヌクレオチドからの発現に関わらず、内因性でんぷん分解植物酵素は、ジェット加熱の温度又はさらに粒状でんぷんのゼラチン化温度を超える温度等の上昇された温度に暴露することにより不活化される。しかし、本願発明の方法で実施される温度において、内因性でんぷん分解酵素は、不活性化されず、実際に粒状でんぷんの加水分解に寄与することが考えられている。理論には結びつかないものの、発明者は、接触工程で提供されるアルファ−アミラーゼが、植物原料の粒状でんぷん構造を修飾し、デキストリンを含むオリゴ糖の生成を可能にすると考える。前記オリゴ糖は、接触工程によって包括される温度(例えば45℃から70℃)で植物でんぷん分解酵素によりさらに分解される。前記植物でんぷん分解酵素は、部分的に加水分解されたでんぷんからグルコースの生成に作用する。グルコアミラーゼの外因性供給源が接触工程で含まれることが出来る一方、その後のアルコール発酵への供給体として随意に使用されるグルコースの供給に外因性グルコアミラーゼの追加が必要とされない。従って1つの実施形態において、本願発明に係る前記接触工程は、微生物供給源に由来するグルコアミラーゼの追加を含まない。別の実施形態において、前記接触工程は、外因性酵素、特に外因性グルコアミラーゼ又は他のオリゴ糖加水分解酵素の追加なしに実施される。別の実施形態において、前記オリゴ糖は、植物の属によって特定、或いは植物の属及び種によって特定される自然発生の内生植物酵素によってのみ加水分解される。しかし、外因性グルコアミラーゼの追加及び/又は他のフィターゼ及びプロテアーゼ等の酵素は、可溶化粒状でんぷんの生成を増大する。
発酵微生物の例は、アルコールデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デヒドロゲナーゼを発現し、Zymomonas moblisから得ることが出来る(例えば米国特許第5,000,000号、米国特許第5,028,539号、米国特許第5,424,202号、米国特許第5,514,583号及び米国特許第5,554,520号を参照にされたい)エタノール生産(ethanologenic)細菌等のエタノール生産(ethanologenic)微生物又はエタノール生産(ethanol producing)微生物である。追加的実施形態において、前記エタノール生産(ethanologenic)微生物は、キシロース還元酵素及びキシリトールデヒドロゲナーゼ、キシロースからキシルロースに転化する酵素を発現する。別の実施形態において、キシロース異性体は、キシロースからキシルロースへの転化に使用される。特に好ましい実施形態において、ペントース及びヘキソースの両方からエタノールへの発酵が可能な微生物が利用される。例えば、いくつかの実施形態において、前記微生物は、天然の又は遺伝子操作されていない微生物とすることができ、また他の実施形態において、前記微生物は、組み換え微生物とすることが出来る。例えば、いくつかの実施形態において、好ましい発酵微生物は、バチルス属、乳酸菌、大腸菌、エルウィニア属、パントエア属(例えば、P.citrea)及びクレブシエラ属(例えばK.oxytoca)からの細菌株を含む(例えば、米国特許第5,028,539号、米国特許第5,424,202号及びWO95/13362を参照にされたい)。
1つの実施形態において、追加的でんぷん加水分解酵素を必要とせず、よって、接触工程で前記酵素を含まないことを意図する一方で、追加的酵素は、本願発明によって包含される接触工程及び発酵工程の両方で含まれることが出来る。いくつかの実施形態において、これらの酵素は、粒状でんぷんスラリーと、アルファ−アミラーゼ及び1以上の第二酵素とを接触することを含む接触工程において、1以上の第二酵素として含まれる。他の実施形態において、前記追加的酵素は、酵母及び他の成分と共に発酵工程で含まれる。
前記処理される粒状でんぷん(例えば、粉砕された穀物)は、水溶液と混合され、スラリーを得る。前記水溶液は、例えば、水、希薄蒸留液及び/又は逆流から得られることが出来る。
本願発明に係る発酵方法の好ましい最終生成物は、アルコール生成物、好ましくはエタノールである。前記方法により生成された最終生成物は、発酵培地から分離及び/又は精製されることが出来る。分離及び精製に用いる方法は知られており、例えば、前記培地を抽出、蒸留及びカラム・クロマトグラフィー処理することである。いくつかの実施形態において、前記最終生成物は、培地を高圧液体クロマトグラフ(HPLC)分析に直接処理することで単離される。
下記の実施例は、特定の好ましい実施形態及び本願発明に係る態様の実証及びさらに具体化を目的として供給され、それらの範囲を限定するようには解釈されない。実際に、これらの教示は、本明細書で記載されるプロセスシステムの更なる最適化に使用される。
SPEZYME Ethyl(ジェネンコーから入手可能)−バチルス・リシェニフォルミスの遺伝子組み換え株から得られた細菌性アルファ−アミラーゼである。
前記アルファ−アミラーゼの活性を、アルファ−アミラーゼ単位(AAU)として表現し、酵素活性は、分光光度法で測定したヨウ素染色能力の減少率に反映されるでんぷん加水分解の割合によって決定した。細菌性アルファ−アミラーゼ活性の1AAUは、標準状態で1分間当たり10mgのでんぷんを加水分解するのに必要な酵素量である。
全粉末コーン及び細分化コーンの粒状でんぷんからの可溶化及びエタノール生産
この実施例では、(A)13.3%の含水率を有する全粉末コーン370g、(B)9.2%の含水率を有するコーン内胚乳354.2g及び(C)11.8%の含水率を有する精製コーンでんぷんの3つの異なるコーン粒状でんぷん基質について行った。各基質を、秤量した後、ステインレス−スチール容器に移し、水でDS32%に対応した最終1000gスラリーを作成した。
ミロ粒状でんぷんからの可溶化及びエタノール生産
2つの前処理を行った。(A)11.6%の含水率及び53.3%の全でんぷん含有量を有する全粉末ミロ160gを秤量し、340gの水を有するステインレススチール容器に移した。スラリーのpHを6N硫酸を用いてpH5.5に調製した。SPEZYME Ethyl(1.0AAU/gDS)を加えた。温度を62℃及びDS32%に維持した。(B)HGAを0.1GAU HGA/gDSと当量で上述の(A)に記載された前処理に加えた。可溶固形分(%)及びグルコース分(%)を表3に示した。
全粉末ミロからのグルコース生成における温度の効果
pH5.5でGC100(4.0AAU/gDS)を有する全粉末ミロの30%DS水性スラリーのインキュベーションを、60℃、65℃及び70℃で行った。6時間のインキュベーションの後、試料を回収し、遠心分離で不溶性物質を分離した。透明な上清のブリックス及びHPLC組成を測定した。可溶でんぷん分(%)及びグルコース分(%)を決定し、結果を表5に示した。
米粒状でんぷんからの可溶化及びエタノール生産
14%の含水率及び30メッシュスクリーンを通る粒径を有する81.5%のでんぷん含有量を有する米穀物(116g)を、284gの水と混合し、25%DSスラリーを作成した。その後、GC100(4.0AAU/gDS)をスラリーに加えた。温度を65℃で維持し、pHをpH5.5に調製した。ブリックスを2、4、6、及び24時間後に測定した。可溶でんぷん分(%)及びグルコース分(%)を決定し、その結果を表7に示した。
Claims (24)
- 粒状でんぷん基質からアルコールを生成する方法であって、
a)植物原料から得られた粒状でんぷんを含むスラリーとアルファ−アミラーゼとを、粒状でんぷんのでんぷんゼラチン化温度未満の温度で接触させ、オリゴ糖を生成し、そして前記オリゴ糖を植物内因性のでんぷん加水分解酵素によって加水分解する工程であって、前記温度が60℃から65℃の間であり、かつ前記アルファ−アミラーゼがスペザイムエチル(SPEZYME Ethyl)(ジェネンコー社製)を含む工程、
b)少なくとも10%のグルコースを含むマッシュを生成する工程、及び
c)10℃から40℃の間の温度で、10時間から250時間、発酵微生物及びでんぷん加水分解酵素の存在下でマッシュを発酵し、アルコールを生成する工程を含み、
前記接触工程が5分間から48時間、pH3.5から7.0で実施され、
前記接触工程が、更にヒューミコラ・グリセア(Humicola grisea)グルコアミラーゼを含み、かつ
前記発酵工程におけるでんぷん加水分解酵素が、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)グルコアミラーゼとアスペルギルス・カワチ(Aspergillus kawachi)アルファ−アミラーゼとの混合物を含む、
方法。 - 接触工程で供給されるアルファ−アミラーゼの量が、0.01から10.0AAU/gDSの間である、請求項1に記載の方法。
- 前記マッシュが少なくとも30%のグルコースを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記植物原料がコーン、ミロ、大麦、小麦、米又はそれらの組み合わせである、請求項1に記載の方法。
- 前記植物原料が細分化されたコーンである、請求項4に記載の方法。
- 前記アルコールがエタノールである、請求項1に記載の方法。
- さらにエタノールを回収する工程を含む、請求項6に記載の方法。
- エタノールを生成する方法であって、
a)植物原料から得られた粒状でんぷんを含むスラリーと、粒状でんぷんを可溶化するアルファ−アミラーゼとを接触させる工程であって、前記接触がpH3.5からpH7.0、粒状でんぷんのでんぷんゼラチン化温度未満の温度で、5分間から24時間であり、前記温度が60℃から65℃の間であり、かつ前記アルファ−アミラーゼがスペザイムエチル(SPEZYME Ethyl)(ジェネンコー社製)を含む工程、
b)20%より多いグルコースを含む基質を得る工程、及び
c)10℃から40℃の間の温度で10時間から250時間、発酵微生物及びでんぷん加水分解酵素の存在下で基質を発酵し、エタノールを生成する工程を含み、
前記接触工程が、更にヒューミコラ・グリセア(Humicola grisea)グルコアミラーゼを含み、かつ
前記発酵工程におけるでんぷん加水分解酵素が、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)グルコアミラーゼとアスペルギルス・カワチ(Aspergillus kawachi)アルファ−アミラーゼとの混合物を含む、
方法。 - さらにエタノールを回収する工程を含む、請求項8に記載の方法。
- 前記接触工程がpH5.0から6.0の間で実施される、請求項8に記載の方法。
- 前記接触の時間が15分間から12時間である、請求項8に記載の方法。
- 前記基質が15分間から6時間の間の接触の後、30%より多いグルコースを含む、請求項8に記載の方法。
- 前記基質が15分間から6時間の間の接触の後、40%より多いグルコースを含む、請求項12に記載の方法。
- さらに発酵工程の前に基質を清浄する工程を含む、請求項8に記載の方法。
- さらに接触工程で追加的酵素を加えることを含む、請求項8に記載の方法。
- 前記追加的酵素がグルコアミラーゼ、フィターゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ及び/又はヘミセルラーゼの群から選択される、請求項15に記載の方法。
- 前記追加的酵素がフィターゼである、請求項16に記載の方法。
- 前記追加的酵素がプロテアーゼである、請求項16に記載の方法。
- 前記スラリーが5−60%DS粒状でんぷんを有する、請求項8に記載の方法。
- 前記粒状でんぷんのDSが20−40%の間である、請求項19に記載の方法。
- さらに前記基質と、逆流を含む水溶液とを接触させ、発酵工程の前にDSを希釈する工程を含む、請求項8に記載の方法。
- 前記粒状でんぷんがコーン、ミロ、大麦、小麦、米又はそれらの組み合わせから得られる、請求項8に記載の方法。
- 6時間後のグルコース分(%)が30%である、請求項22に記載の方法。
- 6時間後のグルコース分(%)が40%である、請求項23に記載の方法。
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