CN111471803A - 一种新型冠状病毒covid-19感染检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型冠状病毒COVID‑19感染检测试剂盒，属于体外诊断试剂领域。本发明试剂盒包括检测新型冠状病毒COVID‑19特异基因ORF1ab的引物与探针，检测阳性内标基因GAPDH的引物与探针，检测外源监控基因EGFP的引物与探针，序列分别如SEQ ID NO.1‑9所示；该试剂盒在保证检测结果准确性和稳定性和前提下，提高检测通量。本发明使用Trizol试剂作为样品保存液，保证了生物安全性、核酸完整性、病毒载量。本发明在提取RNA时引入外源监控基因的RNA，可以监控整个提取检测过程的RNA损失情况，保证整个操作过程的规范性，排除由于操作过程任何步骤的缺陷造成的假阴性。

Description

一种新型冠状病毒COVID-19感染检测试剂盒

技术领域

本发明属于体外诊断试剂领域，具体涉及一种新型冠状病毒COVID-19感染检测试剂盒。

背景技术

新冠病毒肺炎疫情发生以来，核酸检测一直是临床诊断、康复出院、解除隔离的“金标准”。目前普遍使用的荧光定量PCR方法步骤包括：样品采集，核酸提取，荧光定量PCR检测，通过检测送检样本中是否含有新冠病毒的特异性基因，进而判断样本中是否含有新型冠状病毒。

但是目前核酸检测普遍存在假阴性和假阳性的问题，也就是准确性和灵敏性的问题。这主要是由于新冠病毒是一种RNA病毒，而RNA酶具有一定的稳定性，且来源广泛，人体及环境中无处不在的RNA酶，可能会在样品采集、运输、保存、提取和检测的各个环节，造成RNA的降解；除此之外还有采样体积大，对病毒载量造成稀释；检测结果无法量化不同病人的病毒载量；整个过程缺乏监控等。对于检测结果，一方面无法判断是否是采样失败或样品稀释造成的病毒载量不足，另一方面无法确认实验操作中的核酸损失情况，也无法对不同病人携带的病毒载量进行准确描述。严重阻碍疑似病例的确诊和对潜在带毒者的筛查，以及对于患者病程的监控。

关于样品采集，目前常用的方法主要有两种：非灭活的病毒保存液和灭活的病毒保存液，采样体积一般是3-4mL，现有方法通常会取其中的0.2-1mL样本进行核酸提取，稀释了样品，降低了潜在的病毒载量，进而使得检测灵敏度大大降低。如果采用非灭活的病毒保存液，可以通过增加离心收集细胞沉淀的步骤，获得全部样品进行后续裂解和提取，但同时增加了运输过程的生物危害性。

关于样品提取，现有方法常用的是直接进行柱提法和磁珠法提取，但是提取过程中可能会由于操作流程或者人为因素带来样本损失，从而造成样本提取失败，如何界定采样失败或者样品提取失败所造成的假阴性，并且不同样本之间提取效率差异如何界定，有待解决。

关于RT-QPCR检测，对于检测结果的判定，仅仅对于病毒特异基因的阴性检测结果，无法判定是否是由于采样运输失败或者是核酸提取失败而造成的假阴性，需要设置阳性内标基因。同时，相对于RT和QPCR分步法和染料法检测，一步探针法检测是更准确和高效的检测方法，但是由于该方法没有消解基因组污染的步骤，阳性内标基因带来的基因组检测干扰，也会误导对样品合格性的判定。增加内标基因的检测，提高了对结果准确性的解读，但是也限制了检测通量，增加了检测成本。

关于气溶胶污染造成的假阳性的问题，普遍使用的方法是严格进行实验室分区管理，设置阴性对照。除此之外，反应中使用UDG酶，也是非常有效的防止气溶胶污染的手段。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术存在的缺点与不足，提供一种新型冠状病毒COVID-19感染检测试剂盒；此外，还提供新型冠状病毒COVID-19样品的保存方法以及RNA提取方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种新型冠状病毒COVID-19感染检测试剂盒，包含：检测新型冠状病毒COVID-19特异基因的引物与探针，检测阳性内标基因的引物与探针，检测外源监控基因的引物与探针。其中，新型冠状病毒COVID-19特异基因与阳性内标基因进行双重PCR。

进一步地，所述的新型冠状病毒COVID-19特异基因为ORF1ab，阳性内标基因为GAPDH，外源监控基因为EGFP。

更进一步地，检测新型冠状病毒COVID-19特异基因ORF1ab的引物和探针为：

ORF1ab F引物：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA(SEQ ID NO.1)，

ORF1ab R引物：ACGATTGTGCATCAGCTGA(SEQ ID NO.2)，

ORF1ab探针：5’FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3’(SEQ ID NO.3)；

检测阳性内标基因GAPDH的引物与探针为：

GAPDH F引物：ATCAGCAATGCCTCCTGCAC(SEQ ID NO.4)，

GAPDH R引物：ACAGTCTTCTGGGTGGCAGT(SEQ ID NO.5)，

GAPDH探针：5’VIC-ACCAACTGCTTAGCACCCCTG-BHQ1-3’(SEQ ID NO.6)；

检测外源监控基因EGFP的引物与探针为：

EGFP F引物：ATGTTGTGGCGGATCTTGAAGT(SEQ ID NO.7)，

EGFP R引物：GTCTATATCATGGCCGACAAGCA(SEQ ID NO.8)，

EGFP探针：5’FAM-CACCTTGATGCCGTTCT-BHQ1-3’(SEQ ID NO.9)。

进一步地，所述的新型冠状病毒COVID-19感染检测试剂盒，包含dUTP/dNTP Mix，UDG酶，荧光定量PCR试剂等。

进一步地，所述的新型冠状病毒COVID-19感染检测试剂盒，包含新型冠状病毒COVID-19特异基因、阳性内标基因和外源监控基因的RNA标准品。

一种新型冠状病毒COVID-19样品的保存方法，为使用Trizol试剂保存。进一步地，所述的样品包括鼻拭子、口咽拭子、脑脊液、血液等样品；样品保存体积为1mL。

一种新型冠状病毒COVID-19RNA的提取方法，为Trizol法提取RNA，在提取RNA前往样品中加入已知分子数的外源监控基因的RNA。进一步地，所述的外源监控基因为EGFP。

本发明具有的有益效果：

(1)为了保证样品采集和运输过程中的防止RNA降解和生物安全性问题，本发明选用Trizol试剂作为裂解、提取和保存试剂。Trizol试剂主要由胍盐配合吐温、苯酚等试剂配置而得。胍盐成分可以有效抑制RNA酶活性，保证了RNA的完整性；同时试剂成分对可能存在的病毒进行充分灭活，保证了生物安全性。并且采样体积只有1mL，采集的所有样品均可进行核酸提取，进一步提高了病毒载量，增加了检测灵敏度，降低了采样成本。

(2)设置外源监控基因EGFP，EGFP基因检测的引物和探针经过比对，与新冠病毒和人类基因组均无同源匹配。在RNA提取前加入已知分子数的EGFP的RNA，QPCR检测中，根据EGFP标准曲线，确定样品中剩余的EGFP分子数，进而得出EGFP的得率，间接反映样品中的RNA提取和检测得率。通过外源监控基因可以监控整个提取检测过程的RNA损失情况，保证整个操作过程的规范性，排除由于操作过程任何步骤的缺陷造成的假阴性。

(3)设置阳性内标基因GAPDH，GAPDH基因检测的引物和探针经过比对，与新冠病毒无匹配；且引物跨越内含子设计，避免基因组污染。阳性内标基因可以监控样品采集和运输过程损耗等造成的假阴性问题，评价样品本身是否合格。

(4)设定标准品，假病毒RNA标准品为10^5分子，10^4分子，10^3分子，10^2分子，10分子和1分子。标准品与样品同批检测，绘制标准曲线，根据标准曲线对检测结果进行绝对定量，对病人样品的病毒载量进行定量分析。对于感染的样品，可以给出感染的新冠病毒个数，并根据现有的知识和算法，推测可能的感染程度，每个反应的检测灵敏度低至10个分子。

(5)选定病毒特异基因ORF1ab和人的GAPDH作为检测靶标，进行双重PCR，在保证结果准确性和稳定性的同时，提高检测通量。病毒特异基因ORF1ab经比对，在已下载的118个新冠病毒基因组中序列保守；在冠状病毒hku1、冠状病毒nl63、呼吸道合胞体病毒、人类偏肺病毒、鼻病毒、人博卡病毒、MERS病毒和SARS病毒无匹配，表明ORF1ab检测引物和探针保守性和特异性良好。

(6)在反应体系中，使用dUTP/UDG防污染***，含有优化比例的dUTP/dNTP Mix，并加入了来源于嗜冷海洋细菌的Heat-labile Uracil-DNA Glycosylase。Heat-labileUracil-DNA Glycosylase在室温下具有很高的活性，在反应体系混合过程中即可充分降解含U的双链DNA污染。当反应体系升温至50℃时，Heat-labile Uracil-DNA Glycosylase迅速彻底失活，维持cDNA的完整性，保证检测灵敏度不受影响，排除气溶胶污染带来的假阳性。

附图说明

图1是用于新型冠状病毒COVID-19感染检测的全套技术方案的流程图。

图2是ORF1ab和GAPDH的扩增曲线图，左和右分别为2号和5号样本的扩增曲线图。

图3是ORF1ab和GAPDH二重PCR检测、单基因检测的标准曲线图。

具体实施方式

用于新型冠状病毒COVID-19感染检测的全套技术方案的流程图如图1所示，具体包括以下步骤：

一、样品采集

1)鼻拭子和口咽拭子取样

取1mL的Trizol试剂(ambion，15596-018)加入到2mL样品采集管中，可常温运输，采集的鼻咽拭子样品直接加入到采样管，浸入Trizol试剂，折断多余的拭子杆，旋紧瓶盖，装入生物材料袋，干冰运输样品。

2)脑脊液样品取样

脑脊液样品与Trizol试剂等体积混合，例如4.5mL脑脊液+4.5mL的Trizol试剂混合。

3)血液样品取样

抗凝血样品与Trizol试剂按照体积比1:2混合，例如2mL抗凝血+4mL的Trizol试剂混合。

二、核酸提取

在生物安全二级实验室，主要是生物安全柜内进行以下操作：

(1)将样品管放置冰上解冻，样品管中的样品转移至1.5mL EP管，用枪头轻轻挤压拭子头，将样品充分挤压出来，完全转移至EP管。大约可以取出700μL Trizol保存的样品，向其中加入2.5*10^4分子数的EGFP标准品RNA，充分混匀后进行后续核酸提取。

(2)每个样品加入140μL氯仿(1/5样品体积)，旋涡震荡混匀5s。

(3)将样品依次放入冷冻离心机，4℃13200rpm离心20分钟。

(4)离心同时，准备另一套EP管，每支管子依次加入1μL糖原(20mg/mL)、35μL的3MpH5.2醋酸钠和350μL的异丙醇。

(5)离心结束后，将离心机中样品管小心取出来，依次放在EP管架。EP管内液体分为3层，中号枪头套小号枪头小心吸取上层水相，不要碰到中间层或者下面的有机层。大约能够吸取到约350μL水相(如不小心吸到中间层或下层液体，轻轻将枪头内非水相液体打掉，看剩余液体是否保持水相纯净，是则保留，不是则弃掉)，依次加入到上个步骤准备好的EP管内。

(6)旋涡震荡仪震荡5s，充分混匀EP管内液体，-20℃沉淀30分钟。

(7)沉淀后，4℃13200rpm离心20分钟，肉眼可见RNA白色沉淀在离心管底部。

(8)大枪头套小枪头，沿着沉淀对面管壁，轻轻吸取并弃掉上清液，此时的上清不需要弃的很完全，因为后面还要进行乙醇洗涤。

(9)每管内加入1mL的75％乙醇，旋涡震荡5s，可见白色沉淀变得更加清晰可见，4℃13200rpm离心5分钟，大枪头套小枪头，沿着沉淀对面管壁，轻轻吸取并弃掉上清液；此时管壁还会有少量残余的乙醇，4℃13200rpm离心30s，再用小号枪头小心吸取残留液体。(如果是同时处理批量样品，前面的样品去除乙醇上清时，需要关闭管盖，避免后续干燥时，同批样品干燥时间不一致)

(10)打开盖子，室温干燥3min，白色沉淀刚刚变为透明状时为干燥完全的最佳时间，干燥时间过长或者过短，都会影响RNA质量。

(11)加入15μL DEPC水回溶。RNA可直接进行RT-QPCR实验或者转出至-70℃冰箱保存。

三、荧光定量PCR检测

(1)RNA样品放置于4℃解冻，相关试剂解冻；根据需要检测的样品数，配置相关的Mix，同时设置阴性对照样品(实验使用的DEPC水)，阳性对照标准品ORF1ab RNA、GAPDHRNA和EGFP RNA(分子数分别为10^5分子，10^4分子，10^3分子，10^2分子，10分子和1分子)。

(2)配置Taqman探针法QPCR体系

引物探针信息：

表1

ORF1ab和GAODH二重PCR检测：

表2

EGFP检测：

表3

(3)反应程序

表4

(4)结果分析

收集荧光时间可以根据不同机型做适当调整，本程序是根据ABI Quant Studio6Flex荧光定量PCR仪设置。

ABI Quant Studio 6Flex荧光定量PCR仪基线和阈值设定方法：

基线(baseline)设定：去除自动设定，选择手动设定，基线起点设为3，终点设为15。

阈值(threshold)设定：去除自动设定，选择手动设定，对各通道阈值分别进行设定，设定某通道阈值线时，首先选中检测的阴性对照品，去掉勾选的自动阈值线，然后手动调整阈值线，以阈值线刚好超过正常空白对照品通道扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点为准。

(5)结果判定

a)若待测样本ORF1ab扩增曲线为典型的S型曲线，且ORF1ab的Ct值≤38，可以判定为阳性；

b)若待测样本ORF1ab的扩增曲线不呈S型曲线，或者ORF1ab无Ct值，且内参的Ct值≤32，内参扩增曲线为典型的S型曲线，可以判定为阴性；

c)若待测样本ORF1ab扩增曲线呈S型曲线，且检测样本的Ct值＞38，需要复检，根据上述情况判定；

d)若待测样本ORF1ab的扩增曲线不呈S型曲线，或者ORF1ab无Ct值，且内参的Ct值＞32或无数值，内参扩增曲线不呈典型的S型曲线，判定样品不合格，需要重新检测。

下面结合具体检测实施例进一步体现本发明的优点和效果。

实施例1

使用上述方案进行了11个人的鼻拭子和口咽拭子以及8个病人脑脊液和血液样品的采集、RNA提取以及荧光定量PCR检测，结果见表1和图2。

鼻拭子和口咽拭子的阳性内参基因GAPDH检测的Ct值在12-25之间(表5)，脑脊液样品的阳性内参基因GAPDH检测的Ct值在23-31之间，血液样品的阳性内参基因GAPDH检测的Ct值在16-18之间(表6)，均满足样品保存和提取合格的要求；另外Trizol试剂保存和提取的脑脊液样品的RNA，在后续RNA-seq检测中，发现有新冠病毒，这也是在现有方法的保存和提取中没有发现的，充分证明了Trizol试剂保存样品和进行核酸提取的可靠性、稳定性和灵敏性。

表5

表6

准确检出COVID-19病人口咽拭子样品中检测GAPDH和ORF1ab拷贝数，以及外源加入的EGFP拷贝数(表5)：在所检测的11个鼻拭子和口咽拭子中，根据标准曲线计算得出，检测到的阳性内参基因GAPDH的分子数在7500到3*10^8分子数之间，表征着不同样本取到的细胞数量多少不一；检测到的EGFP分子数为401.1到4300.2分子之间，根据EGFP起始投入量5000分子，得出EGFP的回收率为8％到86％之间(表5)；另外本次检测到2个阳性样本，通过ORF1ab的标准曲线，得出检测的ORF1ab分子数，间接得出病人检测到的病毒拷贝数，发现同样是阳性样本，但是病毒载量有很大的差异(图2)，比如2号样本的病毒载量为4*10^5，而5号病人的病毒载量仅为0.1。由此推断，2号病人可能处于高度传染期，因为含有的病毒载量高，需要高度重视隔离，相关的医护人员也要格外注重防护；而5号病人可能处于刚刚感染，或者快要治愈阶段，感染性不强，仍然需要隔离和防护，但是等级较前者可以降低。因此，本发明的检测结果，可以根据EGFP回收率，准确给出全流程RNA提取和检测效率的结果；根据GAPDH结果，给出样本合格性的结果；并且给出阳性样本准确的病毒感染拷贝数，有助于临床判断。

实施例3

使用上述荧光定量PCR检测方法对GAPDH、ORF1ab标准品进行单基因检测和二重PCR检测，结果见表7和图3。从结果中可以看出，同样分子数的标准品，单基因检测的Ct值与二重PCR检测的Ct值几乎无差别，说明引物特异性较好，并且2组引物和探针之间无明显影响，线性关系也很好。

表7

上述实施例为本发明列举的部分实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉生命之美科技有限公司

<120> 一种新型冠状病毒COVID-19感染检测试剂盒

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccctgtgggt tttacactta a 21

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acgattgtgc atcagctga 19

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccgtctgcgg tatgtggaaa ggttatgg 28

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atcagcaatg cctcctgcac 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acagtcttct gggtggcagt 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

accaactgct tagcacccct g 21

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgttgtggc ggatcttgaa gt 22

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtctatatca tggccgacaa gca 23

<210> 9

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

caccttgatg ccgttct 17

Claims (10)

1.一种新型冠状病毒COVID-19感染检测试剂盒，其特征在于：包含检测新型冠状病毒COVID-19特异基因的引物与探针、检测阳性内标基因的引物与探针、检测外源监控基因的引物与探针。

2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒COVID-19感染检测试剂盒，其特征在于：新型冠状病毒COVID-19特异基因与阳性内标基因进行双重PCR。

3.根据权利要求1所述的新型冠状病毒COVID-19感染检测试剂盒，其特征在于：所述的新型冠状病毒COVID-19特异基因为ORF1ab，阳性内标基因为GAPDH，外源监控基因为EGFP。

4.根据权利要求3所述的新型冠状病毒COVID-19感染检测试剂盒，其特征在于：

检测新型冠状病毒COVID-19特异基因ORF1ab的引物和探针为：

ORF1ab F引物：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA，

ORF1ab R引物：ACGATTGTGCATCAGCTGA，

ORF1ab探针：5’FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3’；

检测阳性内标基因GAPDH的引物与探针为：

GAPDH F引物：ATCAGCAATGCCTCCTGCAC，

GAPDH R引物：ACAGTCTTCTGGGTGGCAGT，

GAPDH探针：5’VIC-ACCAACTGCTTAGCACCCCTG-BHQ1-3’；

检测外源监控基因EGFP的引物与探针为：

EGFP F引物：ATGTTGTGGCGGATCTTGAAGT，

EGFP R引物：GTCTATATCATGGCCGACAAGCA，

EGFP探针：5’FAM-CACCTTGATGCCGTTCT-BHQ1-3’。

5.根据权利要求1-4任一项所述的新型冠状病毒COVID-19感染检测试剂盒，其特征在于：包含dUTP/dNTP Mix、UDG酶、荧光定量PCR试剂。

6.根据权利要求1-4任一项所述的新型冠状病毒COVID-19感染检测试剂盒，其特征在于：包含新型冠状病毒COVID-19特异基因、阳性内标基因和外源监控基因的RNA标准品。

7.一种新型冠状病毒COVID-19样品的保存方法，其特征在于：为使用Trizol试剂保存；所述的样品包含鼻拭子、口咽拭子、脑脊液、血液。

8.根据权利要求7所述的新型冠状病毒COVID-19样品的保存方法，其特征在于：样品保存体积为1mL。

9.一种新型冠状病毒COVID-19RNA的提取方法，其特征在于：为Trizol法提取RNA，在提取RNA前往样品中加入已知分子数的外源监控基因的RNA。

10.根据权利要求9所述的新型冠状病毒COVID-19RNA的提取方法，其特征在于：所述的外源监控基因为EGFP。

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