CN113832199A - 重组微生物及其用途 - Google Patents

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Abstract

将细菌遗传改造以产生3‑羟基丙酸盐(3‑HP)。该细菌是一氧化碳营养产乙酸细菌。该细菌使用用于固定CO/CO2的Wood‑Ljungdahl途径而产生乙酰辅酶A。引入来自含有此类酶的细菌的丙二酰辅酶A还原酶。另外，还可引入乙酰辅酶A羧化酶。3‑HP的生产可通过乙酰辅酶A羧化酶的过度生产或通过生物素的过度生产得到改善。这可通过改善的启动子或更高的拷贝数或催化上更有效的酶来实现。

Description

重组微生物及其用途
本申请为分案申请，其原申请的申请日为2013年5月30日，申请号为201380040793.3(国际申请号PCT/NZ2013/000092)，名称为“重组微生物及其用途”。
技术领域
本发明涉及用于通过对包含CO和/或CO2的底物的微生物发酵生产3-羟基丙酸盐[3-Hydroxypropionate,3-HP]的重组微生物和方法。
背景技术
3-羟基丙酸盐[3-HP]是平台化学品，充当用于生产聚合物材料的前体和化学原料。聚(3-羟基丙酸)[P(3-HP)]是具有有希望的特征例如罕见的高热稳定性的生物可降解聚合物。
3-HP可用于获得许多有价值的工业化学品，包括：用于制造油漆、纸张、粘合剂、纺织品、特种涂料、油墨和超吸收性聚合物聚丙烯酸酯的丙烯酸；用作溶剂、粘合剂、化妆品或制备地毯和纺织品中使用的聚对苯二甲酸丙二酯的1,3-丙二醇；用于制备食物、用作饲料添加剂和营养工业中的防腐剂的3-羟基丙醛(3-hydroxypropinaldehyde)。
3-HP被美国能源部列为第三重要的可再生化学品，并且对于3-HP的全球市场缺口估计为每年363万吨(Paster et al，2003,US DOE报告：48–49)。
本发明的目的是提供用于通过微生物发酵生产3-HP的重组微生物和方法，所述方法可提供超过已知方法的一个或多个优点，或至少为公众提供有用的选择。
发明内容
总的来说，本发明尤其提供了用于通过对包含CO和/或CO2的底物的微生物发酵生产3-HP的方法，以及在此类方法中使用的重组微生物。它组合两种不同的CO2固定途径以产生单一代谢产物。
在第一个方面，本发明提供了能够通过对包含CO和/或CO2的底物发酵产生3-HP以及任选的一种或多种其他产物的厌氧产乙酸重组微生物。
在一个特定实施方案中，微生物被改造为适于表达3-HP生物合成途径中的一种或多种酶(或其一个或多个亚基)，所述酶并非天然存在于用于获得所述重组微生物的亲本微生物中。在另一个实施方案中，微生物被改造为适于过表达3-HP生物合成途径中的一种或多种酶(或其一个或多个亚基)，所述酶天然存在于用于获得所述重组微生物的亲本微生物中。在一个实施方案中，微生物被改造为适于表达3-HP生物合成途径中的一种或多种酶(或其一个或多个亚基)，所述酶并非天然存在于亲本微生物中，并且过表达3-HP生物合成途径中的一种或多种酶(或其一个或多个亚基)，所述酶天然存在于亲本微生物中。
在一个实施方案中，所述一种或多种酶选自：丙二酰辅酶A还原酶(EC 1.2.1.75)；乙酰辅酶A羧化酶(ACC)(EC 6.4.1.2)；以及其中任何一种的功能等价变体。
在一个实施方案中，所述亲本微生物能够发酵包含CO和/或CO2的底物，以产生乙酰辅酶A，但不能将乙酰辅酶A转化为3-HP，并且重组微生物被改造为适于表达涉及乙酰辅酶A转化为3-HP的一种或多种酶(或其一个或多个亚基)。
在一个实施方案中，所述微生物包含被改造为适于增加所述亲本微生物天然包含的一种或多种核酸的表达的一种或多种外源核酸，并且所述一种或多种核酸编码上文提及的酶中的一种或多种(或其一个或多个亚基)。
在一个实施方案中，被改造为适于增加表达的一种或多种外源核酸是调节元件。在一个实施方案中，所述调节元件是启动子。
在一个实施方案中，所述启动子是组成型启动子。在一个实施方案中，所述启动子选自Wood-Ljungdahl基因簇或磷酸转乙酰酶/乙酸激酶操纵子启动子。
在一个实施方案中，该微生物包含编码并被改造为适于表达上文提及的酶中的一种或多种(或其一个或多个亚基)的一种或多种外源核酸。在一个实施方案中，该微生物包含编码并被改造为适于表达酶中的至少两种(或其一个或多个亚基)的一种或多种外源核酸。
在一个实施方案中，所述一种或多种外源核酸是编码上文提及的酶中的一种或多种的任何组合的核酸构建体或载体，在一个特定实施方案中，是编码上文提及的酶中的一种或多种的任何组合的质粒。
在一个实施方案中，所述外源核酸是表达质粒。
在一个实施方案中，所述亲本微生物选自厌氧产乙酸菌。
在一个特定实施方案中，所述亲本微生物选自一氧化碳营养产乙酸细菌，在一个实施方案中，选自自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、扬氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)、拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)、食羰基化物梭菌(Clostridiumcarboxidivorans)、德氏梭菌(Clostridium drakei)、粪味梭菌(Clostridiumscatologenes)、乙酸梭菌(Clostridium aceticum)、蚁酸乙酸梭菌(Clostridiumformicoaceticum)、大梭菌(Clostridium magnum)、食甲基丁酸杆菌(Butyribacteriummethylotrophicum)、伍氏乙酸杆菌(Acetobacterium woodii)、巴氏嗜碱菌(Alkalibaculum bacchii)、Blautia producta、淤泥真杆菌(Eubacterium limosum)、热乙酸穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、热自养穆尔氏菌(Moorellathermautotrophica)、卵形鼠孢菌(Sporomusa ovata)、Sporomusa silvacetica、球形鼠孢菌(Sporomusa sphaeroides)、普氏产醋杆菌(Oxobacter pfennigii)和凯伍热厌氧菌(Thermoanaerobacter kiuvi)。
在一个实施方案中，所述亲本微生物是自产乙醇梭菌或扬氏梭菌。在一个特定实施方案中，所述微生物是自产乙醇梭菌DSM23693。在另一个特定实施方案中，所述微生物是扬氏梭菌DSM13528(或ATCC55383)。
在一个实施方案中，所述亲本微生物缺乏编码丙二酰辅酶A还原酶和/或乙酰辅酶A羧化酶或者其一个或多个亚基的一种或多种基因。
在第二个方面，本发明提供了编码一种或多种酶(或其一个或多个亚基)的核酸，当在微生物中表达时，其允许该微生物通过对包含CO和/或CO2的底物的发酵产生3-HP。
在一个实施方案中，所述核酸编码两种或更多种酶(或其一个或多个亚基)，当在微生物中表达时，其允许该微生物通过对包含CO的底物的发酵产生3-HP。
在一个实施方案中，所述酶选自丙二酰辅酶A还原酶和乙酰辅酶A羧化酶，以及其任何一种或多种的功能等价变体。
在一个实施方案中，所述核酸以任何次序包含编码丙二酰辅酶A还原酶、乙酰辅酶A羧化酶或其任何一种或多种的功能等价变体的核酸序列。
在一个实施方案中，编码丙二酰辅酶A还原酶的核酸具有SEQ ID NO:1或GI:163848165,Caur 2614的序列，或者是其功能等价变体。
在一个实施方案中，编码乙酰辅酶A羧化酶的核酸包含序列SEQ ID NO:18、20、22和24(或CLJU_c42100-40,GI:9447826-31和GI:163847210-11,Caur_1647-48，GI:163849262,Caur_3739，GI:163848951,Caur_3421，GI:163846951,Caur_1378)，或其任何一种或多种的功能等价变体。乙酰辅酶A羧化酶可包含多个亚基。需要时，这些可在一种或多种核酸上编码。
在一个实施方案中，本发明的核酸还包含启动子。在一个实施方案中，所述启动子允许所述基因在其控制下的组成型表达。在特定实施方案中，使用Wood-Ljungdahl簇启动子。在另一个特定实施方案中，使用磷酸转乙酰酶/乙酸激酶操纵子启动子。在一个特定实施方案中，所述启动子来自自产乙醇梭菌。
在第三个方面，本发明提供了包含第二个方面的一种或多种核酸的核酸构建体或载体。
在一个特定实施方案中，所述核酸构建体或载体是表达构建体或载体。在一个特定实施方案中，所述表达构建体或载体是质粒。
在第四个方面，本发明提供了包含第七个方面的核酸中的任何一种或多种或者第三个方面的载体或构建体的宿主生物。
在第五个方面，本发明提供了包含如本发明的第三个方面中提及的表达构建体或载体以及甲基化构建体或载体的组合物。
优选地，该组合物能够产生根据本发明的第一个方面的重组微生物。
在一个特定实施方案中，所述表达构建体/载体和/或甲基化构建体/载体是质粒。
在第六个方面，本发明提供了通过包括使用本发明的第一个方面的重组微生物发酵包含CO和/或CO2的底物的微生物发酵，用于生产3-HP以及任选的一种或多种其他产物的方法。
在一个实施方案中，该方法包括下述步骤：
(a)向含有本发明的第一个方面的一种或多种微生物的培养物的生物反应器中提供包含CO和/或CO2的底物；和
(b)使生物反应器中的培养物厌氧发酵，以产生3-HP。
在一个实施方案中，该方法包括下述步骤：
(a)在由工业过程产生的含CO和/或CO2的气体释放到大气中之前，捕获所述气体；
(b)通过含有本发明的第一个方面的一种或多种微生物的培养物厌氧发酵含CO和/或CO2的气体，以至少产生3-HP。
在所述方法方面的特定实施方案中，所述微生物维持在水性培养基内。
在所述方法方面的特定实施方案中，所述底物的发酵在生物反应器中发生。
优选地，所述包含CO和/或CO2的底物是包含CO和/或CO2的气态底物。在一个实施方案中，所述底物包含工业废气。在某些实施方案中，所述气体是钢铁厂废气或合成气。
在特定实施方案中，所述底物是包含CO的底物。
在其中所述底物包含CO2但不含CO的本发明的实施方案中，所述底物优选地还包含H2。
在一个实施方案中，所述底物包含CO和CO2。在一个实施方案中，所述底物包含CO2和H2。在另一个实施方案中，所述底物包含CO、CO2和H2。
在一个实施方案中，所述底物通常含有较大比例的CO，例如按体积计至少约20％至约100％CO，按体积计20％至70％CO，按体积计30％至60％CO，以及按体积计40％至55％CO。在特定实施方案中，所述底物包含按体积计约25％、或约30％、或约35％、或约40％、或约45％、或约50％CO、或约55％CO、或约60％CO。
在某些实施方案中，该方法还包括从发酵液中回收3-HP以及任选的一种或多种其他产物的步骤。
在第七个方面，本发明提供了通过第六个方面的方法产生的3-HP。
在另一个方面中，本发明提供了用于产生本发明的第一个方面的微生物的方法，所述方法包括用一种或多种外源核酸转化亲本微生物，使得该微生物能够通过对包含CO和/或CO2的底物的发酵，产生3-HP以及任选的一种或多种其他产物，其中所述亲本微生物不能通过对包含CO和/或CO2的底物的发酵产生3-HP。
在一个特定实施方案中，用经改造适于表达3-HP生物合成途径中的一种或多种酶的一种或多种外源核酸转化亲本微生物，所述一种或多种酶并非天然存在于所述亲本微生物中。在另一个实施方案中，用经改造适于过表达3-HP生物合成途径中的一种或多种酶的一种或多种核酸转化亲本微生物，所述一种或多种酶天然存在于所述亲本微生物中。在另一个实施方案中，将亲本微生物用经改造适于表达3-HP生物合成途径中的一种或多种酶(所述一种或多种酶并非天然存在于所述亲本微生物中)并且过表达3-HP生物合成途径中的一种或多种酶(所述一种或多种酶天然存在于亲本微生物中)的一种或多种外源核酸转化。
在某些实施方案中，所述一种或多种酶是如本文所描述。
在某些实施方案中，所述亲本微生物是如上文所描述。
根据一个实施方案，本发明提供了用于将CO或CO2转化成3-羟基丙酸盐(3-HP)的方法。将含CO和/或含CO2的气态底物传送至含有在培养基中的一氧化碳营养产乙酸细菌的培养物的生物反应器，使得所述细菌将CO和/或CO2转化为3-HP。所述一氧化碳营养产乙酸细菌被遗传改造为表达丙二酰辅酶A还原酶。它们还表达不论是天然的还是外源的乙酰辅酶A羧化酶。将3-HP从所述生物反应器中回收。
根据另一个实施方案，本发明提供了分离的、遗传改造的一氧化碳营养产乙酸细菌，其包含编码丙二酰辅酶A还原酶的核酸。所述核酸对于所述宿主细菌而言是外源的。该细菌表达丙二酰辅酶A还原酶，并且该细菌获得将三个CO或CO2分子固定到一个3-羟基丙酸盐(3-HP)分子内的能力。丙二酰辅酶A还原酶通常与SEQ ID NO:1的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少85％相同。
该细菌还可包含编码乙酰辅酶A羧化酶的外源核酸。乙酰辅酶A羧化酶通常与SEQID NO:18-21的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少85％相同。核酸可与启动子可操作地连接。核酸可已经是密码子优化的。所述核酸或所编码的羧化酶可来自非硫、光合作用细菌。该细菌可选自自产乙醇梭菌、扬氏梭菌、拉氏梭菌、食羰基化物梭菌、德氏梭菌、粪味梭菌、乙酸梭菌、蚁酸乙酸梭菌、大梭菌、食甲基丁酸杆菌、伍氏乙酸杆菌、巴氏嗜碱菌、Blautiaproducta、淤泥真杆菌、热乙酸穆尔氏菌、热自养穆尔氏菌、卵形鼠孢菌、Sporomusasilvacetica、球形鼠孢菌、普氏产醋杆菌和凯伍热厌氧菌。所述外源核酸的供体细菌可以是非硫、光合作用细菌，例如橙色绿屈挠菌(Chloroflexus auranticus)、生金球形菌属(Metallosphaera)和硫化叶菌属(Sulfolobus)种。
遗传改造的细菌可通过在包含气态碳源的培养基中生长而培养。所述碳源可包含CO和/或CO2，其可用作能源或碳源中的任一种或两者。该细菌可任选地在严格的厌氧条件下生长。所述碳源可包含工业废弃物或废气。
本发明还可在广义上被说成单独地或共同地包含在本申请的说明书中个别或共同提及或指出的部分、元素和特征，以及包含所述部分、元素或特征的两个或更多个的任何或所有组合，并且当在本文中提及在本发明涉及的领域中具有已知等价物的特定整数时，此类已知等价物应被认为如同单独提出一样纳入本文。
附图说明
应从其所有新颖的方面加以考虑的本发明的这些及其他方面将通过下述参考附图的描述变得显而易见，所述描述仅作为示例给出，在所述附图中：
图1：用于由3个CO或CO2分子可持续生产1个3-HP分子的两种CO2固定途径的组合。
具体实施方式
对优选实施方案的下述描述是在广义上给出的。本发明还由在本文下文的标题“实例”下给出的公开内容来进一步阐明，所述公开内容提供了支持本发明的实验数据、本发明的多个方面的具体实例和实施本发明的方式。
本发明人已能够令人惊讶地改造一氧化碳营养产乙酸微生物，以通过发酵包含CO和/或CO2的底物来产生3-羟基丙酸盐(3-HP)。这提供了用于生产3-HP的可替代方式，所述可替代方式可具有优于当前用于生产3-HP的方法的益处。此外，它提供了使用来自工业过程的一氧化碳的方式，所述一氧化碳原本将被释放到大气中并污染环境。
在改造本发明的微生物时，本发明人已能够令人惊讶地组合两种单独的CO2固定途径，如图1中示出的。这提供了使用包含CO的底物和/或包含CO2的底物产生3-HP的可持续发酵。两种固定CO2的途径因此被连接起来以产生所需的产物。
在一个实施方案中，本发明描述了通过组合两种单独的CO2固定途径(图1)，将三个CO2分子固定到一个3-HP分子内，所述两种途径是允许固定两个CO2分子的产乙酸菌的Wood-Ljungdahl途径，以及允许固定另一个CO2分子的3-HP循环的起始碳固定步骤。CO2还可替换为一氧化碳(CO)，因为Wood-Ljungdahl途径的关键酶——CO脱氢酶(CODH)能够在生物水煤气变换反应(CO+H2O<->CO2+H2)中将CO转化成CO2和能量。可使用CO和CO2的任何混合物。当使用单独的CO2时，可能需要供应以氢气(Hydrogen)或电形式的能量，而CO可充当碳源和能源两者。
虽然本发明人已在自产乙醇梭菌中证实了本发明的效力，但本发明可应用于更广泛的厌氧产乙酸微生物以及对包含CO和/或CO2的底物的发酵，如本文上文和进一步讨论的。
如本文提及的，“发酵液”是至少包含营养培养基和细菌细胞的培养基。
如本文提及的，“穿梭微生物”是在其中表达甲基转移酶并且不同于目的微生物的微生物。
如本文提及的，“目的微生物”是在其中表达在包括表达构建体/载体上的基因并且不同于穿梭微生物的微生物。这也被称为宿主微生物。
术语“主要发酵产物”意指以最高浓度和/或产率产生的一种发酵产物。可存在一种或多种发酵产物。最普遍的可以是或可以不是最有商业价值的。
当在提及发酵过程中使用时，术语“增加效率”、“增加的效率”等等包括但不限于增加下列中的一种或多种：催化发酵的微生物生长速率、在升高产物浓度下的生长和/或产物生产率、所产生的所需产物的体积/所消耗底物的体积、所需产物的生产率或生产水平、以及与发酵的其他副产物相比较所产生的所需产物的相对比例。
短语“包含一氧化碳的底物”和相似术语应理解为包括其中一氧化碳可被一种或多种细菌菌株利用以例如用于生长和/或发酵的任何底物。
短语“包含一氧化碳的气态底物”以及相似短语和术语包括含有一定水平的一氧化碳的任何气体。在某些实施方案中，所述底物含有按体积计至少约20％至约100％CO，按体积计20％至70％CO，按体积计30％至60％CO，以及按体积计40％至55％CO。在特定实施方案中，底物包含按体积计约25％、或约30％、或约35％、或约40％、或约45％、或约50％CO、或约55％CO、或约60％CO。
虽然包含CO的底物并不必须要包含任何氢，但H2的存在不应不利于依照本发明方法的产物形成。在特定实施方案中，氢的存在导致醇生产的总体效率改善。例如，在特定实施方案中，所述底物可包含大约2:1、或1:1或1:2的H2:CO比。在一个实施方案中，所述底物包含按体积计约30％或更少的H2、按体积计20％或更少的H2、按体积计约15％或更少的H2、或者按体积计约10％或更少的H2。在其他实施方案中，所述底物流包含低浓度的H2，例如小于5％、或小于4％、或小于3％、或小于2％、或小于1％或基本上不含氢。所述底物还可含有一些CO2，例如按体积计约1％至约80％CO2、或按体积计1％至约30％CO2。在一个实施方案中，所述底物包含按体积计小于或等于约20％CO2。在特定实施方案中，所述底物包含按体积计小于或等于约15％CO2、按体积计小于或等于约10％CO2、按体积计小于或等于约5％CO2或基本上不含CO2。
短语“包含二氧化碳的底物”和相似术语应理解为包括其中二氧化碳可被一种或多种细菌菌株利用以例如用于生长和/或发酵的任何底物。包含二氧化碳的底物还可包含氢和/或一氧化碳。
短语“包含二氧化碳的气态底物”以及相似短语和术语包括含有一定水平的二氧化碳的任何气体。在某些实施方案中，底物含有按体积计至少约10％至约60％CO2，按体积计20％至50％CO2，按体积计30％至60％CO2，以及按体积计40％至55％CO2。在特定实施方案中，所述底物包含按体积计约20％、或约25％、或约30％、或约35％、或约40％、或约45％、或约50％CO、或约55％CO、或约60％CO2。
优选地，包含CO2的底物还将包含一定水平的CO或H2。在特定实施方案中，所述底物包含至少约1:1、或至少约1:2、或至少约1:3、或至少约1:4、或至少约1:5的CO2:H2比例。
在下文的描述中，以递送并发酵“含有CO和/或CO2的气态底物”来描述本发明的实施方案。然而，应当理解气态底物可以替代形式提供。例如，可提供溶解于液体中的含有CO和/或CO2的气态底物。基本上，将液体用含有一氧化碳的气体饱和，并且随后将该液体加入生物反应器中。这可使用标准方法来实现。例如，可使用微泡分布发生器(Hensirisak etal，Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobic fermentation；Applied Biochemistry and Biotechnology，Volume 101，Number 3/2002年10月)。又例如，含有CO的气态底物可吸附到固体载体上。使用术语“包含CO和/或CO2的底物”等时包括了此类替代方法。
在本发明的特定实施方案中，含CO气态底物(或包含CO2、或CO和CO2、或CO2和H2以及CO的气态底物)是工业废气(off gas或waste gas)。“工业废气”应在广义上理解为为包括由工业过程产生的包含CO和/或CO2的任何气体，并且包括因铁金属产品制造、非铁产品制造、石油精炼过程、煤炭气化、生物质气化、电力生产、碳黑生产和焦炭制造而产生的气体。进一步的例子可在本文其他地方提供。
除非上下文另有要求，否则如本文使用的，短语“发酵”、“发酵过程”或“发酵反应”等意欲包含所述过程的生长期和产物生物合成期两者。如本文进一步描述的，在一些实施方案中，生物反应器可包括第一生长反应器和第二发酵反应器。因此，向发酵反应中添加金属或组合物应理解为包括向这些反应器中的任一或两者中的添加。
术语“生物反应器”包括由一个或多个容器和/或塔或管道排列组成的发酵装置，所述发酵装置包括连续搅拌釜式反应器(CSTR)、固定化细胞反应器(ICR)、滴流床反应器(TBR)、鼓泡塔、气升式发酵罐、静态混合器或者适合于气体-液体接触的其他容器或其他装置。在一些实施方案中，生物反应器可包括第一生长反应器和第二发酵反应器。因此，当提及向生物反应器或发酵反应中添加底物时，应理解为包括适当时向这些反应器中的任一或两者中的添加。
“外源核酸”是源于待将它们引入其中的微生物之外的核酸。外源核酸可源自任何适当来源，包括但不限于待将它们引入其中的微生物，与待将它们引入其中的生物不同的微生物菌株或物种，或者它们可以是人工或重组方法制备的。当生物是遗传改造的或重组体时，它含有与不同于天然存在于微生物中的序列的序列邻近的序列。在一个实施方案中，外源核酸代表天然存在于待将它们引入其中的微生物中的核酸序列，并且将它们引入以增加特定基因的表达或过表达特定基因(例如，通过增加所述序列(例如基因)的拷贝数，或引入强启动子或组成型启动子以增加表达)。在另一个实施方案中，外源核酸代表并非天然存在于待将它们引入其中的微生物中的核酸序列，并且所述外源核酸允许表达并非天然存在于微生物内的产物或增加微生物中天然基因的表达(例如在引入调节元件例如启动子的情况下)。外源核酸可被改造为适于整合到待将它引入其中的微生物的基因组内，或保持染色体外的状态。外源序列可来自异源来源，例如另一个种、属、科或界。在任何情况下，如此产生的细菌是非天然存在的，具有例如因序列差异或因拷贝数差异而不同于天然存在的细菌的遗传互补。
应当理解本发明可使用其序列不同于本文具体示例的序列的核酸来实施，条件是它们执行基本上相同的功能。对于编码蛋白质或肽的核酸序列，这意指所编码的蛋白质或肽具有基本上相同的功能。对于代表启动子序列的核酸序列，变体序列将具有促进一种或多种基因表达的能力。此类核酸在本文中可被称为“功能等价变体”。例如，核酸的功能等价变体包括等位基因变体、基因的片段、包括突变(缺失、***、核苷酸置换等)和/或多态性的基因等。来自其他微生物的同源基因也可视为本文具体示例的序列的功能等价变体的实例。
这些包括在诸如扬氏梭菌、橙色绿屈挠菌、生金球形菌属或硫化叶菌属种的物种中的同源基因，其细节在网站例如Genbank或NCBI上可公开获得。短语“功能等价变体”还应视为包括其序列因针对特定生物的密码子优化而改变的核酸。本文中核酸的“功能等价变体”优选与经鉴定的核酸具有至少大约70％、优选大约80％、更优选大约85％、优选大约90％、优选大约95％或更高的核酸序列同一性。
还应当理解本发明可使用其序列不同于本文具体示例的氨基酸序列的多肽实施。这些变体在本文中可被称为“功能等价变体”。蛋白质或肽的功能等价变体包括这样的蛋白质或肽，即所述蛋白质或肽与经鉴定的蛋白质或肽享有至少40％、优选50％、优选60％、优选70％、优选75％、优选80％、优选85％、优选90％、优选95％或更高的氨基酸同一性并且具有与目的肽或蛋白质基本上相同的功能。此类变体在它们的范围内包括蛋白质或肽的片段，其中所述片段包含截短形式的多肽，其中缺失可以是1至5、至10、至15、至20、至25个氨基酸，并且可在多肽的任一末端处从1位残基延伸到25位残基，并且其中缺失可为所述区域内的任何长度；或可在内部位置处。本文中具体多肽的功能等价变体还应视为包括由其他细菌菌种中的同源基因表达的多肽，例如如先前段落中示例的。
如本文使用的“基本上相同的功能”意指核酸或多肽能够进行它是其变体的核酸或多肽的功能。例如，本发明的酶的变体将能够与该酶一样催化相同的反应。然而，它不应视为意指变体具有与它是其变体的多肽或核酸相同的活性水平。
可使用很多已知方法评价功能等价变体是否具有与它是其变体的核酸或多肽基本上相同的功能。然而，例如，由Hügler等人(2002,J.Bacteriol.184:2404–2410)或Kroeger等人(2011,Anal.Biochem.411:100-5)概述的方法可分别用于测量丙二酰辅酶A还原酶和乙酰辅酶A羧化酶的活性。
当用于本发明时，“过表达”以及相似术语和短语应在广义上视为包括在相同条件下与亲本微生物的蛋白质表达水平相比较，一种或多种蛋白质表达的任何增加。它不应视为意指蛋白质以任何特定水平表达。
“亲本微生物”是用于生成本发明的重组微生物的微生物。亲本微生物可以是在自然界中存在的微生物(即，野生型微生物)，或已被预先修饰但不表达或不过表达本发明中题述酶中的一种或多种的微生物。因此，本发明的重组微生物已被修饰，以表达或过表达在亲本微生物中不表达或不过表达的一种或多种酶。
术语核酸“构建体”或“载体”和相似术语应在广义上视为包括适合用作载体(vehicle)以将遗传材料转移到细胞内的任何核酸(包括DNA和RNA)。该术语应视为包括质粒、病毒(包括细菌噬菌体)、粘粒和人工染色体。构建体或载体可包括一种或多种调节元件、复制起点、多克隆位点和/或可选择标记。在一个特定实施方案中，构建体或载体被改造为适于允许表达由该构建体或载体编码的一种或多种基因。核酸构建体或载体包括裸核酸以及用一种或多种试剂配制的核酸，以促进向细胞的递送(例如脂质体缀合的核酸，包含所述核酸的生物)。
“3-HP生物合成途径”是允许下列转化的酶促途径：乙酰辅酶A至丙二酰辅酶A至丙二酸半醛至3-HP的转化。除非上下文另有明确要求，否则提及3-HP生物合成途径中的酶应视为包括提及该酶的任何一个或多个亚基。仅作为实例，乙酰辅酶A羧化酶可包含四个亚基。
微生物
如本文上文讨论的，本发明提供了能够通过发酵包含CO和/或CO2的底物，产生3-HP以及任选的一种或多种其他产物的重组微生物。
在一个特定实施方案中，所述微生物被改造为适于表达3-HP生物合成途径中的一种或多种酶(或其一个或多个亚基)，所述一种或多种酶并非天然存在于用于获得该微生物的亲本微生物中。在另一个实施方案中，所述微生物被改造为适于过表达3-HP生物合成途径中的一种或多种酶(或其一个或多个亚基)，所述一种或多种酶天然存在于亲本微生物中。
在一个实施方案中，所述亲本微生物能够发酵包含CO的底物，以产生乙酰辅酶A，但不能将乙酰辅酶A转化为3-HP，并且所述重组微生物被改造为适于表达参与乙酰辅酶A转化为3-HP的一种或多种酶(或其一个或多个亚基)。在一个实施方案中，所述亲本微生物能够将乙酰辅酶A转化为丙二酰辅酶A，但不能将丙二酰辅酶A转化为3-HP。在另一个实施方案中，所述亲本微生物能够将丙二酰辅酶A转化为3-HP，但不能将乙酰辅酶A转化为丙二酰辅酶A。
在一个实施方案中，所述3-HP生物合成中的一种或多种酶选自：丙二酰辅酶A还原酶、乙酰辅酶A羧化酶以及其任何一种或多种的功能等价变体。
所述微生物可被改造为适于通过很多重组方法表达或过表达一种或多种酶(或其一个或多个亚基)，所述重组方法包括例如，增加该微生物内的天然基因的表达(例如通过引入更强的启动子或组成型启动子以驱动基因的表达)，通过引入编码并被改造为适于表达该酶的外源核酸来增加编码特定酶的基因拷贝数，引入编码并被改造为适于表达并非天然存在于亲本微生物内的酶的外源核酸。
在某些实施方案中，可转化所述亲本微生物，以提供所述亲本微生物天然包含的一种或多种基因的表达增加或过表达与引入非亲本微生物天然包含的一种或多种基因的组合。例如，编码3-HP生物合成途径中的一种或多种酶的一种或多种基因是所述亲本微生物天然包含的，但它可能不包括编码该途径中的一种或多种其他酶的一种或多种其他基因。所述微生物可例如被改造，以过表达天然的乙酰辅酶A羧化酶，并且引入编码用于将丙二酰辅酶A转化为3-HP的酶(例如丙二酰辅酶A还原酶)的丙二酰辅酶A还原酶基因。或者，所述微生物可被改造，以过表达天然的丙二酰辅酶A还原酶，并且引入编码乙酰辅酶A羧化酶的基因。技术人员将知道在本发明中使用的多种其他组合。
仅作为例子，丙二酰辅酶A还原酶的示例性序列信息在本文中以SEQ ID NO:1的形式提供，并且还使用登录号YP_001636209.1/Caur_2614,GI:163848165在公共数据库上提供。作为另外的例子，乙酰辅酶A羧化酶的示例性序列信息在本文中以SEQ ID NO:18-21的形式提供，并且还使用登录号NC_014328.1-33.1/CLJU_c42100-40,GI:9447826-31和GI:163847210-11,Caur_1647-48,YP_001635254.1-55.1；GI:163849262,Caur_3739,YP_001637306.1；GI:163848951,Caur_3421,YP_001636995.1；GI:163846951,Caur_1378,YP_001634995.1在公共数据库上提供。可使用天然存在的酶或合成的酶。通常，该酶与由根据SEQ ID NO:1或18-21的核酸编码的序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。
在本发明的微生物中使用的酶(以及编码它们的任何相应基因)可源自任何适当来源，包括细菌的不同属和种或其他生物。然而，在一个实施方案中，丙二酰辅酶A还原酶是源自橙色绿屈挠菌、扬氏梭菌、生金球形菌属或硫化叶菌属种的酶。在一个实施方案中，丙二酰辅酶A还原酶具有上文示例的氨基酸序列，或它是其功能等价变体。在一个实施方案中，乙酰辅酶A羧化酶是源自扬氏梭菌、橙色绿屈挠菌、生金球形菌属或硫化叶菌属种的酶。在一个实施方案中，乙酰辅酶A羧化酶具有上文示例的氨基酸序列，或它是其功能等价变体。
丙二酰辅酶A还原酶(EC 1.2.1.75)属于短链还原酶(SDR)组，并且可得自细菌如绿色非硫光养细菌(绿弯菌门(Chloroflexi))橙色绿屈挠菌(YP_001636209.1；AAS20429.1)、聚集绿曲挠丝状菌(Chloroflexus aggregans)(YP_002462600.1)、毛样颤绿菌(Oscillochloris trichoides)(WP_006561105.1)、卡斯特玫瑰弯菌(Roseiflexuscastenholzii)(YP_001433009.1)或玫瑰弯菌属种(Roseiflexus sp.)(YP_001277512.1)，以及α变形菌纲(alpha-proteobacteria)如赤杆菌属种(Erythrobacter sp.)(WP_007163680)和如γ变形菌纲(WP_009019528.1、WP_007234918.1、WP_009021869.1、WP_009470571.1)，并且可得自嗜热嗜酸古细菌如泉古头寇岱硫化叶菌(CrenarchaeotesSulfolobus tokodaii)(NP_378167.1)、好客嗜酸两面菌(Acidianus hospitalis)(YP_004459517.1)、铜生金球形菌(Metallosphaera cuprina)(YP_004410014.1)、勤奋生金球形菌(Metallosphaera sedula)(YP_001190808.1)、硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobussolfataricus)(NP_343563.1)、黄石生金球形菌(Metallosphaera yellowstonensis)(WP_009071519.1)、冰岛硫化叶菌(Sulfolobus islandicus)(YP_002844727.1；YP_002833533.1；YP_002830795.1)、嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)(YP_256941.1；YP_256733.1)，以及如深处古生球菌(Archaeoglobus profundus)(YP_003401535.1)，和Candidatus Chloracidobacterium thermophilum(YP_004863680.1)或Caldiarchaeum subterraneum(BAJ47902.1)。
乙酰辅酶A羧化酶(EC 1.2.1.75)属于生物素依赖性羧化酶组，并且可得自细菌如绿色非硫光养细菌(绿弯菌门)如橙色绿屈挠菌(YP_001635254.1-55.1；YP_001637306.1；YP_001636995.1；YP_001634995.1)，或一氧化碳营养产乙酸菌如扬氏梭菌(NC_014328.1-33.1)。
在一个实施方案中，该微生物包含被改造为适于增加所述亲本微生物天然包含的一种或多种核酸的表达的一种或多种外源核酸，并且所述一种或多种核酸编码上文提及的酶中的一种或多种(或其一个或多个亚基)。在一个实施方案中，被改造为适于增加表达的一种或多种外源核酸是调节元件。在一个实施方案中，所述调节元件是启动子。在一个实施方案中，启动子是优选在适当发酵条件下具有高度活性的组成型启动子。还可使用诱导型启动子。在优选实施方案中，所述启动子选自Wood-Ljungdahl基因簇或磷酸转乙酰酶/乙酸激酶操纵子启动子。本领域技术人员应当理解可指导表达(优选在适当发酵条件下高水平表达)的其他启动子可有效作为示例实施方案的替代物。当启动子处于使得它驱动下游编码序列表达的位置时，它被称为可操作地连接的。
在一个实施方案中，该微生物包含编码并被改造为适于表达上文提及的酶中的一种或多种(或其一种或多种亚基)的一种或多种外源核酸。在一个实施方案中，该微生物包含编码并被改造为适于表达所述酶中的至少两种(或其一个或多个亚基)的一种或多种外源核酸。
在一个特定实施方案中，该微生物包含编码丙二酰辅酶A还原酶或其功能等价变体的一种或多种外源核酸。在一个特定实施方案中，该微生物包含编码乙酰辅酶A羧化酶或其功能等价变体的一种或多种外源核酸。乙酰辅酶A羧化酶可由4个亚基组成，其中每个亚基由不同基因编码。这些基因可被组合在单一核酸中或者一起编码完整酶的两种或更多种核酸中。此外，特定亲本微生物可含有针对这些亚基中的仅一个、两个或三个的基因。因此，本发明包含使用一种或多种外源核酸改造所述微生物，以仅表达所述亚基中的一个、两个或三个。类似地，它包含改造微生物以过表达所述亚基中的一个或多个，如果所述基因是所述微生物天然包含的。还设想了天然亚基基因的过表达和任何缺失亚基基因的引入的组合。
在一个实施方案中，丙二酰辅酶A还原酶是由包含SEQ ID NO:1的核酸或其功能等价变体编码。在一个实施方案中，乙酰辅酶A羧化酶是由包含SEQ ID NO:18、19、20和21的一种或多种核酸或者其中任何一种或多种的功能等价变体编码。或者，该酶可由如可公开获得的数据库中所述的核酸序列编码，例如上文所列出的。
该微生物可包含一种或多种外源核酸。当希望用两种或更多种遗传元件(例如基因或调节元件(例如启动子))转化亲本微生物时，它们可被包含在一种或多种外源核酸上。
在一个实施方案中，所述一种或多种外源核酸是编码上文提及的酶中的一种或多种的任何组合的核酸构建体或载体(在一个特定实施方案中，是质粒)。
所述外源核酸在转化亲本微生物后可保留在染色体外或可整合到亲本微生物的基因组内。因此，它们可包括另外的核苷酸序列，所述另外的核苷酸序列被改造为适于协助整合(例如，允许同源重组和靶向整合到宿主基因组内的区域)或染色体外构建体的表达和复制(例如复制起点、启动子和其他调节元件或序列)。
在一个实施方案中，编码如本文上文提及的一种或多种酶(或其一个或多个亚基)的外源核酸还将包含被改造为适于促进由外源核酸编码的一种或多种酶的表达的启动子。在一个实施方案中，所述启动子是优选在适当发酵条件下具有高度活性的组成型启动子。还可使用诱导型启动子。在优选实施方案中，所述启动子选自Wood-Ljungdahl基因簇和磷酸转乙酰酶/乙酸激酶启动子。本领域技术人员应当理解可指导表达(优选在适当发酵条件下高水平表达)的其他启动子有效作为示例实施方案的替代物。
在一个实施方案中，外源核酸是表达质粒。
在一个实施方案中，亲本微生物选自厌氧产乙酸菌。
在一个特定实施方案中，所述亲本微生物选自一氧化碳营养产乙酸细菌。在某些实施方案中，该微生物选自自产乙醇梭菌、扬氏梭菌、拉氏梭菌、食羰基化物梭菌、德氏梭菌、粪味梭菌、乙酸梭菌、蚁酸乙酸梭菌、大梭菌、食甲基丁酸杆菌、伍氏乙酸杆菌、巴氏嗜碱菌、Blautia producta、淤泥真杆菌、热乙酸穆尔氏菌、热自养穆尔氏菌、卵形鼠孢菌、Sporomusa silvacetica、球形鼠孢菌、普氏产醋杆菌和凯伍热厌氧菌。
在一个特定实施方案中，所述亲本微生物选自产乙醇、产乙酸梭菌，包括以下种：自产乙醇梭菌、杨氏梭菌和拉氏梭菌以及相关分离物。这些包括但不限于下述菌株：自产乙醇梭菌JAI-1T(DSM10061)[Abrini J,Naveau H,Nyns E-J:Clostridiumautoethanogenum,sp.nov.,an anaerobic bacterium that produces ethanol fromcarbon monoxide.Arch Microbiol1994,4:345-351]，自产乙醇梭菌LBS1560(DSM19630)[Simpson SD,Forster RL,Tran PT,Rowe MJ,Warner IL:Novel bacteria and methodsthereof.国际专利2009,WO/2009/064200]，自产乙醇梭菌LBS1561(DSM23693)，杨氏梭菌PETCT(DSM13528＝ATCC 55383)[Tanner RS,Miller LM,Yang D:Clostridium.ljungdahlii sp.nov.,an Acetogenic Species in Clostridial rRNAHomology Group I.Int J Syst Bacteriol 1993,43:232-236]，杨氏梭菌ERI-2(ATCC55380)[Gaddy JL:Clostridium stain which produces acetic acid from wastegases.美国专利1997,5,593,886]，杨氏梭菌C-01(ATCC 55988)[Gaddy JL,Clausen EC,KoC-W:Microbial process for the preparation of acetic acid as well as solventfor its extraction from the fermentation broth.美国专利，2002,6,368,819]，杨氏梭菌O-52(ATCC 55989)[Gaddy JL,Clausen EC,Ko C-W:Microbial process for thepreparation of acetic acid as well as solvent for its extraction from thefermentation broth.美国专利，2002,6,368,819]，拉氏梭菌P11T(ATCC BAA-622)[HuhnkeRL,Lewis RS,Tanner RS:Isolation and Characterization of novel ClostridialSpecies.国际专利2008，WO 2008/028055]，相关分离物例如“C.coskatii”[Zahn et al-Novel ethanologenic species Clostridium coskatii(美国专利申请号US20110229947)]和“梭菌属种”(Tyurin et al.，2012,J.Biotech Res.4:1-12)，或突变株例如拉氏梭菌OTA-1(Tirado-Acevedo O.Production of Bioethanol from SynthesisGas Using Clostridium ljungdahlii.PhD thesis,北卡罗莱纳州立大学,2010)。这些菌株在梭菌rRNA簇I内形成亚簇，并且它们的16S rRNA基因超过99％相同，具有相似的约30％的低GC含量。然而，DNA-DNA重新组合和DNA指纹实验显示这些菌株属于种[Huhnke RL,Lewis RS,Tanner RS:Isolation and Characterization of novel ClostridialSpecies.国际专利2008，WO 2008/028055]。
该簇的所有种均具有相似的形态和大小(对数生长的细胞为0.5-0.7x3-5μm)，是嗜温的(最适生长温度为30-37℃)和严格厌氧菌[Tanner RS,Miller LM,Yang D:Clostridium ljungdahlii sp.nov.,an Acetogenic Species in Clostridial rRNAHomology Group I.Int J Syst Bacteriol 1993,43:232-236；Abrini J,Naveau H,NynsE-J:Clostridium autoethanogenum,sp.nov.,an anaerobic bacterium that producesethanol from carbon monoxide.Arch Microbiol 1994,4:345-351；Huhnke RL,LewisRS,Tanner RS:Isolation and Characterization of novel Clostridial Species.国际专利2008，WO 2008/028055]。此外，它们均共享相同的主要的***发育性状，例如相同的pH范围(pH 4-7.5，最适起始pH为5.5-6)，以含CO气体的强自养生长并伴随相似的生长速率，和以乙醇和乙酸作为主要发酵终产物的相似的代谢谱，以及在某些条件下形成少量的2,3-丁二醇和乳酸。[Tanner RS,Miller LM,Yang D:Clostridium ljungdahlii sp.nov.,anAcetogenic Species in Clostridial rRNA Homology Group I.Int J Syst Bacteriol1993,43:232-236；Abrini J,Naveau H,Nyns E-J:Clostridium autoethanogenum,sp.nov.,an anaerobic bacterium that produces ethanol from carbonmonoxide.Arch Microbiol 1994,4:345-351；Huhnke RL,Lewis RS,Tanner RS:Isolationand Characterization of novel Clostridial Species.国际专利2008，WO 2008/028055]。对于所有三个种还观察到吲哚产生。然而，所述种的区别在于多种糖(例如鼠李糖、***糖)、酸(例如葡糖酸、柠檬酸)、氨基酸(例如精氨酸、组氨酸)或其他底物(例如甜菜碱、丁醇)的底物利用。此外，发现一些种对于某些维生素(例如硫胺素、生物素)是营养缺陷型的，而其他种则不是。
在一个实施方案中，所述亲本菌株使用CO作为其唯一碳源和能源。
在一个实施方案中，所述亲本微生物是自产乙醇梭菌或扬氏梭菌。在一个特定实施方案中，所述微生物是自产乙醇梭菌DSM23693。在另一个特定实施方案中，所述微生物是扬氏梭菌DSM13528(或ATCC55383)。
在一个实施方案中，所述亲本微生物缺乏编码丙二酰辅酶A还原酶或乙酰辅酶A羧化酶(或其一个或多个亚基)的一种或多种基因。
核酸
本发明还提供了用于生成本发明的重组微生物的核酸和核酸构建体。
在一个实施方案中，所述核酸包含编码3-HP生物合成途径中的一种或多种酶(或其一个或多个亚基)的一种或多种序列，当在微生物中表达时，其允许该微生物通过发酵包含CO和/或CO2的底物产生3-HP。在一个特定实施方案中，本发明提供了编码两种或更多种酶(或其一个或多个亚基)的核酸，当在微生物中表达时，其允许该微生物通过发酵包含CO和/或CO2的底物产生3-HP。
在一个特定实施方案中，该酶选自丙二酰辅酶A还原酶、乙酰辅酶A羧化酶以及其中任何一种或多种的功能等价变体。
在一个实施方案中，本发明的核酸以任何次序包含编码丙二酰辅酶A还原酶、乙酰辅酶A羧化酶或其中任何一种或多种的功能等价变体的一种或多种核酸序列。
在一个实施方案中，本发明的核酸以任何次序包含编码乙酰辅酶A羧化酶的一个或多个亚基或其中任何一种或多种的功能等价变体的一种或多种核酸序列。
编码上述酶中每一种的示例性氨基酸序列和核酸序列在本文中提供，或者可获自如上文提及的GenBank。然而，考虑到在本文中、在GenBank及其他数据库中所含有的信息和遗传密码，技术人员应当容易地知道编码所述酶或其功能等价变体的可替代核酸序列。
在一个实施方案中，丙二酰辅酶A还原酶具有如上文描述的序列或是其功能等价变体。
在一个实施方案中，编码乙酰辅酶A羧化酶的核酸序列具有如上文描述的序列或是其功能等价变体。
在一个实施方案中，本发明的核酸还包含启动子。在一个实施方案中，所述启动子允许所述基因在其控制下的组成型表达。然而，还可采用诱导型启动子。技术人员应当容易地知道用于本发明的启动子。优选地，启动子可指导在适当发酵条件下的高水平表达。在特定实施方案中，使用Wood-Ljungdahl簇启动子。在另一个实施方案中，使用磷酸转乙酰酶/乙酸激酶启动子。在另一个实施方案中，使用丙酮酸盐:铁氧还蛋白氧化还原酶启动子、Rnf复合体操纵子启动子或ATP合酶操纵子启动子。在一个特定实施方案中，所述启动子来自自产乙醇梭菌。
本发明的核酸在转化亲本微生物后可保留在染色体外或可被改造为适于整合到所述微生物的基因组内。因此，本发明的核酸可包括另外的核苷酸序列，所述另外的核苷酸序列被改造为适于协助整合(例如，允许同源重组和靶向整合到宿主基因组内的区域)或染色体外构建体的稳定表达和复制(例如复制起点、启动子和其他调节序列)。
在一个实施方案中，所述核酸是核酸构建体或载体。在一个特定实施方案中，所述核酸构建体或载体是表达构建体或载体，然而，本发明包含其他构建体和载体例如用于克隆的那些。在一个特定实施方案中，所述表达构建体或载体是质粒。
应当理解，出所述启动子外，本发明的表达构建体/载体还可包含任意数目的调节元件，以及需要时适合于表达其他蛋白质的另外的基因。在一个实施方案中，所述表达构建体/载体包括一个启动子。在另一个实施方案中，所述表达构建体/载体包括两个或更多个启动子。在一个特定实施方案中，对于待表达的每种基因，所述表达构建体/载体包括一个启动子。在一个实施方案中，所述表达构建体/载体包括一个或多个核糖体结合位点，优选用于每种待表达基因的核糖体结合位点。
本领域技术人员应当理解本文描述的核酸序列和构建体/载体序列可含有标准接头核苷酸，例如核糖体结合位点和/或限制性位点所需的那些接头核苷酸。此类接头序列不应解释为是必需的并且不对所定义的序列产生限制。
本发明的核酸和核酸构建体，包括表达构建体/载体，可使用任意数目的本领域中已知的技术进行构建。例如，可使用化学合成或重组技术。此类技术记载于例如Sambrooket al(Molecular Cloning:A laboratory manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,NY,1989)。进一步的示例性技术记载于在下文实施例部分中。基本上，各个基因和调节元件彼此可操作地连接，使得可表达所述基因以形成所需蛋白质。本领域普通技术人员应当理解用于本发明的合适载体。然而，例如，下述载体可以是合适的：pMTL80000载体、pIMP1、pJIR750以及下文实施例部分中示例的质粒。
应当理解本发明的核酸可采取任何适当的形式，包括RNA、DNA或cDNA。
本发明还提供了包含本文描述的核酸中的任何一种或多种的宿主生物，特别是微生物，并且包括病毒、细菌和酵母。
所述一种或多种外源核酸可作为裸核酸递送至亲本微生物，或可用一种或多种试剂配制以促进转化过程(例如脂质体缀合的核酸，其中包含核酸的生物)。适当时，所述一种或多种核酸可以是DNA、RNA或其组合。限制性抑制剂可用于某些实施方案中；参见例如Murray,N.E.et al.(2000)Microbial.Molec.Biol.Rev.64,412.)。
可使用任何数目的本领域中已知的用于产生重组微生物的技术，由亲本微生物和一种或多种外源核酸制备本发明的微生物。仅作为实例，转化(包括转导或转染)可通过电穿孔、超声处理、聚乙二醇介导的转化、化学或天然感受态或者缀合来实现。合适的转化技术记载于例如Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T:Molecular Cloning:A laboratoryManual,Cold Spring Harbour Laboratory Press,Cold Spring Harbour,1989中。
在某些实施方案中，由于待转化的微生物中有活性的限制***，必须甲基化待引入微生物内的核酸。这可使用多种技术包括下文描述的技术来完成，并且在下文实施例部分中进一步示例。
例如，在一个实施方案中，本发明的重组微生物是通过包括下述步骤的方法产生：将下述引入穿梭微生物内：(i)如本文描述的表达构建体/载体，和(ii)包含甲基转移酶基因的甲基化构建体/载体；表达甲基转移酶基因；从穿梭微生物中分离一种或多种构建体/载体；以及将一种或多种构建体/载体引入目的微生物内。
在一个实施方案中，步骤B的甲基转移酶基因是组成型地表达的。在另一个实施方案中，步骤B的甲基转移酶基因的表达是被诱导的。
所述穿梭微生物是促进对构成所述表达构建体/载体的核酸序列的甲基化的微生物，优选是限制性阴性微生物。在特定实施方案中，所述穿梭微生物是限制性阴性大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。
甲基化构建体/载体包含编码甲基转移酶的核酸序列。
一旦将表达构建体/载体和甲基化构建体/载体引入穿梭微生物内，就诱导甲基化构建体/载体上存在的甲基转移酶基因。诱导可以是通过任何合适的启动子***，尽管在本发明的一个特定实施方案中，甲基化构建体/载体包含诱导型lac启动子，并且是通过添加乳糖或其类似物，更优选异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导。其他合适的启动子包括ara、tet或T7***。在本发明的另一个实施方案中，甲基化构建体/载体启动子是组成型启动子。
在一个特定实施方案中，所述甲基化构建体/载体具有特异性针对所述穿梭微生物的种类的复制起点，使得所述甲基化构建体/载体上存在的任何基因在所述穿梭微生物中表达。优选地，所述表达构建体/载体具有特异性针对目的微生物的种类的复制起点，使得所述表达构建体/载体上存在的任何基因在目的微生物中表达。
甲基转移酶的表达导致所述表达构建体/载体上存在的基因的甲基化。根据许多已知方法中的任何一种，随后可从所述穿梭微生物中分离所述表达构建体/载体。仅作为实例，下文描述的实施例部分中所述的方法可用于分离表达构建体/载体。
在一个特定实施方案中，两种构建体/载体被同时分离。
可使用任意数目的已知方法将所述表达构建体/载体引入所述目的微生物内。然而，例如，可使用下文实施例部分中所述的方法。因为所述表达构建体/载体是甲基化的，所以所述表达构建体/载体上存在的核酸序列能够被纳入目的微生物内并成功表达。
应想到可将甲基转移酶基因引入穿梭微生物内并过表达。因此，在一个实施方案中，所得的甲基转移酶可使用已知方法收集，并且在体外用于甲基化表达质粒。随后可将所述表达构建体/载体引入目的微生物内用于表达。在另一个实施方案中，将所述甲基转移酶基因引入穿梭微生物的基因组内，随后将所述表达构建体/载体引入所述穿梭微生物内，从所述穿梭微生物中分离一种或多种构建体/载体，并且随后将所述表达构建体/载体引入所述目的微生物内。
应想到可组合如上定义的所述表达构建体/载体和所述甲基化构建体/载体，以提供物质的组合物。此类组合物在避开限制性障碍机制以产生本发明的重组微生物中特别有用。
在一个特定实施方案中，所述表达构建体/载体和/或所述甲基化构建体/载体是质粒。
本领域普通技术人员应当理解用于产生本发明的微生物的许多合适的甲基转移酶。然而，例如，可使用枯草芽孢杆菌噬菌体ΦT1甲基转移酶和下文实施例中所述的甲基转移酶。在一个实施方案中，所述甲基转移酶具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列，或是其功能等价变体。考虑到所需甲基转移酶的序列和遗传密码，编码合适甲基转移酶的核酸是容易想到的。在一个实施方案中，编码甲基转移酶的核酸是如下文实施例中所述(例如SEQ ID NO:26的核酸，或它是其功能等价变体)。
被改造为适于允许甲基转移酶基因表达的任意数目的构建体/载体均可用于生成所述甲基化构建体/载体。然而，例如，可使用下文实施例部分中所述的质粒(例如，SEQ IDNO:7)。
生产方法
本发明提供了通过包括使用本发明的重组微生物发酵包含CO和/或CO2的底物的微生物发酵，用于生产3-HP以及任选的一种或多种其他产物的方法。优选地，3-HP是主要发酵产物。本发明的方法可用于减少来自工业过程的总大气碳排放。
优选地，所述发酵包括使用本发明的重组微生物厌氧发酵生物反应器中的底物以至少产生3-HP的步骤。
在一个实施方案中，该方法包括下述步骤：
(a)向含有本发明的一种或多种微生物的培养物的生物反应器中提供包含CO和/或CO2的底物；和
(b)厌氧发酵生物反应器中的培养物，以至少产生3-HP。
在一个实施方案中，该方法包括下述步骤：
(a)在因工业过程产生的含CO和/或CO2气体释放到大气中之前，捕获所述气体；
(b)通过含有本发明的一种或多种微生物的培养物厌氧发酵所述含CO和/或CO2气体，以至少产生3-HP。
在一个实施方案中，底物包含CO。在一个实施方案中，底物包含CO和CO2。在另一个实施方案中，底物包含CO2和H2。在另一个实施方案中，底物包含CO2和CO以及H2。
在本发明的一个特定实施方案中，由微生物发酵的气态底物是含有CO的气态底物。所述气态底物可以是作为工业过程的副产物而获得的含CO废气，或来自一些其他来源例如来自汽车尾气。在某些实施方案中，所述工业过程选自铁金属产品制造例如钢铁厂、非铁产品制造、石油精炼过程、煤炭气化、电力生产、碳黑生产、氨生产、甲醇生产和焦炭制造。在这些实施方案中，可在含CO气体被排放到大气中之前，使用任何方便的方法从所述工业过程中将其捕获。CO可以是合成气(包含一氧化碳和氢的气体)的组分。由工业过程产生的CO通常被燃烧掉以产生CO2，因此本发明可特别用于减少CO2温室气体排放并产生用作生物燃料的丁醇。取决于含CO的气态底物的组成，可能还需要在将其引入发酵之前对其进行处理，以去除任何不需要的杂质例如尘粒。例如，可使用已知方法对气态底物进行过滤或洗涤。
在本发明的特定实施方案中，由微生物发酵的气态底物是包含CO2和H2的气态底物。所述含CO2/H2底物可以是作为工业过程的副产物而获得的废气。在某些实施方案中，所述工业过程选自氢生产。在某些实施方案中，所述包含CO2和H2的气态底物可以是混合气流，其中将源自一种或多种工业过程的气流的至少一部分与至少一部分CO2或H2混合，以优化所述气态底物的CO2:H2比例。这对于富含CO2或H2的工业气流而言可以是特别有益的。产生可以用作CO2和H2底物或CO2和H2混合底物的来源的副产物气流的工业过程的实例包括焦炭制造、精炼过程、氨生产过程、甲醇生产过程、乙酸生产、天然气精炼厂和发电厂。
应当理解，为了发生细菌生长以及气体至包含3-HP的产物的转化，需要将合适的液体营养培养基与含CO和/或CO2的底物气体进料给生物反应器。所述底物和培养基可以连续、分批或分批补料的形式进料给生物反应器。营养培养基含有足以允许使所用的微生物生长的维生素和矿物质。适合于使用CO和/或CO2发酵以产生一种或多种产物的厌氧培养基是本领域中已知的。例如，合适的培养基记载于Biebel(2001)中。在本发明的一个实施方案中，所述培养基是如下文实施例部分中所述。
需要在发生支持所述气体至包含3-HP的产物的转化的发酵的适当条件下进行发酵。应考虑的反应条件包括压力、温度、气体流速、液体流速、培养基pH、培养基氧化还原电位、搅拌速度(如果使用连续搅拌釜式反应器)、接种物水平、确保液相中的CO和/或CO2不变成限制性的最大气体底物浓度以及避免产物抑制的最大产物浓度。
此外，通常需要增加底物流的CO和/或CO2浓度(或气态底物中的CO和/或CO2分压)，并且因此增加其中CO和/或CO2是底物的发酵反应的效率。在增加的压力下的操作允许CO和/或CO2从气相转移至液相的速率得到显著提高，其中CO和/或CO2可被微生物作为碳源摄取，以生产包含3-HP的产物。这又意味着当将生物反应器保持在高压而不是大气压力下时，可减少保留时间(被定义为生物反应器中的液体体积除以输入气体流速)。最佳反应条件将部分取决于所用的本发明的具体微生物。然而，一般而言，优选在高于大气压的压力下进行发酵。同样，因为给定的CO和/或CO2到至少3-HP的转化率在某种程度上是底物保留时间的函数，而且实现所需的保留时间又决定了所需的生物反应器体积，所以加压***的使用可极大地减少所需的生物反应器体积，从而减少发酵设备的资金成本。根据美国专利第5,593,886号中给出的实施例，反应器体积可与反应器操作压力的增加成线性比例地减小，即在10个大气压下操作的生物反应器只需为在1个大气压下操作的生物反应器体积的十分之一。
例如，在高压下进行气体至乙醇发酵的益处已有记载。例如，WO02/08438描述了在30psig和75psig的压力下进行的气体至乙醇的发酵，分别提供150g/l/天和369g/l/天的乙醇生产率。然而，发现在大气压下使用类似的培养基和输入气体组合物进行的示例发酵每天每升产生1/10至1/20的乙醇。
还期望含CO和/或CO2气态底物的引入速率能够确保液相中的CO和/或CO2浓度不变成限制性的。这是因为CO和/或CO2受限的条件的后果可能是一种或多种产物被培养物消耗。
用于进料给发酵反应的气流的组成可对该反应的效率和/或成本具有显著影响。例如，O2可降低厌氧发酵过程的效率。在发酵前或发酵后的发酵过程各阶段中处理不需要或不必要的气体可增加对此类阶段的负担(对于包含其中气流在进入生物反应器前被压缩的产物，不必要的能量被用于压缩在发酵中不需要的气体)。因此，可能需要处理底物流，特别是源自工业源的底物流，以去除不需要的组分并增加所需组分的浓度。
在某些实施方案中，将本发明的细菌培养物维持在水性培养基中。优选地，水性培养基是最低厌氧微生物生长培养基。合适的培养基是本领域已知的，并且例如在美国专利第5,173,429号和第5,593,886号以及WO02/08438中有描述，以及如本文下文实施例部分中所述。
3-HP，或含有3-HP和/或一种或多种其他产物的混合流，可通过本领域中已知的方法从发酵液中回收，所述方法例如分馏或蒸发、渗透蒸发、汽提和萃取发酵，包括例如液液萃取。
在本发明的某些优选实施方案中，3-HP和一种或多种产物通过下述方法从发酵液中回收：从生物反应器中连续移出发酵液的一部分，从发酵液中分离微生物细胞(方便地通过过滤)，并且从发酵液中回收一种或多种产物。醇类可方便地例如通过蒸馏进行回收。丙酮可例如通过蒸馏进行回收。所产生的任何酸类均可例如通过吸附在活性炭上进行回收。优选地将分离的微生物细胞送回至发酵生物反应器。还优选地将已移出任何醇和酸后剩余的无细胞渗透物送回至发酵生物反应器。可向无细胞渗透物中添加另外的营养素(例如B族维生素)，以在将营养培养基送回至生物反应器之前补充所述营养培养基。
此外，如果如上所述调整发酵液的pH以增强乙酸至活性炭的吸附，则在将所述发酵液送回生物反应器前，应将pH重新调整至与发酵生物反应器中的发酵液相似的pH。
可使用任何适当的方法包括但不限于渗透蒸发、反渗透和液液萃取技术，在发酵后回收3-HP。
实施例
现在将参考下述非限制性实施例更详细地描述本发明。
实施例1
组合两种CO2固定途径，产乙酸菌的线性Wood-Ljungdahl途径以及在绿色非硫细菌和古细菌中发现的3-HP循环(Thauer,2007,Science,318:1732-33)，以获得朝向平台化学品3-羟基丙酸盐(3-HP)的可持续途径。该途径允许将3个CO或CO2分子固定到一个3-HP分子内。选择一氧化碳营养产乙酸生物自产乙醇梭菌，并且用来自非硫光合作用菌橙色绿屈挠菌的执行起始CO2固定步骤的基因进行代谢改造(图1)。
一氧化碳营养产乙酸菌例如自产乙醇梭菌或扬氏梭菌能够通过固定两个CO或CO2分子并且使它们融合以形成乙酰辅酶A来自养生长。非硫光合作用细菌例如橙色绿屈挠菌能够在循环过程中固定CO2。它们使用乙酰辅酶A作为起点，并将其融合到通过乙酰辅酶A羧化酶(EC.6.4.1.2)催化的ATP依赖性步骤中以形成丙二酰辅酶A，所述丙二酰辅酶A随后可通过丙二酰辅酶A还原酶(EC 1.2.1.75)的作用被还原为3-HP，即该循环的中心中间产物(Huegler et al，2002,J.Bacteriol.184:2404-10)。将丙二酰辅酶A还原酶基因，酶(GI:163848165,Caur_2614；YP_001636209.1)引入一氧化碳营养生物内，以形成将三个CO或CO2分子固定到3-HP内的新代谢途径。经鉴定，乙酰辅酶A羧化酶已作为脂肪酸生物合成的一部分存在于宿主生物内(自产乙醇梭菌:SEQ ID NO:18-21；扬氏梭菌：CLJU_c42100-40,GI:9447826-31,NC_014328.1-33.1)，但除必需的丙二酰辅酶A还原酶之外，还可引入橙色绿屈挠菌乙酰辅酶A羧化酶(GI:163847210-11,Caur_1647-48,YP_001635254.1-55.1；GI:163849262,Caur_3739,YP_001637306.1；GI:163848951,Caur_3421,YP_001636995.1；GI:163846951,Caur_1378,YP_001634995.1)。
材料与方法
微生物和生长条件
自产乙醇梭菌DSM23693是源自DSMZ(德国微生物和细胞培养物保藏中心(TheGerman Collection of Microorganisms and Cell Cultures)，Inhoffenstraβe 7B,38124Braunschweig，德国)的自产乙醇梭菌DSM10061的衍生物。
大肠杆菌XL1-Blue MRF’Kan购自Stratagene(Santa Clara,CA95051-7201,USA)。
将大肠杆菌在好氧条件下培养，而所有其他菌株均在血清瓶中的50ml液体培养基中以果糖(异养生长)或在顶空中以30psi含CO钢铁厂气体(收集自Glenbrook,NZ的NewZealand Steel场所；组成：44％CO、32％N2、22％CO2、2％H2)(自养生长)严格厌氧地生长。
根据表1-3中给出的配方，使用标准厌氧技术(Hungate RE:A roll tube methodfor cultivation of strict anaerobes,in Norris JR and Ribbons DW(eds.),Methodsin Microbiology,vol.3B.Academic Press,New York,1969:117-132；Wolfe RS:Microbial formation of methane.Adv Microb Physiol 1971,6:107-146)制备培养基。对于固体培养基，加入1.2％Bacto琼脂(BD,Frankton Lakes,NJ 07417,USA)。
除非另有说明，所有菌株均在37℃下生长。
表1：PETC-MES培养基(自产乙醇梭菌pH5.6)
培养基组分 每1.0L培养基中的浓度
NH<sub>4</sub>Cl 1g
KCl 0.1g
MgSO<sub>4</sub>.7H<sub>2</sub>O 0.2g
NaCl 0.8g
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 0.2g
CaCl<sub>2</sub> 0.02g
痕量金属溶液(参见下文) 10ml
Wolfe维生素溶液(参见下文) 10ml
酵母提取物 2g
刃天青(2g/L母液) 0.5ml
2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES) 20g
乙酸钠 0.25g
还原剂 0.006-0.008％(v/v)
果糖(用于异养生长) 5g
痕量金属溶液 每L母液
氮川三乙酸 2g
MnSO<sub>4</sub>.H<sub>2</sub>O 1g
Fe(SO<sub>4</sub>)<sub>2</sub>(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>.6H<sub>2</sub>O 0.8g
CoCl<sub>2</sub>.6H<sub>2</sub>O 0.2g
ZnSO<sub>4</sub>.7H<sub>2</sub>O 0.2mg
CuCl<sub>2</sub>.2H<sub>2</sub>O 0.02g
NaMoO<sub>4</sub>.2H<sub>2</sub>O 0.02g
Na<sub>2</sub>SeO<sub>3</sub> 0.02g
NiCl<sub>2</sub>.6H<sub>2</sub>O 0.02g
Na<sub>2</sub>WO<sub>4</sub>.2H<sub>2</sub>O 0.02g
还原剂母液 每100mL母液
NaOH 0.9g
Cystein.HCl 4g
Na<sub>2</sub>S 4g
表2：Luria Bertani培养基LB(大肠杆菌)
培养基组分 每1.0L培养基中的浓度
胰蛋白胨 10g
酵母提取物 5g
NaCl 10g
表3：M9基本培养基(大肠杆菌)
培养基组分 每1.0L培养基中的浓度
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 6g
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 3g
NaCl 0.5g
NH<sub>4</sub>Cl 1g
100mM MgSO<sub>4</sub> 10ml
葡萄糖 20％
CaCl<sub>2</sub> 10mM
硫胺素-HCl 100mM
构建具有来自橙色绿屈挠菌的丙二酰辅酶A还原酶的表达质粒
使用标准重组DNA和分子克隆技术(Sambrook,J.and Russell,D.,Molecularcloning:A Laboratory Manual 3rd Ed.，Cold Spring Harbour Lab Press,Cold SpringHarbour,NY,2001)。来自橙色绿屈挠菌的丙二酰辅酶A还原酶的DNA序列得自NCBI GenBank(GI:163848165,Caur_2614；YP_001636209.1)。
使来自橙色绿屈挠菌的丙二酰辅酶A还原酶进行密码子优化(SEQ ID NO:1)，并且通过ATG:Biosynthetics GmbH(Merzhausen，德国)合成，侧翼为NdeI和EcoI限制位点用于进一步亚克隆。将自产乙醇梭菌的磷酸转乙酰酶/乙酸激酶操纵子启动子(Ppta-ack)用于表达丙二酰辅酶A还原酶。所使用的所有DNA序列均在表4中给出。
表4：用于具有来自橙色绿屈挠菌的丙二酰辅酶A还原酶的表达质粒的序列
Figure BDA0003289895400000321
使用引物Ppta-ack-NotI-F(SEQ ID NO:8:GAGCGGCCGCAATATGATATTTATGTCC)和Ppta-ack-NdeI-R(SEQ ID NO:9:TTCCATATGTTTCATGTTCATTTCCTCC)，扩增磷酸转乙酰酶-乙酸激酶操纵子的启动子区(Ppta-ack)(SEQ ID NO:17)，并且使用NotI和NdeI限制性位点和菌株XL1-Blue MRF’Kan，将其克隆到大肠杆菌-梭菌属穿梭载体pMTL 85141中(FJ797651.1；Nigel Minton,University of Nottingham,UK)[Heap JT,Pennington OJ,Cartman ST,Minton NP.A modular system for Clostridium shuttle plasmids.J MicrobiolMethods.2009,78:79-85]。
随后，使用FseI和PmeI限制性位点和菌株XL1-Blue MRF’Kan，将所制备的质粒pMTL 85145中的抗生素抗性基因替换为来自pMTL82254的红霉素抗性基因(FJ797646.1；Nigel Minton,University of Nottingham,UK)[Heap JT,Pennington OJ,Cartman ST,Minton NP.A modular system for Clostridium shuttle plasmids.J MicrobiolMethods.2009,78:79-85]。将所制备的质粒pMTL 85245(SEQ ID NO:3)和来自pMTL83151的repL基因的1625bp片段(FJ797647.1；Nigel Minton,University of Nottingham,UK)[Heap JT,Pennington OJ,Cartman ST,Minton NP.A modular system for Clostridiumshuttle plasmids.J Microbiol Methods.2009,78:79-85]均用FseI和AscI进行切割。进行连接以得到质粒pMTL83245。
将所制备的质粒pMTL 83245(SEQ ID NO:4)和3660bp密码子优化的丙二酰辅酶A还原酶基因的产物均用NdeI和EcoRI进行切割。进行连接，并且随后将连接产物转化到大肠杆菌XL1-Blue MRF’Kan内，得到质粒pMTL83245-SDR(SEQ ID NO:5)。使用寡核苷酸(表5中给出)进行的DNA测序证实了不含突变的丙二酰辅酶A还原酶基因的成功克隆。
表5：用于证实成功的SDR克隆的引物
Figure BDA0003289895400000331
酶活性测定
使含有质粒pMTL 83245-SDR的重组菌株在含有适当抗生素的LB培养基中在好氧条件下生长过夜。将细胞接种到新鲜的LB培养基内，起始OD600为0.1。在对数期时(OD600～0.6)收获细胞，并在13,000×g和4℃下离心10分钟。将细胞沉淀用100mM Tris–HCl(pH7.8)洗涤两次，并重悬于含有蛋白酶抑制剂的相同洗涤缓冲液中，并且与1.44g 100μm玻璃小珠混合。使管在冰上冷却5分钟，之后在Mini Bead Beater(Biospec Products)中通过5个循环(在5,000rpm下打浆1分钟、随后在循环之间在冰上放置1分钟)而进行破坏。在裂解后，将样品离心(13,000×g，4℃10分钟)，并且将上清液等分并贮存于-80℃下，直至分析。使用商业试剂盒(
Figure BDA0003289895400000332
Microplate BCA Protein Assay Kit-Reducing Agent Compatible,Thermo Scientific)测定提取物中的蛋白质含量。
使用Hugler等人(Hugler,M.,Menendez,C.,Schagger,H.,Fuchs,G.,2002.Malonyl-coenzyme A reductase from Chloroflexus aurantiacus,a key enzymeof the 3-hydroxypropionate cycle for autotrophic CO2 fixation.J.Bacteriol.184(9),2404–2410)报告的方法，在45℃下测定丙二酰辅酶A还原酶活性。对于常规测定，使酶裂解产物在45℃下在含有3mM 1,4-二硫赤藓醇、2mM MgCl2和0.3mM NADPH的100mM Tris–HCl缓冲液(pH 7.8)中预温育10分钟。通过添加0.3mM丙二酰辅酶A启动反应。使用3400M- 1cm-1的摩尔消光系数(Δε365)确定所消耗的NADPH量。一个单位的SDR活性被定义为每分钟将2μmol NADPH氧化为NADP+所需的酶量。为了研究温度对SDR活性的影响，还在37℃下进行了测定。
具有来自橙色绿屈挠菌的丙二酰辅酶A还原酶的表达质粒的甲基化
使用由来自自产乙醇梭菌、拉氏梭菌和扬氏梭菌的甲基转移酶基因设计的合成的杂种II型甲基转移酶基因(SEQ ID NO:6)，在大肠杆菌中在体内进行3-HP表达质粒pMTL83245-SDR的甲基化。合成甲基转移酶(SEQ ID NO:6)并在载体pGS20(ATG:biosynthetics GmbH,Merzhausen，德国)(SEQ ID NO:7)中与诱导型lac启动子融合。
将表达质粒和甲基化质粒均转化到限制性阴性的大肠杆菌XL1-Blue MRF’Kan的相同细胞内，由于它们的相容性革兰氏-(-)复制起点(表达质粒中的高拷贝ColE1和甲基化质粒中的低拷贝p15A)，因此这是可能的。通过添加1mM IPTG而诱导体内甲基化，并且使用QIAGEN Plasmid Midi Kit(QIAGEN GmbH,Hilden,Germany)分离甲基化的质粒。将所得的混合物用于使用自产乙醇梭菌DSM23693的转化实验，但仅具有革兰氏-(+)复制起点(repH)的丰富(高拷贝)表达质粒能够在梭菌属中复制。
甲基化的3-HP表达质粒在自产乙醇梭菌中的转化
为了制备自产乙醇梭菌DSM23693的感受态细胞，将50ml培养物(含钢铁厂气体和果糖作为碳源的PETC培养基(表1)；37℃)继代培养至新鲜培养基中，共连续3天。将这些细胞用于接种含有40mM DL-苏氨酸的50ml PETC培养基，OD600nm为0.05。当培养物达到OD600nm为0.45时，将细胞转移到厌氧培养室，并且在4,700x g和4℃下收获。将培养物用冰冷的电穿孔缓冲液(270mM蔗糖、1mM MgCl2、7mM磷酸钠，pH 7.4)洗涤两次，并且最终悬浮于600μl体积的新鲜电穿孔缓冲液中。将该混合物转移到含有～10μg甲基化的质粒混合物、具有0.4cm电极间隙的预冷却电穿孔杯中。因为与自产乙醇梭菌相比较，在扬氏梭菌的基因组中鉴定了另外的I型限制性***，所以将1μl I型限制性抑制剂(EPICENTREBiotechnologies,Madison,WI 53713,USA)加入所述质粒混合物中。使细胞与质粒和限制性抑制剂混合，并且立即使用Gene pulser Xcell电穿孔***(Bio-Rad Labratories,Hercules,CA 94547,USA)进行冲击，其中使用下述设置：2.5kV、600Ω和25μF。时间常数在3.7-5.1ms之间。为了再生，将培养物转移到5ml PETC-MES培养基(表1)中，这增加了细胞的恢复。使用配备管支架的Spectronic Helios Epsilon Spectrophotometer(ThermoFisher Scientific Inc.,Waltham MA 02454,USA)，在600nm波长下监测培养物。一旦观察到生长(一次倍增)，则将培养放大至各含有5μg/ml克拉霉素的10ml和以后的50ml PETC-MES培养基中，且顶空中为30psi钢铁厂气体作为唯一碳源。代谢产物的分析
使用配备在35℃下操作的RID(折射率检测器)和保持在35℃下的Aminex HPX-87H柱(300x 7.8mm，粒径5μm)的安捷伦1100系列HPLC***(Agilent 1100Series HPLCsystem)，进行3-羟基丙酸盐(3-HP)及其他代谢产物的HPLC分析。使用轻微酸化的水(0.005M H2SO4)作为流动相，流速为0.6ml/分钟。为了去除蛋白质及其他细胞残渣，将400μl样品与100μl在1M硫酸中的1％(w/v)5-磺基水杨酸混合，并且在14,000rpm下离心3分钟，以分离沉淀的残渣。随后将10μl上清液注入HPLC内用于分析。
结果
在经转化的细胞中的3-HP生产在自产乙醇梭菌中使用橙色绿屈挠菌途径基因由CO和CO2/H2生产3-HP：
在具有橡皮塞的血清中的50ml PETC-MES培养基(表1；不含果糖)中，用携带质粒pMTL83245-SDR的经转化的自产乙醇梭菌DSM23693进行生长实验，顶空中为30psi钢铁厂气体(由Glenbrook,NZ的New Zealand Steel场所收集；组成：44％CO、32％N2、22％CO2、2％H2)作为唯一能源和碳源。使用HPLC分析证实了3-HP生产。
实施例2
经由增加的生物素生物合成提高3-HP生产
通过乙酰辅酶A羧化酶(ACC)将CO2固定到乙酰辅酶A上，这是通过生物素(维生素B7、维生素H)介导的。需要生物素作为用于该羧化反应的辅因子。
乙酰辅酶A羧化酶是由四个不同亚基AccA、AccB、AccC和AccD组成的复合物，其中生物素与亚基AccB共价结合。生物素的羧化是通过亚基AccC进行催化，该催化消耗ATP。随后，CO2通过AccA和AccD从羧化的生物素转移到乙酰辅酶A，这导致丙二酰辅酶A的形成。在乙酰辅酶A羧化酶复合物活化的第一步中，生物素与AccB的结合是通过生物素-[乙酰辅酶A羧化酶]连接酶(全酶合成酶)催化的。
为了提高一氧化碳营养产乙酸菌中经由乙酰辅酶A羧化酶的CO2固定和3-HP生产，生物素辅因子库可通过过表达参与该辅因子的生物合成途径的基因而得到增加。生物素的生物合成包括酶6-羧基己酸辅酶A连接酶[EC:6.2.1.14]、8-氨基-7-氧代壬酸合酶[EC:2.3.1.47]、腺苷甲硫氨酸-8-氨基-7-氧代壬酸氨基转移酶[EC:2.6.1.62]、生物素合成酶[EC:2.8.1.6]、生物素-[乙酰辅酶A羧化酶]连接酶[EC:6.3.4.15]、生物素酶[EC:3.5.1.12]、生物素-蛋白质连接酶[EC:6.3.4.15；EC:6.3.4.11；EC:6.3.4.10；EC:6.3.4.9]、脱硫生物素合成酶(ethiobiotin synthetase)[EC:6.3.3.3]、III型泛酸激酶[EC:2.7.1.33]。
实施例3
经由限制脂肪酸生物合成提高3-HP生产
丙二酰辅酶A也是脂肪酸生物合成的前体。为了增加3-HP生产，可限制脂肪酸的生物合成率以有利于3-HP生产。丙二酰辅酶A:酰基载体蛋白质酰基转移酶(FabD)[EC:2.3.1.39]启动脂肪酸链的延长。可下调编码该酶的基因或降低该酶的活性以阻止丙二酰辅酶A被用于天然脂肪酸的生物合成。
已在本文中参考某些优选实施方案描述了本发明，以便允许读者无需过度实验而实践本发明。然而，本领域普通技术人员应容易地认识到可将许多组分和参数中改变或修饰至一定程度或替换为已知等价物，而不背离本发明的范围。应当理解此类修饰和等价物如同经个别阐述一样被纳入本文。提供题目、标题等等以增强读者对本文的理解，而不应被理解为限制本发明的范围。
如果存在的话，上文和下文所引用的所有专利申请、专利和出版物的全部公开内容均以引用的方式纳入本文。然而，本说明书中对任何专利申请、专利和出版物的参考不是，也不应被视为承认或任何形式的暗示它们在全世界任何国家构成有效的现有技术或构成公知常识的一部分。
本说明书和随后的任何权利要求自始至终，除非上下文另有说明，否则单词“包含”、“含有”等等应理解为与排他的含义相反的包括在内的含义，也就是说，为“包括但不限于”的含义。
序列表
<110>朗泽科技新西兰有限公司
<120> 重组微生物及其用途
<130> LT78
<160> 26
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3660
<212> DNA
<213> 橙色绿屈挠菌（Cloroflexus auranticus）
<400> 1
atgtcaggaa caggtagatt agctggaaaa attgcattaa ttacaggtgg tgctggtaat 60
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ggttgggctg aatctttaat tggacttcat ttaggaaagg tagctcttat aacaggtggt 1740
tcagctggaa taggtggtca aataggaaga cttttagcac ttagtggtgc tagagtaatg 1800
cttgctgcaa gagatagaca caaattagaa caaatgcaag caatgattca gagtgaactt 1860
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ttcggtggtg aaaaagatgc agctatacca tacccaaata gagcagatta tgctgtaagt 2220
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attaatgcta tagcaccagg accagtagaa ggtgacagac ttagaggtac tggtgaaaga 2340
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catgctgctt taatagctgc tgctagaaca gatgagagat caatgcatga acttgtagaa 2460
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cttttaaata gaagtatagc tgcaaaactt ttagcaagat tacataacgg tggttatgta 2640
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caaatagaca gagaagcaag aaaagtaaga gatggaatta tgggaatgct ttatttacaa 2760
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<210> 2
<211> 479
<212> DNA
<213> 自产乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum）
<400> 2
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<210> 3
<211> 3552
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒pMTL 85245
<400> 3
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<211> 4299
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<220>
<223> 质粒pMTL 83245
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aagggaaagt ccaatgtatt aattgttcaa agatgaaccg atatggatgg tgtgccataa 2700
aaatgagatg ttttacagag gaagaacaga aaaaagaacg tacatgcatt aaatattatg 2760
caaggagctt taaaaaagct catgtaaaga agagtaaaaa gaaaaaataa tttatttatt 2820
aatttaatat tgagagtgcc gacacagtat gcactaaaaa atatatctgt ggtgtagtga 2880
gccgatacaa aaggatagtc actcgcattt tcataataca tcttatgtta tgattatgtg 2940
tcggtgggac ttcacgacga aaacccacaa taaaaaaaga gttcggggta gggttaagca 3000
tagttgaggc aactaaacaa tcaagctagg atatgcagta gcagaccgta aggtcgttgt 3060
ttaggtgtgt tgtaatacat acgctattaa gatgtaaaaa tacggatacc aatgaaggga 3120
aaagtataat ttttggatgt agtttgtttg ttcatctatg ggcaaactac gtccaaagcc 3180
gtttccaaat ctgctaaaaa gtatatcctt tctaaaatca aagtcaagta tgaaatcata 3240
aataaagttt aattttgaag ttattatgat attatgtttt tctattaaaa taaattaagt 3300
atatagaata gtttaataat agtatatact taatgtgata agtgtctgac agtgtcacag 3360
aaaggatgat tgttatggat tataagcggc cggccgaagc aaacttaaga gtgtgttgat 3420
agtgcagtat cttaaaattt tgtataatag gaattgaagt taaattagat gctaaaaatt 3480
tgtaattaag aaggagtgat tacatgaaca aaaatataaa atattctcaa aactttttaa 3540
cgagtgaaaa agtactcaac caaataataa aacaattgaa tttaaaagaa accgataccg 3600
tttacgaaat tggaacaggt aaagggcatt taacgacgaa actggctaaa ataagtaaac 3660
aggtaacgtc tattgaatta gacagtcatc tattcaactt atcgtcagaa aaattaaaac 3720
tgaatactcg tgtcacttta attcaccaag atattctaca gtttcaattc cctaacaaac 3780
agaggtataa aattgttggg agtattcctt accatttaag cacacaaatt attaaaaaag 3840
tggtttttga aagccatgcg tctgacatct atctgattgt tgaagaagga ttctacaagc 3900
gtaccttgga tattcaccga acactagggt tgctcttgca cactcaagtc tcgattcagc 3960
aattgcttaa gctgccagcg gaatgctttc atcctaaacc aaaagtaaac agtgtcttaa 4020
taaaacttac ccgccatacc acagatgttc cagataaata ttggaagcta tatacgtact 4080
ttgtttcaaa atgggtcaat cgagaatatc gtcaactgtt tactaaaaat cagtttcatc 4140
aagcaatgaa acacgccaaa gtaaacaatt taagtaccgt tacttatgag caagtattgt 4200
ctatttttaa tagttatcta ttatttaacg ggaggaaata attctatgag tcgcttttgt 4260
aaatttggaa agttacacgt tactaaaggg aatgtgttt 4299
<210> 5
<211> 7884
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒pMTL83245-SDR
<400> 5
aaactccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga 60
gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta 120
atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa 180
gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact 240
gttcttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca 300
tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt 360
accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg 420
ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag 480
cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta 540
agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat 600
ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg 660
tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc 720
ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac 780
cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc 840
gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc ccaatacgca gggccccctg caggataaaa 900
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atgaccgcgg ccgcaatatg atatttatgt ccattgtgaa agggattata ttcaactatt 1020
attccagtta cgttcataga aattttcctt tctaaaatat tttattccat gtcaagaact 1080
ctgtttattt cattaaagaa ctataagtac aaagtataag gcatttgaaa aaataggcta 1140
gtatattgat tgattattta ttttaaaatg cctaagtgaa atatatacat attataacaa 1200
taaaataagt attagtgtag gatttttaaa tagagtatct attttcagat taaatttttg 1260
attatttgat ttacattata taatattgag taaagtattg actagcaaaa ttttttgata 1320
ctttaatttg tgaaatttct tatcaaaagt tatatttttg aataattttt attgaaaaat 1380
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tgtttcaact atattttcaa gagctgaata ttatggtaga ataccttacg taacacctaa 1980
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tgtagcagac gctgctgtat ttttagctag tgctgaatca gcagcattat caggtgaaac 2280
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aggatttaga tcagctgcag cattagcaca gtttgagcag gcagtaaatg aatctagaag 2520
acttgcaggt gcagatttca ctccacctat agcattacca cttgacccaa gagatccagc 2580
tactatagat gctgtatttg attgggctgg tgaaaataca ggtggtatac atgcagcagt 2640
aatattacct gcaactagtc atgaaccagc accatgtgtt attgaagttg atgatgagag 2700
agtacttaac tttttagctg atgaaataac aggaacaatt gtaatagcaa gtagacttgc 2760
aagatattgg caatctcaga gacttacacc aggtgctaga gcaagaggtc caagagtaat 2820
ttttcttagt aatggtgctg atcagaatgg aaatgtatat ggtagaatac agtcagctgc 2880
aattggacaa ttaataagag tttggagaca tgaggctgaa cttgattatc aaagagcttc 2940
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aagatcagct agtgttggtt gggctgaatc tttaattgga cttcatttag gaaaggtagc 3180
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tggtgctaga gtaatgcttg ctgcaagaga tagacacaaa ttagaacaaa tgcaagcaat 3300
gattcagagt gaacttgcag aagttggata tactgatgtt gaagacagag ttcatatagc 3360
tcctggatgt gatgtaagtt ctgaagctca gttagcagat cttgttgaga gaactttatc 3420
tgcattcgga acagttgatt atcttataaa taatgcaggt atagcaggtg ttgaagaaat 3480
ggttatagat atgcctgtag aaggttggag acatacactt tttgctaacc ttatatcaaa 3540
ctattcttta atgagaaaat tagctccact tatgaaaaag caaggaagtg gttatatact 3600
taatgtatca tcatatttcg gtggtgaaaa agatgcagct ataccatacc caaatagagc 3660
agattatgct gtaagtaaag caggacagag agctatggct gaagtatttg ctagattctt 3720
aggaccagaa attcagatta atgctatagc accaggacca gtagaaggtg acagacttag 3780
aggtactggt gaaagacctg gactttttgc tagaagagct agattaatac ttgaaaataa 3840
gagacttaat gagcttcatg ctgctttaat agctgctgct agaacagatg agagatcaat 3900
gcatgaactt gtagaacttt tattaccaaa tgacgtagca gcattagagc aaaacccagc 3960
agctcctaca gctcttagag aacttgctag aagatttaga tcagaaggtg atcctgctgc 4020
aagttcttct agtgcacttt taaatagaag tatagctgca aaacttttag caagattaca 4080
taacggtggt tatgtattac ctgctgatat attcgcaaat ttaccaaacc ctccagatcc 4140
tttctttact agagcacaaa tagacagaga agcaagaaaa gtaagagatg gaattatggg 4200
aatgctttat ttacaaagaa tgccaactga gtttgacgtt gcaatggcta ctgtatatta 4260
tttagcagat agaaatgttt ctggtgaaac ttttcatcca tcaggtggtt taagatacga 4320
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aaaggattct gactggtcaa cagttttaag tgaagcagaa tttgctgagt tatgcgaaca 4740
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tgcacaaaga attttaatta accaggttga tttaacaaga agagcaagag ctgaagaacc 4980
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cttattttta tggcgcgccg ccattatttt tttgaacaat tgacaattca tttcttattt 5400
tttattaagt gatagtcaaa aggcataaca gtgctgaata gaaagaaatt tacagaaaag 5460
aaaattatag aatttagtat gattaattat actcatttat gaatgtttaa ttgaatacaa 5520
aaaaaaatac ttgttatgta ttcaattacg ggttaaaata tagacaagtt gaaaaattta 5580
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gaagcagtac gcaaaggctt ttttatttga taaaaattag aagtatattt attttttcat 5880
aattaattta tgaaaatgaa agggggtgag caaagtgaca gaggaaagca gtatcttatc 5940
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gtattaattg ttcaaagatg aaccgatatg gatggtgtgc cataaaaatg agatgtttta 6300
cagaggaaga acagaaaaaa gaacgtacat gcattaaata ttatgcaagg agctttaaaa 6360
aagctcatgt aaagaagagt aaaaagaaaa aataatttat ttattaattt aatattgaga 6420
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tagtcactcg cattttcata atacatctta tgttatgatt atgtgtcggt gggacttcac 6540
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aacaatcaag ctaggatatg cagtagcaga ccgtaaggtc gttgtttagg tgtgttgtaa 6660
tacatacgct attaagatgt aaaaatacgg ataccaatga agggaaaagt ataatttttg 6720
gatgtagttt gtttgttcat ctatgggcaa actacgtcca aagccgtttc caaatctgct 6780
aaaaagtata tcctttctaa aatcaaagtc aagtatgaaa tcataaataa agtttaattt 6840
tgaagttatt atgatattat gtttttctat taaaataaat taagtatata gaatagttta 6900
ataatagtat atacttaatg tgataagtgt ctgacagtgt cacagaaagg atgattgtta 6960
tggattataa gcggccggcc gaagcaaact taagagtgtg ttgatagtgc agtatcttaa 7020
aattttgtat aataggaatt gaagttaaat tagatgctaa aaatttgtaa ttaagaagga 7080
gtgattacat gaacaaaaat ataaaatatt ctcaaaactt tttaacgagt gaaaaagtac 7140
tcaaccaaat aataaaacaa ttgaatttaa aagaaaccga taccgtttac gaaattggaa 7200
caggtaaagg gcatttaacg acgaaactgg ctaaaataag taaacaggta acgtctattg 7260
aattagacag tcatctattc aacttatcgt cagaaaaatt aaaactgaat actcgtgtca 7320
ctttaattca ccaagatatt ctacagtttc aattccctaa caaacagagg tataaaattg 7380
ttgggagtat tccttaccat ttaagcacac aaattattaa aaaagtggtt tttgaaagcc 7440
atgcgtctga catctatctg attgttgaag aaggattcta caagcgtacc ttggatattc 7500
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cagcggaatg ctttcatcct aaaccaaaag taaacagtgt cttaataaaa cttacccgcc 7620
ataccacaga tgttccagat aaatattgga agctatatac gtactttgtt tcaaaatggg 7680
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atctattatt taacgggagg aaataattct atgagtcgct tttgtaaatt tggaaagtta 7860
cacgttacta aagggaatgt gttt 7884
<210> 6
<211> 601
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> II型甲基转移酶
<400> 6
Met Phe Pro Cys Asn Ala Tyr Ile Glu Tyr Gly Asp Lys Asn Met Asn
1 5 10 15
Ser Phe Ile Glu Asp Val Glu Gln Ile Tyr Asn Phe Ile Lys Lys Asn
20 25 30
Ile Asp Val Glu Glu Lys Met His Phe Ile Glu Thr Tyr Lys Gln Lys
35 40 45
Ser Asn Met Lys Lys Glu Ile Ser Phe Ser Glu Glu Tyr Tyr Lys Gln
50 55 60
Lys Ile Met Asn Gly Lys Asn Gly Val Val Tyr Thr Pro Pro Glu Met
65 70 75 80
Ala Ala Phe Met Val Lys Asn Leu Ile Asn Val Asn Asp Val Ile Gly
85 90 95
Asn Pro Phe Ile Lys Ile Ile Asp Pro Ser Cys Gly Ser Gly Asn Leu
100 105 110
Ile Cys Lys Cys Phe Leu Tyr Leu Asn Arg Ile Phe Ile Lys Asn Ile
115 120 125
Glu Val Ile Asn Ser Lys Asn Asn Leu Asn Leu Lys Leu Glu Asp Ile
130 135 140
Ser Tyr His Ile Val Arg Asn Asn Leu Phe Gly Phe Asp Ile Asp Glu
145 150 155 160
Thr Ala Ile Lys Val Leu Lys Ile Asp Leu Phe Leu Ile Ser Asn Gln
165 170 175
Phe Ser Glu Lys Asn Phe Gln Val Lys Asp Phe Leu Val Glu Asn Ile
180 185 190
Asp Arg Lys Tyr Asp Val Phe Ile Gly Asn Pro Pro Tyr Ile Gly His
195 200 205
Lys Ser Val Asp Ser Ser Tyr Ser Tyr Val Leu Arg Lys Ile Tyr Gly
210 215 220
Ser Ile Tyr Arg Asp Lys Gly Asp Ile Ser Tyr Cys Phe Phe Gln Lys
225 230 235 240
Ser Leu Lys Cys Leu Lys Glu Gly Gly Lys Leu Val Phe Val Thr Ser
245 250 255
Arg Tyr Phe Cys Glu Ser Cys Ser Gly Lys Glu Leu Arg Lys Phe Leu
260 265 270
Ile Glu Asn Thr Ser Ile Tyr Lys Ile Ile Asp Phe Tyr Gly Ile Arg
275 280 285
Pro Phe Lys Arg Val Gly Ile Asp Pro Met Ile Ile Phe Leu Val Arg
290 295 300
Thr Lys Asn Trp Asn Asn Asn Ile Glu Ile Ile Arg Pro Asn Lys Ile
305 310 315 320
Glu Lys Asn Glu Lys Asn Lys Phe Leu Asp Ser Leu Phe Leu Asp Lys
325 330 335
Ser Glu Lys Cys Lys Lys Phe Ser Ile Ser Gln Lys Ser Ile Asn Asn
340 345 350
Asp Gly Trp Val Phe Val Asp Glu Val Glu Lys Asn Ile Ile Asp Lys
355 360 365
Ile Lys Glu Lys Ser Lys Phe Ile Leu Lys Asp Ile Cys His Ser Cys
370 375 380
Gln Gly Ile Ile Thr Gly Cys Asp Arg Ala Phe Ile Val Asp Arg Asp
385 390 395 400
Ile Ile Asn Ser Arg Lys Ile Glu Leu Arg Leu Ile Lys Pro Trp Ile
405 410 415
Lys Ser Ser His Ile Arg Lys Asn Glu Val Ile Lys Gly Glu Lys Phe
420 425 430
Ile Ile Tyr Ser Asn Leu Ile Glu Asn Glu Thr Glu Cys Pro Asn Ala
435 440 445
Ile Lys Tyr Ile Glu Gln Tyr Lys Lys Arg Leu Met Glu Arg Arg Glu
450 455 460
Cys Lys Lys Gly Thr Arg Lys Trp Tyr Glu Leu Gln Trp Gly Arg Lys
465 470 475 480
Pro Glu Ile Phe Glu Glu Lys Lys Ile Val Phe Pro Tyr Lys Ser Cys
485 490 495
Asp Asn Arg Phe Ala Leu Asp Lys Gly Ser Tyr Phe Ser Ala Asp Ile
500 505 510
Tyr Ser Leu Val Leu Lys Lys Asn Val Pro Phe Thr Tyr Glu Ile Leu
515 520 525
Leu Asn Ile Leu Asn Ser Pro Leu Tyr Glu Phe Tyr Phe Lys Thr Phe
530 535 540
Ala Lys Lys Leu Gly Glu Asn Leu Tyr Glu Tyr Tyr Pro Asn Asn Leu
545 550 555 560
Met Lys Leu Cys Ile Pro Ser Ile Asp Phe Gly Gly Glu Asn Asn Ile
565 570 575
Glu Lys Lys Leu Tyr Asp Phe Phe Gly Leu Thr Asp Lys Glu Ile Glu
580 585 590
Ile Val Glu Lys Ile Lys Asp Asn Cys
595 600
<210> 7
<211> 4709
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的甲基化质粒
<400> 7
gtttgccacc tgacgtctaa gaaaaggaat attcagcaat ttgcccgtgc cgaagaaagg 60
cccacccgtg aaggtgagcc agtgagttga ttgctacgta attagttagt tagcccttag 120
tgactcgtaa tacgactcac tatagggctc gaggcggccg cgcaacgcaa ttaatgtgag 180
ttagctcact cattaggcac cccaggcttt acactttatg cttccggctc gtatgttgtg 240
tggaattgtg agcggataac aatttcacac aggaaacaca tatgtttccg tgcaatgcct 300
atatcgaata tggtgataaa aatatgaaca gctttatcga agatgtggaa cagatctaca 360
acttcattaa aaagaacatt gatgtggaag aaaagatgca tttcattgaa acctataaac 420
agaaaagcaa catgaagaaa gagattagct ttagcgaaga atactataaa cagaagatta 480
tgaacggcaa aaatggcgtt gtgtacaccc cgccggaaat ggcggccttt atggttaaaa 540
atctgatcaa cgttaacgat gttattggca atccgtttat taaaatcatt gacccgagct 600
gcggtagcgg caatctgatt tgcaaatgtt ttctgtatct gaatcgcatc tttattaaga 660
acattgaggt gattaacagc aaaaataacc tgaatctgaa actggaagac atcagctacc 720
acatcgttcg caacaatctg tttggcttcg atattgacga aaccgcgatc aaagtgctga 780
aaattgatct gtttctgatc agcaaccaat ttagcgagaa aaatttccag gttaaagact 840
ttctggtgga aaatattgat cgcaaatatg acgtgttcat tggtaatccg ccgtatatcg 900
gtcacaaaag cgtggacagc agctacagct acgtgctgcg caaaatctac ggcagcatct 960
accgcgacaa aggcgatatc agctattgtt tctttcagaa gagcctgaaa tgtctgaagg 1020
aaggtggcaa actggtgttt gtgaccagcc gctacttctg cgagagctgc agcggtaaag 1080
aactgcgtaa attcctgatc gaaaacacga gcatttacaa gatcattgat ttttacggca 1140
tccgcccgtt caaacgcgtg ggtatcgatc cgatgattat ttttctggtt cgtacgaaga 1200
actggaacaa taacattgaa attattcgcc cgaacaagat tgaaaagaac gaaaagaaca 1260
aattcctgga tagcctgttc ctggacaaaa gcgaaaagtg taaaaagttt agcattagcc 1320
agaaaagcat taataacgat ggctgggttt tcgtggacga agtggagaaa aacattatcg 1380
acaaaatcaa agagaaaagc aagttcattc tgaaagatat ttgccatagc tgtcaaggca 1440
ttatcaccgg ttgtgatcgc gcctttattg tggaccgtga tatcatcaat agccgtaaga 1500
tcgaactgcg tctgattaaa ccgtggatta aaagcagcca tatccgtaag aatgaagtta 1560
ttaagggcga aaaattcatc atctatagca acctgattga gaatgaaacc gagtgtccga 1620
atgcgattaa atatatcgaa cagtacaaga aacgtctgat ggagcgccgc gaatgcaaaa 1680
agggcacgcg taagtggtat gaactgcaat ggggccgtaa accggaaatc ttcgaagaaa 1740
agaaaattgt tttcccgtat aaaagctgtg acaatcgttt tgcactggat aagggtagct 1800
attttagcgc agacatttat agcctggttc tgaagaaaaa tgtgccgttc acctatgaga 1860
tcctgctgaa tatcctgaat agcccgctgt acgagtttta ctttaagacc ttcgcgaaaa 1920
agctgggcga gaatctgtac gagtactatc cgaacaacct gatgaagctg tgcatcccga 1980
gcatcgattt cggcggtgag aacaatattg agaaaaagct gtatgatttc tttggtctga 2040
cggataaaga aattgagatt gtggagaaga tcaaagataa ctgctaagaa ttcgatatca 2100
cccgggaact agtctgcagc cctttagtga gggttaattg gagtcactaa gggttagtta 2160
gttagattag cagaaagtca aaagcctccg accggaggct tttgactaaa acttcccttg 2220
gggttatcat tggggctcac tcaaaggcgg taatcagata aaaaaaatcc ttagctttcg 2280
ctaaggatga tttctgctag agatggaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga 2340
ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt 2400
gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc 2460
gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct 2520
gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata 2580
ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt 2640
gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc 2700
ttaataagat gatcttcttg agatcgtttt ggtctgcgcg taatctcttg ctctgaaaac 2760
gaaaaaaccg ccttgcaggg cggtttttcg aaggttctct gagctaccaa ctctttgaac 2820
cgaggtaact ggcttggagg agcgcagtca ccaaaacttg tcctttcagt ttagccttaa 2880
ccggcgcatg acttcaagac taactcctct aaatcaatta ccagtggctg ctgccagtgg 2940
tgcttttgca tgtctttccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg 3000
gtcggactga acggggggtt cgtgcataca gtccagcttg gagcgaactg cctacccgga 3060
actgagtgtc aggcgtggaa tgagacaaac gcggccataa cagcggaatg acaccggtaa 3120
accgaaaggc aggaacagga gagcgcacga gggagccgcc aggggaaacg cctggtatct 3180
ttatagtcct gtcgggtttc gccaccactg atttgagcgt cagatttcgt gatgcttgtc 3240
aggggggcgg agcctatgga aaaacggctt tgccgcggcc ctctcacttc cctgttaagt 3300
atcttcctgg catcttccag gaaatctccg ccccgttcgt aagccatttc cgctcgccgc 3360
agtcgaacga ccgagcgtag cgagtcagtg agcgaggaag cggaatatat cctgtatcac 3420
atattctgct gacgcaccgg tgcagccttt tttctcctgc cacatgaagc acttcactga 3480
caccctcatc agtgccaaca tagtaagcca gtatacactc cgctagcgct gaggtctgcc 3540
tcgtgaagaa ggtgttgctg actcatacca ggcctgaatc gccccatcat ccagccagaa 3600
agtgagggag ccacggttga tgagagcttt gttgtaggtg gaccagttgg tgattttgaa 3660
cttttgcttt gccacggaac ggtctgcgtt gtcgggaaga tgcgtgatct gatccttcaa 3720
ctcagcaaaa gttcgattta ttcaacaaag ccacgttgtg tctcaaaatc tctgatgtta 3780
cattgcacaa gataaaaata tatcatcatg aacaataaaa ctgtctgctt acataaacag 3840
taatacaagg ggtgtttact agaggttgat cgggcacgta agaggttcca actttcacca 3900
taatgaaata agatcactac cgggcgtatt ttttgagtta tcgagatttt caggagctaa 3960
ggaagctaaa atggagaaaa aaatcacggg atataccacc gttgatatat cccaatggca 4020
tcgtaaagaa cattttgagg catttcagtc agttgctcaa tgtacctata accagaccgt 4080
tcagctggat attacggcct ttttaaagac cgtaaagaaa aataagcaca agttttatcc 4140
ggcctttatt cacattcttg cccgcctgat gaacgctcac ccggagtttc gtatggccat 4200
gaaagacggt gagctggtga tctgggatag tgttcaccct tgttacaccg ttttccatga 4260
gcaaactgaa acgttttcgt ccctctggag tgaataccac gacgatttcc ggcagtttct 4320
ccacatatat tcgcaagatg tggcgtgtta cggtgaaaac ctggcctatt tccctaaagg 4380
gtttattgag aatatgtttt ttgtctcagc caatccctgg gtgagtttca ccagttttga 4440
tttaaacgtg gccaatatgg acaacttctt cgcccccgtt ttcacgatgg gcaaatatta 4500
tacgcaaggc gacaaggtgc tgatgccgct ggcgatccag gttcatcatg ccgtttgtga 4560
tggcttccat gtcggccgca tgcttaatga attacaacag tactgtgatg agtggcaggg 4620
cggggcgtaa taatactagc tccggcaaaa aaacgggcaa ggtgtcacca ccctgccctt 4680
tttctttaaa accgaaaaga ttacttcgc 4709
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸Ppta-ack-NotI-F
<400> 8
gagcggccgc aatatgatat ttatgtcc 28
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸Ppta-ack-NdeI-R
<400> 9
ttccatatgt ttcatgttca tttcctcc 28
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸M13R
<400> 10
caggaaacag ctatgac 17
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸SDR_seqR1
<400> 11
agcagcttct atctgatcac ctgc 24
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸SDR_seqR2
<400> 12
tgctctaatg ctgctacgtc atttg 25
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸SDR_seqR3
<400> 13
tgcaagttca ctctgaatca ttgc 24
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸SDR_seqR4
<400> 14
acatggtgct ggttcatgac tag 23
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸SDR_seqR5
<400> 15
tctagcacca agttctcttg ctg 23
<210> 16
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸M13 (-21)
<400> 16
tgtaaaacga cggccag 17
<210> 17
<211> 419
<212> DNA
<213> 自产乙醇梭菌
<400> 17
agaaattttc ctttctaaaa tattttattc catgtcaaga actctgttta tttcattaaa 60
gaactataag tacaaagtat aaggcatttg aaaaaatagg ctagtatatt gattgattat 120
ttattttaaa atgcctaagt gaaatatata catattataa caataaaata agtattagtg 180
taggattttt aaatagagta tctattttca gattaaattt ttgattattt gatttacatt 240
atataatatt gagtaaagta ttgactagca aaattttttg atactttaat ttgtgaaatt 300
tcttatcaaa agttatattt ttgaataatt tttattgaaa aatacaacta aaaaggatta 360
tagtataagt gtgtgtaatt ttgtgttaaa tttaaaggga ggaaatgaac atgaaattg 419
<210> 18
<211> 864
<212> DNA
<213> 自产乙醇梭菌
<400> 18
atgaaaggaa gctcttatat ggaaaaatta gaaaaggttc aaaaaatttt taataaaaaa 60
tttgagagta aaagtgcgtg ggatagggtt actttagcta gaatgataga aaggccaact 120
tcacttgatt atataaatag aatatttgac tcttttatgg agcttcatgg agatagatat 180
tttaatgacg atccttctgt agtaggaggc attggattgt taaatggtga gcctgtaacc 240
attgtggccc agcaaaaagg taggaataca caggagaata taaagagaaa ttttggtatg 300
ccggagcctg acggatatag aaaaggatta agactcatga agcaggcaga taaatttgat 360
aggcctatta tatgttttgt ggatacacct ggagcttttt gcggcatgga agcagaggaa 420
agaggacagg gagaggcaat agccaaaaat ctgatggaga tgtttaattt aagagtacct 480
ataatatcta taatagttgg agaaggtgga agcggaggtg ctcttgcttt tgctgtagcg 540
gattcagttt ggatgctgga gaattctata tattctattt taaccccaga aggttttgca 600
ggtatactat ggaaagatgc ttccaaagct aaggaagcag ctgagattat gaaaattaca 660
gctcaagatt taaaaaaata cggtataata gataagatat taaaggaacc tgcaggaggg 720
gcacaaaagg atgtagataa aatgtcctgc accataaaag aagaacttat agaaaaaata 780
ggcatactta ggaaaaggtc taaagaggaa ttacttgaac aaagatacaa taaatttaga 840
aaaatgggta agtttatgga atag 864
<210> 19
<211> 287
<212> PRT
<213> 自产乙醇梭菌
<400> 19
Met Lys Gly Ser Ser Tyr Met Glu Lys Leu Glu Lys Val Gln Lys Ile
1 5 10 15
Phe Asn Lys Lys Phe Glu Ser Lys Ser Ala Trp Asp Arg Val Thr Leu
20 25 30
Ala Arg Met Ile Glu Arg Pro Thr Ser Leu Asp Tyr Ile Asn Arg Ile
35 40 45
Phe Asp Ser Phe Met Glu Leu His Gly Asp Arg Tyr Phe Asn Asp Asp
50 55 60
Pro Ser Val Val Gly Gly Ile Gly Leu Leu Asn Gly Glu Pro Val Thr
65 70 75 80
Ile Val Ala Gln Gln Lys Gly Arg Asn Thr Gln Glu Asn Ile Lys Arg
85 90 95
Asn Phe Gly Met Pro Glu Pro Asp Gly Tyr Arg Lys Gly Leu Arg Leu
100 105 110
Met Lys Gln Ala Asp Lys Phe Asp Arg Pro Ile Ile Cys Phe Val Asp
115 120 125
Thr Pro Gly Ala Phe Cys Gly Met Glu Ala Glu Glu Arg Gly Gln Gly
130 135 140
Glu Ala Ile Ala Lys Asn Leu Met Glu Met Phe Asn Leu Arg Val Pro
145 150 155 160
Ile Ile Ser Ile Ile Val Gly Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ala Leu Ala
165 170 175
Phe Ala Val Ala Asp Ser Val Trp Met Leu Glu Asn Ser Ile Tyr Ser
180 185 190
Ile Leu Thr Pro Glu Gly Phe Ala Gly Ile Leu Trp Lys Asp Ala Ser
195 200 205
Lys Ala Lys Glu Ala Ala Glu Ile Met Lys Ile Thr Ala Gln Asp Leu
210 215 220
Lys Lys Tyr Gly Ile Ile Asp Lys Ile Leu Lys Glu Pro Ala Gly Gly
225 230 235 240
Ala Gln Lys Asp Val Asp Lys Met Ser Cys Thr Ile Lys Glu Glu Leu
245 250 255
Ile Glu Lys Ile Gly Ile Leu Arg Lys Arg Ser Lys Glu Glu Leu Leu
260 265 270
Glu Gln Arg Tyr Asn Lys Phe Arg Lys Met Gly Lys Phe Met Glu
275 280 285
<210> 20
<211> 876
<212> DNA
<213> 自产乙醇梭菌
<400> 20
ttgttaaata aattctttaa aaaaacaaaa tatattacag ttagtcagag ggctttaaat 60
aatatccatg aagatttaga ttcaaagcca agtataccaa atggaatgtg ggtaaaatgt 120
gatggatgtg gtaaggtact atataagcag gatctagaaa aaaataatag ggtatgccag 180
tattgcaagc atcattttag gatgaatgct aaagaaagaa tagatcttat aacagataag 240
gatagctttt gccaatttga tgaaaacatg acgtctacta atcctatagg atttaaagga 300
tatgaagata aaatcagcaa tatgcagaaa aagactaacc tcaaagaagc tgtaattaca 360
ggaaagggta ctataggagg agagtctgca gtaatttgtg ttatggatag taattttatg 420
atgggaagca tgggttccgt ggtaggagag aaaattacta gagctgtaga aaaagctatt 480
gagttaaaaa tacctctaat tatttttaca gcttctggag gcgctagaat gcaggagggt 540
attttttcat taatgcaaat ggcaaagata agtggagcta taaacaggtt gaatgatgca 600
ggacttttat atatatcggt tcttacagat cctactactg gtggagttac agcaagtttt 660
gctatgcttg gtgatataat tttagcagaa cctggagcac ttgttggatt tgcaggaaag 720
agagtaatag agcagaccat aaagcaaaaa cttcccgatg gatttcaaag tgcagaattt 780
ctattaaaac atggatttgt agatagtata gtttcaaggg aaaatttaaa gagtaccttg 840
aagaagatat tgtatattca taataggaat aggtaa 876
<210> 21
<211> 291
<212> PRT
<213> 自产乙醇梭菌
<400> 21
Met Leu Asn Lys Phe Phe Lys Lys Thr Lys Tyr Ile Thr Val Ser Gln
1 5 10 15
Arg Ala Leu Asn Asn Ile His Glu Asp Leu Asp Ser Lys Pro Ser Ile
20 25 30
Pro Asn Gly Met Trp Val Lys Cys Asp Gly Cys Gly Lys Val Leu Tyr
35 40 45
Lys Gln Asp Leu Glu Lys Asn Asn Arg Val Cys Gln Tyr Cys Lys His
50 55 60
His Phe Arg Met Asn Ala Lys Glu Arg Ile Asp Leu Ile Thr Asp Lys
65 70 75 80
Asp Ser Phe Cys Gln Phe Asp Glu Asn Met Thr Ser Thr Asn Pro Ile
85 90 95
Gly Phe Lys Gly Tyr Glu Asp Lys Ile Ser Asn Met Gln Lys Lys Thr
100 105 110
Asn Leu Lys Glu Ala Val Ile Thr Gly Lys Gly Thr Ile Gly Gly Glu
115 120 125
Ser Ala Val Ile Cys Val Met Asp Ser Asn Phe Met Met Gly Ser Met
130 135 140
Gly Ser Val Val Gly Glu Lys Ile Thr Arg Ala Val Glu Lys Ala Ile
145 150 155 160
Glu Leu Lys Ile Pro Leu Ile Ile Phe Thr Ala Ser Gly Gly Ala Arg
165 170 175
Met Gln Glu Gly Ile Phe Ser Leu Met Gln Met Ala Lys Ile Ser Gly
180 185 190
Ala Ile Asn Arg Leu Asn Asp Ala Gly Leu Leu Tyr Ile Ser Val Leu
195 200 205
Thr Asp Pro Thr Thr Gly Gly Val Thr Ala Ser Phe Ala Met Leu Gly
210 215 220
Asp Ile Ile Leu Ala Glu Pro Gly Ala Leu Val Gly Phe Ala Gly Lys
225 230 235 240
Arg Val Ile Glu Gln Thr Ile Lys Gln Lys Leu Pro Asp Gly Phe Gln
245 250 255
Ser Ala Glu Phe Leu Leu Lys His Gly Phe Val Asp Ser Ile Val Ser
260 265 270
Arg Glu Asn Leu Lys Ser Thr Leu Lys Lys Ile Leu Tyr Ile His Asn
275 280 285
Arg Asn Arg
290
<210> 22
<211> 1344
<212> DNA
<213> 自产乙醇梭菌
<400> 22
gtgtttaata agattttgat tgccaataga ggagaaatag cagttaggat aattagagct 60
tgcagggaaa tgggaataga aactgtagca gtgtattcag aagcagatag ggatgcactt 120
catactcaga tggcggatga agccatatgt ataggaccgg catctcctaa agaaagttat 180
ttaaacgtac aaaatataat aagtgccaca gttttatcag gagcgcaagc tattcatcct 240
ggatttggtt ttttatctga aaacagtaag tttgcaagta tatgtaaaca gtgtaatatt 300
acttttatag gccctactcc ggaatgtatt gacaatatgg gcaataagtc taatgctaga 360
gatataatgg gaaaggcagg agttcctatc gttccagggt cagatggtgc tataaaaaca 420
aatgaagaac ttttggaaac tgcaagaaaa ataggatatc ctgttatgat aaaagcctct 480
gcaggcggtg gtggacgtgg tataagagtc gtatatgatg aatctgagat tataaaaaat 540
tatgaaaatg ctaaagctga agctagtgca gcctttggag atgacactat atacttagaa 600
aagtttatag aaagaccaaa gcatgtagaa attcagatac ttggagataa ttttgaaaat 660
gtagtttatc tgggggaaag agactgttcc atgcagagaa gaaatcaaaa agtaatggaa 720
gaagcaccta gcaaggtagt tacggaagaa cttagaaaat ccatgggaga aacagctgta 780
agggcagcca aggctgtaca ttataataat gctggaactg tagaatttct tttagacaaa 840
aataataatt actatttcat ggagatgaat actcgtattc aagtagaaca tgctataaca 900
gaaatggtaa caggtataga tcttgtaaaa gaacagataa aaattgcagc aggagaaaag 960
ttagattttt ctcaagagga tgttaagata accggtcatt ctatagaatg cagaataaat 1020
gcagaagatg taaaaagagg ttttatgcct tctccaggaa agataaaaga cttatatgta 1080
cctggaggtt ttaatgtaag agtagatagt gcagtgtact cgggatataa tattcctccc 1140
tattatgatt ctatgatagc aaagctcatt gtatatggaa aagataggga tgaggctata 1200
tgcagaatga ggagagcctt gggagagttt attatagaag gggttagtac caatatagac 1260
ttccaatttg aactcataga tagtaaggaa tttatagaag gaacttatga tacaaagttt 1320
atagaaaata atttcaagta ttaa 1344
<210> 23
<211> 447
<212> PRT
<213> 自产乙醇梭菌
<400> 23
Met Phe Asn Lys Ile Leu Ile Ala Asn Arg Gly Glu Ile Ala Val Arg
1 5 10 15
Ile Ile Arg Ala Cys Arg Glu Met Gly Ile Glu Thr Val Ala Val Tyr
20 25 30
Ser Glu Ala Asp Arg Asp Ala Leu His Thr Gln Met Ala Asp Glu Ala
35 40 45
Ile Cys Ile Gly Pro Ala Ser Pro Lys Glu Ser Tyr Leu Asn Val Gln
50 55 60
Asn Ile Ile Ser Ala Thr Val Leu Ser Gly Ala Gln Ala Ile His Pro
65 70 75 80
Gly Phe Gly Phe Leu Ser Glu Asn Ser Lys Phe Ala Ser Ile Cys Lys
85 90 95
Gln Cys Asn Ile Thr Phe Ile Gly Pro Thr Pro Glu Cys Ile Asp Asn
100 105 110
Met Gly Asn Lys Ser Asn Ala Arg Asp Ile Met Gly Lys Ala Gly Val
115 120 125
Pro Ile Val Pro Gly Ser Asp Gly Ala Ile Lys Thr Asn Glu Glu Leu
130 135 140
Leu Glu Thr Ala Arg Lys Ile Gly Tyr Pro Val Met Ile Lys Ala Ser
145 150 155 160
Ala Gly Gly Gly Gly Arg Gly Ile Arg Val Val Tyr Asp Glu Ser Glu
165 170 175
Ile Ile Lys Asn Tyr Glu Asn Ala Lys Ala Glu Ala Ser Ala Ala Phe
180 185 190
Gly Asp Asp Thr Ile Tyr Leu Glu Lys Phe Ile Glu Arg Pro Lys His
195 200 205
Val Glu Ile Gln Ile Leu Gly Asp Asn Phe Glu Asn Val Val Tyr Leu
210 215 220
Gly Glu Arg Asp Cys Ser Met Gln Arg Arg Asn Gln Lys Val Met Glu
225 230 235 240
Glu Ala Pro Ser Lys Val Val Thr Glu Glu Leu Arg Lys Ser Met Gly
245 250 255
Glu Thr Ala Val Arg Ala Ala Lys Ala Val His Tyr Asn Asn Ala Gly
260 265 270
Thr Val Glu Phe Leu Leu Asp Lys Asn Asn Asn Tyr Tyr Phe Met Glu
275 280 285
Met Asn Thr Arg Ile Gln Val Glu His Ala Ile Thr Glu Met Val Thr
290 295 300
Gly Ile Asp Leu Val Lys Glu Gln Ile Lys Ile Ala Ala Gly Glu Lys
305 310 315 320
Leu Asp Phe Ser Gln Glu Asp Val Lys Ile Thr Gly His Ser Ile Glu
325 330 335
Cys Arg Ile Asn Ala Glu Asp Val Lys Arg Gly Phe Met Pro Ser Pro
340 345 350
Gly Lys Ile Lys Asp Leu Tyr Val Pro Gly Gly Phe Asn Val Arg Val
355 360 365
Asp Ser Ala Val Tyr Ser Gly Tyr Asn Ile Pro Pro Tyr Tyr Asp Ser
370 375 380
Met Ile Ala Lys Leu Ile Val Tyr Gly Lys Asp Arg Asp Glu Ala Ile
385 390 395 400
Cys Arg Met Arg Arg Ala Leu Gly Glu Phe Ile Ile Glu Gly Val Ser
405 410 415
Thr Asn Ile Asp Phe Gln Phe Glu Leu Ile Asp Ser Lys Glu Phe Ile
420 425 430
Glu Gly Thr Tyr Asp Thr Lys Phe Ile Glu Asn Asn Phe Lys Tyr
435 440 445
<210> 24
<211> 513
<212> DNA
<213> 自产乙醇梭菌
<400> 24
atggacttta aagcaattga gaatatgata aaaactatgg ataattcaaa gcttggatat 60
ttagaagtta attgggataa cgtatctata attatgaaaa agcagggtga agaaggaaat 120
ataaaacagg taaacatagt aaaaggaaat ggagaaaatg taaaacctgt ctttgaaaaa 180
caaagtgaca aaattgaagc aaaagaagat aatatagata aggtaaaaaa agttgaagaa 240
aaaaaagatg atgatataga ggacagcaat ataaaagaag taaagtcacc tatagtaggt 300
actttttaca attcatcagg acctgaaaaa cctgtttttg taaatgtagg atctaaggta 360
aaaaaaggag acactctgtg tataatagaa gctatgaaac ttatgaatga gattcaaagc 420
gaggtagatg gagaagtagt ggatatttta gttaagaatg aacagatggt agagtatggc 480
cagccgctat ttaaaataaa aactgaatct taa 513
<210> 25
<211> 170
<212> PRT
<213> 自产乙醇梭菌
<400> 25
Met Asp Phe Lys Ala Ile Glu Asn Met Ile Lys Thr Met Asp Asn Ser
1 5 10 15
Lys Leu Gly Tyr Leu Glu Val Asn Trp Asp Asn Val Ser Ile Ile Met
20 25 30
Lys Lys Gln Gly Glu Glu Gly Asn Ile Lys Gln Val Asn Ile Val Lys
35 40 45
Gly Asn Gly Glu Asn Val Lys Pro Val Phe Glu Lys Gln Ser Asp Lys
50 55 60
Ile Glu Ala Lys Glu Asp Asn Ile Asp Lys Val Lys Lys Val Glu Glu
65 70 75 80
Lys Lys Asp Asp Asp Ile Glu Asp Ser Asn Ile Lys Glu Val Lys Ser
85 90 95
Pro Ile Val Gly Thr Phe Tyr Asn Ser Ser Gly Pro Glu Lys Pro Val
100 105 110
Phe Val Asn Val Gly Ser Lys Val Lys Lys Gly Asp Thr Leu Cys Ile
115 120 125
Ile Glu Ala Met Lys Leu Met Asn Glu Ile Gln Ser Glu Val Asp Gly
130 135 140
Glu Val Val Asp Ile Leu Val Lys Asn Glu Gln Met Val Glu Tyr Gly
145 150 155 160
Gln Pro Leu Phe Lys Ile Lys Thr Glu Ser
165 170
<210> 26
<211> 1806
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的II型甲基转移酶
<400> 26
atgtttccgt gcaatgccta tatcgaatat ggtgataaaa atatgaacag ctttatcgaa 60
gatgtggaac agatctacaa cttcattaaa aagaacattg atgtggaaga aaagatgcat 120
ttcattgaaa cctataaaca gaaaagcaac atgaagaaag agattagctt tagcgaagaa 180
tactataaac agaagattat gaacggcaaa aatggcgttg tgtacacccc gccggaaatg 240
gcggccttta tggttaaaaa tctgatcaac gttaacgatg ttattggcaa tccgtttatt 300
aaaatcattg acccgagctg cggtagcggc aatctgattt gcaaatgttt tctgtatctg 360
aatcgcatct ttattaagaa cattgaggtg attaacagca aaaataacct gaatctgaaa 420
ctggaagaca tcagctacca catcgttcgc aacaatctgt ttggcttcga tattgacgaa 480
accgcgatca aagtgctgaa aattgatctg tttctgatca gcaaccaatt tagcgagaaa 540
aatttccagg ttaaagactt tctggtggaa aatattgatc gcaaatatga cgtgttcatt 600
ggtaatccgc cgtatatcgg tcacaaaagc gtggacagca gctacagcta cgtgctgcgc 660
aaaatctacg gcagcatcta ccgcgacaaa ggcgatatca gctattgttt ctttcagaag 720
agcctgaaat gtctgaagga aggtggcaaa ctggtgtttg tgaccagccg ctacttctgc 780
gagagctgca gcggtaaaga actgcgtaaa ttcctgatcg aaaacacgag catttacaag 840
atcattgatt tttacggcat ccgcccgttc aaacgcgtgg gtatcgatcc gatgattatt 900
tttctggttc gtacgaagaa ctggaacaat aacattgaaa ttattcgccc gaacaagatt 960
gaaaagaacg aaaagaacaa attcctggat agcctgttcc tggacaaaag cgaaaagtgt 1020
aaaaagttta gcattagcca gaaaagcatt aataacgatg gctgggtttt cgtggacgaa 1080
gtggagaaaa acattatcga caaaatcaaa gagaaaagca agttcattct gaaagatatt 1140
tgccatagct gtcaaggcat tatcaccggt tgtgatcgcg cctttattgt ggaccgtgat 1200
atcatcaata gccgtaagat cgaactgcgt ctgattaaac cgtggattaa aagcagccat 1260
atccgtaaga atgaagttat taagggcgaa aaattcatca tctatagcaa cctgattgag 1320
aatgaaaccg agtgtccgaa tgcgattaaa tatatcgaac agtacaagaa acgtctgatg 1380
gagcgccgcg aatgcaaaaa gggcacgcgt aagtggtatg aactgcaatg gggccgtaaa 1440
ccggaaatct tcgaagaaaa gaaaattgtt ttcccgtata aaagctgtga caatcgtttt 1500
gcactggata agggtagcta ttttagcgca gacatttata gcctggttct gaagaaaaat 1560
gtgccgttca cctatgagat cctgctgaat atcctgaata gcccgctgta cgagttttac 1620
tttaagacct tcgcgaaaaa gctgggcgag aatctgtacg agtactatcc gaacaacctg 1680
atgaagctgt gcatcccgag catcgatttc ggcggtgaga acaatattga gaaaaagctg 1740
tatgatttct ttggtctgac ggataaagaa attgagattg tggagaagat caaagataac 1800
tgctaa 1806

Claims (15)

1.一种用于将CO和/或CO2转化成3-羟基丙酸盐(3-HP)的方法，所述方法包括：
将含CO和/或含CO2的气态底物传送至含有在培养基中的一氧化碳营养产乙酸细菌的培养物的生物反应器，使得所述细菌将CO和/或CO2转化为3-HP，和
从所述生物反应器中回收3-HP，
其中所述一氧化碳营养产乙酸细菌被遗传改造为表达丙二酰辅酶A还原酶，其中所述细菌包含两种气体固定发酵途径，包括能够将两个CO分子或CO2分子转化为一个乙酰辅酶A分子的Wood-Ljungdahl途径以及能够将一个乙酰辅酶分子转化为一个3-羟基丙酸盐分子的羟基丙酸盐生物合成途径，其中所述3-羟基丙酸盐途径包含乙酰辅酶A羧化酶和丙二酰辅酶A还原酶，其中至少所述丙二酰辅酶A还原酶对细菌而言是外源的，并且
其中所述一氧化碳营养产乙酸细菌选自自产乙醇梭菌(Clostridiumautoethanogenum)、扬氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)和拉氏梭菌(Clostridiumragsdalei)。
2.遗传改造的一氧化碳营养产乙酸细菌，其包含两种气体固定发酵途径，包括能够将两个CO分子或CO2分子转化为一个乙酰辅酶A分子的Wood-Ljungdahl途径以及能够将一个乙酰辅酶分子转化为一个3-羟基丙酸盐分子的羟基丙酸盐生物合成途径，其中所述3-羟基丙酸盐途径包含乙酰辅酶A羧化酶和丙二酰辅酶A还原酶，其中至少所述丙二酰辅酶A还原酶对细菌而言是外源的，其中所述细菌源自选自自产乙醇梭菌、扬氏梭菌和拉氏梭菌的亲本细菌。
3.根据权利要求2所述的遗传改造的一氧化碳营养产乙酸细菌，其还包含编码来自非硫、光合作用细菌的乙酰辅酶A羧化酶的核酸，其中所述核酸与启动子可操作地连接。
4.根据权利要求2所述的遗传改造的一氧化碳营养产乙酸细菌，其为选自扬氏梭菌和自产乙醇梭菌的梭菌属种。
5.根据权利要求3所述的遗传改造的一氧化碳营养产乙酸细菌，其中所述非硫、光合作用细菌选自扬氏梭菌、生金球形菌属(Metallosphaera)和硫化叶菌属(Sulfolobus)种。
6.根据权利要求3所述的遗传改造的一氧化碳营养产乙酸细菌，其中所述非硫、光合作用细菌是橙色绿屈挠菌(Chloroflexus auranticus)。
7.根据权利要求2所述的遗传改造的一氧化碳营养产乙酸细菌，其中所述编码丙二酰辅酶A还原酶的核酸已进行了密码子优化。
8.一种培养根据权利要求2所述的遗传改造的一氧化碳营养产乙酸细菌的方法，其包括使所述细菌在包含气态碳源的培养基中生长，其中所述碳源包含CO和/或CO2。
9.一种培养根据权利要求2所述的遗传改造的一氧化碳营养产乙酸细菌的方法，其包括使所述细菌在包含能源的培养基中生长，其中所述能源包含CO和/或CO2。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述培养是严格厌氧的。
11.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述碳源包含工业废弃产物或废气。
12.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述细菌还包含编码来自非硫、光合作用细菌的乙酰辅酶A羧化酶的外源核酸，其中所述核酸与启动子可操作地连接。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述丙二酰辅酶A还原酶来自非硫、光合作用细菌。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述丙二酰辅酶A还原酶来自橙色绿屈挠菌。
15.根据权利要求2所述的遗传改造的一氧化碳营养产乙酸细菌，其中所述丙二酰辅酶A还原酶与由SEQ ID NO:1的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少85％相同。
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