CN113736913B - 基于病毒核酸与miRNA双向共生检测2019-nCoV的方法及试剂盒 - Google Patents

基于病毒核酸与miRNA双向共生检测2019-nCoV的方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于病毒核酸与miRNA双向共生检测2019‑nCoV的方法及试剂盒，属于涉及RNA病毒核酸检测技术领域，其步骤包括：待检测样本病毒RNA裂解；病毒RNA捕获和miRNA捕获；扩增片段双向生成：进行RT反应得到病毒RNA衍生片段和miRNA衍生片段；将病毒RNA衍生片段和miRNA衍生片段进行同步扩增；PCR产物的荧光片段长度多态性分析；本发明的检测方法精准性高，同一反应中检出3‑6重靶标基因，涵盖了目前发布的所有新型冠状病毒的核酸序列并可与普通冠状感冒病毒进行区分；假阳性、假阴性率低；采用内源性miRNA为样本质控指标，检出率高；检测低限10‑100个分子，灵敏度高；适用范围广，病毒RNA免提取，适合自动化杂交与扩增，封闭式操作杜绝接触病毒，可有效保证操作人员安全。

Description

基于病毒核酸与miRNA双向共生检测2019-nCoV的方法及试 剂盒
技术领域
本发明涉及RNA病毒核酸检测技术领域，尤其涉及一种基于病毒核酸与miRNA双向共生检测2019-nCoV的方法。
背景技术
rRT-PCR测定法是确诊患者RNA病毒感染的临床金标准。但受制于qPCR反应原理，无法克服假阳性、假阴性高的缺点，因此，较难确诊病毒载量低的病人(早期，轻度患者)。核酸检测整个分析流程中，涉及采样、样本保存运输、核酸提取、实时PCR分析等步骤。
出现核酸检测假阴性的可能原因很多，包括：1.样本质量(包括取样部位，核酸降解)；2.样本保存及运输条件(核酸降解)；3.核酸提取质量(核酸丢失、杂质)；4.PCR核酸检测方法局限(PCR抑制，检测下限为统计平均值-调高检测下限，假阴性率升高；调低，则假阳性率增加)。
在2020年爆发的2019-nCoV(也称为“SARS-CoV-2”，也称“新型冠状病毒”)瘟疫的临床检测实践中，新型冠状病毒rRT-PCR核酸检测结果没有达到预期，是造成大量疑似病例的主要原因之一。
JAMA杂志总结了各种检测新型冠状病毒手段的窗口期，以及灵敏度随时间的变化规律。在病毒感染后，能够最早检出的方法是鼻咽拭子/唾液qPCR核酸检测法，大约在感染后一周，症状出现前一周就逐渐呈现阳性，且灵敏度较高。但到了发病(症状出现后)3.5周灵敏度逐渐下降，灵敏度低于BALF和粪便的qPCR核酸检测及抗体检测。而抗体在发病后一周逐渐呈现阳性，3周后灵敏度达到峰值，而后IgG抗体检测持续保持较高灵敏度，因此，在前期用鼻咽拭子/唾液qPCR可以有效筛查新发感染，而后期的抗体检测能获得患者感染史信息。
如前所述，RNA病毒核酸检测所面临的问题包括：
1.病毒样本收集：rRT-PCR检测的硬伤，在于对样本的要求很高。阴性结果也不能排除新型冠状病毒感染，需要排除可能产生假阴性的因素，包括：样本质量差，比如口咽等部位的呼吸道样本；样本收集的过早或过晚；没有正确的保存、运输和处理样本；技术本身存在的原因，如病毒变异、PCR抑制等。样本稳定性差。
第五版《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》建议采集口鼻咽组织，下呼吸道采集的痰、肺泡灌洗液样本、粪便及肛拭子等多部位标本。下呼吸道采集的痰、肺泡灌洗液标本阳性率高，但采集难度大、易引起患者喷射导致采集操作者感染风险大。本研究比较口罩内层收集患者飞沫、深咳痰液与常规样本收集方式的优劣。
鼻咽拭子采集鼻部分泌物，口咽拭子采集咽部和扁桃体分泌物，深咳痰液是由气道远端咳出的分泌物，支气管分泌物由腺体或局部杯状细胞产生分泌物，唾液为唾液腺产生的分泌物，采集后用于检测细菌、病毒。通用的样本采集方式必须使棉签深入到鼻腔上部的更深处(鼻咽处)，才能采集到有效样本。这是一项困难而又不舒服的操作，需要训练有素的医疗专业人员的参与，不仅造成被检测者诸多不适，采集者也近距离面对被检测者，有高传染风险。而这也阻碍了家庭测试的发展。
2020年4月15日，美国FDA通过了罗格斯大学开发的唾液检测的EUA，只需要吐口水到检测试剂盒，即可检测是否感染新冠病毒，医务人员和患者可以保持6英尺的距离，确保没有近距离接触新冠病人。检测过程的安全性大大提高，在全球的检测新冠病毒的方式中是一项创举。理论上，任何呼吸道传染的病毒均可在唾液中被检查出来，因此，唾液作为检测样本是非常理想的。
2、样本灭活：在核酸检测实验室，病毒样本首先需要进行灭活处理，由两名完成三级防护的工作人员，进入样本处理区或样本处理专用实验室，将接收到的样本二级包装在安全柜内打开，检查样本主容器是否为严格密闭；对密封袋表面进行消毒后，对送检样本进行56℃下30分钟的灭活，灭活后的样本管需在生物安全柜内打开最内层的容器，将拭子保存液混匀后进行分装和用于核酸提取。涉及高致病性病原微生物的实验室活动，需由两名工作人员完成，其中一人负责主要实验操作，一人提供必要的协助。主操作者需避免反复多次进出安全柜。这个过程对病毒核酸产生降解，是样本检出率不高的主要来源之一，并有可能感染操作人员。
3、样本内源基因：人类细胞中有一类持续高表达的保守基因，如GAPDH、RNaseP等，常被用作样本保存完整程度及样本量的质控标记，即生物样本内源性质控。内源质控基因需要在样本中首先被检出，以确认该样本是否合格，保证检测结果的有效性。但是，新冠检测的无细胞分泌样本，如唾液、痰液、泪液等，缺乏常规表达的mRNA基因，无法提供样本内源质控标记。
Rutgers临床基因组学实验室发布了用唾液作为2019-nCoV测试的可行生物样品，与其Perkin Elmer核酸提取和ThermoFisher TaqPath SARS-CoV-2自动化过程相匹配，获得了美国FDA的紧急使用授权(EUA)的快速批准。该方法可使用Spectrum公司的SDNA-1000唾液收集装置收集的唾液，但无法设置内源样本质控，只能在RNA提取前，向样本中加入噬菌体作为质控代替。这会降低检出率并造成潜在的假阳性结果。
现有研究证实，无细胞分泌物中含有大量的miRNA，其中的一些miRNA，如miR-21，miR-16,Let-7家族成员等，具有广谱的高表达。可以作为这类样本的内源质控指标[1]。但时由于miRNA(22nt)同病毒核酸大小相差巨大，目前还缺乏能同时检测这两类核酸的实用技术。
4、核酸提取：新冠病毒是RNA病毒，单链RNA(约3万个碱基)被病毒外壳蛋白包裹，与成熟的微小RNA(miRNA，22个碱基)被蛋白包裹的形式一致。病毒RNA为长链RNA，更容易被捕获和扩增。
令人关切的是，测定的假阴性结果在2019-nCoV患者病例中相当普遍，专业文章及媒体中也有诸多报道。一些患者已经出现乏力、肌肉酸痛、干咳、鼻塞等症状，多次咽拭子检测结果核酸阴性，复查后核酸检验阳性的病例，是目前检测方法假阴性结果的一个例证。加拿大和美国疾控中心(CDC)也报出多个假阴转“阳”的案例。增加疫情控制难度和成本。
另外，rRT-PCR核酸检测通常仅能检出标本中是否含有新冠病毒一种病原体，其它病原体就被忽略了。在感冒季节，非新冠病毒导致的肺炎患者占大部分，造成核酸检测结果与临床CT结果不符时也不能排除其他病毒引起的肺炎，导致大量疑似病例。理论上讲，如果是合格的核酸检测试剂，选择正确的体液样品，核酸检测应该更灵敏。通过CT结果来确诊，更会导致更多的早期新冠病毒感染患者的漏诊，造成更大的临床诊断混乱，加大管理成本。
区别核酸检测结果是真阴性还是假阴性，需要从采样方式、样本保存储藏、核酸提取及检测方法等多方面进行质量控制，需要更高通量的检测方法，尽量排除非新冠状病毒病因。rRT-PCR核酸检测无法完全胜任，因此，性能更优的样本采集、及样本保存方式、准确和多靶标检测的核酸检测试剂才能解决疫情爆发时对病毒核酸进行临床确诊的迫切需求。
发明内容
本发明的目的之一，就在于提供一种基于病毒核酸与miRNA双向共生检测2019-nCoV的方法，以解决上述问题。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是这样的：
一种基于病毒核酸与miRNA双向共生检测2019-nCoV的方法，包括以下步骤：
(1)待检测样本病毒RNA裂解；
(2)病毒RNA捕获和miRNA捕获；
(3)扩增片段双向生成：进行RT反应得到病毒RNA衍生片段和miRNA衍生片段；
(4)PCR同步扩增：将病毒RNA衍生片段和miRNA衍生片段进行同步扩增；
(5)PCR产物的荧光片段长度多态性分析。
为解决病毒核酸检测中假阴性高和检出率低等问题，本发明利用OmegaPlex荧光片段毛细管电泳检测法检测新冠病毒核酸的方法，在一个反应中，可以同时检测大小悬殊、不同类型的核酸序列，包括普通冠状感冒病毒共享的保守基因，流感基因，样本内控基因(RNase P)，microRNA(miRNA)等。该检测法直接检测干斑样本，如口罩内层的飞沫、唾液和痰液斑，无需核酸提取步骤。
作为优选的技术方案：步骤(1)中，加入细胞裂解液进行RNA裂解，所述细胞裂解液优选为去污剂。
作为进一步优选的技术方案：所述去污剂为Triton X114，当然，本领域技术人员能够理解的，其余常用的去污剂，比如Tween-20,和Tween-80也可以用来部分的裂解病毒，及miRNA，尽管效果略不如Triton X114。
作为优选的技术方案：步骤(1)中，所述待检测样本为唾液、鼻咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血清及血浆及其干斑；所述待检测样本优选采用70％-75％酒精进行干燥脱水和灭活；
进一步优选的，检测样本采用全灭活的唾液、鼻咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血清及血浆等的干斑，可经室温保存运输，减少操作人员感染的可能性，同时改善样本质量，提升检出率。
作为优选的技术方案：步骤(2)中，所述miRNA为miR-16或miR-21。
作为优选的技术方案：步骤(2)中，加入欧米伽引物进行捕获。
作为优选的技术方案：步骤(2)中，加入茎环引物进行捕获。
作为进一步优选的技术方案：所述茎环引物为经过长度编码的茎环引物。
本发明设计了通过DNA片段长度多态性荧光相对定量分析来完成小分子RNA尤其是miRNA定性检测的方法(miRFLP测定法)，同时通过OmegaPlex定量检测的方式完成对大分子核酸的检出的技术方案。
所述miRFLP检测法，尤其指申请号为CN201410362696/US10266880B2的专利中所公开的技术。
所述RNA反转录过程中，优选采用的引物为欧米茄引物。
本发明所述的欧米茄引物，尤其指申请号为PCT/CN2013/070525的PCT专利申请中所公开的欧米茄引物。欧米茄引物作为本发明miRFLP定量分析反应的引物探针。欧米伽引物含有一个极稳定的二级茎环结构，可避免引物二聚体的形成，提高末端引发精确度，且将引物有效地分隔为探针区及编码区。通过加减编码区的碱基数目就可以方便地对不同引物进行长度编码，并可在同一反转录反应中将多种miRNA转换为长度不一的cDNA片段,经PCR同步扩增进行荧光片段长度多态性分析，解决了单一反应中检测多种miRNA的关键技术问题。
本发明对病毒大核酸片段捕获和逆转录的过程，优选所采用的为OmegaPlex测定法，尤其指申请号为CN104120184A的专利申请中所公开的技术。
OmegaPlex多重荧光片段检测法，利用欧米伽引物，或茎环引物，特异捕获并重复复制低频率DNA碱基变异的方法，提供了一种对大核酸分子进行多基因特异捕获，扩增后，通过荧光毛细管电泳对OmegaPlex产物进行精细的评估，实现多点靶基因的高通量检测。
所述RNA反转录过程中，也可以采用茎环引物。
所述茎环引物为经过长度编码的茎环引物。
所述长度编码的方法为：在所述茎环引物的PCR靶位点与探针序列之间加上不同碱基数目，并调整引物5’端的碱基序列使之维持茎环的二级结构不变。
具有茎环结构的引物探针(Applied Biosystems,Inc,PCT/CN2013/070525)将多个小RNA同时定量地转换为cDNA，生产次生引物，经与miRFLP反应路径相似的cDNA产物加尾、反应后经PCR同步扩增进行荧光片段长度多态性分析。通过延长引物探针的碱基数目，同时利用茎环结构对PCR引物结合位点的屏蔽，也可以实现对病毒RNA的识别和转换，只要加上适当的编码区，茎环引物也可用于本发明的设计规划的实施，利用本发明的双向共生机理，同时扩增长度差异巨大的核酸分子，并在测定有限数目的核酸目标时，与欧米伽引物互换或同时使用。我们以前的工作也证实了经过一定优化的茎环引物可用于miRNA的miRFLP分析原理，对miRNA定量测定(参考成都诺恩基因所申请的专利CN201410362696.2)
本发明的目的之二，在于提供基于上述检测方法的检测试剂盒，采用技术方案为：所述试剂盒包括：细胞裂解液、核酸捕获引物组、适配引物组和PCR引物。
本领域技术人员能够理解的，本发明的试剂盒，除了上述的引物，还包括buffer等进行PCR反应必须的物质。
本发明的上述试剂盒，试剂是目前唯一可以超越rRT-PCR灵敏度、假阴性率、和检出率的非PCR试剂盒，而不仅仅是对现有试剂盒的简单补充。
作为优选的技术方案：所述细胞裂解液为去污剂。
作为优选的技术方案：所述核酸捕获引物组为欧米伽引物或茎环引物，优选具有SEQ ID NO.1-13所示碱基序列的引物组合；所述适配引物组为具有SEQ ID NO.14-21所示碱基序列的引物组合；所述PCR引物具有SEQ ID NO.22-23所示碱基序列。
为了提高新型冠状病毒检出率和避免假阴性，本发明以下几个方面加以改进：
(一)样本收集：
本发明对样本收集方式提供改进，优选利用70％-75％酒精让生物样本干燥脱水，并同时灭活病毒；有效防止二次传播，杜绝样本运输、样本处理造成交叉感染，方便居家操作和常温运输，见图1。
稳定性高，提高检出率：蛋白灭活，阻止运输过程中RNA的降解，提高后续试验冠状病毒检出率。潜在可能，可以针对医院、机场、家庭等场所快捷采集唾液、鼻拭子、咽拭子、口痰样本及环境样本，同时将收集到的样本放入75％的酒精中，有效灭活病毒，避免在运输过程中病毒产生二次传播，同时实现样本常温运输保存，本套装也可由个人或机构自行制作。
(二)核酸降解、丢失：
RNA病毒，很容易被无处不在的外源RNA酶降解。目前的临床样本收集于样本保存液，造成样本稀释，同时需要置于低温保存(24小时内)或-70℃保存，标本采集后难以及时送达检测实验室。核酸提取方法有手工提取和机器自动或半自动提取，提取流程的操作对最后提取到的核酸数量和质量存在差别，对核酸扩增的影响至关重要。本发明除了可以利用纯化RNA为检测对象，也可以对常规收集的样本，以及样本干斑进行直接测定，有利于样本RNA的保存、病毒灭活及样本室温运输。
(三)核酸测定：
本发明利用结构性欧米伽引物从核酸样本中捕获多重目标基因片段、利用竞争性PCR等量扩增，荧光毛细管电泳仪进行片段分析，同时鉴定样本中大小差异巨大的目标核酸。欧米伽引物和竞争性PCR的应用，克服多重PCR灵敏度低、片段扩增不均问题。
可以优选采用RNA保存液，比如本申请人所申请的CN103881978A的专利，不影响逆转录酶及DNA聚合酶的活性，适用于对微量样本核酸的保护和血斑、唾液干斑中RNA片段的直接测定。在血液微核酸鉴定和司法物证的血迹及唾液干斑样本类型鉴定中，获得大量实验结果验证；
(四)无细胞分泌液中miRNA测定作为样本内源质控
方法特异性高。同一反应中检出多重靶标基因，同时测定新冠病毒ORF1ab，N,E基因片段，结果交叉印证，确保检测精准性。同时测定普通冠状感冒病毒保守片段和流感保守片段，有助对感冒患者的排除性诊断。利用高丰度微小RNA(miR-16)为样本内控基因，克服部分临床样本，如唾液或飞沫中常规RNase P基因含量低的难题，提高核酸检测检出率。我们的测试结果显示，唾液含有多种微小RNA，每微升样本中miR-21及miR-16数目过千。
本发明提出的病毒核酸荧光片段双向共生测定法，针对RNA病毒易变的特性进行多重病毒基因片段测定，阳性结果交叉验证，严格区分假阴性、假阳性样本，对排除疑似新冠病毒感染具有巨大的意义。该检测法不需要对样本进行核酸提纯，因此，除了常见的临检样本形式，还可直接利用飞沫、咽拭子、口痰、血浆等样本及其干斑，提升检出率。使用全灭活生物样本干斑，可经室温运输，减少操作人员感染的可能性。检测所需主要仪器为常规PCR仪和荧光毛细管电泳仪，前者便宜、普及率高，后者检测通量大，有助于克服目前核酸检测方法对核酸自动提取仪和实时荧光PCR仪的依赖。后二者也是疫情时核酸检测能力的限制因素。
测定原理：
本发明的病毒核酸双向生成检测法是在OmegaPlex荧光毛细管电泳和miRFLP荧光毛细管电泳测定法基础上，组合发展而成的RNA病毒高通量检测法，可以直接裂解生物干斑样本，释放RNA分子，然后用欧米伽引物组合对样本中病毒RNA分子多个关键基因区域及miRNA进行特异捕获/逆转录/DNA等量扩增，再通过荧光毛细管电泳进行定性定量分析的高通量RNA病毒直接检测方法，见图2。
测定步骤-见图3：
(1)用样本释放液对干斑样本(或血浆，或纯化的RNA)进行裂解；样本释放液包含内对照RNA、流感病毒阳性对照样本；
(2)在样本释放液加入各种欧米伽引物，对内对照RNA，流感病毒阳性RNA，样本中新冠状病毒RNA进行低温捕获；
(3)加入逆转录酶，以目标RNA为模板进行逆转录，复制出cDNA模板；
(4)加入PCR引物，进行PCR等量扩增；
(5)对PCR产物进行荧光毛细管电泳高通量分析，测定目标大小和丰度；
(6)用自动化软件分析荧光片段读数，诊断样本病毒载量。
检测方案：
本发明的新冠病毒OmegaPlex荧光片段测定法，将改变临床采样方法、样本保存和运输方式、核酸提取和核酸检测等各个环节，改善样本质量，提升核酸诊断的准确度和检出率。
为了达到对病毒RNA的精准检测，本发明的技术方案是这样的：
1.设置内对照1，2：作为PCR扩增质控。避免假阴性。
2.同时测定人类易感的冠状病毒(占感冒发病的15-30％)、流感病毒等，减少疑似病例数。
3.利用SARS-CoV-2的序列，同时测定ORF1ab，N,E基因区域。交叉印证，确保检测精准性。
5.无细胞分泌样本中miRNA含量，监控样本质量。
6.直接测定各种干斑样本。56℃干燥灭活病毒。室温运输，并可有效防护操作人员安全。
7.对RNA病毒突变株的检出，片段多态性检测优于rRT-PCR杂交探针检测。
8.样本无需RNA纯化，无丢失，增加检测灵敏度。
9.检测鼻咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血清及血浆，全方位覆盖临床患者不同类型样本。
与现有技术相比，本发明的优点至少包括但不限于：
1.精准性高-同一反应中检出3-6重靶标基因，涵盖了目前发布的所有新型冠状病毒的核酸序列并可与普通冠状感冒病毒进行区分；方法假阳性、假阴性率低；
2.检出率高–利用唾液等无细胞分泌物中所含的内源性miRNA为样本质控指标；
3.灵敏度高-低温杂交，片段长度多态性诊断(物证级别)，无干扰，检测低限10-100个分子；而现有报道中，比如美国Broad研究所张锋教授团队开发的STOP(SHERLOCKTesting in One Pot)法，检测限为100个分子，又比如北京赛尔瑞成科技团队开发的双重荧光PCR法，检测限也为100分子拷贝数；
4.适用范围广-可直接使用检测唾液、鼻咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血清及血浆及其干斑，可全方位覆盖临床患者不同类型的样本；
5.安全性高-临床现场灭活，使用干斑灭活样本，可以通过室温运送样本，节省时间；
6.可自动化-RNA免提取，适合自动化杂交与扩增，封闭式操作杜绝接触病毒，可有效防护操作人员安全。
附图说明
图1：病毒样本灭活收集及病毒裂解流程图；
图1中，A：咽拭子、唾液、痰液等分泌液，及血液等体液，均可以无菌医用棉签进行收集，然后浸泡于75％的酒精中灭菌，室温保存及运输；B:棉签样本倒置离心，去除酒精；C：样本裂解液处理；D：冰浴超声裂解病毒，释放RNA；E：得到待测样本；
图2：本发明的病毒核酸及微小核酸扩增片段的双向生成机制；
图3：RNA病毒裂解及检测过程；
图4：唾液样本中相关miRNA含量；用miRFLP测定法对唾液干斑中分泌液相关miRNA浓度的测定结果。
图5：Triton X-114浓度对不同RNA病毒裂解的影响；
图6：2019-nCoV-N假病毒检测结果；
图7：SARS-CoV-2病毒基因检测靶点；
图8：国家标准物质SARS-CoV-2病毒RNA检测结果。
具体实施方式
下面对本发明作详细的说明。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1病毒核酸双向生成检测原理
本实施例以欧米伽引物为例，具体阐述病毒核酸双向生成检测法检测SARS-CoV-2的反应流程及测定原理：
病毒核酸双向生成检测由病毒及微小RNA裂解、RNA捕获、扩增片段双向生成、PCR同步扩增及PCR产物的荧光片段长度多态性分析等五个步骤组成，如图2所示。其中，反应的第三步，即图2中的步骤C，是将miRNA和欧米伽引物混合杂交，反转录形成的次生引物同适配引物结合，以形成适合的PCR模板；而对病毒核酸则利用携带PCR公用位点的延伸引物进行扩增，以形成适合的PCR模板；然后进行PCR同步扩增，即图2中的步骤D；扩增片段经过荧光毛细管电泳进行精确区分，即图2中的步骤E，达到对目标核酸的鉴别。完整的检测过程参见图3
实施例2病毒核酸双向生成检测反应标准流程
本实施例以咽拭子的检测为例：
(1)病毒及微小RNA裂解：取干燥保存的咽拭子，放入1.5mL离心管，根据棉签体积加入100-200μL样本释放液；取8μL样本，冰浴中低频超声破碎10分钟；加热75℃，3分钟，冷至4℃；
(2)RNA捕获：加入8μL病毒核酸捕获引物组，所有核酸捕获引物即欧米伽引物以等量混合，在RT反应中浓度为10nM，在65℃杂交10分钟；
(3)扩增片段双向生成：加入RT酶，进行逆转录反应，反应程序为：48℃，1分钟；12℃，1分钟；42℃，5分钟；4℃；得到RT反应液；
向RT反应液中加入70μL包含适配引物组的延伸反应液，所有适配引物以等量混合，反应液中终浓度是10nM，保温：95℃，2分钟；95℃，10秒；50℃，1分钟；4℃，1分钟；37℃，1分钟；72℃，5分钟；室温放置；
(4)同步扩增：取5μL延伸反应物，加入35μL包括PCR引物的产物扩增液，两条PCR引物等量混合，浓度分别为：500nM，进行PCR扩增：95℃，2分钟；55℃，10分钟；37℃，3分钟；55℃，1分钟；72℃，1分钟；(95℃，30秒；68℃，1分钟；72℃，30秒)，循环45次；72℃，10分钟；60℃，4小时；25℃放置；
(5)PCR产物片段毛细血管电泳分析。
本实施例所用引物见下表1：
表1实施例2所用的引物序列
序号 核酸捕获引物组 备注
No.1 GGTTGTGCTGAGTCACGAGGTATTCTAGGCACGCTTCTTAGCGTGCCACGATTGTGCATCAGCTGACTGAAGCA cCDC-ORF1ab
No.3 GGTTGTGCTGAGTCACGAGGTATTCTAGGCACGCTTCTTAGCGTGCCATGTTAAAAACACTATTAGCATAAGCA WHO-ORF1ab
No.5 GGTTGTGCTGAGTCACGAGGTATTCTAGGCACGCTTCTTAGCGTGCCAAGACTCACGTTAACAATATTGCAGCA WHO-E
No.7 GGTTGTGCTGAGTCACGAGGTATTCTAGGCACGCTTCTTAGCGTGCCATGCCGAGGCTTCTTAGAAGCCTCAG cCDC-N
No.9 GGTTGTGCTGAGTCACGAGGTATTCTAGGCACGCTTCTTAGCGTGCCATATCTTCCCACGGGCTTGTTCACA SA14-1
No.13 GGTTGTGCTGAGTCACGAGGTATTCTAGGCACGCTTCTTAGCGTGCCATCAACATCAG miR-21-5p
适配引物组
No.14 CACCGACAGGAGACCTGTTCTTAGACTTAAAAGGTAAGTAT cCDC-ORF1ab
No.15 CACCGACAGGAGACCTGTTCTTAGCAAGTATTGAGTGAAAT WHO-ORF1ab
No.16 CACCGACAGGAGACCTGTTCTTAGACGTTAATAGTTAATAG WHO-E
No.17 CACCGACAGGAGACCTGTTCTTAGATTCAACTCCAGGCAGC cCDC-N
No.18 CACCGACAGGAGACCTGTTCTTAGAACGCCCAGATCCCTAG SA14-1
No.21 CACCGACAGGAGACCTGTTCTTAGCTTATCAGAC miR-21-5p
PCR引物
No.22 CACCGACAGGAGACCTGTTCTTAG PCR引物
No.23 [5-Fam]GGTTGTGCTGAGTCACGAGGTATTCTA PCR引物
实施例3 miRNA作为分泌样本内源质控的筛选分析和测定试验
现有研究证实无细胞分泌液，如唾液、痰液、血浆、血清等均含有一定数量的miRNA。miR-21、miR-16是所有细胞中均有中等到高丰度表达的miRNA。血液中红细胞的数目远超其余各类细胞数目之和，而且，随血液流向全身的所有组织、细胞。红细胞中特有的miR-451,表达量极高，根据我们用miRFLP分析法对血液样本miR-451的检测，每微升血液所拥有的miR-451多达180亿个之多，是各种组织液收集过程中最大的潜在污染源。NCBI-SRA数据库中SRR7545527、SRR7545528、SRR7545529记录了红细胞miRNA的二代测序(NGS)测定结果，表2。
表2血红细胞中相关miRNA的NGS测序读数
结合我们对血液中miR-451浓度的测定结果，可以推算出红细胞中相关miRNA的含量，见表3。
表3 1微升血液所含血红细胞的miRNA浓度
NCBI SRA数据库中，PRJNA445293项目对不同体液中miRNA进行了二代测序，体液miRNA表达谱显示出多样性和特征性，见表4。
表4唾液及血液相关miRNA的NGS测序
这为利用miRNA作为分泌液样本的内源质控基因打下了基础。其中，miR-451被发现存在于大多数组织中，各种体液中也常能发现其存在，通过对唾液干斑样本中miR-16、miR-21和miR-451的测定分析。结果如图4所示，从20个自愿者收集的唾液样本中均测出miR-16和miR-21的表达，而在5个样本中miR-451的检测值低于检测下限(10个分子)。显示miR-16、miR-21是唾液样本潜在的内源标志基因，miR-16在唾液中的表达量，均高于miR-21的表达量，使其成为唾液样本内控标志的首选。
实施例4 Triton X114浓度对RNA病毒的裂解效率测定
去污剂Triton X114对粘多糖、脂类有结合能力，并在低温下与水溶液互溶，在35℃以上温度中，形成脂质体，与水相分离。因此可以利用其特性，在低温下处理样本，保护RNA不受降解。高温下，Triton X114结合脂类，形成油滴，与水相分离，对酶反应影响不大。调整样本裂解液中Triton X114的浓度，用于对含8000个2019-nCoV-N假病毒和200个乙脑灭活病毒进行裂解，经本发明的标准检测流程进行检测，检测结果见图5及表5，
表5 Triton X114浓度对RNA病毒的裂解效率结果
结果显示裂解液中含0.05％-0.1％的Triton X114可以有效地帮助裂解nCoV-N假病毒(慢病毒)和乙脑灭活病毒。
实施例5病毒核酸双向生成检测法检测病毒核酸实验
本实施例利用南京科佰生物科技有限公司生产的nCoV-N假病毒(2019-nCoV-NPseudoVirus Standard Reference，Cat No.CBV3002；Lot；CGD2020022401)为检测对象，检测本发明方法的灵敏度和特异性。将假病毒溶解稀释成1百万/5μL，每管分装5μL，室温干燥，然后56℃干燥灭活30分钟。真空干燥包装，放置室温保存。测定时，用100μL含0.1％Triton X114的稀释液进行裂解，冰浴下，低频(40MHz)超声10分钟。用稀释液进行稀释，取1μL进行检测。用本发明的病毒核酸双向生成检测法进行检测的检测结果见图6，ABI荧光片段图谱显示特定的nCoV-N基因片段的峰，并随加样量升高。检测下限达到2个病毒颗粒。对乙脑灭活病毒/nCoV-N混合样本进行测定，证实乙脑片段和nCoV-N片段的存在，检测灵敏度分别达到25个分子，见表6。
表6乙脑灭活病毒的检测，样本内源miR-16与RNase P基因的效率比较
在同次实验中，我们对肺癌细胞H1299纯化RNA、血浆干斑也进行了测定。结果显示血浆干斑中含有大量的miR-16，荧光读值大于3万，而未能测到RNaseP基因。H1299细胞纯化RNA含有大量的miR-16，也能测出RNaseP基因的表达，但表达丰度比miR-16少60倍。miR-16的表达量远大于RNaseP，并且受蛋白质复合物的保护，是理想的样本质控标志物。实验进一步比较了唾液干斑样本和血浆干斑样本中miR-16和RNaseP基因的表达差异，结果见表7，结果证实了miR-16在这两种体液中的表达。
表7乙脑灭活病毒的检测，样本内源质控基因的效率比较
对咽拭子，鼻拭子样本的比较发现，miR-16在所测定6个不同个体的所有测试的样本中均有表达。如果以RNaseP基因为样本质控，在血浆，咽拭子，鼻拭子样本中均会出现不同程度的漏检，见表8。
表8分泌液样本内源质控基因的效率比较
本实施例所用引物见表9：
表9实施例5所用引物
序号 核酸捕获引物 备注
No.2 GGTTGTGCTGAGTCACGAGGTATTCTAGGCACGCTTCTTAGCGTGCCATCACAACTACAGCCATAACCTTTCCA cCDC-ORF1ab
No.4 GGTTGTGCTGAGTCACGAGGTATTCTAGGCACGCTTCTTAGCGTGCCATTGTGGCATCTCCTGATGAGGTTCCA WHO-ORF1ab
No.6 GGTTGTGCTGAGTCACGAGGTATTCTAGGCACGCTTCTTAGCGTGCCACGCACACAATCGAAGCGCAGTAAGGAT WHO-E
No.8 GGTTGTGCTGAGTCACGAGGTATTCTAGGCACGCTTCTTAGCGTGCCGTTCAATCTGTCAAGCAGCAGCAAAG cCDC-N
No.10 GGTTGTGCTGAGTCACGAGGTATTCTAGGCACGCTTCTTAGCGTGCCAGAACCACGTTTTCTTGGTTCGTC SA14-2
No.11 GGTTGTGCTGAGTCACGAGGTATTCTAGGCACGCTTCTTAGCGTGCCACGGTGAGCGGCTGTCTCCACAA RNase P
No.12 GGTTGTGCTGAGTCACGAGGTATTCTACTAGGCACGCTTCTTAGCGTGCCACGCCAATAT miR-16-5p
适配引物
No.14 CACCGACAGGAGACCTGTTCTTAGACTTAAAAGGTAAGTAT cCDC-ORF1ab
No.15 CACCGACAGGAGACCTGTTCTTAGCAAGTATTGAGTGAAAT WHO-ORF1ab
No.16 CACCGACAGGAGACCTGTTCTTAGACGTTAATAGTTAATAG WHO-E
No.17 CACCGACAGGAGACCTGTTCTTAGATTCAACTCCAGGCAGC cCDC-N
No.18 CACCGACAGGAGACCTGTTCTTAGAACGCCCAGATCCCTAG SA14-1
No.19 CACCGACAGGAGACCTGTTCTTAGGTGTTTGCAGATTTGGA RNase P-p30
No.20 CACCGACAGGAGACCTGTTCTTAGCAGCACGTA miR-16-5p
PCR引物
No.22 CACCGACAGGAGACCTGTTCTTAG PCR引物
No.23 [5-Fam]GGTTGTGCTGAGTCACGAGGTATTCTA PCR引物
实施例6酒精灭活唾液样本与唾液干斑中miR-16和nCoV-N假病毒测定
为了验证75％酒精对唾液样本中内源miRNA及掺入的nCoV-N假病毒的灭菌保存效果，本实施例使用20例自愿者唾液样本与nCoV-N假病毒混和，进行COVID-19患者病毒唾液样本的模拟实验。对照组为直接在0.5ml管中分装的10μL唾液，无菌通风厨中56℃下干燥30分钟，制成干斑，室温保存。棉签对照组，是将分出的100μL唾液，用医用棉签吸干，放置2分钟，75％酒精侵泡，室温保存。唾液假病毒混合样本的制备是用样本稀释液溶解nCoV-N假病毒干粉，再与唾液样本混合。唾液假病毒组唾液中加入不同浓度的nCoV-N假病毒，形成每微升含100，10，1，0.1，0.01个假病毒的唾液样本，以对照组制备同样的方式制成10μL的唾液干斑，及吸附100μL假病毒唾液的酒精灭菌棉签。酒精灭活唾液的收集形式见图1中的A，均室温保存。用本发明病毒核酸双向生成检测法对唾液样本进行检测。唾液干斑直接加入40μL样本稀释液，冰浴下，低频超声10分钟裂解病毒及miRNA复合物。酒精保存的棉签先经过倒置离心，干燥处理，见图1中的B。然后加入60μL稀释液，冰浴下低频超声裂解，图1中的C,D。取8μL进行检测。检测结果显示含1000和10000个假病毒的棉签，检出为阳性，含1-100个假病毒的棉签，部分鉴定为阳性，见表10。
表10 75％酒精灭菌收集的唾液样本中内源质控基因miR-16及掺入的2019-nCoV-N假病毒核酸的检测结果
唾液及痰液对照样本均为nCoV-N阴性。除了检测空白对照，其余样本中均检测出很高的miR-16含量，检出的荧光平均值大于20000。本发明检测方法对唾液干斑及酒精保存的唾液样本的检测灵敏度分别达到200和13个假病毒，但检出的荧光峰值明显低于对相同病毒载量的假病毒干粉样本的直接测定值。
在对假病毒干粉样本的常规检测实验中，nCoV-N假病毒的检测灵敏度为20个病毒。同唾液干斑的检测结果相比，酒精保存的唾液检出率较好，见表11。
表11：酒精灭菌收集的唾液样本中内源质控基因miR-16及参入的2019-nCoV-N假病毒核酸的检测结果
酒精保存的唾液样本，miR-16的检出峰值很高。但假病毒nCoV-N的峰值很低。假病毒唾液混合样本中nCoV-N检测灵敏度较差，及检出率较低，可能受到制备过程中不可避免的因素有关。假病毒干粉经受了再次溶解和干燥处理，唾液富含蛋白酶和核酸酶，对假病毒造成降解。唾液干斑制备经历56℃干燥灭活，对假病毒的降解影响更大。测定时，干斑可以用较少的样本稀释液，而棉签样本需要60-120μL的稀释液进行裂解。
本实施例所用引物的序列见下表11
表11实施例6所用引物序列
实施例7对国家标准SARS-CoV-2病毒核酸的检测实验
中国计量科学研究院生产的新型冠状病毒(2019-nCoV)核糖核酸基因组标准物质(货号：GBW(E)091098)，采用经纯化分离得到的新型冠状病毒核糖核酸基因组作为标准物质原料，涵盖了WHO和中国疾控中心推荐检测的新型冠状病毒全部特征基因：核壳蛋白N基因(全长)、包膜蛋白E基因(全长)和开放阅读框1ab(ORF1ab)基因。该标准物质用于新型冠状病毒核酸检测方法开发、检测试剂盒质量控制与评价，实验室质量控制与测量结果的量值溯源，以及病毒核酸相关研究工作。
本实施例以此SARS-CoV-2国家标准物质(GB-RNA)为检测对象，检测本发明方法对四个新冠病毒核酸靶点的检测灵敏度和特异性，见图7。将GB-RNA复溶后，稀释成1万/5μL，每管分装5μL，真空冷冻干燥。真空干燥包装，放置室温保存。测定时，用100μL含0.1％Triton X114的稀释液进行裂解，冰浴下，低频超声10分钟。用稀释液进行稀释，取1μL进行检测。用本发明的病毒核酸双向生成检测法进行检测的检测结果见图8，ABI荧光片段图谱显示特定的nCoV-N基因片段的峰，并随加样量增大而升高。各个目标靶点的检测下限分别达到16-134个分子。GB-RNA样本中检出到miR-16，并随加样量降低而减少。
本实施例所用引物与实施例6所用引物组合相同。
序列表
<110> 成都诺恩基因科技有限公司
<120> 基于病毒核酸与miRNA双向共生检测2019-nCoV的方法及试剂盒
<130> 20200528
<160> 23
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggttgtgctg agtcacgagg tattctaggc acgcttctta gcgtgccacg attgtgcatc 60
agctgactga agca 74
<210> 2
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggttgtgctg agtcacgagg tattctaggc acgcttctta gcgtgccatc acaactacag 60
ccataacctt tcca 74
<210> 3
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggttgtgctg agtcacgagg tattctaggc acgcttctta gcgtgccatg ttaaaaacac 60
tattagcata agca 74
<210> 4
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggttgtgctg agtcacgagg tattctaggc acgcttctta gcgtgccatt gtggcatctc 60
ctgatgaggt tcca 74
<210> 5
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggttgtgctg agtcacgagg tattctaggc acgcttctta gcgtgccaag actcacgtta 60
acaatattgc agca 74
<210> 6
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggttgtgctg agtcacgagg tattctaggc acgcttctta gcgtgccacg cacacaatcg 60
aagcgcagta aggat 75
<210> 7
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggttgtgctg agtcacgagg tattctaggc acgcttctta gcgtgccatg ccgaggcttc 60
ttagaagcct cag 73
<210> 8
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggttgtgctg agtcacgagg tattctaggc acgcttctta gcgtgccgtt caatctgtca 60
agcagcagca aag 73
<210> 9
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggttgtgctg agtcacgagg tattctaggc acgcttctta gcgtgccata tcttcccacg 60
ggcttgttca ca 72
<210> 10
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggttgtgctg agtcacgagg tattctaggc acgcttctta gcgtgccaga accacgtttt 60
cttggttcgt c 71
<210> 11
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggttgtgctg agtcacgagg tattctaggc acgcttctta gcgtgccacg gtgagcggct 60
gtctccacaa 70
<210> 12
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggttgtgctg agtcacgagg tattctacta ggcacgcttc ttagcgtgcc acgccaatat 60
<210> 13
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggttgtgctg agtcacgagg tattctaggc acgcttctta gcgtgccatc aacatcag 58
<210> 14
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
caccgacagg agacctgttc ttagacttaa aaggtaagta t 41
<210> 15
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
caccgacagg agacctgttc ttagcaagta ttgagtgaaa t 41
<210> 16
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
caccgacagg agacctgttc ttagacgtta atagttaata g 41
<210> 17
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
caccgacagg agacctgttc ttagattcaa ctccaggcag c 41
<210> 18
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
caccgacagg agacctgttc ttagaacgcc cagatcccta g 41
<210> 19
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
caccgacagg agacctgttc ttaggtgttt gcagatttgg a 41
<210> 20
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
caccgacagg agacctgttc ttagcagcac gta 33
<210> 21
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
caccgacagg agacctgttc ttagcttatc agac 34
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
caccgacagg agacctgttc ttag 24
<210> 23
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ggttgtgctg agtcacgagg tattcta 27

Claims (7)

1.一种非诊断目的的基于病毒核酸与miRNA双向共生检测2019-nCoV的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）待检测样本病毒RNA裂解；
（2）病毒RNA捕获和miRNA捕获；
（3）扩增片段双向生成：进行RT反应得到病毒RNA衍生片段和miRNA衍生片段；
（4）PCR同步扩增：将病毒RNA衍生片段和miRNA衍生片段进行同步扩增；
（5）PCR产物的荧光片段长度多态性分析；
其中，步骤（2）中，所述病毒RNA捕获和miRNA捕获所用的核酸捕获引物组为SEQ ID NO.1-13所示碱基序列的引物组合；步骤（3）中，所述RT反应还加入适配引物组，所述适配引物组为SEQ ID NO .14-21所示碱基序列的引物组合；步骤（4）中，所述PCR同步扩增的PCR引物SEQ ID NO .22-23所示碱基序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，加入细胞裂解液进行RNA裂解。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述细胞裂解液为去污剂。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述去污剂为Triton X114。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述待检测样本采用70%-75%酒精进行干燥脱水和灭活。
6.基于权利要求1-5任意一项的方法的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：细胞裂解液、核酸捕获引物组、适配引物组和PCR引物；
其中，所述核酸捕获引物组为SEQ ID NO .1-13所示碱基序列的引物组合；所述适配引物组为SEQ ID NO .14-21所示碱基序列的引物组合；所述PCR引物SEQ ID NO .22-23所示碱基序列。
7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于：所述细胞裂解液为去污剂。
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