CN113846087A - 一种样品前处理方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于包含生物分子的样品前处理方法及其应用，其包括以下步骤：将待测样品置于保存液中，进行外力处理以降低非特异性结合。将该前处理方法用于检测生物分子，可以有效地减少来自于样品中杂质的非特异性吸附，降低背景噪声，促进生物分子特异性结合，从而进一步提高生物分子检测方法的灵敏度。
Description
技术领域
本发明属于生物检测领域。具体地，本发明涉及一种样品前处理方法、一种生物分子的检测方法及上述方法的应用。
背景技术
新型冠状病毒疫情突然来袭，对高通量、高灵敏度、高特异性的抗原快速检测方法提出了迫切的需求。目前的主流分子检测手段—荧光定量PCR可以满足特异性、灵敏度的检测要求，但由于其需要核酸提取等多个复杂步骤，仍无法实现高通量、快速检测。然而常规的免疫检测方法，包括化学发光和层析试纸条等，虽符合高通量、快速检测要求，但因咽拭子样品成份复杂及检测原理的限制，无法满足特异性和灵敏度的要求。目前机场、医院急诊科等特殊场景存在迫切的快速检测需求。另外，秋冬季呼吸道传染病高发期即将来临，也需要大面积、高通量筛查病原体，特别是新型冠状病毒感染者，以防止可能形成的疫情反复。
目前，基于免疫层析试纸条的检测产品已经被批准上市，化学发光免疫法也在做临床验证。然而，由于咽拭子样本或唾液样本通常会携带细胞碎片、口腔和鼻咽部分泌物等易于被吸附的干扰物质，因此导致此类免疫反应的特异性得不到保证，容易产生假阳性或假阴性的检测结果，给生物分子的快速、准确和高通量检测造成了困难，成为阻碍相关检测方法推广应用的主要因素，特别是在新冠疫情期间，不少企业以及科研院所在对新冠检测的各种方法进行研究，但是能实现准确快检的方法则寥寥无几，现在这种需求依然紧迫。
发明内容
鉴于现有技术中存在的上述不足之处，本发明针对生物分子检测方法中样本处理的瓶颈问题，提出一种检测生物分子的样品的前处理方法，其可以在采用咽拭子获取的样本或唾液样本等的免疫检测过程中有效地降低无关物质的非特异性吸附，将其用于生物分子检测方法可以极大地提高检测的灵敏度。
本申请的发明人长期从事生物分子检测方法的研究，若检测样本直接使用采用咽拭子获得的待检测样品或唾液等样品时，由于反应中产生非特异性吸附，导致背景信号过高，进而导致假阳性率高，检测的灵敏度总是达不到预期目标。经过很多次实验分析发现，影响检测效果的因素是样品中存在多种来自口腔细胞碎片、食物残渣以及鼻咽部分泌物的杂质，特别是蛋白杂质是严重干扰检测特异性的重要原因，去除这部分干扰杂质有利于提高生物分子检测的灵敏度，降低假阳性和假阴性的错误检测结果的发生率。
由于目前对于生物分子检测的高通量、高灵敏度和高特异性要求日益提高，因此还要求去除这部分杂质的手段快速、简便和有效，从而满足检疫防疫工作对于快速检测和消毒杀菌的时效性要求。
经过反复摸索和验证，本申请的发明人出乎意料地发现，通过对置于保存液中的生物分子样品进行外力处理，可以实现咽拭子携带的待测样品或唾液样品等中的目标生物分子与干扰杂质快速、有效的分离，且不破坏待检测的生物分子的三维结构并且保持其抗原活性，而将处理后的待检样品用于后续的检测过程，可以极大地提高整个检测方法的特异性和灵敏度。
针对上述的外力处理，本发明使用了超声波、涡旋振荡、施加电场、施加高压等方法，对提高检测方法的特异性和灵敏度都有一定的效果。
为了得到更好的检测效果，发明人进一步研究注意到，超声波是一种频率超出人类听觉范围20kHz以上的声波，超声波能够引起质点振动，质点振动的加速度与超声频率的平方成正比。因此，几十千赫兹的超声会产生极大的作用力，强超声波在液体中传播时，由于非线性作用，会产生声空化。在空化气泡突然闭合时发出的冲击波可在其周围产生上千个大气压力，对污层的直接反复冲击，一方面破坏污物与清洗件表面的吸附，另一方面也会引起污物层的破坏而脱离清洗件表面并使它们分散到清洗液中。气泡的振动也能对固体表面进行擦洗。气泡还能“钻入”裂缝中做振动，使污物脱落。此外，超声振动在清洗液中引起质点很大的振动速度和加速度，亦使清洗件表面的污物受到频繁而激烈的冲击。
超声波通常用于固体器件的清洗，而本发明的样品与传统的清洗物件性质完全不同，清洗过程不能破坏蛋白抗原的性质，还要降低样品中其他杂质的吸附性。本发明通过研究超声波的适用条件，对本发明的样本做了充分的实验，意外发现利用超声处理后的样本检测的灵敏度大大提高，基本上避免了假阳性的产生，兼顾了特异性、灵敏度、高通量、快速的检测要求。本发明的检测样品的前处理方法除了适用于大面积防疫筛查的检测样品的过程，还适用于机场、海关、医院急诊科及相关科室的检测样品的过程。
本发明的上述目的是通过如下技术方案实现的：
根据本发明的第一方面，提供一种包含生物分子的样品的前处理方法，其包括以下步骤：
(1)将待测样品置于保存液中；
(2)对保存液施加外力，以降低非特异性结合。
根据前述的方法，步骤(2)进一步包括：通过所施加的外力促进生物分子特异性结合。
根据前述的方法，所述外力是超声波。
根据前述的方法，所述超声波的频率为20-130kHz，优选地，所述超声波的频率为25-90kHz；优选地，所述超声波的频率为40-60kHz。
根据前述的方法，所述超声波的作用时间为5～30分钟。
根据前述的方法，所述超声波的功率为10-500W，优选为60-150W。
根据前述的方法，所述外力为涡旋振荡、施加电场和施加高压中的一种或多种。
根据前述的方法，其中所述生物分子来源于微生物，所述微生物选自细菌、病毒、真菌、放线菌、立克次氏体、支原体、衣原体、螺旋体中的一种或多种。
优选地，所述微生物来自沙门氏菌、葡萄球菌、链球菌、副溶血性弧菌、变形杆菌、志贺氏菌、禽流感病毒、黄曲霉菌及病毒、***病毒、流感病毒、冠状病毒、肠道病毒71型和猪瘟病毒的一种或多种。
优选地，所述病毒为选自***病毒、流感病毒、冠状病毒、肠道病毒和猪瘟病毒的一种或多种；
优选地，所述冠状病毒为选自新型冠状病毒、SARS冠状病毒、中东呼吸综合征(MERS)冠状病毒、229E冠状病毒、NL63冠状病毒、OC43冠状病毒、HKU1冠状病毒的一种或多种；
优选地，所述生物分子为选自刺突蛋白S、核衣壳蛋白N、膜蛋白M、包膜蛋白E和血凝素酯酶HE的冠状病毒蛋白抗原的一种或多种。
更优选地，所述生物分子为一种或多种选自刺突蛋白S和核衣壳蛋白N的冠状病毒蛋白抗原。
根据前述的方法，其还包括在所述外力处理之前对所述待测样品进行灭活处理；
优选地，所述灭活处理为将所述待测样品在56-60℃下保持30-60分钟；
更优选地，所述灭活处理为将所述待测样品在56℃下保持30分钟。
根据前述的方法，其中所述样本选自咽拭子、肺泡灌洗液、痰液、口腔拭子、唾液、血液、尿液、脑脊髓液、组织、***拭子、体液、汗液、粪便、肛拭子、泪液、食品、土壤、水体。
根据前述的方法，其还包括在所述外力处理之后对经外力处理的包含生物分子的样品保存液进行离心处理；
优选地，所述离心力为1000g～30000g，优选为20000g；所述离心时间为3～30分钟，优选为5～10分钟。
根据本发明的第二方面，提供一种用于非疾病诊断目的的生物分子的检测方法，包括以下步骤：
(1)采用前述方法对待测样品进行前处理；
(2)对保存液中的蛋白抗原进行检测。
根据本发明的第三方面，提供一种前述的方法在生物分子检测中降低本底噪声的应用。
根据本发明的第四方面，提供一种前述的方法在生物分子检测中提高生物分子特异性结合的应用。
根据前述的应用，所述生物分子为新型冠状病毒。
在本发明所述的方法中，所述保存液可以为生理盐水(saline)、PBS、Hanks、UTM、ESwab、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、甘氨酸缓冲液、2-(N-***啉)乙磺酸缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液等病毒保存和转移液中的一种或多种；
通过本发明所述的前处理方法得到的样本可适用于各种后续的检测方法，例如化学发光法、层析试纸条、数字免疫检测方法或单分子免疫检测方法进行蛋白抗原的检测。上述非诊断目的的生物分子的检测方法用于检测人体或动物体样本，还可用于除人体和动物体之外的环境，例如公共场所、居民住宅、企事业单位，或者物体，例如医疗设施、实验设备等的内部或表面处的生物分子，特别是病原微生物生物分子的检测。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅用于阐明本发明，并不限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
实施例1新型冠状病毒S蛋白的检测
本实施例采用表面表达新型冠状病毒S蛋白的假病毒溶液作为检测样本，其中包括不含所述假病毒的溶液和每100μL含2颗至200颗假病毒的系列溶液。本实施例不对样本进行外力处理，具体方法如下：
(1)分别将上述假病毒溶液置于保存液中，保存液的成分为DMEM培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)和2％胎牛血清(FBS)，随后在56℃下灭活处理30分钟；
(2)将经灭活处理的包含假病毒的保存液分别与包被捕获抗体的磁珠、连接生物素的检测抗体和连接链霉亲和素的荧光报告分子共同孵育，采用显微镜成像技术分别对全部磁珠和具有荧光的磁珠进行计数；
(3)计算具有荧光的磁珠的数量与全部磁珠数量的比值，当比值小于10％时，则具有荧光的磁珠的数量即捕获到的抗原数；当比值大于10％可采用类似数字PCR原理中泊松分布模型来确定捕获得到的抗原数(李亮等，基于数字PCR的单分子DNA定量技术研究进展，生物化学与生物物理进展，2012年第10期)。具体结果详见表1。
表1表面表达新型冠状病毒S蛋白的假病毒的检测结果
| 每100μL假病毒数 | 一组 | 二组 | 三组 | 平均 |
| 0 | 0.27％ | 0.16％ | 0.22％ | 0.22％ |
| 2 | 0.50％ | 0.43％ | 0.44％ | 0.45％ |
| 5 | 0.86％ | 0.92％ | 1.05％ | 0.94％ |
| 20 | 4.94％ | 4.12％ | 3.33％ | 4.13％ |
| 100 | 24.47％ | 19.71％ | 16.40％ | 20.19％ |
| 200 | 35.74％ | 45.36％ | 36.09％ | 39.06％ |
注：表1中的百分比为具有荧光的磁珠的数量与全部磁珠数量的比值。
由表1可见，当假病毒数为2和5的情况下，具有荧光的磁珠的数量与全部磁珠数量的比值比较低，虽然能够与没有病毒的对照区分，但在通常情况下咽拭子和其他生物采集样本里所含有的杂质会进一步增加背景数值，导致这些低浓度的抗原无法检出。因此，要想得到高灵敏度的免疫检测结果，必须降低样本中的杂质带来的检测背景。
实施例2新型冠状病毒S蛋白的检测
本实施例采用广州市第八人民医院采集的新型冠状病毒阴性受试者的咽拭子作为检测样本。咽拭子购自江苏一米生物科技有限公司。
(1)将上述咽拭子置于ESwab保存液中；
(2)先在56℃下灭活处理30分钟，再采用超声仪(昆山市超声仪器有限公司，KQ3200DE)在150W、频率40kHz下超声处理10分钟；
(3)将上述处理后的保存液以20000g的离心力离心8分钟；
(4)采用与实施例1相同检测方法和数据分析方法获得S蛋白抗原数。
表2医院采集的新型冠状病毒阴性受试者的咽拭子的检测结果
| 样本编号 | 未经超声处理 | 经超声处理 |
| 1 | 0.50％ | 0.17％ |
| 2 | 4.28％ | 0.49％ |
| 3 | 2.24％ | 0.34％ |
| 4 | 2.87％ | 0.17％ |
| 5 | 12.2％ | 2.51％ |
| 6 | 2.34％ | 0.17％ |
| 平均 | 4.07％ | 0.64％ |
注：表2中的百分比为具有荧光的磁珠的数量与全部磁珠数量的比值。
结合实施例1的测试结果表明，若对含低丰度抗原样本直接进行检测时，部分样本的检测因呈现高背景而严重影响了检测方法的灵敏度，而本实施例的结果显示，经过本发明的超声处理过程可以显著降低因待测样品中的非特异性吸附带来的高背景信号，平均可降低6倍以上的背景干扰，将极大提高新型冠状病毒S蛋白检测的灵敏度。
实施例3新型冠状病毒N蛋白的检测
本实施例采用广州市第八人民医院采集的新型冠状病毒阴性受试者的咽拭子作为检测样本，每个样本分为两组。咽拭子保存液购自意大利COPAN公司。
(1)将上述咽拭子置于UTM保存液中；
(2)先在56℃下灭活处理30分钟，再采用超声仪(昆山市超声仪器有限公司，KQ3200DE)在频率40kHz下，采用不同的超声功率和不同时间处理样本；
(3)将上述处理后的保存液以20000g的离心力离心10分钟；
(4)采用与实施例1相同检测方法和数据分析方法获得N蛋白抗原数。
表3医院采集的新型冠状病毒阴性受试者的咽拭子的检测结果
| 一组 | 二组 | 平均 | |
| 未经超声处理 | 0.27％ | 0.22％ | 0.25％ |
| 60W超声5min | 0.06％ | 0.14％ | 0.10％ |
| 60W超声15min | 0.08％ | 0.05％ | 0.07％ |
| 60W超声30min | 0.06％ | 0.06％ | 0.06％ |
| 90W超声5min | 0.09％ | 0.17％ | 0.13％ |
| 90W超声15min | 0.05％ | 0.04％ | 0.05％ |
| 90W超声30min | 0.07％ | 0.05％ | 0.06％ |
| 150W超声5min | 0.10％ | 0.10％ | 0.10％ |
| 150W超声15min | 0.07％ | 0.04％ | 0.06％ |
| 150W超声30min | 0.08％ | 0.05％ | 0.07％ |
注：表3中的百分比为具有荧光的磁珠的数量与全部磁珠数量的比值。
为了能够达到最优的降低背景的效果，且同时不影响阳性信号的检出，本实施例中，采用了不同的超声功率和时间处理样本。结果显示，本发明的前处理方法可显著降低因待测样品中的非特异性吸附带来的高背景信号，降低了50％以上，大大提高了检测灵敏度。
Claims (15)
1.一种包含生物分子的样品的前处理方法，其包括以下步骤：
(1)将待测样品置于保存液中；
(2)对保存液施加外力，以降低非特异性结合。
2.根据权利要求1所述的方法，步骤(2)进一步包括：通过所施加的外力促进生物分子特异性结合。
3.根据权利要求1或2所述的方法，所述外力是超声波。
4.根据权利要求3所述的方法，所述超声波的频率为20-130kHz，优选地，所述超声波的频率为25-90kHz；优选地，所述超声波的频率为40-60kHz。
5.根据权利要求3或4所述的方法，所述超声波的作用时间为5-30分钟。
6.根据权利要求3-5任一项所述的方法，所述超声波的功率为10-500W，优选为60-150W。
7.根据权利要求1或2所述的方法，所述外力为涡旋振荡、施加电场和施加高压中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物分子来源于微生物，所述微生物选自细菌、病毒、真菌、放线菌、立克次氏体、支原体、衣原体、螺旋体中的一种或多种。
优选地，所述病毒为选自***病毒、流感病毒、冠状病毒、肠道病毒和猪瘟病毒的一种或多种；
优选地，所述冠状病毒为选自新型冠状病毒、SARS冠状病毒、中东呼吸综合征(MERS)冠状病毒、229E冠状病毒、NL63冠状病毒、OC43冠状病毒、HKU1冠状病毒的一种或多种；
优选地，所述生物分子为选自刺突蛋白S、核衣壳蛋白N、膜蛋白M、包膜蛋白E和血凝素酯酶HE的冠状病毒蛋白抗原的一种或多种。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其还包括在所述外力处理之前对所述待测样品进行灭活处理；
优选地，所述灭活处理为将所述待测样品在56-60℃下保持30-60分钟；
更优选地，所述灭活处理为将所述待测样品在56℃下保持30分钟。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述样本选自咽拭子、肺泡灌洗液、痰液、口腔拭子、唾液、血液、尿液、脑脊髓液、组织、***拭子、体液、汗液、粪便、肛拭子、泪液、食品、土壤、水体。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其还包括在所述外力处理之后对经外力处理的包含生物分子的样品保存液进行离心处理；
优选地，所述离心力为1000g～30000g，优选为20000g；所述离心时间为3～30分钟，优选为5～10分钟。
12.一种用于非疾病诊断目的的生物分子的检测方法，包括以下步骤：
(1)采用权利要求1-11任一项所述的方法对待测样品进行前处理；
(2)对保存液中的蛋白抗原进行检测。
13.根据权利要求1-12任一项所述的方法在生物分子检测中降低本底噪声的应用。
14.根据权利要求1-12任一项所述的方法在生物分子检测中提高生物分子特异性结合的应用。
15.根据权利要求13或14所述的应用，所述生物分子为新型冠状病毒。
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