KR102098849B1 - 재조합 미생물 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

박테리아는 3-하이드록시프로피오네이트(3-HP)를 생성하도록 유전적으로 조작된다. 박테리아는 일산화탄소영양 아세토젠이다. 박테리아는 CO/CO₂를 고정하기 위한 우드-리융다흘 경로를 이용하여 아세틸-coA를 생성한다. 이러한 효소를 포함하는 박테리아로부터의 말로닐-coA 환원효소가 도입된다. 추가로, 아세틸-coA 카복실라제는 또한 도입될 수 있다. 3-HP의 생성은 아세틸-CoA 카복실라제의 과생성 또는 바이오틴의 과생성에 의해 개선될 수 있다. 이는 개선된 프로모터 또는 더 많은 카피수 또는 촉매적으로 더 효과적인 효소에 의해 수행될 수 있다.

Description

재조합 미생물 및 이의 용도{RECOMBINANT MICROORGANISMS AND USES THEREFOR}

본 발명은 CO 및/또는 CO₂를 포함하는 기질의 세균 발효에 의한 3-하이드록시프로피오네이트[3-HP]의 생성을 위한 재조합 미생물 및 방법에 관한 것이다.

3-하이드록시프로피오네이트[3-HP]는 중합체 재료의 제조를 위한 전구체로서 및 화학 공급원료로서 작용하는 플랫폼 화학물질이다. 폴리(3-하이드록시프로피온산)[P(3-HP)]은 유망한 특성, 예컨대 흔치않은 고열 안정성을 갖는 생분해성 중합체이다.

3-HP를 사용하여, 페인트, 제지, 접착제, 텍스타일, 특수 코팅, 잉크 및 초흡수제 중합체 폴리아크릴레이트의 제조에 사용되는 아크릴산; 용매, 접착제, 화장품으로서 사용되거나 카펫 및 텍스타일에서 사용되는 폴리트라이메틸렌 테레프탈레이트를 제조하기 위한 1,3-프로판다이올; 식품의 제조에서, 식품 첨가물로서 및 영양제 산업에서 보존제로서 사용되는 3-하이드록시프로핀알데하이드를 포함하는 다수의 가치있는 산업용 화학물질을 유도할 수 있다.

3-HP는 미국 에너지부가 제3의 가장 중요한 재생성 화학물질로서 기재하였고, 3-HP에 대한 개방된 세계 시장은 매년 363 만톤인 것으로 추정된다(Paster 등, 2003, US DOE 리포트: 48-49).

본 발명의 목적은 재조합 미생물 및 세균 발효에 의한 3-HP의 제조 방법(이는 공지된 방법에 비해 하나 이상의 이점을 제공할 수 있음)을 제공하거나 공중에게 유용한 선택을 적어도 제공하는 것이다.

발명의 요약

본 발명은 일반적으로, 특히, CO 및/또는 CO₂를 포함하는 기질의 세균 발효에 의한 3-HP의 제조 방법 및 이러한 방법의 용도의 재조합 미생물을 제공한다. 이는 2개의 다른 CO₂ 고정 경로를 조합하여 단일 대사 생성물을 생성한다.

제1 측면에서, 본 발명은 CO 및/또는 CO₂를 포함하는 기질의 발효에 의해 3-HP 및 임의로 1종 이상의 다른 생성물을 생성할 수 있는 무산소성 초산생성 재조합 미생물을 제공한다.

특정한 일 구현예에서, 미생물은 재조합 미생물이 유래하는 모 미생물에 효소가 자연적으로 존재하지 않는 3-HP 생합성 경로에서 1종 이상의 효소(또는 이의 1종 이상의 아단위)를 발현하기에 적합하다. 다른 구현예에서, 미생물은 재조합 미생물이 유래하는 모 미생물에 효소가 자연적으로 존재하는 3-HP 생합성 경로에서 1종 이상의 효소(또는 이의 1종 이상의 아단위)를 과발현하기에 적합하다. 일 구현예에서, 미생물은 모 미생물에 자연적으로 존재하지 않는 3-HP-생합성 경로에서 1종 이상의 효소(또는 이의 1종 이상의 아단위)를 발현하고 모 미생물에 자연적으로 존재하는 3-HP 생합성 경로에서 1종 이상의 효소(또는 이의 1종 이상의 아단위)를 과발현하기에 적합하다.

일 구현예에서, 1종 이상의 효소는 말로닐-조효소 A 환원효소(EC 1.2.1.75); 아세틸-CoA 카복실라제(ACC)(EC 6.4.1.2); 및 이들 중 어느 하나의 기능적 균등 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일 구현예에서, 모 미생물은 CO 및/또는 CO₂를 포함하는 기질을 발효시켜 아세틸-CoA를 생성할 수 있지만, 아세틸-CoA를 3-HP로 전환시킬 수 없고, 재조합 미생물은 아세틸-CoA의 3-HP로의 전환에 관여하는 1종 이상의 효소(또는 이의 1종 이상의 아단위)를 발현하기에 적합하다.

일 구현예에서, 미생물은 모 미생물에 네이티브인 1종 이상의 핵산의 발현을 증가시키기에 적합한 1종 이상의 외인성 핵산 및 본 명세서에서 이전에 언급된 1종 이상의 효소(또는 이의 1종 이상의 아단위)를 코딩하는 1종 이상의 핵산을 포함한다.

일 구현예에서, 발현을 증가시키기에 적합한 1종 이상의 외인성 핵산은 조절 구성요소이다. 일 구현예에서, 조절 구성요소는 프로모터이다.

일 구현예에서, 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일 구현예에서, 프로모터는 우드-리융다흘 유전자 클러스터 또는 포스포트랜스아세틸라제/아세테이트 키나제 오페론 프로모터를 포함하는 군으로부터 선택된다.

일 구현예에서, 미생물은 본 명세서에서 이전에 언급된 1종 이상의 효소(또는 이의 1종 이상의 아단위)를 코딩하고 이를 발현하기에 적합한 1종 이상의 외인성 핵산을 포함한다. 일 구현예에서, 미생물은 적어도 2종의 효소(또는 이의 1종 이상의 아단위)를 코딩하고 이를 발현하기에 적합한 1종 이상의 외인성 핵산을 포함한다.

일 구현예에서, 1종 이상의 외인성 핵산은 본 명세서에서 이전에 언급된 임의의 조합의 1종 이상의 효소를 코딩하는, 핵산 작제물 또는 벡터, 특정한 일 구현예에서는 플라스미드이다.

일 구현예에서, 외인성 핵산은 발현 플라스미드이다.

일 구현예에서, 모 미생물은 무산소성 아세토젠의 군으로부터 선택된다.

특정한 일 구현예에서, 모 미생물은 일산화탄소영양 초산생성 박테리아의 군, 일 구현예에서는 클로스트리디움 아우토에타노제늄(Clostridium autoethanogenum), 클로스트리디움 리융다흘리(Clostridium ljungdahlii), 클로스트리디움 라그스달레이(Clostridium ragsdalei), 클로스트리디움 카복시디보란스(Clostridium carboxidivorans), 클로스트리디움 드라케이(Clostridium drakei), 클로스트리디움 스카토로제네스(Clostridium scatologenes), 클로스트리디움 아세티쿰(Clostridium aceticum), 클로스트리디움 포르미코아세티쿰(Clostridium formicoaceticum), 클로스트리디움 마그눔(Clostridium magnum), 부티리박테리움 메틸로트로피쿰(Butyribacterium methylotrophicum), 아세토박테리움 우디(Acetobacterium woodii), 알칼리바쿨룸 바크히(Alkalibaculum bacchii), 블라우티아 프로덕타(Blautia producta), 유박테리아 리모섬(Eubacterium limosum), 모렐라 써모아세티카(Moorella thermoacetica), 모렐라 써마우토트로피카(Moorella thermautotrophica), 스포로무사 오바타(Sporomusa ovata), 스포로무사 실바세티카(Sporomusa silvacetica), 스포로무사 스파에로이데스(Sporomusa sphaeroides), 옥소박터 프테니지(Oxobacter pfennigii) 및 써모아나에로박터 키우비(Thermoanaerobacter kiuvi)를 포함하는 군으로부터 선택된다.

일 구현예에서, 모 미생물은 클로스트리디움 아우토에타노제늄 또는 클로스트리디움 리융다흘리이다. 특정한 일 구현예에서, 미생물은 클로스트리디움 아우토에타노제늄 DSM23693이다. 특정한 다른 구현예에서, 미생물은 클로스트리디움 리융다흘리 DSM13528(또는 ATCC55383)이다.

일 구현예에서, 모 미생물은 말로닐-조효소 A 환원효소 및/또는 아세틸-CoA 카복실라제 또는 이의 1종 이상의 아단위를 코딩하는 1종 이상의 유전자가 결여된다.

제2 측면에서, 본 발명은 미생물에서 발현될 때 미생물이 CO 및/또는 CO₂를 포함하는 기질의 발효에 의해 3-HP를 생성하게 하는 1종 이상의 효소(또는 이의 1종 이상의 아단위)를 코딩하는 핵산을 제공한다.

일 구현예에서, 핵산은 미생물에서 발현될 때 미생물이 CO를 포함하는 기질의 발효에 의해 3-HP를 생성하게 하는 2개 이상의 효소(또는 이의 1종 이상의 아단위)를 코딩한다.

일 구현예에서, 효소는 말로닐-조효소 A 환원효소 및 아세틸 CoA 카복실라제 및 이의 임의의 1종 이상의 기능적 균등 변이체로부터 선택된다.

일 구현예에서, 핵산은 말로닐-조효소 A 환원효소, 아세틸 CoA 카복실라제 또는 이의 임의의 1종 이상의 기능적 균등 변이체를 임의의 순서로 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.

일 구현예에서, 말로닐-조효소 A 환원효소를 코딩하는 핵산은 서열 번호 1 또는 GI:163848165, Caur 2614의 서열을 갖거나 이의 기능적 균등 변이체이다.

일 구현예에서, 아세틸 CoA 카복실라제를 코딩하는 핵산은 서열 번호 18, 20, 22 및 24의 서열(또는 CLJU_c42100-40, GI: 9447826-31 및 GI:163847210-11, Caur_1647-48, GI:163849262, Caur_3739, GI:163848951, Caur_3421, GI:163846951, Caur_1378) 또는 이의 임의의 1종 이상의 기능적 균등 변이체를 포함한다. 아세틸 CoA 카복실라제는 다수의 아단위로 구성될 수 있다. 이들은, 원하는 경우, 1종 이상의 핵산에 코딩될 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 핵산은 프로모터를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 프로모터는 이의 제어 하에 유전자의 구성적 발현을 허용한다. 특정한 구현예에서, 우드-리융다흘 클러스터 프로모터가 사용된다. 특정한 다른 구현예에서, 포스포트랜스아세틸라제/아세테이트 키나제 오페론 프로모터가 사용된다. 특정한 일 구현예에서, 프로모터는 C. 아우토에타노제늄 유래이다.

제3 측면에서, 본 발명은 제2 측면의 1종 이상의 핵산을 포함하는 핵산 작제물 또는 벡터를 제공한다.

특정한 일 구현예에서, 핵산 작제물 또는 벡터는 발현 작제물 또는 벡터이다. 특정한 일 구현예에서, 발현 작제물 또는 벡터는 플라스미드이다.

제4 측면에서, 본 발명은 제7 측면의 임의의 1종 이상의 핵산 또는 제3 측면의 벡터 또는 작제물을 포함하는 숙주 생물을 제공한다.

제5 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제3 측면에서 언급된 발현 작제물 또는 벡터, 및 메틸화 작제물 또는 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.

바람직하게는, 상기 조성물은 본 발명의 제1 측면에 따라 재조합 미생물을 생성할 수 있다.

특정한 일 구현예에서, 발현 작제물/벡터 및/또는 메틸화 작제물/벡터는 플라스미드이다.

제6 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제1 측면의 재조합 미생물을 사용하여 CO 및/또는 CO₂를 포함하는 기질을 발효시키는 단계를 포함하는 세균 발효에 의해 3-HP 및 임의로 1종 이상의 다른 생성물을 제조하는 방법을 제공한다.

일 구현예에서, 상기 방법은,

(a) CO 및/또는 CO₂를 포함하는 기질을 본 발명의 제1 측면의 1종 이상의 미생물의 배양물을 포함하는 생물반응기로 제공하는 단계; 및

(b) 생물반응기에서 배양물을 무산소성으로 발효하여 3-HP를 생성하는 단계

를 포함한다.

일 구현예에서, 상기 방법은,

(a) 산업 공정의 결과로서 생성된 CO- 및/또는 CO₂-함유 가스가 대기로 방출되기 전에 상기 가스를 포획하는 단계;

(b) CO- 및/또는 CO₂-함유 가스를 무산소성으로 발효하여 본 발명의 제1 측면의 1종 이상의 미생물의 배양물에 의해 적어도 3-HP를 생성하는 단계

를 포함한다.

상기 방법 측면의 특정한 구현예에서, 미생물은 수성 배양 배지 중에 유지된다.

상기 방법 측면의 특정한 구현예에서, 기질의 발효는 생물반응기에서 발생한다.

바람직하게는, CO 및/또는 CO₂를 포함하는 기질은 CO 및/또는 CO₂를 포함하는 가스 기질이다. 일 구현예에서, 기질은 산업용 폐가스를 포함한다. 특정한 구현예에서, 가스는 제강소 폐가스 또는 합성가스이다.

특정한 구현예에서, 기질은 CO를 포함하는 기질이다.

기질이 CO₂를 포함하지만 CO를 포함하지 않는 본 발명의 구현예에서, 기질은 바람직하게는 또한 H₂를 포함한다.

일 구현예에서, 기질은 CO 및 CO₂를 포함한다. 일 구현예에서, 기질은 CO₂ 및 H₂를 포함한다. 다른 구현예에서, 기질은 CO, CO₂ 및 H₂를 포함한다.

일 구현예에서, 기질은 통상적으로 대부분의 CO, 예컨대 적어도 약 20 용적% 내지 약 100 용적%의 CO, 20 용적% 내지 70 용적%의 CO, 30 용적% 내지 60 용적%의 CO, 및 40 용적% 내지 55 용적%의 CO를 포함한다. 특정한 구현예에서, 기질은 약 25 용적% 또는 약 30 용적% 또는 약 35 용적% 또는 약 40 용적% 또는 약 45 용적% 또는 약 50 용적%의 CO, 또는 약 55 용적%의 CO, 또는 약 60 용적%의 CO를 포함한다.

특정한 구현예에서, 상기 방법은 발효 브로쓰로부터 3-HP 및 임의로 1종 이상의 다른 생성물을 회수하는 단계를 추가로 포함한다.

제7 측면에서, 본 발명은 제6 측면의 방법에 의해 생성될 때 3-HP를 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은 모 미생물을 1종 이상의 외인성 핵산으로 형질전환시켜 CO 및/또는 CO₂를 포함하는 기질의 발효에 의해 미생물이 3-HP 및 임의로 1종 이상의 다른 생성물을 생성할 수 있도록 하는 단계를 포함하는 본 발명의 제1 측면의 미생물의 제조 방법을 제공하고, 모 미생물은 CO 및/또는 CO₂를 포함하는 기질의 발효에 의해 3-HP를 생성할 수 없다.

특정한 일 구현예에서, 모 미생물은 모 미생물에 자연적으로 존재하지 않는 3-HP 생합성 경로에서 1종 이상의 효소를 발현하기에 적합한 1종 이상의 외인성 핵산으로 형질전환된다. 다른 구현예에서, 모 미생물은 모 미생물에 자연적으로 존재하는 3-HP 생합성 경로에서 1종 이상의 효소를 과발현하기에 적합한 1종 이상의 핵산으로 형질전환된다. 다른 구현예에서, 모 미생물은 모 미생물에 자연적으로 존재하지 않는 3-HP 생합성 경로에서 1종 이상의 효소를 발현하고 모 미생물에 자연적으로 존재하는 3-HP 생합성 경로에서 1종 이상의 효소를 과발현하기에 적합한 1종 이상의 외인성 핵산으로 형질전환된다.

특정한 구현예에서, 1종 이상의 효소는 본 명세서에서 상기 기재된 바와 같다.

특정한 구현예에서, 모 미생물은 본 명세서에서 상기 기재된 바와 같다.

일 구현예에 따르면, CO 또는 CO₂를 3-하이드록시프로피오네이트(3-HP)로 전환하는 방법이 제공된다. 가스 CO-함유 및/또는 CO₂-함유 기질을 배양 배지에서 일산화탄소영양, 초산생성 박테리아의 배양물을 포함하는 생물반응기로 통과시켜, 박테리아가 CO 및/또는 CO₂를 3-HP로 전환되게 한다. 일산화탄소영양 초산생성 박테리아는 말로닐-조효소 A 환원효소를 발현시키도록 유전적으로 조작된다. 이들은 또한, 네이티브이든 또는 외인성이든, 아세틸-CoA 카복실라제를 발현한다. 3-HP는 생물반응기로부터 회수된다.

다른 구현예에 따르면, 말로닐-조효소 A 환원효소를 코딩하는 핵산을 포함하는 단리된, 유전적으로 조작된, 일산화탄소영양, 초산생성 박테리아가 제공된다. 핵산은 숙주 박테리아에 외인성이다. 박테리아는 말로닐-조효소 A 환원효소를 발현하고, 박테리아는 CO 또는 CO₂의 3개의 분자를 3-하이드록시프로피오네이트(3-HP)의 1개의 분자로 고정하는 능력을 획득한다. 말로닐-조효소 A 환원효소는 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열과 통상적으로 적어도 85% 동일하다.

박테리아는 아세틸-조효소 A 카복실라제를 코딩하는 외인성 핵산을 추가로 포함할 수 있다. 아세틸-CoA 카복실라제는 서열 번호 18 내지 서열 번호 21의 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열과 통상적으로 적어도 85% 동일하다. 핵산은 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 핵산은 코돈 최적화될 수 있다. 핵산 또는 코딩된 카복실라제는 무황, 광합성 박테리아 유래일 수 있다. 박테리아는 클로스트리디움 아우토에타노제늄, 클로스트리디움 리융다흘리, 클로스트리디움 라그스달레이, 클로스트리디움 카복시디보란스, 클로스트리디움 드라케이, 클로스트리디움 스카토로제네스, 클로스트리디움 아세티쿰, 클로스트리디움 포르미코아세티쿰, 클로스트리디움 마그눔, 부티리박테리움 메틸로트로피쿰, 아세토박테리움 우디, 알칼리바쿨룸 바크히, 블라우티아 프로덕타, 유박테리아 리모섬, 모렐라 써모아세티카, 모렐라 써마우토트로피카, 스포로무사 오바타, 스포로무사 실바세티카, 스포로무사 스파에로이데스, 옥소박터 프테니지 및 써모아나에로박터 키우비로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 외인성 핵산의 도너 박테리아는 무황, 광합성 박테리아 예컨대, 클로로플렉서스 아우란티쿠스(Chloroflexus auranticus), 메탈로스파에라(Metallosphaera) 및 설포로부스 종(Sulfolobus spp .)일 수 있다.

유전적으로 조작된 박테리아는 가스 탄소원을 포함하는 배지 중에 성장시킴으로써 배양될 수 있다. 탄소원은 CO 및/또는 CO₂를 포함할 수 있고, 이들은 에너지원 또는 탄소원으로서 또는 둘 다로서 사용될 수 있다. 박테리아는 임의로 엄격히 무산소성 조건 하에 성장될 수 있다. 탄소원은 산업용 폐기물 또는 배출 가스를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 본원의 명세서에 언급되거나 표시된 부분, 구성요소 및 특징으로, 개별적으로 또는 총체적으로, 2개 이상의 부분, 구성요소 및 특징의 임의의 또는 모든 조합으로 하여, 이루어진다고 광범위하게 일컬어질 수 있고, 여기서 특정한 정수는 본 발명이 관련한 분야에서 공지된 등가물을 갖는 본 명세서에서 언급되고, 이러한 공지된 등가물은 개별적으로 기재된 것처럼 본 명세서에 포함된 것으로 간주된다.

모든 새로운 측면에서 고려되어야 하는 본 발명의 이들 및 다른 측면은 하기 설명으로부터 명확해지고, 이는 첨부한 도면을 참조하여 오직 예의 방식으로 제공되고, 여기서:
도 1: CO 또는 CO₂의 3개의 분자로부터 3-HP의 1개 분자의 지속 가능한 생성을 위한 2개의 CO₂ 고정 경로의 조합.
바람직한 구현예의 상세한 설명
바람직한 구현예의 하기 설명은 일반 용어로 제공된다. 본 발명은 하기 본 명세서에서 "실시예" 표제 하에 제공된 개시내용으로부터 추가로 기술되어 있고, 이 실시예는 본 발명을 지지하는 실험 데이터, 본 발명의 다양한 측면의 특정한 예 및 본 발명을 수행하는 수단을 제공한다.
본 발명자들은 놀랍게도 CO 및/또는 CO₂를 포함하는 기질의 발효에 의해 3-하이드록시프로피오네이트(3-HP)를 생성하도록 일산화탄소영양 초산생성 미생물을 조작할 수 있었다. 이는 3-HP의 생성을 위한 현재의 방법에 비해 유리할 수 있는 3-HP의 생성을 위한 대안적인 수단을 제공한다. 또한, 이는 산업 공정으로부터 일산화탄소를 사용하는 수단을 제공하고, 그렇지 않으면 이는 대기로 방출되고 환경을 오염시킬 것이다.
본 발명의 미생물을 조작할 때, 본 발명자들은 도 1에 도시된 바대로 2개의 별개의 CO₂ 고정 경로를 조합할 수 있었다. 이는 CO를 포함하는 기질 및/또는 CO₂를 포함하는 기질을 사용하여 3-HP를 생성하기 위한 지속 가능한 발효를 제공한다. CO₂를 고정하는 2개의 경로는 이렇게 연결되어 원하는 생성물을 생성한다.
일 구현예에서, 본 발명은 2개의 별개의 CO₂ 고정 경로를 조합함으로써 CO₂의 3개의 분자를 3-HP의 1개의 분자로 고정하는 것(도 1), CO₂의 2개의 분자의 고정을 허용하는 아세토젠의 우드-리융다흘 경로 및 CO₂의 다른 분자의 고정을 허용하는 3-HP 사이클의 초기 탄소 고정 단계를 기술한다. CO₂는 또한 일산화탄소(CO)로 대체되고, 우드-리융다흘 경로의 중요한 효소로서, CO 탈수소효소(CODH)는 생물학적 물 가스 이동 반응(CO + H₂O <-> CO₂ + H₂)에서 CO를 CO₂ 및 에너지로 전환할 수 있다. CO와 CO₂의 임의의 혼합물을 사용할 수 있다. CO₂를 단독으로 사용할 때, 수소 또는 전기 형태의 에너지가 공급될 필요가 있는 반면, CO는 탄소 및 에너지원 둘 다로서 작용할 수 있다.
본 발명자들은 클로스트리디움 아우토에타노제늄에서 본 발명의 효율을 입증하였고, 본 발명은 상기 및 본 명세서에서 추가로 기재된 바대로 CO 및/또는 CO₂를 포함하는 기질에서 무산소성 초산생성 미생물 및 발효의 더 넓은 군으로 적용 가능하다.
본 명세서에서 칭하는 "발효 브로쓰"는 적어도 영양 배지 및 박테리아 세포를 포함하는 배양 배지이다.
본 명세서에서 칭하는 "셔틀 미생물(shuttle microorganism)"은 메틸트랜스퍼라제 효소가 발현되고 목적지 미생물과 구별되는 미생물이다.
본 명세서에서 칭하는 "목적지 미생물"은 발현 작제물/벡터에 포함된 유전자가 발현되고 셔틀 미생물과 구별되는 미생물이다. 이는 또한 숙주 미생물이라 칭한다.
용어 "주요 발효 생성물"은 최고의 농도 및/또는 수율로 생성될 수 있는 1종의 발효 생성물을 의미하도록 의도된다. 1종 이상의 발효 생성물이 존재할 수 있다. 가장 흔한 것은 가장 상업적으로 중요하거나 그렇지 않을 수 있다.
용어 "효율을 증가시킨다", "증가 효율" 등은, 발효 과정과 관련하여 사용될 때, 발효를 촉매화하는 미생물의 성장 속도, 증대된 생성물 농도에서의 성장 및/또는 생성물 생성 속도, 소비된 기질의 용적당 생성된 원하는 생성물의 용적, 원하는 생성물의 생성 속도 또는 생성 수준, 및 발효의 다른 부산물과 비교하여 생성된 원하는 생성물의 상대 생성 중 하나 이상의 증가를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
구절 "일산화탄소를 포함하는 기질" 및 유사 용어는 일산화탄소가 예를 들어 성장 및/또는 발효에 대해 박테리아의 1종 이상의 균주에 이용 가능한 임의의 기질을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
구절 "일산화탄소를 포함하는 가스 기질" 및 유사 구절 및 용어는 일정 수준의 일산화탄소를 포함하는 임의의 가스를 포함한다. 특정한 구현예에서, 기질은 적어도 약 20 용적% 내지 약 100 용적%의 CO, 20 용적% 내지 70 용적%의 CO, 30 용적% 내지 60 용적%의 CO, 및 40 용적% 내지 55 용적%의 CO를 포함한다. 특정한 구현예에서, 기질은 약 25 용적% 또는 약 30 용적% 또는 약 35 용적% 또는 약 40 용적% 또는 약 45 용적% 또는 약 50 용적%의 CO, 또는 약 55 용적%의 CO, 또는 약 60 용적%의 CO를 포함한다.
CO를 포함하는 기질이 임의의 수소를 포함해야할 필요는 없지만, H₂의 존재는 본 발명의 방법에 따라 생성물 형성에 해롭지 않아야 한다. 특정한 구현예에서, 수소의 존재는 알콜 생성의 전체 효율을 개선한다. 예를 들어, 특정한 구현예에서, 기질은 H₂:CO의 대략 2:1 또는 1:1 또는 1:2 비율을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 기질은 약 30 용적% 이하의 H₂, 20 용적% 이하의 H₂, 약 15 용적% 이하의 H₂ 또는 약 10 용적% 이하의 H₂를 포함한다. 다른 구현예에서, 기질 스트림은 낮은 농도, 예를 들어, 5% 미만 또는 4% 미만 또는 3% 미만 또는 2% 미만 또는 1% 미만의 H₂를 포함하거나 실질적으로 수소가 없다. 기질은 또한 약간의 CO₂, 예를 들어 약 1 용적% 내지 약 80 용적%의 CO₂, 또는 1 용적% 내지 약 30 용적%의 CO₂를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 기질은 약 20 용적% 이하의 CO₂를 포함한다. 특정한 구현예에서, 기질은 약 15 용적% 이하의 CO₂, 약 10 용적% 이하의 CO₂, 약 5 용적% 이하의 CO₂를 포함하거나 실질적으로 CO₂가 없다.
구절 "이산화탄소를 포함하는 기질" 및 유사 용어는 이산화탄소가 예를 들어 성장 및/또는 발효에 대해 박테리아의 1종 이상의 균주에 이용 가능한 임의의 기질을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 이산화탄소를 포함하는 기질은 수소 및/또는 일산화탄소를 추가로 포함할 수 있다.
구절 "이산화탄소를 포함하는 가스 기질" 및 유사 구절 및 용어는 일정 수준의 이산화탄소를 포함하는 임의의 가스를 포함한다. 특정한 구현예에서, 기질은 적어도 약 10 용적% 내지 약 60 용적%의 CO₂, 20 용적% 내지 50 용적%의 CO₂, 30 용적% 내지 60 용적%의 CO₂ 및 40 용적% 내지 55 용적%의 CO₂를 포함한다. 특정한 구현예에서, 기질은 약 20 용적% 또는 약 25 용적% 또는 약 30 용적% 또는 약 35 용적% 또는 약 40 용적% 또는 약 45 용적% 또는 약 50 용적%의 CO, 또는 약 55 용적%의 CO, 또는 약 60 용적%의 CO₂를 포함한다.
바람직하게는, CO₂를 포함하는 기질은 또한 일정 수준의 CO 또는 H₂를 포함할 것이다. 특정한 구현예에서, 기질은 적어도 약 1:1 또는 적어도 약 1:2 또는 적어도 약 1:3 또는 적어도 약 1:4 또는 적어도 약 1:5의 CO₂:H₂ 비율을 포함한다.
하기하는 설명에서, 본 발명의 구현예는 "CO 및/또는 CO₂를 포함하는 가스 기질"을 전달하거나 발효시키는 조건에서 기재되어 있다. 그러나, 가스 기질이 대안적인 형태로 제공될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, CO 및/또는 CO₂를 포함하는 가스 기질은 액체 중에 용해되어 제공될 수 있다. 본질적으로, 액체는 일산화탄소 함유 가스로 포화되고, 이후 이 액체는 생물반응기에 첨가된다. 표준 방법론을 이용하여 이를 성취할 수 있다. 예의 방식으로, 마이크로버블 분산액 생성기(Hensirisak 등 Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobic fermentation; Applied Biochemistry and Biotechnology Volume 101, Number 3 / October, 2002)를 사용한다. 추가의 예의 방식으로, CO를 포함하는 가스 기질은 고체 지지체에 흡착될 수 있다. 이러한 대안적인 방법은 "CO 및/또는 CO₂를 포함하는 기질" 등의 용어의 사용에 포함된다.
본 발명의 특정한 구현예에서, CO-함유 가스 기질(또는 CO₂ 또는 CO 및 CO₂ 또는 CO₂ 및 H₂ 및 CO를 포함하는 가스 기질)은 산업 배출 가스 또는 폐가스이다. "산업 폐가스 또는 배출 가스"는 산업 공정에 의해 생성된 CO 및/또는 CO₂를 포함하는 임의의 가스를 포함하는 것으로 광범위하게 취해져야 하고, 철 금속 생성물 제조, 비철 생성물 제조, 석유 제련 공정, 코크스 기화, 바이오매스의 기화, 전력 생성, 카본 블랙 생성 및 코크스 제조의 결과로서 생성된 가스를 포함한다. 추가의 예는 본 명세서에서 그 외 부분에서 제공될 수 있다.
문맥이 달리 필요로 하지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 구절 "발효시킨다", "발효 과정" 또는 "발효 반응" 등은 이 과정의 성장 단계 및 생성물 생합성 단계 둘 다를 포함하는 것으로 의도된다. 본 명세서에서 추가로 기재된 바대로, 몇몇 구현예에서, 생물반응기는 제1 성장 반응기 및 제2 발효 반응기를 포함할 수 있다. 그러므로, 발효 반응에 대한 금속 또는 조성물의 첨가는 이 반응기 중 하나 또는 둘 다에 대한 첨가를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "생물반응기"는 연속 교반 탱크 반응기(Continuous Stirred Tank Reactor: CSTR), 부동화 세포 반응기(Immobilized Cell Reactor: ICR), 삼상층 반응기(Trickle Bed Reactor: TBR), 버블 컬럼, 가스 리프트 발효기, 정적 혼합기, 또는 다른 용기 또는 가스-액체 접촉에 적합한 다른 장치를 포함하는, 1개 이상의 용기 및/또는 탑 또는 배관 배치로 이루어진 발효 장치를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 생물반응기는 제1 성장 반응기 및 제2 발효 반응기를 포함할 수 있다. 그러므로, 생물반응기 또는 발효 반응에 대한 기질의 첨가를 언급할 때, 적절한 경우 이 반응기 중 하나 또는 둘 다에 대한 첨가를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
"외인성 핵산"은 이 핵산이 도입되는 미생물의 외부에서 기원하는 핵산이다. 외인성 핵산은 이 핵산이 도입되는 미생물, 이 핵산이 도입되는 생물과 다른 미생물의 균주 또는 종(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 임의의 적절한 소스로부터 유래할 수 있거나, 이는 인공으로 또는 재조합으로 생성될 수 있다. 생물이 유전 조작되거나 재조합일 때, 이는 자연적으로 발생하는 미생물에서와 다른 서열에 인접한 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 외인성 핵산은 이 핵산이 도입되는 미생물 내에 자연적으로 존재하는 핵산 서열을 나타내고, 이는 특정한 유전자의 발현 또는 과발현을 증가시키도록 도입된다(예를 들어, 서열(예를 들어, 유전자)의 카피수를 증가시키거나 발현을 증가시키도록 강한 또는 구성적 프로모터를 도입함으로써). 다른 구현예에서, 외인성 핵산은 이 핵산이 도입되는 미생물 내에 자연적으로 존재하지 않는 핵산 서열을 나타내고, (예를 들어, 조절 구성요소, 예컨대 프로모터의 도입의 경우) 미생물 내에 자연적으로 존재하지 않는 생성물의 발현 또는 미생물에 네이티브인 유전자의 발현 증가를 허용한다. 외인성 핵산은 이 핵산이 도입되는 미생물의 게놈을 편입하거나, 염색체외 상태로 있도록 하기에 적합할 수 있다. 외인성 서열은 비상동 소스, 예를 들어 다른 종, 속, 과 또는 계로부터 생길 수 있다. 임의의 경우에, 예를 들어 서열 차이 또는 카피수 차이에 의해 자연적으로 발생하는 것과 다른 유전 보체를 갖는, 이렇게 생성된 박테리아는 자연적으로 발생하지 않는다.
본 명세서에 구체적으로 예시화된 서열과 서열이 다른 핵산이 실질적으로 동일한 기능을 수행하는 한, 이 핵산을 사용하여 본 발명을 실행할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 단백질 또는 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열의 경우, 이는 코딩된 단백질 또는 펩타이드가 실질적으로 동일한 기능을 갖는다는 것을 의미한다. 프로모터 서열을 나타내는 핵산 서열의 경우, 변이체 서열은 1종 이상의 유전자의 발현을 촉진하는 능력을 가질 것이다. 이러한 핵산은 본 명세서에서 "기능적 균등 변이체"라 칭해질 수 있다. 예의 방식으로, 핵산의 기능적 균등 변이체는 대립형질 변이체, 유전자의 단편, 돌연변이(결실, 삽입, 뉴클레오타이드 치환 등) 및/또는 다형 등을 포함하는 유전자를 포함한다. 다른 미생물로부터의 상동성 유전자는 본 명세서에 구체적으로 예시화된 서열의 기능적 균등 변이체의 예로서 또한 생각될 수 있다.
이는 클로스트리디움 리융다흘리, 클로로플렉서스 아우란티쿠스, 메탈로스파에라 또는 설포로부스 종과 같은 종에서 상동성 유전자를 포함하고, 이들의 상세내용은 웹사이트, 예컨대 유전자은행(Genbank) 또는 NCBI에서 공중에게 이용 가능하다. 구절 "기능적 균등 변이체"는 또한 특정한 생물에 대한 코돈 최적화의 결과로서 서열이 변하는 핵산을 포함하는 것으로 취해져야 한다. 본 명세서에서의 핵산의 "기능적 균등 변이체"는 바람직하게는 확인된 핵산과 적어도 대략 70%, 바람직하게는 대략 80%, 더 바람직하게는 대략 85%, 바람직하게는 대략 90%, 바람직하게는 대략 95% 이상의 핵산 서열 동일성을 가질 것이다.
본 명세서에 구체적으로 예시화된 아미노산 서열로부터 서열이 변하는 폴리펩타이드를 사용하여 본 발명을 실행할 수 있는 것으로 또한 이해되어야 한다. 이 변이체는 본 명세서에서 "기능적 균등 변이체"라 칭할 수 있다. 단백질 또는 펩타이드의 기능적 균등 변이체는 확인된 단백질 또는 펩타이드와 적어도 40%, 바람직하게는 50%, 바람직하게는 60%, 바람직하게는 70%, 바람직하게는 75%, 바람직하게는 80%, 바람직하게는 85%, 바람직하게는 90%, 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 동일성을 공유하고 관심 있는 펩타이드 또는 단백질과 동일한 기능을 실질적으로 갖는 단백질 또는 펩타이드를 포함한다. 이러한 변이체는 이의 범위 내에 단백질 또는 펩타이드의 단편을 포함하고, 단편은 폴리펩타이드의 절두 형태를 포함하고, 결실은 1개 내지 5개, 내지 10개, 내지 15개, 내지 20개, 내지 25개의 아미노산일 수 있고, 폴리펩타이드의 말단 중 어느 하나에서 1번 내지 25번의 잔기로부터 연장될 수 있고, 결실은 구역 내에 임의의 길이를 가질 수 있거나; 내부 위치에 있을 수 있다. 본 명세서에서의 특정한 폴리펩타이드의 기능적 균등 변이체는 또한 예를 들어 이전 문단에서 예시화된 바대로 박테리아의 다른 종에서 상동성 유전자에 의해 발현된 폴리펩타이드를 포함하는 것으로 취해져야 한다.
본 명세서에 사용되는 "실질적으로 동일한 기능"은 핵산 또는 폴리펩타이드가 이의 변이체인 핵산 또는 폴리펩타이드의 기능을 수행할 수 있다는 것을 의미하도록 의도된다. 예를 들어, 본 발명의 효소의 변이체는 그 효소와 동일한 반응을 촉매화할 수 있다. 그러나, 변이체가 이의 변이체인 폴리펩타이드 또는 핵산과 동일한 수준의 활성을 갖는 것을 의미하도록 취해져서는 안 된다.
기능적 균등 변이체가 임의의 수의 공지된 방법을 이용하여 이의 변이체인 핵산 또는 폴리펩타이드와 동일한 기능을 실질적으로 갖는지를 평가할 수 있다. 그러나, 예의 방식으로, 문헌[Hugler 등 (2002, J. Bacteriol . 184: 2404-2410 또는 Kroeger 등 (2011, Anal . Biochem . 411: 100-5)]에 기재된 방법은 각각 말로닐-조효소 A 환원효소 및 아세틸 Co-A 카복실라제의 활성을 측정하도록 이용될 수 있다.
"과발현한다", "과발현" 및 유사 용어 및 구절은, 본 발명과 관련하여 사용될 때, 동일한 조건 하에 모 미생물의 단백질의 발현 수준과 비교하여 1종 이상의 단백질의 임의의 발현 증가를 포함하도록 광범위하게 취해져야 한다. 단백질은 임의의 특정한 수준으로 발현되는 것으로 취해져서는 안 된다.
"모 미생물"은 본 발명의 재조합 미생물을 생성시키도록 사용되는 미생물이다. 모 미생물은 자연에 존재하는 것(즉, 야생형 미생물) 또는 본 발명의 대상인 이전에 변형되었지만 1종 이상의 효소를 발현하거나 과발현하지 않는 것일 수 있다. 따라서, 본 발명의 재조합 미생물은 모 미생물에서 발현되거나 과발현되지 않은 1종 이상의 효소를 발현하거나 과발현하도록 변형된다.
용어 핵산 "작제물" 또는 "벡터" 등 용어는 유전 재료를 세포에 전달하기 위한 비히클로서 사용하기에 적합한 임의의 핵산(DNA 및 RNA를 포함)을 포함하는 것으로 광범위하게 취해져야 한다. 상기 용어는 플라스미드, 바이러스(박테리오파지를 포함), 코스미드(cosmid) 및 인공 염색체를 포함하는 것으로 취해져야 한다. 작제물 또는 벡터는 1종 이상의 조절 구성요소, 복제 기원, 멀티클로닝 자리 및/또는 선택 가능한 마커를 포함할 수 있다. 특정한 일 구현예에서, 작제물 또는 벡터는 작제물 또는 벡터에 의해 코딩된 1종 이상의 유전자의 발현을 허용하도록 적합하다. 핵산 작제물 또는 벡터는 네이키드 핵산 및 세포(예를 들어, 리포솜 접합 핵산, 핵산이 포함된 생물)로의 전달을 수월하게 하는 1종 이상의 물질로 제제화된 핵산을 포함한다.
"3-HP 생합성 경로"는 말로닐-CoA에 대한 아세틸-CoA의 3-HP에 대한 말로네이트 세미알데하이드로의 전환을 허용하는 효소 경로이다. 달리 명확히 문맥에서 요구하지 않는 한, 3-HP 생합성 경로에서의 효소에 대한 언급은 효소의 임의의 1종 이상의 아단위에 대한 언급을 포함하는 것으로 취해져야 한다. 오직 예의 방식으로, 아세틸 CoA 카복실라제는 4개의 아단위를 포함할 수 있다.
미생물
상기 본 명세서에 기재된 바대로, 본 발명은 CO 및/또는 CO₂를 포함하는 기질의 발효에 의해 3-HP 및 임의로 1종 이상의 다른 생성물을 생성할 수 있는 재조합 미생물을 제공한다.
특정한 일 구현예에서, 미생물은 이것이 유래한 모 미생물에 자연적으로 존재하지 않는 3-HP 생합성 경로에서 1종 이상의 효소(또는 이의 1종 이상의 아단위)를 발현하기에 적합하다. 다른 구현예에서, 미생물은 모 미생물에 자연적으로 존재하는 3-HP 생합성 경로에서 1종 이상의 효소(또는 이의 1종 이상의 아단위)를 과발현하기에 적합하다.
일 구현예에서, 모 미생물은 아세틸-CoA를 생성하도록 CO를 포함하는 기질을 발효시킬 수 있지만, 아세틸-CoA를 3-HP로 전환할 수 없고, 재조합 미생물은 아세틸-CoA의 3-HP로의 전환에 관여하는 1종 이상의 효소(또는 이의 1종 이상의 아단위)를 발현하기에 적합하다. 일 구현예에서, 모 미생물은 아세틸 CoA를 말로닐 CoA로 전환할 수 있지만, 말로닐 CoA를 3-HP로 전환할 수 없다. 다른 구현예에서, 모 미생물은 말로닐 CoA를 3-HP로 전환할 수 있지만, 아세틸 CoA를 말로닐 CoA로 전환할 수 없다.
일 구현예에서, 3-HP 생합성 경로에서의 1종 이상의 효소는 말로닐-조효소 A 환원효소; 아세틸 CoA 카복실라제; 및 이의 임의의 1종 이상의 기능적 균등 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
미생물은 예를 들어 (예를 들어, 유전자의 발현을 추진시키게 하는 더 강한 또는 구성적 프로모터의 도입에 의한) 미생물 내의 네이티브 유전자의 발현 증가, 효소를 코딩하고 이를 발현시키기에 적합한 외인성 핵산의 도입에 의한 특정한 효소를 코딩하는 유전자의 카피수 증가, 모 미생물 내에 자연적으로 존재하지 않는 효소를 코딩하고 이를 발현시키기에 적합한 외인성 핵산의 도입을 포함하는 임의의 수의 재조합 방법에 의해 1종 이상의 효소(또는 이의 1종 이상의 아단위)를 발현하거나 과발현하기에 적합할 수 있다.
특정한 구현예에서, 모 미생물은 모 미생물에 네이티브인 1종 이상의 유전자의 발현 증가 또는 과발현과 모 미생물에 네이티브가 아닌 1종 이상의 유전자의 도입의 조합을 제공하도록 형질전환될 수 있다. 예를 들어, 3-HP 생합성 경로에서 1종 이상의 효소를 코딩하는 1종 이상의 유전자는 모 미생물에 네이티브일 수 있지만, 경로에서 1종 이상의 다른 효소를 코딩하는 1종 이상의 다른 유전자를 포함하지 않을 수 있다. 미생물은 예를 들어 네이티브 아세틸 CoA 카복실라제를 과발현하고 말로닐-CoA의 3-HP로의 전환을 위한 효소(예를 들어, 말로닐 CoA 환원효소)를 코딩하는 말로닐 CoA 환원효소 유전자를 도입하도록 조작될 수 있다. 대안적으로, 미생물은 네이티브 말로닐 CoA 환원효소를 과발현하고 아세틸 CoA 카복실라제를 코딩하는 유전자를 도입하도록 조작될 수 있다. 당업자는 본 발명에서의 용도의 다양한 다른 조합을 이해할 수 있다.
오직 예의 방식으로, 말로닐 CoA 환원효소에 대한 예시적인 서열 정보는 본 명세서에서의 서열 번호 1의 형태로 및 또한 수탁 번호 YP_001636209.1/Caur_2614, GI:163848165로 공중의 데이터베이스로 제공된다. 추가의 예의 방식으로, 아세틸 CoA 카복실라제에 대한 예시적인 서열 정보는 본 명세서에서의 서열 번호 18 내지 서열 번호 21의 형태로 및 또한 수탁 번호 NC_014328.1-33.1/CLJU_c42100-40, GI: 9447826-31 및 GI:163847210-11, Caur_1647-48, YP_001635254.1-55.1; GI:163849262, Caur_3739, YP_001637306.1; GI:163848951, Caur_3421, YP_001636995.1; GI:163846951, Caur_1378, YP_001634995.1로 공중의 데이터베이스로 제공된다. 자연적으로 존재하거나 합성인 효소를 사용할 수 있다. 통상적으로, 효소는 서열 번호 1 또는 서열 번호 18 내지 서열 번호 21에 따른 핵산에 의해 코딩된 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는다.
본 발명의 미생물에서 사용되는 효소(및 이를 코딩하는 임의의 상응하는 유전자)는 박테리아 또는 다른 생물의 상이한 속 및 종을 포함하는 임의의 적절한 소스로부터 유래할 수 있다. 그러나, 일 구현예에서, 말로닐-조효소 A 환원효소는 클로로플렉서스 아우란티쿠스, 클로스트리디움 리융다흘리, 메탈로스파에라 또는 설포로부스 종으로부터 유래한 것이다. 일 구현예에서, 말로닐-조효소 A 환원효소는 상기 예시화된 아미노산 서열을 갖거나, 이것은 이의 기능적 균등 변이체이다. 일 구현예에서, 아세틸 CoA 카복실라제는 클로스트리디움 리융다흘리, 클로로플렉서스 아우란티쿠스, 메탈로스파에라 또는 설포로부스 종으로부터 유래한 것이다. 일 구현예에서, 아세틸 CoA 카복실라제는 상기 본 명세서에 예시화된 아미노산 서열을 갖거나, 이것은 이의 기능적 균등 변이체이다.
말로닐-CoA 환원효소(EC 1.2.1.75)는 짧은 사슬의 환원효소(SDR)의 군에 속하고, 녹색 무황 광독립영양(phototrophic) 박테리아(클로로플렉시(Chloroflexi)) 클로로플렉수스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)(YP_001636209.1; AAS20429.1), 클로로플렉수스 아그레간스(Chloroflexus aggregans)(YP_002462600.1), 오스실로클로리스 트리코이데스(Oscillochloris trichoides)(WP_006561105.1), 로세이플렉수스 카스텐홀지(Roseiflexus castenholzii)(YP_001433009.1) 또는 로세이플렉수스 종(Roseiflexus sp.)(YP_001277512.1)으로서 박테리아로부터 및 에리쓰로박터 종(Erythrobacter sp.)(WP_007163680) 및 감마 프로테오박테리아(WP_009019528.1, WP_007234918.1, WP_009021869.1, WP_009470571.1)로서 알파-프로테오박테리아에서 얻어질 수 있고, 크레나르카에오테스 설포로부스 토코다이(Crenarchaeotes Sulfolobus tokodaii)(NP_378167.1), 아시디아누스 호스피탈리스(Acidianus hospitalis)(YP_004459517.1), 메탈로스파에라 쿠프리나(Metallosphaera cuprina)(YP_004410014.1) 메탈로스파에라 세둘라(Metallosphaera sedula)(YP_001190808.1), 설포로부스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus)(NP_343563.1), 메탈로스파에라 예로우스토넨시스(Metallosphaera yellowstonensis)(WP_009071519.1), 설포로부스 이슬란디쿠스(Sulfolobus islandicus)(YP_002844727.1; YP_002833533.1; YP_002830795.1), 설포로부스 아시도칼다리우스(Sulfolobus acidocaldarius)(YP_256941.1; YP_256733.1)로서 및 아르케아오글로부스 프로푼두스(Archaeoglobus profundus)(YP_003401535.1)로서 및 칸디다투스 클로라시도박테리아 테르모필룸(Candidatus Chloracidobacterium thermophilum)(YP_004863680.1) 또는 칼디아르카움 서브테라눔(Caldiarchaeum subterraneum)(BAJ47902.1)으로서 내열호산성 고세균으로부터 얻을 수 있다.
아세틸 CoA 카복실라제(EC 1.2.1.75)는 바이오틴 의존적 카복실라제의 군에 속하고, 클로로플렉수스 아우란티아쿠스(YP_001635254.1-55.1; YP_001637306.1; YP_001636995.1; YP_001634995.1)로서 녹색 무황 광독립영양 박테리아(클로로플렉시) 또는 C. 리융다홀리(NC_014328.1-33.1)로서 일산화탄소영양 아세토젠으로서 박테리아로부터 얻어질 수 있다.
일 구현예에서, 미생물은 모 미생물에 네이티브인 1종 이상의 핵산의 발현을 증가시키기에 적합한 1종 이상의 외인성 핵산을 포함하고, 1종 이상의 핵산은 상기 본 명세서에서 언급된 1종 이상의 효소(또는 이의 1종 이상의 아단위)를 코딩한다. 일 구현예에서, 발현을 증가시키기에 적합한 1종 이상의 외인성 핵산은 조절 구성요소이다. 일 구현예에서, 조절 구성요소는 프로모터이다. 일 구현예에서, 프로모터는 적절한 발효 조건 하에 바람직하게는 매우 활성인 구성적 프로모터이다. 유도성 프로모터를 또한 사용할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 프로모터는 우드-리융다흘 유전자 클러스터 또는 포스포트랜스아세틸라제/아세테이트 키나제 오페론 프로모터를 포함하는 군으로부터 선택된다. 당해 분야의 당업자는 적절한 발효 조건 하에 발현, 바람직하게는 높은 수준의 발현을 지시할 수 있는 다른 프로모터가 예시화된 구현예에 대한 대안으로서 효과적이라는 것을 이해할 것이다. 프로모터가 하류 코딩 서열의 발현을 추진하게 하는 위치에 있을 때, 이것을 작동가능하게 연결되었다고 칭한다.
일 구현예에서, 미생물은 상기 본 명세서에 언급하는 1종 이상의 효소(또는 이의 1종 이상의 아단위)를 코딩하고 이를 발현시키기에 적합한 1종 이상의 외인성 핵산을 포함한다. 일 구현예에서, 미생물은 적어도 2종의 효소(또는 이의 1종 이상의 아단위)를 코딩하고 이를 발현시키기에 적합한 1종 이상의 외인성 핵산을 포함한다.
특정한 일 구현예에서, 미생물은 말로닐-조효소 A 환원효소를 코딩하는 1종 이상의 외인성 핵산 또는 이의 기능적 균등 변이체를 포함한다. 특정한 일 구현예에서, 미생물은 아세틸 CoA 카복실라제를 코딩하는 1종 이상의 외인성 핵산 또는 이의 기능적 균등 변이체를 포함한다. 아세틸 CoA 카복실라제는 4개의 아단위로 구성될 수 있고, 각각의 아단위는 상이한 유전자에 의해 코딩된다. 이 유전자는 단일 핵산 또는 전체 효소를 함께 코딩하는 2개 이상의 핵산에서 조합될 수 있다. 또한, 특정한 모 미생물은 오직 1개, 2개 또는 3개의 이 아단위에 대해 유전자를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명은 오직 1개, 2개 또는 3개의 아단위를 발현하도록 1종 이상의 외인성 핵산을 사용하여 미생물을 조작하는 것을 포함한다. 유사하게, 이는 유전자가 미생물에 네이티브인 경우 1종 이상의 아단위를 과발현하도록 미생물을 조작하는 것을 포함한다. 네이티브 아단위 유전자의 과발현과 임의의 손실 아단위 유전자의 도입의 조합이 또한 고안된다.
일 구현예에서, 말로닐-조효소 A 환원효소는 서열 번호 1을 포함하는 핵산 또는 이의 기능적 균등 변이체에 의해 코딩된다. 일 구현예에서, 아세틸 CoA 카복실라제는 서열 번호 18, 19, 20 및 21을 포함하는 1종 이상의 핵산 또는 이의 임의의 1종 이상의 기능적 균등 변이체에 의해 코딩된다. 대안적으로, 효소는 공중에게 이용 가능한 데이터베이스에 기재된, 예를 들어 상기 본 명세서에 기재된 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다.
미생물은 1종 이상의 외인성 핵산을 포함할 수 있다. 모 미생물을 2종 이상의 유전 구성요소(예컨대, 유전자 또는 조절 구성요소(예를 들어, 프로모터))로 형질전환하는 바람직한 경우, 이는 1종 이상의 외인성 핵산에 포함될 수 있다.
일 구현예에서, 1종 이상의 외인성 핵산은 임의의 조합의 상기 본 명세서에 언급된 1종 이상의 효소를 코딩하는, 핵산 작제물 또는 벡터, 특정한 일 구현예에서, 플라스미드이다.
외인성 핵산은 모 미생물의 형질전환 시 염색체외 존재할 수 있거나 모 미생물의 게놈에 편입될 수 있다. 따라서, 이것은 염색체외 작제물(예를 들어, 복제 기원, 프로모터 및 다른 조절 구성요소 또는 서열)의 통합(예를 들어, 상동성 재조합 및 숙주 게놈으로의 표적화된 통합을 허용하는 구역) 또는 발현 및 복제를 보조하기에 적합한 추가의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 본 명세서에 언급된 것 또는 효소(또는 이의 1종 이상의 아단위)를 코딩하는 외인성 핵산은 외인성 핵산에 의해 코딩된 1종 이상의 효소의 발현을 촉진하는 데 적합한 프로모터를 추가로 포함할 것이다. 일 구현예에서, 프로모터는 적절한 발효 조건 하에 바람직하게는 매우 활성인 구성적 프로모터이다. 유도성 프로모터를 또한 사용할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 프로모터는 우드-리융다흘 유전자 클러스터 및 포스포트랜스아세틸라제/아세테이트 키나제 프로모터를 포함하는 군으로부터 선택된다. 당해 분야의 당업자는 적절한 발효 조건 하에 발현, 바람직하게는 높은 수준의 발현을 지시할 수 있는 다른 프로모터가 예시화된 구현예에 대한 대안으로서 효과적이라는 것을 이해할 것이다.
일 구현예에서, 외인성 핵산은 발현 플라스미드이다.
일 구현예에서, 모 미생물은 무산소성 아세토젠의 군으로부터 선택된다.
특정한 일 구현예에서, 모 미생물은 일산화탄소영양 초산생성 박테리아의 군으로부터 선택되다. 특정한 구현예에서, 미생물은 클로스트리디움 아우토에타노제늄, 클로스트리디움 리융다흘리, 클로스트리디움 라그스달레이, 클로스트리디움 카복시디보란스, 클로스트리디움 드라케이, 클로스트리디움 스카토로제네스, 클로스트리디움 아세티쿰, 클로스트리디움 포르미코아세티쿰, 클로스트리디움 마그눔, 부티리박테리움 메틸로트로피쿰, 아세토박테리움 우디, 알칼리바쿨룸 바크히, 블라우티아 프로덕타, 유박테리아 리모섬, 모렐라 써모아세티카, 모렐라 써마우토트로피카, 스포로무사 오바타, 스포로무사 실바세티카, 스포로무사 스파에로이데스, 옥소박터 프테니지 및 써모아나에로박터 키우비를 포함하는 군으로부터 선택된다.
특정한 일 구현예에서, 모 미생물은 C. 아우토에타노제늄, C. 리융다홀리 및 C. 라그스달레이의 종 및 관련 단리물을 포함하는 에탄올생성(ethanologenic), 초산생성 클로스트리디아(Clostridia)의 클러스터로부터 선택된다. 이는 균주 C. 아우토에타노제늄 JAI-1^T(DSM10061)[Abrini J, Naveau H, Nyns E-J: Clostridium autoethanogenum, sp. nov., an anaerobic bacterium that produces ethanol from carbon monoxide. Arch Microbiol 1994, 4: 345-351], C. 아우토에타노제늄 LBS1560(DSM19630)[Simpson SD, Forster RL, Tran PT, Rowe MJ, Warner IL: Novel bacteria and methods thereof. 국제 특허(2009), WO/2009/064200], C. 아우토에타노제늄 LBS1561(DSM23693), C. 리융다홀리 PETC^T(DSM13528 = ATCC 55383)[Tanner RS, Miller LM, Yang D: Clostridium ljungdahlii sp. nov., an Acetogenic Species in Clostridial rRNA Homology Group I. Int J Syst Bacteriol 1993, 43: 232-236], C. 리융다홀리 ERI-2(ATCC 55380)[Gaddy JL: Clostridium stain which produces acetic acid from waste gases. 미국 특허(1997), 5,593,886], C. 리융다홀리 C-01(ATCC 55988)[Gaddy JL, Clausen EC, Ko C-W: Microbial process for the preparation of acetic acid as well as solvent for its extraction from the fermentation broth. US 특허(2002), 6,368,819], C. 리융다홀리 O-52(ATCC 55989)[Gaddy JL, Clausen EC, Ko C-W: Microbial process for the preparation of acetic acid as well as solvent for its extraction from the fermentation broth. US 특허(2002), 6,368,819], C. 라그스달레이 P11^T(ATCC BAA-622)[Huhnke RL, Lewis RS, Tanner RS: Isolation and Characterization of novel Clostridial Species. 국제 특허(2008), WO 2008/028055], 관련 단리물, 예컨대 "C. 코스카티(coskatii)"[Zahn 등 - Novel ethanologenic species Clostridium coskatii (미국 특허 출원 US20110229947)] 및 "클로스트리디움 종"(Tyurin 등, 2012, J. Biotech Res . 4: 1-12) 또는 돌연변이 균주, 예컨대 C. 리융다홀리 OTA-1(Tirado-Acevedo O. Production of Bioethanol from Synthesis Gas Using Clostridium ljungdahlii. PhD thesis, North Carolina State University, 2010)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 이 균주는 클로스트리디아 rRNA 클러스터 I 내에 하위클러스터를 형성하고, 이의 16S rRNA 유전자는 약 30%의 유사한 낮은 GC 함량으로 99% 초과로 동일하다. 그러나, DNA-DNA 재집합 및 DNA 핑거프린팅(fingerprinting) 실험은 이 균주가 별개의 종에 속한다는 것을 나타낸다[Huhnke RL, Lewis RS, Tanner RS: Isolation and Characterization of novel Clostridial Species. 국제 특허(2008), WO 2008/028055].
이 클러스터의 모든 종은 유사한 형태 및 크기(대수로 성장하는 세포는 0.5 내지 0.7 x 3-5㎛임)를 갖고, 중온성(30 내지 37℃의 최적 성장 온도)이고, 엄격히 혐기성 생물이다[Tanner RS, Miller LM, Yang D: Clostridium ljungdahlii sp. nov., an Acetogenic Species in Clostridial rRNA Homology Group I. Int J Syst Bacteriol 1993, 43: 232-236; Abrini J, Naveau H, Nyns E-J: Clostridium autoethanogenum, sp. nov., an anaerobic bacterium that produces ethanol from carbon monoxide. Arch Microbiol 1994, 4: 345-351; Huhnke RL, Lewis RS, Tanner RS: Isolation and Characterization of novel Clostridial Species. 국제 특허(2008), WO 2008/028055]. 더구나, 이들은 모두 동일한 주요한 계통발생 특질, 예컨대 동일한 pH 범위(pH 4-7.5, 5.5-6의 최적 초기 pH), 특정한 조건 하에 형성된 소량의 2,3-부탄다이올 및 락트산 및 주요 발효 최종 생성물로서의 에탄올 및 아세트산과 유사한 성장 속도 및 유사한 대사 프로필을 갖는 CO 함유 가스에서 강한 독립영양 성장을 공유한다.[Tanner RS, Miller LM, Yang D: Clostridium ljungdahlii sp. nov., an Acetogenic Species in Clostridial rRNA Homology Group I. Int J Syst Bacteriol 1993, 43: 232-236; Abrini J, Naveau H, Nyns E-J: Clostridium autoethanogenum, sp. nov., an anaerobic bacterium that produces ethanol from carbon monoxide. Arch Microbiol 1994, 4: 345-351; Huhnke RL, Lewis RS, Tanner RS: Isolation and Characterization of novel Clostridial Species. 국제 특허(2008), WO 2008/028055]. 인돌 생성은 모든 3개의 종에서 또한 관찰되었다. 그러나, 종은 다양한 당(예를 들어, 람노스, 아라비노스), 산(예를 들어, 글루코네이트, 시트레이트), 아미노산(예를 들어, 아르기닌, 히스티딘) 또는 다른 기질(예를 들어, 베타인, 부탄올)의 기질 이용이 다르다. 더구나, 몇몇 종은 특정한 비타민(예를 들어, 티아민, 바이오틴)에 대해 영양요구성인 것으로 밝혀진 반면, 다른 것은 그렇지 않다.
일 구현예에서, 모 균주는 이의 유일한 탄소 및 에너지원으로서 CO를 사용한다.
일 구현예에서, 모 미생물은 클로스트리디움 아우토에타노제늄 또는 클로스트리디움 리융다흘리이다. 특정한 일 구현예에서, 미생물은 클로스트리디움 아우토에타노제늄 DSM23693이다. 특정한 다른 구현예에서, 미생물은 클로스트리디움 리융다흘리 DSM13528(또는 ATCC55383)이다.
일 구현예에서, 모 미생물은 말로닐-조효소 A 환원효소 또는 아세틸 CoA 카복실라제(또는 이의 1종 이상의 아단위)를 코딩하는 1종 이상의 유전자가 결여된다.
핵산
본 발명은 또한 본 발명의 재조합 미생물을 생성하는 데 있어서의 용도의 핵산 및 핵산 작제물을 제공한다.
일 구현예에서, 핵산은 CO 및/또는 CO₂를 포함하는 기질의 발효에 의해 미생물이 3-HP를 생성하게 하는 3-HP 생합성 경로에서 1종 이상의 효소(또는 이의 1종 이상의 아단위)를 코딩하는 1종 이상의 서열을 포함한다. 특정한 일 구현예에서, 본 발명은 미생물에서 발현될 때 CO 및/또는 CO₂를 포함하는 기질의 발효에 의해 미생물이 3-HP를 생성하게 하는 2개 이상의 효소(또는 이의 1종 이상의 아단위)를 코딩하는 핵산을 제공한다.
특정한 일 구현예에서, 효소는 말로닐 CoA 환원효소, 아세틸 CoA 카복실라제 및 이의 임의의 1종 이상의 기능적 균등 변이체로부터 선택된다.
일 구현예에서, 본 발명의 핵산은 말로닐-조효소 A 환원효소, 아세틸 CoA 카복실라제 또는 이의 임의의 1종 이상의 기능적 균등 변이체를 임의의 순서로 코딩하는 1종 이상의 핵산 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 핵산은 아세틸 CoA 카복실라제의 1종 이상의 아단위 또는 이의 임의의 1종 이상의 기능적 균등 변이체를 임의의 순서로 코딩하는 1종 이상의 핵산 서열을 포함한다.
각각의 상기 효소를 코딩하는 예시적인 아미노산 서열 및 핵산 서열이 본 명세서에 제공되거나, 상기 본 명세서에 언급된 바대로 유전자은행로부터 얻을 수 있다. 그러나, 당업자는 유전자은행 및 다른 데이터베이스 및 유전자 코드에서 본 명세서에 포함된 정보를 고려하여 효소를 코딩하는 대안적인 핵산 서열 또는 이의 기능적 균등 변이체를 용이하게 이해할 것이다.
일 구현예에서, 말로닐-조효소 A 환원효소는 상기 본 명세서에 기재된 서열을 갖거나 이의 기능적 균등 변이체이다.
일 구현예에서, 아세틸 CoA 카복실라제를 코딩하는 핵산 서열은 상기 본 명세서에 기재된 서열을 갖거나 이의 기능적 균등 변이체이다.
일 구현예에서, 본 발명의 핵산은 프로모터를 추가로 포함할 것이다. 일 구현예에서, 프로모터는 이의 제어 하에 유전자의 구성적 발현을 허용한다. 그러나, 유도성 프로모터를 또한 사용할 수 있다. 당해 분야의 당업자는 본 발명에서 사용되는 프로모터를 용이하게 이해할 것이다. 바람직하게는, 프로모터는 적절한 발효 조건 하에 높은 수준의 발현을 지시할 수 있다. 특정한 구현예에서, 우드-리융다흘 클러스터 프로모터를 사용한다. 다른 구현예에서, 포스포트랜스아세틸라제/아세테이트 키나제 프로모터를 사용한다. 다른 구현예에서, 피루베이트: 페로독신 옥시도환원효소 프로모터, Rnf 복합체 오페론 프로모터 또는 ATP 신타제 오페론 프로모터. 특정한 일 구현예에서, 프로모터는 C. 아우토에타노제늄 유래이다.
본 발명의 핵산은 모 미생물의 형질전환 시 염색체외 존재할 수 있거나 미생물의 게놈으로의 통합에 적합할 수 있다. 따라서, 본 발명의 핵산은 염색체외 작제물(예를 들어, 복제 기원, 프로모터 및 다른 조절 서열)의 통합(예를 들어, 상동성 재조합 및 숙주 게놈으로의 표적화된 통합을 허용하는 구역) 또는 안정한 발현 및 복제를 보조하기에 적합한 추가의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 핵산은 핵산 작제물 또는 벡터이다. 특정한 일 구현예에서, 핵산 작제물 또는 벡터는 발현 작제물 또는 벡터이지만, 다른 작제물 및 벡터, 예컨대 클로닝에 사용되는 것이 본 발명에 포함된다. 특정한 일 구현예에서, 발현 작제물 또는 벡터는 플라스미드이다.
본 발명의 발현 작제물/벡터가 프로모터 이외의 임의의 수의 조절 구성요소 및 원하는 경우 추가의 단백질의 발현에 적합한 추가의 유전자를 포함할 수 있는 것으로 이해된다. 일 구현예에서, 발현 작제물/벡터는 1개의 프로모터를 포함한다. 다른 구현예에서, 발현 작제물/벡터는 2개 이상의 프로모터를 포함한다. 특정한 일 구현예에서, 발현 작제물/벡터는 발현하고자 하는 각각의 유전자에 대한 1개의 프로모터를 포함한다. 일 구현예에서, 발현 작제물/벡터는 하나 이상의 리보솜 결합 자리, 바람직하게는 발현하고자 하는 각각의 유전자에 대한 리보솜 결합 자리를 포함한다.
당해 분야의 당업자는 본 명세서에 기재된 핵산 서열 및 작제물/벡터 서열이 기준 링커 뉴클레오타이드, 예컨대 리보솜 결합 자리 및/또는 제한 자리에 필요한 것을 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이러한 링커 서열은 필요한 것으로 해석되어서는 안 되고, 정의된 서열에 제한을 제공하지 않는다.
당해 분야에 공지된 임의의 수의 기법을 이용하여 본 발명의 발현 작제물/벡터를 포함하는 핵산 및 핵산 작제물을 작제할 수 있다. 예를 들어, 화학 합성 또는 재조합 기법을 이용할 수 있다. 이러한 기법은 예를 들어 문헌[Sambrook 등 (Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989]에 기재되어 있다. 추가의 예시적인 기법은 하기 본 명세서에서의 실시예 부문에 기재되어 있다. 본질적으로, 각각의 유전자 및 조절 구성요소는 서로 작동가능하게 연결되어, 원하는 단백질을 형성하도록 유전자가 발현될 수 있다. 당해 분야의 당업자는 본 발명에서 사용되는 적합한 벡터를 이해할 것이다. 그러나, 예의 방식으로, 하기 벡터가 적합할 수 있다: pMTL80000 벡터, pIMP1, pJIR750 및 하기 본 명세서에서의 실시예 부문에 예시화된 플라스미드.
RNA, DNA 또는 cDNA를 포함하여 본 발명의 핵산이 임의의 적절한 형태일 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 임의의 1종 이상의 핵산을 포함하는 바이러스, 박테리아 및 효모를 포함하는 숙주 생물, 특히 미생물을 제공한다.
1종 이상의 외인성 핵산은 네이키드 핵산으로서 모 미생물에 전달될 수 있거나, 형질전환 과정(예를 들어, 리포솜 접합 핵산, 핵산이 포함된 생물)을 촉진하는 1종 이상의 물질로 제제화될 수 있다. 1종 이상의 핵산은 DNA, RNA 또는 적절한 바대로 이들의 조합일 수 있다. 제한 저해제를 특정한 구현예에서 사용할 수 있고; 예를 들어 문헌[Murray, N.E. 등 (2000) Microbial . Molec . Biol . Rev . 64, 412]을 참조한다.
재조합 미생물을 제조하기 위한 당해 분야에 공지된 임의의 수의 기법을 이용하여 모 미생물 및 1종 이상의 외인성 핵산으로부터 본 발명의 미생물을 제조할 수 있다. 오직 예의 방식으로, 형질전환(형질유도 또는 형질감염을 포함)을 전기영동, 초음파처리, 폴리에틸렌 글라이콜 매개 형질전환, 화학 또는 천연 경쟁 또는 접합에 의해 성취할 수 있다. 적합한 형질전환 기법은 예를 들어 문헌[Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T: Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, 1989]에 기재되어 있다.
특정한 구현예에서, 형질전환하고자 하는 미생물에서 활성인 제한 시스템으로 인해, 미생물로 도입하고자 하는 핵산을 메틸화하는 것이 필요하다. 하기 기재되고 하기 본 명세서에서의 실시예 부문에서 추가로 예시화된 것을 포함하는 다양한 기법을 이용하여 이를 수행할 수 있다.
예의 방식으로, 일 구현예에서, 본 발명의 재조합 미생물은 (ⅰ) 본 명세서에 기재된 발현 작제물/벡터 및 (ⅱ) 메틸트랜스퍼라제 유전자를 포함하는 메틸화 작제물/벡터의 셔틀 미생물로의 도입; 메틸트랜스퍼라제 유전자의 발현; 셔틀 미생물로부터의 하나 이상의 작제물/벡터의 단리; 및 목적지 미생물로의 하나 이상의 작제물/벡터의 도입의 단계를 포함하는 방법에 의해 생성된다.
일 구현예에서, 단계 B의 메틸트랜스퍼라제 유전자는 구성적으로 발현된다. 다른 구현예에서, 단계 B의 메틸트랜스퍼라제 유전자의 발현이 유도된다.
셔틀 미생물은 미생물, 바람직하게는 발현 작제물/벡터를 구성하는 핵산 서열의 메틸화를 촉진하는 제한 네가티브 미생물이다. 특정한 구현예에서, 셔틀 미생물은 제한 네가티브 이. 콜라이, 바실러스 서브틸리스 또는 락토코커스 락티스이다.
메틸화 작제물/벡터는 메틸트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
발현 작제물/벡터 및 메틸화 작제물/벡터가 셔틀 미생물로 도입되면, 메틸화 작제물/벡터에 존재하는 메틸트랜스퍼라제 유전자가 유도된다. 본 발명의 특정한 일 구현예에서, 메틸화 작제물/벡터가 유도성 lac 프로모터를 포함하고 락토스 또는 이의 유사체, 더 바람직하게는 이소프로필-β-D-티오-갈락토사이드(IPTG)의 첨가에 의해 유도되더라도, 유도는 임의의 적합한 프로모터 시스템에 의해 의할 수 있다. 다른 적합한 프로모터는 ara, tet 또는 T7 시스템을 포함한다. 본 발명의 추가의 구현예에서, 메틸화 작제물/벡터 프로모터는 구성적 프로모터이다.
특정한 구현예에서, 메틸화 작제물/벡터는 셔틀 미생물의 정체성에 특이적인 복제 기원을 가져서 메틸화 작제물/벡터에 존재하는 임의의 유전자가 셔틀 미생물에서 발현된다. 바람직하게는, 발현 작제물/벡터는 목적지 미생물의 정체성에 특이적인 복제 기원을 가져서 발현 작제물/벡터에 존재하는 임의의 유전자가 목적지 미생물에서 발현된다.
메틸트랜스퍼라제 효소의 발현은 발현 작제물/벡터에 존재하는 유전자를 메틸화시킨다. 이후, 발현 작제물/벡터는 다수의 공지된 방법 중 임의의 하나에 따라 셔틀 미생물로부터 단리될 수 있다. 오직 예의 방식으로, 발현 작제물/벡터를 단리하기 위해 하기 본 명세서에서의 실시예 부문에 기재된 방법론을 이용할 수 있다.
특정한 일 구현예에서, 작제물/벡터 둘 다는 동시에 단리된다.
발현 작제물/벡터는 임의의 수의 공지된 방법을 이용하여 목적지 미생물로 도입될 수 있다. 그러나, 예의 방식으로, 하기 본 명세서에서의 실시예 부문에 기재된 방법론을 이용할 수 있다. 발현 작제물/벡터가 메틸화되므로, 발현 작제물/벡터에 존재하는 핵산 서열은 목적지 미생물에 도입되고 성공적으로 발현될 수 있다.
메틸트랜스퍼라제 유전자는 셔틀 미생물로 도입되고 과발현될 수 있는 것으로 고안된다. 따라서, 일 구현예에서, 생성된 메틸트랜스퍼라제 효소는 공지된 방법을 이용하여 수집되고, 발현 플라스미드를 메틸화하도록 실험실내 이용될 수 있다. 이후, 발현 작제물/벡터는 발현을 위해 목적지 미생물로 도입될 수 있다. 다른 구현예에서, 메틸트랜스퍼라제 유전자가 셔틀 미생물의 게놈으로 도입된 후, 발현 작제물/벡터가 셔틀 미생물로 도입되고, 하나 이상의 작제물/벡터가 셔틀 미생물로부터 단리되고, 이후 발현 작제물/벡터가 목적지 미생물로 도입된다.
상기 정의된 발현 작제물/벡터 및 메틸화 작제물/벡터가 조합되어 물질의 조성물을 제공할 수 있는 것으로 고안된다. 이러한 조성물은 본 발명의 재조합 미생물을 생성하기 위해 제한 장벽 기전을 피하는 데 있어서 특정한 유용성을 갖는다.
특정한 일 구현예에서, 발현 작제물/벡터 및/또는 메틸화 작제물/벡터는 플라스미드이다.
당해 분야의 당업자는 본 발명의 미생물을 생성하는 데 사용되는 다수의 적합한 메틸트랜스퍼라제를 이해할 것이다. 그러나, 예의 방식으로, 바실러스 서브틸리스 파지 φT1 메틸트랜스퍼라제 및 하기 본 명세서에서의 실시예에 기재된 메틸트랜스퍼라제를 사용할 수 있다. 일 구현예에서, 메틸트랜스퍼라제는 서열 번호 6의 아미노산 서열을 갖거나 이의 기능적 균등 변이체이다. 적합한 메틸트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산은 원하는 메틸트랜스퍼라제 및 유전자 코드의 서열을 고려하여 용이하게 이해될 것이다. 일 구현예에서, 메틸트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산은 하기 본 명세서에서의 실시예에 기재된 것과 같다(예를 들어 서열 번호 26의 핵산 또는 이것은 이의 기능적 균등 변이체임).
메틸트랜스퍼라제 유전자의 발현을 허용하기에 적합한 임의의 수의 작제물/벡터를 사용하여 메틸화 작제물/벡터를 생성할 수 있다. 그러나, 예의 방식으로, 하기 본 명세서에서의 실시예 부문에 기재된 플라스미드를 사용할 수 있다(예를 들어, 서열 번호 7).
제조 방법
본 발명은 본 발명의 재조합 미생물을 사용하여 CO 및/또는 CO₂를 포함하는 기질을 발효시키는 단계를 포함하는 세균 발효에 의한 3-HP 및 임의로 1종 이상의 다른 생성물의 생성 방법을 제공한다. 바람직하게는, 3-HP는 주요 발효 생성물이다. 본 발명의 방법을 이용하여 산업 공정으로부터의 전체 대기 탄소 방출을 감소시킬 수 있다.
바람직하게는, 발효는 생물반응기에서 기질을 무산소성으로 발효시켜 본 발명의 재조합 미생물을 사용하여 적어도 3-HP를 생성하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서 상기 방법은,
(a) CO 및/또는 CO₂를 포함하는 기질을 본 발명의 1종 이상의 미생물의 배양물을 포함하는 생물반응기에 제공하는 단계; 및
(b) 생물반응기에서 배양물을 무산소성으로 발효시켜 적어도 3-HP를 생성하는 단계
를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 방법은,
(a) 산업 공정의 결과로서 생성된 CO- 및/또는 CO₂-함유 가스가 대기로 방출되기 전에 상기 가스를 생산하는 단계; 및
(b) CO- 및/또는 CO₂-함유 가스를 무산소성으로 발효시켜 본 발명의 1종 이상의 미생물을 포함하는 배양물에 의해 적어도 3-HP를 생성하는 단계
를 포함한다.
일 구현예에서, 기질은 CO를 포함한다. 일 구현예에서, 기질 CO₂ 및 CO를 포함한다. 다른 구현예에서, 기질은 CO₂ 및 H₂를 포함한다. 다른 구현예에서, 기질은 CO₂, 및 CO 및 H₂를 포함한다.
본 발명의 특정한 일 구현예에서, 미생물에 의해 발효된 가스 기질은 CO를 포함하는 가스 기질이다. 가스 기질은 산업 공정의 부산물로서 또는 몇몇 다른 소스, 예컨대 자동차 배기 가스로부터 얻은 CO-함유 폐가스일 수 있다. 특정한 구현예에서, 산업 공정은 철 금속 생성물 제조, 예컨대 제강소, 비철 생성물 제조, 석유 제련 공정, 코크스 기화, 전력 생성, 카본 블랙 생성, 암모니아 생성, 메탄올 생성 및 코크스 제조로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이 구현예에서, CO-함유 가스는 대기로 방출되기 전에 임의의 편리한 방법을 이용하여 산업 공정으로부터 포획될 수 있다. CO는 합성가스(일산화탄소 및 수소를 포함하는 가스)의 성분일 수 있다. 산업 공정으로부터 생성된 CO는 보통 연소되어 CO₂를 생성하고, 따라서 본 발명은 CO₂ 온실 가스 방출을 감소시키고 바이오연료로서 사용하기 위한 부탄올을 생성하는 데 있어서 특정한 유용성을 갖는다. 가스 CO-함유 기질의 조성에 따라, 이것이 발효에 도입하기 전에 임의의 원치않는 불순물, 예컨대 먼지 입자를 제거하도록 이를 처리하는 것이 또한 바람직할 수 있다. 예를 들어, 가스 기질은 공지된 방법을 이용하여 여과되거나 스크러빙될 수 있다.
본 발명의 특정한 구현예에서, 미생물에 의해 발효된 가스 기질은 CO₂ 및 H₂를 포함하는 가스 기질이다. CO₂/H₂ 함유 기질은 산업 공정의 부산물로서 얻어진 폐가스일 수 있다. 특정한 구현예에서, 산업 공정은 수소 생성으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정한 구현예에서, CO₂ 및 H₂를 포함하는 가스 기질은 블렌딩된 가스 스트림일 수 있고, 1개 이상의 산업 공정으로부터 유도된 가스 스트림의 적어도 일부는 CO₂ 또는 H₂의 적어도 일부와 블렌딩되어 가스 기질의 CO₂:H₂ 비율을 최적화한다. 이는 CO₂ 또는 H₂가 농후한 산업 가스 스트림에 특히 유리할 수 있다. CO₂ 및 H₂ 기질 또는 CO₂ 및 H₂ 블렌딩된 기질에 대한 소스로서 사용될 수 있는 부산물 가스 스트림을 생성하는 산업 공정의 예는 코크스 제조, 제련 공정, 암모니아 생성 공정, 메탄올 생성 공정, 아세트산 생성, 천연 가스 정제 및 발전소를 포함한다.
박테리아의 성장 및 발생하는 3-HP를 포함하는 생성물에 대한 가스의 전환의 경우, CO- 및/또는 CO₂-함유 기질 가스 이외의 적합한 액체 영양 배지가 생물반응기로 공급될 필요가 있는 것으로 이해된다. 기질 및 배지는 연속, 뱃취 또는 유가 배양 방식의 생물반응기로 도입될 수 있다. 영양 배지는 사용된 미생물의 성장을 허용하기에 충분한 비타민 및 무기질을 포함한다. CO 및/또는 CO₂를 사용하여 1종 이상의 생성물을 생성하기 위한 발효에 적합한 무산소성 배지는 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 적합한 배지가 Biebel (2001)에 기재되어 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 배지는 하기 본 명세서에서의 실시예 부문에 기재되어 있다.
발효는 바람직하게는 발효에 대한 적절한 조건 하에 수행되어야 하고, 이는 발생하는 3-HP를 포함하는 생성물로의 가스의 전환을 지지한다. 고려되어야 하는 반응 조건은 압력, 온도, 가스 유속, 액체 유속, 배지 pH, 배지 산화환원 전위, 교반 속도(연속 교반 탱크 반응기를 사용하는 경우), 접종 수준, 액상에서 CO 및/또는 CO₂가 제한되지 않도록 보장하는 최대 가스 기질 농도 및 생성물 저해를 회피하는 최대 생성물 농도를 포함한다.
또한, 기질 스트림의 CO 및/또는 CO₂ 농도(또는 가스 기질에서의 CO 및/또는 CO₂ 분압)을 증가시키고, 따라서 CO 및/또는 CO₂가 기질인 발효 반응의 효율을 증가시키는 것이 대개 바람직하다. 증가 압력에서의 조작은 기상으로부터 액상으로의 CO 및/또는 CO₂ 이동의 속도를 상당히 증가시키고, 여기서 이 액상은 3-HP를 포함하는 생성물을 만드는 탄소원으로서 미생물로 채워질 수 있다. 이는 결국 생물반응기가 대기압보다는 승압에서 유지될 때 체류 시간(유입 가스 유속으로 나눈 생물반응기에서의 액체 용적으로 정의됨)이 감소할 수 있다는 것을 의미한다. 최적 반응 조건은 부분적으로 사용되는 본 발명의 특정한 미생물에 따라 달라진다. 그러나, 일반적으로, 상압보다 높은 압력에서 발효가 수행되는 것이 바람직하다. 또한, 적어도 3-HP로의 소정의 CO- 및/또는 CO₂-의 전환 속도는 부분적으로 기질 체류 시간의 함수이고, 결국 원하는 체류 시간을 성취하는 것은 생물반응기의 필요한 용적을 기술하고, 가압 시스템의 사용은 필요한 생물반응기의 용적 및 결과적으로 발효 설비의 자본 비용을 크게 감소시킬 수 있다. 미국 특허 5,593,886에 제공된 실시예에 따라, 반응기 용적은 반응기 조작 압력의 증가에 선형 비례로 감소할 수 있고, 즉 10기압에서 조작되는 생물반응기는 1기압에서 조작되는 것의 용적의 오직 10분의 1일 필요가 있다.
예의 방식으로, 승압에서 가스-대-에탄올 발효를 수행하는 것의 이점이 기재되어 있다. 예를 들어, WO 02/08438은 30psig 및 75psig의 압력에서 수행되는 가스-대-에탄올 발효를 기술하고, 각각 150g/ℓ/일 및 369g/ℓ/일의 에탄올 생산성을 제공한다. 그러나, 대기압에서의 유사한 배지 및 유입 가스 조성물을 사용하여 수행된 예시적 발효는 일마다 리터당 10배 내지 20배 더 적은 에탄올을 생성시키는 것으로 발견되었다.
CO 및/또는 CO₂-함유 가스 기질의 도입 속도가 예컨대 액상에서의 CO 및/또는 CO₂의 농도가 제한이 되지 않도록 보장하는 것이 또한 바람직하다. 이는 CO- 및/또는 CO₂-제한 조건의 결과가 1종 이상의 생성물이 배양물에 의해 소비된다는 것일 수 있기 때문이다.
발효 반응에 공급하도록 사용되는 가스 스트림의 조성은 이 반응의 효율 및/또는 비용에 상당히 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, O₂는 무산소성 발효 과정의 효율을 감소시킬 수 있다. 발효 전에 또는 후에 발효 과정의 단계에서의 원치않는 또는 불필요한 가스의 공정처리는 이러한 단계에 대한(가스 스트림이 생물반응기를 진입하기 전에 압축되고, 발효에 필요하지 않은 가스를 압축하기 위해 불필요한 에너지가 사용될 수 있는 것을 포함하는 생성물에 대한) 부담을 증가시킬 수 있다. 따라서, 기질 스트림, 특히 원치않는 성분을 제거하고 원하는 성분의 농도를 증가시키도록 산업 소스로부터 유도된 기질 스트림을 처리하는 것이 바람직할 수 있다.
특정한 구현예에서, 본 발명의 박테리아의 배양물은 수성 배양 배지에서 유지된다. 바람직하게는, 수성 배양 배지는 최소 무산소성 세균 성장 배지이다. 적합한 배지는 당해 분야에서 공지되어 있고, 예를 들어 미국 특허 5,173,429 및 5,593,886 및 WO 02/08438에 기재되어 있고, 하기 본 명세서에서의 실시예 부문에 기재되어 있다.
3-HP 또는 3-HP 및/또는 1종 이상의 다른 생성물을 포함하는 혼합 스트림은 분별 증류 또는 증발, 투과증발, 가스 스트리핑 및 추출 발효(예를 들어, 액체-액체 추출을 포함)와 같은 당해 분야에 공지된 방법에 의해 발효 브로쓰로부터 회수될 수 있다.
본 발명의 특정한 바람직한 구현예에서, 3-HP 및 1종 이상의 생성물은 생물반응기로부터 브로쓰의 일부를 연속하여 제거하고, (편리하게는 여과로) 브로쓰로부터 세균 세포를 분리하고, 브로쓰로부터 1종 이상의 생성물을 회수함으로써 발효 브로쓰로부터 회수된다. 알콜은 편리하게는 예를 들어 증류에 의해 회수될 수 있다. 아세톤은 예를 들어 증류에 의해 회수될 수 있다. 제조된 임의의 산은 예를 들어 활성 챠콜 상의 흡착에 의해 회수될 수 있다. 분리된 세균 세포는 바람직하게는 발효 생물반응기로 복귀된다. 임의의 알콜(들) 및 산(들)이 제거된 후 남아 있는 세포 비함유 투과액은 또한 바람직하게는 발효 생물반응기로 반환된다. 추가의 영양소(예컨대, B 비타민)는 세포 비함유 투과액에 첨가되어 생물반응기로 반환되기 전에 영양 배지를 보충할 수 있다.
또한, 브로쓰의 pH가 활성 챠콜로의 아세트산의 흡착을 증대시키기 위해 상기 기재된 바대로 조정되는 경우, pH는 생물반응기로 반환되기 전에 발효 생물반응기에서의 브로쓰와 유사한 pH로 조정되어야 한다.
3-HP는 투과증발, 역삼투 및 액체 액체 추출 기법(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 임의의 적절한 방법론을 이용하여 발효 후 회수될 수 있다.
실시예
본 발명은 하기 비제한적인 실시예를 참조하여 이제 더 자세히 기재된다.
실시예 1
아세토젠의 선형 우드-리융다흘 경로 및 녹색 무황 박테리아 및 고세균에서 발견되는 3-HP 사이클(Thauer, 2007, Science, 318: 1732-33)의 2개의 CO₂ 고정 경로는 조합되어 플랫폼 화학물질 3-하이드록시프로피오네이트(3-HP)에 대한 지속 가능한 경로를 제시할 수 있다. 이 경로는 3-HP의 1개의 분자로 CO 또는 CO₂의 3개의 분자를 고정시킨다. 클로스트리디움 아우토에타노제늄인 일산화탄소영양 초산생성 생물을 선택하고, 유전자로 대사적으로 조작하여 무황 광합성 박테리아 클로로플렉서스 아우란티쿠스로부터 초기 CO₂ 고정 단계를 수행한다(도 1).
일산화탄소영양 아세토젠, 예컨대 클로스트리디움 아우토에타노제늄 또는 클로스트리디움 리융다흘리는 CO 또는 CO₂의 2개의 분자를 고정하고 이를 융합하여 아세틸-CoA를 형성함으로써 독립영양으로 성장할 수 있다. 무황 광합성 박테리아, 예컨대 클로로플렉서스 아우란티쿠스는 순환 과정에서 CO₂를 고정할 수 있다. 이는 출발점으로서 아세틸-CoA를 사용하고, 아세틸-CoA 카복실라제(EC. 6.4.1.2)에 의해 촉매화되는 ATP 의존적 단계에서 이를 융합시켜, 말로닐-CoA를 형성하고, 이후 이는 말로닐-조효소 A 환원효소(EC 1.2.1.75)의 작용에 의한 이 사이클의 중간 중간체인 3-HP로 환원될 수 있다(Huegler 등, 2002, J. Bacteriol . 184: 2404-10). 효소(GI:163848165, Caur_2614; YP_001636209.1)인 말로닐-조효소 A 환원효소 유전자는 일산화탄소영양 생물로 도입되어 3-HP로 CO 또는 CO₂의 3개의 분자를 고정하는 새로운 대사 경로를 형성한다. 아세틸-CoA 카복실라제는 지방산 생합성의 일부로서 숙주 생물에 이미 존재하는 것으로 확인되었지만(C. 아우토에타노제늄: 서열 번호 18-21; C. 리융다홀리: CLJU_c42100-40, GI: 9447826-31, NC_014328.1-33.1), 클로로플렉수스 아우란티쿠스(Cloroflexus auranticus) 아세틸-CoA 카복실라제(GI:163847210-11, Caur_1647-48, YP_001635254.1-55.1; GI:163849262, Caur_3739, YP_001637306.1; GI:163848951, Caur_3421, YP_001636995.1; GI:163846951, Caur_1378, YP_001634995.1)는 필수적인 말로닐-조효소 A 환원효소 이외에 도입될 수 있다.
재료 및 방법
미생물 및 성장 조건
C. 아우토에타노제늄 DSM23693은 DSMZ로부터 공급된 C. 아우토에타노제늄 DSM10061의 유도체이다(The German Collection of Microorganisms and Cell Cultures(독일 브라운슈벡 38124 인호펜슈트라쎄 7 B)).
이. 콜라이 XL1-블루 MRF' Kan을 스트라타젠(Stratagene)(미국 캘리포니아주 95051-7201 산타 클라라)로부터 구입하였다.
이. 콜라이를 호기성 조건 하에 배양하고, 모든 다른 균주를 두부 간격(독립영양 성장)에서 프럭토스(종속영양 성장) 또는 30psi CO-함유 제강소 가스(New Zealand Steel site(뉴질랜드 글렌브룩)로부터 수집; 조성물: 44%의 CO, 32%의 N₂, 22%의 CO₂, 2%의 H₂)를 갖는 혈청 병에서 50㎖ 액체 배지의 용적에서 엄격히 무산소성으로 성장시켰다.
표 1-3에 제공된 제제에 따라 표준 무산소성 기법(Hungate RE: A roll tube method for cultivation of strict anaerobes, in Norris JR and Ribbons DW (eds.), Methods in Microbiology, vol. 3B. Academic Press, New York, 1969: 117-132; Wolfe RS: Microbial formation of methane. Adv Microb Physiol 1971, 6: 107-146)을 이용하여 배지를 제조하였다. 고체 배지의 경우, 1.2%의 박토 한천(Bacto agar)(미국 뉴저지주 07417 프랭크톤 레이크스 BD)을 사용하였다.
달리 기재되지 않은 한, 모든 균주를 37℃에서 성장시켰다.
표 1: PETC - MES 배지(C. 아우토에타노제늄 pH 5.6)

표 2: 루리아 베르타니 ( Luria Bertani ) 배지 LB(이. 콜라이 )

표 3: M9 최소 배지(이. 콜라이 )

C. 아우라니티아쿠스로부터의 말로닐 -조효소 A 환원효소를 갖는 발현 플라스미드의 작제
표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기법을 이용하였다(Sambrook, J., and Russell, D., Molecular cloning: A Laboratory Manual 3rd Ed., Cold Spring Harbour Lab Press, Cold Spring Harbour, NY, 2001). NCBI 유전자은행(GI:163848165, Caur_2614; YP_001636209.1)로부터 C.아우라니티아쿠스로부터의 말로닐-조효소 A 환원효소의 DNA 서열을 얻었다.
클로로플렉수스 아우란티아쿠스로부터의 말로닐-조효소 A 환원효소는 코돈 최적화되고(서열 번호 1), ATG:Biosynthetics GmbH(독일 메르츠하우젠)에 의해 합성되고, 추가의 서브클로닝을 위한 NdeI 및 EcoI 제한 자리에 플랭킹된다. C. 아우토에타노제늄의 포스포트랜스아세틸라제/아세테이트 키나제 오페론 프로모터(P_{pta -ack})를 말로닐-조효소 A 환원효소의 발현에 사용하였다. 사용된 모든 DNA 서열은 표 4에 기재되어 있다.
표 4: C. 아우라니티아쿠스로부터의 말로닐 -조효소 A 환원효소를 갖는 발현 플라스미드에 사용된 서열

포스포트랜스아세틸라제-아세테이트 키나제 오페론(P_pta-ack)(서열 번호 17)의 프로모터 구역을 프라이머 Ppta-ack-NotI-F(서열 번호 8: GAGCGGCCGCAATATGATATTTATGTCC) 및 Ppta-ack-NdeI-R(서열 번호 9: TTCCATATGTTTCATGTTCATTTCCTCC)을 사용하여 증폭시키고, NotI 및 NdeI 제한 자리 및 균주 XL1-블루 MRF' Kan을 사용하여 이. 콜라이-클로스트리듐 셔틀 벡터 pMTL 85141(FJ797651.1; Nigel Minton(영국 노팅엄 대학))로 클로닝하였다[Heap JT, Pennington OJ, Cartman ST, Minton NP. A modular system for Clostridium shuttle plasmids. J Microbiol Methods. 2009, 78: 79-85].
이후, 생성된 플라스미드 pMTL 85145에서의 항생제 내성 유전자를 FseI 및 PmeI 제한 자리 및 균주 XL1-블루 MRF' Kan을 사용하여 pMTL 82254로부터의 에리쓰로마이신 내성 유전자로 대체하였다(FJ797646.1; Nigel Minton(영국 노팅엄 대학))[Heap JT, Pennington OJ, Cartman ST, Minton NP. A modular system for Clostridium shuttle plasmids. J Microbiol Methods. 2009, 78: 79-85]. 생성된 플라스미드 pMTL 85245(서열 번호 3) 및 pMTL83151(FJ797647.1; Nigel Minton(영국 노팅엄 대학))로부터의 repL 유전자의 1625bp의 단편[Heap JT, Pennington OJ, Cartman ST, Minton NP. A modular system for Clostridium shuttle plasmids. J Microbiol Methods. 2009, 78: 79-85]을 둘 다 FseI 및 AscI로 절단하였다. 결찰을 수행하여 플라스미드 pMTL83245를 생성시켰다.
생성된 플라스미드 pMTL 83245(서열 번호 4) 및 말로닐-조효소 A 환원효소 유전자의 3660bp의 코돈 최적화 생성물을 둘 다 NdeI 및 EcoRI로 절단하였다. 결찰을 수행하고, 결찰 생성물을 이후 이. 콜라이 XL1-블루 MRF' Kan으로 형질전환시켜 플라스미드 pMTL83245-SDR(서열 번호 5)을 생성시켰다. 올리고뉴클레오타이드(표 5에 기재됨)를 사용한 DNA 서열분석은 돌연변이 없이 말로닐-조효소 A 환원효소 유전자의 성공적인 클로닝을 확인시켜준다.
표 5: 성공적인 SDR 클로닝의 확인에 사용된 프라이머

효소 활성의 결정
플라스미드 pMTL 83245-SDR을 포함하는 재조합 균주를 호기성 조건 하에 밤새 적절한 항생제를 포함하는 LB 배지 중에 성장시켰다. 세포를 0.1의 초기 OD600으로 새로운 LB 배지에 접종하였다. 세포를 대수기(OD600 약 0.6)에서 수확하고, 10분 동안 13,000×g 및 4℃에서 원심분리하였다. 세포 펠렛을 100mM 트리스ㆍHCl(pH 7.8)로 2회 세척하고, 프로테아제 저해제를 포함하는 동일한 세척 완충제 중에 재현탁하고 1.44g의 100㎛ 유리 비드와 혼합하였다. 사이클 사이의 5,000rpm에서의 1분 휘젓기, 이어서 얼음에서의 1분의 5회 사이클을 통한 미니 비드 비터(Mini Bead Beater)(Biospec Products)에서의 붕괴 전에 관을 5분 동안 얼음에서 냉각시켰다. 용해 후, 샘플을 원심분리하고(10분 동안 13,000×g, 4℃), 상청액을 분취하고, 분석까지 -80℃에서 저장하였다. 추출물의 단백질 함량을 상업용 키트(피어스(Pierce)^® 마이크로플레이트 BCA 단백질 검정 키트 - 환원제 상용성, Thermo Scientific)를 사용하여 결정하였다.
말로닐-CoA 환원효소 활성을 휴글러(Hugler) 등이 보고한 방법(Hugler, M., Menendez, C., Schagger, H., Fuchs, G., 2002. Malonyl-coenzyme A reductase from Chloroflexus aurantiacus, a key enzyme of the 3-hydroxypropionate cycle for autotrophic CO2 fixation. J. Bacteriol. 184 (9), 2404-2410)을 이용하여 45℃에서 결정하였다. 일상적인 검정을 위해, 효소 용해물을 3mM 1,4-디티오에리트리톨, 2mM MgCl₂ 및 0.3mM NADPH를 포함하는 100mM 트리스ㆍHCl 완충제(pH 7.8) 중에서 10분 동안 45℃에서 예비 항온처리하였다. 0.3mM 말로닐-CoA를 첨가하여 반응을 개시하였다. 소모된 NADPH의 양을 3400M^-1㎝^-1의 몰 소거 계수(Δ_ε365)를 사용하여 결정하였다. SDR 활성의 1단위는 분당 2μmol의 NADPH를 NADP⁺로 산화시키는 데 필요한 효소의 양으로 정의된다. SDR의 활성에 대한 온도의 효과를 연구하기 위해, 37℃에서 검정을 또한 수행하였다.
C. 아우라니티아쿠스로부터의 말로닐 -조효소 A 환원효소를 갖는 발현 플라스미드의 메틸화
3-HP 발현 플라스미드 pMTL83245-SDR의 메틸화를 C. 아우토에타노제늄, C. 라그스달레이 및 C. 리융다홀리로부터의 메틸트랜스퍼라제 유전자로부터 설계된 합성된 하이브리드 II형 메틸트랜스퍼라제 유전자(서열 번호 6)를 사용하여 이. 콜라이에서 생체내 수행하였다. 메틸트랜스퍼라제(서열 번호 6)를 합성하고 벡터 pGS20(ATG:biosynthetics GmbH(독일 메츠하우젠))(서열 번호 7)에서 유도성 lac 프로모터와 융합하였다.
발현 플라스미드 및 메틸화 플라스미드 둘 다를 제한 네가티브 이. 콜라이 XL1-블루 MRF' Kan의 동일한 세포로 형절전환시키고, 이는 이의 상용성 그람-(-) 복제 기원으로 가능하다(발현 플라스미드에서의 고카피의 ColE1 및 메틸화 플라스미드에서의 저카피의 p15A). 생체내 메틸화를 1mM의 IPTG를 첨가하여 유도하고, 메틸화 플라스미드를 퀴아젠 플라스미드 미디 키트(QIAGEN Plasmid Midi Kit)(QIAGEN GmbH(독일 힐든))를 사용하여 단리하였다. 생성된 혼합물을 C. 아우토에타노제늄 DSM23693과 형질전환 실험에 사용하지만, 그람-(+) 복제 기원(repH)을 갖는 풍부한(고카피) 발현 플라스미드만이 클로스트리디아를 복제할 수 있다.
C. 아우토에타노제늄에서의 메틸화 3- HP 발현 플라스미드의 형질전환
C. 아우토에타노제늄 DSM23693의 경쟁적 세포를 만들기 위해, 50㎖의 배양물(제강소 가스 및 탄소원으로서의 프럭토스를 갖는 PETC 배지(표 1); 37℃)을 연속 3일 동안 새로운 배지로 계대 배양하였다. 이 세포를 사용하여 0.05의 OD600nm에서 40mM DL-트레오닌을 포함하는 50㎖의 PETC 배지를 접종하였다. 배양물이 0.45의 OD600nm에 도달할 때, 세포를 무산소성 챔버로 옮기고 4,700×g 및 4℃에서 수확하였다. 배양물을 얼음의 차가운 전기영동 완충제(270mM 수크로스, 1mM MgCl₂, 7mM 인산나트륨, pH 7.4)으로 2회 세척하고, 마지막으로 600㎕의 새로운 전기영동 완충제의 용적 중에 현탁시켰다. 이 혼합물을 약 10㎍의 메틸화 플라스미드 혼합물을 포함하는 0.4㎝ 전극 갭을 갖는 예비 냉각된 전기영동 큐벳에 옮겼다. 추가의 I형 제한 시스템이 C. 아우토에타노제늄과 비교하여 C. 리융다홀리의 게놈에서 확인되므로, 1㎕의 I형 제한 저해제(EPICENTRE Biotechnologies(미국 위스콘신주 53713 메디슨))를 플라스미드 혼합물에 첨가하였다. 세포를 플라스미드 및 제한 저해제와 혼합하고, 하기 설정으로 유전자 펄서 X세포 전기영동 시스템(Gene pulser Xcell electroporation system)(Bio-Rad Labratories(미국 캘리포니아주 94547 헤르큘레스))을 사용하여 즉시 펄스 처리하였다: 2.5kV, 600Ω 및 25μF. 시상수는 3.7 내지 5.1ms이다. 재생을 위해, 배양물을 5㎖의 PETC-MES 배지(표 1)에 옮기고, 이는 세포의 회수를 증가시켰다. 배양물을 관 홀더가 구비된 스펙트로닉 헬리오스 엡실론 분광광도계(Spectronic Helios Epsilon Spectrophotometer)(Thermo Fisher Scientific Inc.(미국 마이애미주 02454 왈탐))를 사용하여 600nm의 파장에서 모니터링하였다. 성장이 관찰되면(1배가), 배양물을 각각의 5㎍/㎖의 클라리쓰로마이신 및 유일한 탄소원으로서 두부 간격에서의 30psi 제강소 가스를 포함하는 10㎖ 및 차후 50㎖의 PETC-MES 배지로 규모 확대시켰다.
대사물질의 분석
35℃에서 조작되는 RID(굴절률 검출기) 및 35℃에서 유지되는 아미넥스(Aminex) HPX-87H 컬럼(300 x 7.8mm, 입자 크기 5㎛)이 구비된 애질런트(Agilent) 1100 시리즈 HPLC 시스템을 사용하여 3-하이드록시프로피오네이트(3-HP) 및 다른 대사물질의 HPLC 분석을 수행하였다. 0.6㎖/분의 유속으로 이동상으로서 약간 산성의 물(0.005M H₂SO₄)을 사용하였다. 단백질 및 다른 세포 잔류물을 제거하기 위해, 400㎕의 샘플을 1M 황산 중의 100㎕의 1%(w/v) 5-설포살리실산과 혼합하고 3분 동안 14,000rpm에서 원심분리하여 침전된 잔류물을 분리시켰다. 이후, 10㎕의 상청액을 분석을 위해 HPLC에 주입하였다.
결과
형질전환된 세포에서의 3- HP 의 생성
C. 아우토에타노제늄에서의 C. 아우라니티아쿠스 경로 유전자를 갖는 CO 및 CO ₂ /H ₂ 로부터의 3- HP 생성:
고무 스톱퍼에서의 50㎖의 PETC-MES 배지(표 1; 프럭토스 무) 중의 혈청 중의 플라스미드 pMTL83245-SDR 및 유일한 에너지 및 탄소원으로서의 두부 간격에서의 30psi 제강소 가스(New Zealand Steel site(뉴질랜드 글렌브룩)로부터 수집; 조성물: 44% CO, 32% N₂, 22% CO₂, 2% H₂)를 운반하는 형질전환된 C. 아우토에타노제늄 DSM23693으로서 성장 실험을 수행하였다. HPLC 분석을 이용하여 3-HP 생성을 확인하였다.
실시예 2
바이오틴 생합성의 증가를 통한 3- HP 생성의 개선
아세틸-CoA 카복실라제(ACC)에 의한 아세틸-CoA로의 CO₂의 고정을 바이오틴(비타민 B7, 비타민 H)에 의해 중재하였다. 이 카복실화 반응에 대한 보조인자로서 바이오틴이 필요하다.
아세틸-CoA 카복실라제는 AccA, AccB, AccC 및 AccD의 4개의 상이한 아단위로 이루어진 복합체이고, 바이오틴은 아단위 AccB에 공유 결합된다. 바이오틴의 카복실화는 ATP을 훼손하면서 아단위 AccC에 의해 촉매화된다. AccA 및 AccD에 의한 카복실화 바이오틴으로부터의 아세틸-CoA로의 CO₂의 후속 전달은 말로닐-CoA를 형성시킨다. 아세틸-CoA 카복실라제 복합체의 활성화의 제1 단계에서, AccB로의 바이오틴의 결합은 바이오틴-[아세틸-CoA 카복실라제] 리가제(전효소 합성효소)에 의해 촉매화된다.
일산화탄소영양 아세토젠에서의 CO₂ 고정 및 아세틸-CoA 카복실라제를 통한 3-HP 생성을 개선하기 위해, 바이오틴 보조인자의 풀(pool)은 이 보조인자의 생합성 경로에 관여하는 유전자의 과발현에 의해 증가할 수 있다. 바이오틴 생합성은 효소 6-카복시헥사노에이트--CoA 리가제[EC:6.2.1.14], 8-아미노-7-옥소노나노에이트 신타제[EC:2.3.1.47], 아데노실메티오닌-8-아미노-7-옥소노나노에이트 아미노트랜스퍼라제[EC:2.6.1.62], 바이오틴 합성효소[EC:2.8.1.6], 바이오틴-[아세틸-CoA-카복실라제] 리가제[EC:6.3.4.15], 바이오티니다제[EC:3.5.1.12], 바이오틴--단백질 리가제[EC:6.3.4.15; EC:6.3.4.11; EC:6.3.4.10; EC:6.3.4.9], 에티오바이오틴 합성효소[EC:6.3.3.3], III형 판토테네이트 키나제[EC:2.7.1.33]를 포함한다.
실시예 3
지방산 생합성의 제한을 통한 3- HP 생성의 개선
말로닐-CoA는 또한 지방산 생합성을 위한 전구체이다. 3-HP 생성을 증가시키기 위해, 지방산 생합성의 속도는 3-HP 생성을 선호하여 제한될 수 있다. A 말로닐-CoA:아실 운반 단백질 트랜스아실라제(FabD)[EC:2.3.1.39]는 지방산 사슬의 연장을 개시시킨다. 이 효소를 코딩하는 유전자는 하향조절되거나, 이 효소의 활성은 감소하여 말로닐-CoA가 네이티브 지방산 생합성에 사용되는 것을 방지한다.
본 발명은 부당한 실험 없이 독자가 본 발명을 실행할 수 있도록 특정한 바람직한 구현예를 참조하여 본 명세서에 기재되어 있다. 그러나, 당해 분야의 당업자는 많은 성분 및 매개변수가 본 발명의 범위를 벗어남이 없이 특정한 정도로 변하거나 변형될 수 있거나, 공지된 등가물에 치환될 수 있다는 것을 용이하게 인식할 것이다. 이러한 변형 및 등가물은 개별적으로 기재된 것처럼 본 명세서에 포함된 것으로 이해되어야 한다. 제목, 표제 등은 본 문헌의 독자의 이해를 향상시키도록 제공되고 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 이해되지 않아야 한다.
상기 및 임의의 경우 하기에 인용된 모든 출원, 특허 및 공보의 전체 개시내용은 참조문헌으로 본 명세서에 포함된다. 그러나, 본 명세서에서의 임의의 출원, 특허 및 공보에 대한 언급은 이것이 유효한 선행 기술을 구성하거나 세계의 임의의 나라에서의 보통의 일반 지식의 일부를 구성한다는 제시의 임의의 형태 또는 지식이 아니고, 이렇게 취해져서는 안 된다.
본 명세서 및 하기 임의의 청구항에 걸쳐, 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함한다", "포함하는" 등은 배타적 의미에 반대인 포괄적 의미로, 즉 "포함하지만, 이들로 제한되지는 않는"의 의미로 해석되어야 한다.

SEQUENCE LISTING <110> LANZATECH NEW ZEALAND LIMITED <120> RECOMBINANT MICROORGANISMS AND USES THEREFOR <130> LT78 <160> 26 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3660 <212> DNA <213> Cloroflexus auranticus <400> 1 atgtcaggaa caggtagatt agctggaaaa attgcattaa ttacaggtgg tgctggtaat 60 ataggatcag aattaactag aagatttctt gctgaaggtg caactgttat tatatcaggt 120 agaaatagag caaaacttac tgcattagca gagagaatgc aagcagaagc aggtgttcca 180 gcaaaaagaa ttgatcttga agtaatggat ggttcagatc ctgttgcagt tagagctgga 240 atagaagcta ttgttgctag acatggacag atagatatat tagttaataa tgctggaagt 300 gctggtgcac agagaagatt agctgaaatt ccacttactg aagcagaatt aggaccaggt 360 gcagaagaga ctcttcatgc ttctatagct aatttattag gtatgggttg gcatttaatg 420 agaatagctg caccacacat gcctgttgga agtgcagtaa taaatgtttc aactatattt 480 tcaagagctg aatattatgg tagaatacct tacgtaacac ctaaagctgc acttaatgca 540 ctttctcaat tagcagcaag agaacttggt gctagaggta taagagtaaa cacaatattt 600 cctggaccaa tagagtcaga tagaattaga acagtatttc agagaatgga tcaacttaaa 660 ggaagacctg 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tctgattaaa ccgtggatta aaagcagcca tatccgtaag aatgaagtta 1560 ttaagggcga aaaattcatc atctatagca acctgattga gaatgaaacc gagtgtccga 1620 atgcgattaa atatatcgaa cagtacaaga aacgtctgat ggagcgccgc gaatgcaaaa 1680 agggcacgcg taagtggtat gaactgcaat ggggccgtaa accggaaatc ttcgaagaaa 1740 agaaaattgt tttcccgtat aaaagctgtg acaatcgttt tgcactggat aagggtagct 1800 attttagcgc agacatttat agcctggttc tgaagaaaaa tgtgccgttc acctatgaga 1860 tcctgctgaa tatcctgaat agcccgctgt acgagtttta ctttaagacc ttcgcgaaaa 1920 agctgggcga gaatctgtac gagtactatc cgaacaacct gatgaagctg tgcatcccga 1980 gcatcgattt cggcggtgag aacaatattg agaaaaagct gtatgatttc tttggtctga 2040 cggataaaga aattgagatt gtggagaaga tcaaagataa ctgctaagaa ttcgatatca 2100 cccgggaact agtctgcagc cctttagtga gggttaattg gagtcactaa gggttagtta 2160 gttagattag cagaaagtca aaagcctccg accggaggct tttgactaaa acttcccttg 2220 gggttatcat tggggctcac tcaaaggcgg taatcagata aaaaaaatcc ttagctttcg 2280 ctaaggatga tttctgctag agatggaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga 2340 ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt 2400 gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc 2460 gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct 2520 gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata 2580 ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt 2640 gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc 2700 ttaataagat gatcttcttg agatcgtttt ggtctgcgcg taatctcttg ctctgaaaac 2760 gaaaaaaccg ccttgcaggg cggtttttcg aaggttctct gagctaccaa ctctttgaac 2820 cgaggtaact ggcttggagg agcgcagtca ccaaaacttg tcctttcagt ttagccttaa 2880 ccggcgcatg acttcaagac taactcctct aaatcaatta ccagtggctg ctgccagtgg 2940 tgcttttgca tgtctttccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg 3000 gtcggactga acggggggtt cgtgcataca gtccagcttg gagcgaactg cctacccgga 3060 actgagtgtc aggcgtggaa tgagacaaac gcggccataa cagcggaatg acaccggtaa 3120 accgaaaggc aggaacagga gagcgcacga gggagccgcc aggggaaacg cctggtatct 3180 ttatagtcct gtcgggtttc gccaccactg atttgagcgt cagatttcgt gatgcttgtc 3240 aggggggcgg agcctatgga aaaacggctt tgccgcggcc ctctcacttc cctgttaagt 3300 atcttcctgg catcttccag gaaatctccg ccccgttcgt aagccatttc cgctcgccgc 3360 agtcgaacga ccgagcgtag cgagtcagtg agcgaggaag cggaatatat cctgtatcac 3420 atattctgct gacgcaccgg tgcagccttt tttctcctgc cacatgaagc acttcactga 3480 caccctcatc agtgccaaca tagtaagcca gtatacactc cgctagcgct gaggtctgcc 3540 tcgtgaagaa ggtgttgctg actcatacca ggcctgaatc gccccatcat ccagccagaa 3600 agtgagggag ccacggttga tgagagcttt gttgtaggtg gaccagttgg tgattttgaa 3660 cttttgcttt gccacggaac ggtctgcgtt gtcgggaaga tgcgtgatct gatccttcaa 3720 ctcagcaaaa gttcgattta ttcaacaaag ccacgttgtg tctcaaaatc tctgatgtta 3780 cattgcacaa gataaaaata tatcatcatg aacaataaaa ctgtctgctt acataaacag 3840 taatacaagg ggtgtttact agaggttgat cgggcacgta agaggttcca actttcacca 3900 taatgaaata agatcactac cgggcgtatt ttttgagtta tcgagatttt caggagctaa 3960 ggaagctaaa atggagaaaa aaatcacggg atataccacc gttgatatat cccaatggca 4020 tcgtaaagaa cattttgagg catttcagtc agttgctcaa tgtacctata accagaccgt 4080 tcagctggat attacggcct ttttaaagac cgtaaagaaa aataagcaca agttttatcc 4140 ggcctttatt cacattcttg cccgcctgat gaacgctcac ccggagtttc gtatggccat 4200 gaaagacggt gagctggtga tctgggatag tgttcaccct tgttacaccg ttttccatga 4260 gcaaactgaa acgttttcgt ccctctggag tgaataccac gacgatttcc ggcagtttct 4320 ccacatatat tcgcaagatg tggcgtgtta cggtgaaaac ctggcctatt tccctaaagg 4380 gtttattgag aatatgtttt ttgtctcagc caatccctgg gtgagtttca ccagttttga 4440 tttaaacgtg gccaatatgg acaacttctt cgcccccgtt ttcacgatgg gcaaatatta 4500 tacgcaaggc gacaaggtgc tgatgccgct ggcgatccag gttcatcatg ccgtttgtga 4560 tggcttccat gtcggccgca tgcttaatga attacaacag tactgtgatg agtggcaggg 4620 cggggcgtaa taatactagc tccggcaaaa aaacgggcaa ggtgtcacca ccctgccctt 4680 tttctttaaa accgaaaaga ttacttcgc 4709 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide Ppta-ack-NotI-F <400> 8 gagcggccgc aatatgatat ttatgtcc 28 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide Ppta-ack-NdeI-R <400> 9 ttccatatgt ttcatgttca tttcctcc 28 <210> 10 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide M13R <400> 10 caggaaacag ctatgac 17 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide SDR_seqR1 <400> 11 agcagcttct atctgatcac ctgc 24 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide SDR_seqR2 <400> 12 tgctctaatg ctgctacgtc atttg 25 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide SDR_seqR3 <400> 13 tgcaagttca ctctgaatca ttgc 24 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide SDR_seqR4 <400> 14 acatggtgct ggttcatgac tag 23 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide SDR_seqR5 <400> 15 tctagcacca agttctcttg ctg 23 <210> 16 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide M13 (-21) <400> 16 tgtaaaacga cggccag 17 <210> 17 <211> 419 <212> DNA <213> Clostridium autoethanogenum <400> 17 agaaattttc ctttctaaaa tattttattc catgtcaaga actctgttta tttcattaaa 60 gaactataag tacaaagtat aaggcatttg aaaaaatagg ctagtatatt gattgattat 120 ttattttaaa atgcctaagt gaaatatata catattataa caataaaata agtattagtg 180 taggattttt aaatagagta tctattttca gattaaattt ttgattattt gatttacatt 240 atataatatt gagtaaagta ttgactagca aaattttttg atactttaat ttgtgaaatt 300 tcttatcaaa agttatattt ttgaataatt tttattgaaa aatacaacta aaaaggatta 360 tagtataagt gtgtgtaatt ttgtgttaaa tttaaaggga ggaaatgaac atgaaattg 419 <210> 18 <211> 864 <212> DNA <213> Clostridium autoethanogenum <400> 18 atgaaaggaa gctcttatat ggaaaaatta gaaaaggttc aaaaaatttt taataaaaaa 60 tttgagagta aaagtgcgtg ggatagggtt actttagcta gaatgataga aaggccaact 120 tcacttgatt atataaatag aatatttgac tcttttatgg agcttcatgg agatagatat 180 tttaatgacg atccttctgt agtaggaggc attggattgt taaatggtga gcctgtaacc 240 attgtggccc agcaaaaagg taggaataca caggagaata taaagagaaa ttttggtatg 300 ccggagcctg acggatatag aaaaggatta agactcatga agcaggcaga taaatttgat 360 aggcctatta tatgttttgt ggatacacct ggagcttttt gcggcatgga agcagaggaa 420 agaggacagg gagaggcaat agccaaaaat ctgatggaga tgtttaattt aagagtacct 480 ataatatcta taatagttgg agaaggtgga agcggaggtg ctcttgcttt tgctgtagcg 540 gattcagttt ggatgctgga gaattctata tattctattt taaccccaga aggttttgca 600 ggtatactat ggaaagatgc ttccaaagct aaggaagcag ctgagattat gaaaattaca 660 gctcaagatt taaaaaaata cggtataata gataagatat taaaggaacc tgcaggaggg 720 gcacaaaagg atgtagataa aatgtcctgc accataaaag aagaacttat agaaaaaata 780 ggcatactta ggaaaaggtc taaagaggaa ttacttgaac aaagatacaa taaatttaga 840 aaaatgggta agtttatgga atag 864 <210> 19 <211> 287 <212> PRT <213> Clostridium autoethanogenum <400> 19 Met Lys Gly Ser Ser Tyr Met Glu Lys Leu Glu Lys Val Gln Lys Ile 1 5 10 15 Phe Asn Lys Lys Phe Glu Ser Lys Ser Ala Trp Asp Arg Val Thr Leu 20 25 30 Ala Arg Met Ile Glu Arg Pro Thr Ser Leu Asp Tyr Ile Asn Arg Ile 35 40 45 Phe Asp Ser Phe Met Glu Leu His Gly Asp Arg Tyr Phe Asn Asp Asp 50 55 60 Pro Ser Val Val Gly Gly Ile Gly Leu Leu Asn Gly Glu Pro Val Thr 65 70 75 80 Ile Val Ala Gln Gln Lys Gly Arg Asn Thr Gln Glu Asn Ile Lys Arg 85 90 95 Asn Phe Gly Met Pro Glu Pro Asp Gly Tyr Arg Lys Gly Leu Arg Leu 100 105 110 Met Lys Gln Ala Asp Lys Phe Asp Arg Pro Ile Ile Cys Phe Val Asp 115 120 125 Thr Pro Gly Ala Phe Cys Gly Met Glu Ala Glu Glu Arg Gly Gln Gly 130 135 140 Glu Ala Ile Ala Lys Asn Leu Met Glu Met Phe Asn Leu Arg Val Pro 145 150 155 160 Ile Ile Ser Ile Ile Val Gly Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ala Leu Ala 165 170 175 Phe Ala Val Ala Asp Ser Val Trp Met Leu Glu Asn Ser Ile Tyr Ser 180 185 190 Ile Leu Thr Pro Glu Gly Phe Ala Gly Ile Leu Trp Lys Asp Ala Ser 195 200 205 Lys Ala Lys Glu Ala Ala Glu Ile Met Lys Ile Thr Ala Gln Asp Leu 210 215 220 Lys Lys Tyr Gly Ile Ile Asp Lys Ile Leu Lys Glu Pro Ala Gly Gly 225 230 235 240 Ala Gln Lys Asp Val Asp Lys Met Ser Cys Thr Ile Lys Glu Glu Leu 245 250 255 Ile Glu Lys Ile Gly Ile Leu Arg Lys Arg Ser Lys Glu Glu Leu Leu 260 265 270 Glu Gln Arg Tyr Asn Lys Phe Arg Lys Met Gly Lys Phe Met Glu 275 280 285 <210> 20 <211> 876 <212> DNA <213> Clostridium autoethanogenum <400> 20 ttgttaaata aattctttaa aaaaacaaaa tatattacag ttagtcagag ggctttaaat 60 aatatccatg aagatttaga ttcaaagcca agtataccaa atggaatgtg ggtaaaatgt 120 gatggatgtg gtaaggtact atataagcag gatctagaaa aaaataatag ggtatgccag 180 tattgcaagc atcattttag gatgaatgct aaagaaagaa tagatcttat aacagataag 240 gatagctttt gccaatttga tgaaaacatg acgtctacta atcctatagg atttaaagga 300 tatgaagata aaatcagcaa tatgcagaaa aagactaacc tcaaagaagc tgtaattaca 360 ggaaagggta ctataggagg agagtctgca gtaatttgtg ttatggatag taattttatg 420 atgggaagca tgggttccgt ggtaggagag aaaattacta gagctgtaga aaaagctatt 480 gagttaaaaa tacctctaat tatttttaca gcttctggag gcgctagaat gcaggagggt 540 attttttcat taatgcaaat ggcaaagata agtggagcta taaacaggtt gaatgatgca 600 ggacttttat atatatcggt tcttacagat cctactactg gtggagttac agcaagtttt 660 gctatgcttg gtgatataat tttagcagaa cctggagcac ttgttggatt tgcaggaaag 720 agagtaatag agcagaccat aaagcaaaaa cttcccgatg gatttcaaag tgcagaattt 780 ctattaaaac atggatttgt agatagtata gtttcaaggg aaaatttaaa gagtaccttg 840 aagaagatat tgtatattca taataggaat aggtaa 876 <210> 21 <211> 291 <212> PRT <213> Clostridium autoethanogenum <400> 21 Met Leu Asn Lys Phe Phe Lys Lys Thr Lys Tyr Ile Thr Val Ser Gln 1 5 10 15 Arg Ala Leu Asn Asn Ile His Glu Asp Leu Asp Ser Lys Pro Ser Ile 20 25 30 Pro Asn Gly Met Trp Val Lys Cys Asp Gly Cys Gly Lys Val Leu Tyr 35 40 45 Lys Gln Asp Leu Glu Lys Asn Asn Arg Val Cys Gln Tyr Cys Lys His 50 55 60 His Phe Arg Met Asn Ala Lys Glu Arg Ile Asp Leu Ile Thr Asp Lys 65 70 75 80 Asp Ser Phe Cys Gln Phe Asp Glu Asn Met Thr Ser Thr Asn Pro Ile 85 90 95 Gly Phe Lys Gly Tyr Glu Asp Lys Ile Ser Asn Met Gln Lys Lys Thr 100 105 110 Asn Leu Lys Glu Ala Val Ile Thr Gly Lys Gly Thr Ile Gly Gly Glu 115 120 125 Ser Ala Val Ile Cys Val Met Asp Ser Asn Phe Met Met Gly Ser Met 130 135 140 Gly Ser Val Val Gly Glu Lys Ile Thr Arg Ala Val Glu Lys Ala Ile 145 150 155 160 Glu Leu Lys Ile Pro Leu Ile Ile Phe Thr Ala Ser Gly Gly Ala Arg 165 170 175 Met Gln Glu Gly Ile Phe Ser Leu Met Gln Met Ala Lys Ile Ser Gly 180 185 190 Ala Ile Asn Arg Leu Asn Asp Ala Gly Leu Leu Tyr Ile Ser Val Leu 195 200 205 Thr Asp Pro Thr Thr Gly Gly Val Thr Ala Ser Phe Ala Met Leu Gly 210 215 220 Asp Ile Ile Leu Ala Glu Pro Gly Ala Leu Val Gly Phe Ala Gly Lys 225 230 235 240 Arg Val Ile Glu Gln Thr Ile Lys Gln Lys Leu Pro Asp Gly Phe Gln 245 250 255 Ser Ala Glu Phe Leu Leu Lys His Gly Phe Val Asp Ser Ile Val Ser 260 265 270 Arg Glu Asn Leu Lys Ser Thr Leu Lys Lys Ile Leu Tyr Ile His Asn 275 280 285 Arg Asn Arg 290 <210> 22 <211> 1344 <212> DNA <213> Clostridium autoethanogenum <400> 22 gtgtttaata agattttgat tgccaataga ggagaaatag cagttaggat aattagagct 60 tgcagggaaa tgggaataga aactgtagca gtgtattcag aagcagatag ggatgcactt 120 catactcaga tggcggatga agccatatgt ataggaccgg catctcctaa agaaagttat 180 ttaaacgtac aaaatataat aagtgccaca gttttatcag gagcgcaagc tattcatcct 240 ggatttggtt ttttatctga aaacagtaag tttgcaagta tatgtaaaca gtgtaatatt 300 acttttatag gccctactcc ggaatgtatt gacaatatgg gcaataagtc taatgctaga 360 gatataatgg gaaaggcagg agttcctatc gttccagggt cagatggtgc tataaaaaca 420 aatgaagaac ttttggaaac tgcaagaaaa ataggatatc ctgttatgat aaaagcctct 480 gcaggcggtg gtggacgtgg tataagagtc gtatatgatg aatctgagat tataaaaaat 540 tatgaaaatg ctaaagctga agctagtgca gcctttggag atgacactat atacttagaa 600 aagtttatag aaagaccaaa gcatgtagaa attcagatac ttggagataa ttttgaaaat 660 gtagtttatc tgggggaaag agactgttcc atgcagagaa gaaatcaaaa agtaatggaa 720 gaagcaccta gcaaggtagt tacggaagaa cttagaaaat ccatgggaga aacagctgta 780 agggcagcca aggctgtaca ttataataat gctggaactg tagaatttct tttagacaaa 840 aataataatt actatttcat ggagatgaat actcgtattc aagtagaaca tgctataaca 900 gaaatggtaa caggtataga tcttgtaaaa gaacagataa aaattgcagc aggagaaaag 960 ttagattttt ctcaagagga tgttaagata accggtcatt ctatagaatg cagaataaat 1020 gcagaagatg taaaaagagg ttttatgcct tctccaggaa agataaaaga cttatatgta 1080 cctggaggtt ttaatgtaag agtagatagt gcagtgtact cgggatataa tattcctccc 1140 tattatgatt ctatgatagc aaagctcatt gtatatggaa aagataggga tgaggctata 1200 tgcagaatga ggagagcctt gggagagttt attatagaag gggttagtac caatatagac 1260 ttccaatttg aactcataga tagtaaggaa tttatagaag gaacttatga tacaaagttt 1320 atagaaaata atttcaagta ttaa 1344 <210> 23 <211> 447 <212> PRT <213> Clostridium autoethanogenum <400> 23 Met Phe Asn Lys Ile Leu Ile Ala Asn Arg Gly Glu Ile Ala Val Arg 1 5 10 15 Ile Ile Arg Ala Cys Arg Glu Met Gly Ile Glu Thr Val Ala Val Tyr 20 25 30 Ser Glu Ala Asp Arg Asp Ala Leu His Thr Gln Met Ala Asp Glu Ala 35 40 45 Ile Cys Ile Gly Pro Ala Ser Pro Lys Glu Ser Tyr Leu Asn Val Gln 50 55 60 Asn Ile Ile Ser Ala Thr Val Leu Ser Gly Ala Gln Ala Ile His Pro 65 70 75 80 Gly Phe Gly Phe Leu Ser Glu Asn Ser Lys Phe Ala Ser Ile Cys Lys 85 90 95 Gln Cys Asn Ile Thr Phe Ile Gly Pro Thr Pro Glu Cys Ile Asp Asn 100 105 110 Met Gly Asn Lys Ser Asn Ala Arg Asp Ile Met Gly Lys Ala Gly Val 115 120 125 Pro Ile Val Pro Gly Ser Asp Gly Ala Ile Lys Thr Asn Glu Glu Leu 130 135 140 Leu Glu Thr Ala Arg Lys Ile Gly Tyr Pro Val Met Ile Lys Ala Ser 145 150 155 160 Ala Gly Gly Gly Gly Arg Gly Ile Arg Val Val Tyr Asp Glu Ser Glu 165 170 175 Ile Ile Lys Asn Tyr Glu Asn Ala Lys Ala Glu Ala Ser Ala Ala Phe 180 185 190 Gly Asp Asp Thr Ile Tyr Leu Glu Lys Phe Ile Glu Arg Pro Lys His 195 200 205 Val Glu Ile Gln Ile Leu Gly Asp Asn Phe Glu Asn Val Val Tyr Leu 210 215 220 Gly Glu Arg Asp Cys Ser Met Gln Arg Arg Asn Gln Lys Val Met Glu 225 230 235 240 Glu Ala Pro Ser Lys Val Val Thr Glu Glu Leu Arg Lys Ser Met Gly 245 250 255 Glu Thr Ala Val Arg Ala Ala Lys Ala Val His Tyr Asn Asn Ala Gly 260 265 270 Thr Val Glu Phe Leu Leu Asp Lys Asn Asn Asn Tyr Tyr Phe Met Glu 275 280 285 Met Asn Thr Arg Ile Gln Val Glu His Ala Ile Thr Glu Met Val Thr 290 295 300 Gly Ile Asp Leu Val Lys Glu Gln Ile Lys Ile Ala Ala Gly Glu Lys 305 310 315 320 Leu Asp Phe Ser Gln Glu Asp Val Lys Ile Thr Gly His Ser Ile Glu 325 330 335 Cys Arg Ile Asn Ala Glu Asp Val Lys Arg Gly Phe Met Pro Ser Pro 340 345 350 Gly Lys Ile Lys Asp Leu Tyr Val Pro Gly Gly Phe Asn Val Arg Val 355 360 365 Asp Ser Ala Val Tyr Ser Gly Tyr Asn Ile Pro Pro Tyr Tyr Asp Ser 370 375 380 Met Ile Ala Lys Leu Ile Val Tyr Gly Lys Asp Arg Asp Glu Ala Ile 385 390 395 400 Cys Arg Met Arg Arg Ala Leu Gly Glu Phe Ile Ile Glu Gly Val Ser 405 410 415 Thr Asn Ile Asp Phe Gln Phe Glu Leu Ile Asp Ser Lys Glu Phe Ile 420 425 430 Glu Gly Thr Tyr Asp Thr Lys Phe Ile Glu Asn Asn Phe Lys Tyr 435 440 445 <210> 24 <211> 513 <212> DNA <213> Clostridium autoethanogenum <400> 24 atggacttta aagcaattga gaatatgata aaaactatgg ataattcaaa gcttggatat 60 ttagaagtta attgggataa cgtatctata attatgaaaa agcagggtga agaaggaaat 120 ataaaacagg taaacatagt aaaaggaaat ggagaaaatg taaaacctgt ctttgaaaaa 180 caaagtgaca aaattgaagc aaaagaagat aatatagata aggtaaaaaa agttgaagaa 240 aaaaaagatg atgatataga ggacagcaat ataaaagaag taaagtcacc tatagtaggt 300 actttttaca attcatcagg acctgaaaaa cctgtttttg taaatgtagg atctaaggta 360 aaaaaaggag acactctgtg tataatagaa gctatgaaac ttatgaatga gattcaaagc 420 gaggtagatg gagaagtagt ggatatttta gttaagaatg aacagatggt agagtatggc 480 cagccgctat ttaaaataaa aactgaatct taa 513 <210> 25 <211> 170 <212> PRT <213> Clostridium autoethanogenum <400> 25 Met Asp Phe Lys Ala Ile Glu Asn Met Ile Lys Thr Met Asp Asn Ser 1 5 10 15 Lys Leu Gly Tyr Leu Glu Val Asn Trp Asp Asn Val Ser Ile Ile Met 20 25 30 Lys Lys Gln Gly Glu Glu Gly Asn Ile Lys Gln Val Asn Ile Val Lys 35 40 45 Gly Asn Gly Glu Asn Val Lys Pro Val Phe Glu Lys Gln Ser Asp Lys 50 55 60 Ile Glu Ala Lys Glu Asp Asn Ile Asp Lys Val Lys Lys Val Glu Glu 65 70 75 80 Lys Lys Asp Asp Asp Ile Glu Asp Ser Asn Ile Lys Glu Val Lys Ser 85 90 95 Pro Ile Val Gly Thr Phe Tyr Asn Ser Ser Gly Pro Glu Lys Pro Val 100 105 110 Phe Val Asn Val Gly Ser Lys Val Lys Lys Gly Asp Thr Leu Cys Ile 115 120 125 Ile Glu Ala Met Lys Leu Met Asn Glu Ile Gln Ser Glu Val Asp Gly 130 135 140 Glu Val Val Asp Ile Leu Val Lys Asn Glu Gln Met Val Glu Tyr Gly 145 150 155 160 Gln Pro Leu Phe Lys Ile Lys Thr Glu Ser 165 170 <210> 26 <211> 1806 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> designed Type II methyltransferase <400> 26 atgtttccgt gcaatgccta tatcgaatat ggtgataaaa atatgaacag ctttatcgaa 60 gatgtggaac agatctacaa cttcattaaa aagaacattg atgtggaaga aaagatgcat 120 ttcattgaaa cctataaaca gaaaagcaac atgaagaaag agattagctt tagcgaagaa 180 tactataaac agaagattat gaacggcaaa aatggcgttg tgtacacccc gccggaaatg 240 gcggccttta tggttaaaaa tctgatcaac gttaacgatg ttattggcaa tccgtttatt 300 aaaatcattg acccgagctg cggtagcggc aatctgattt gcaaatgttt tctgtatctg 360 aatcgcatct ttattaagaa cattgaggtg attaacagca aaaataacct gaatctgaaa 420 ctggaagaca tcagctacca catcgttcgc aacaatctgt ttggcttcga tattgacgaa 480 accgcgatca aagtgctgaa aattgatctg tttctgatca gcaaccaatt tagcgagaaa 540 aatttccagg ttaaagactt tctggtggaa aatattgatc gcaaatatga cgtgttcatt 600 ggtaatccgc cgtatatcgg tcacaaaagc gtggacagca gctacagcta cgtgctgcgc 660 aaaatctacg gcagcatcta ccgcgacaaa ggcgatatca gctattgttt ctttcagaag 720 agcctgaaat gtctgaagga aggtggcaaa ctggtgtttg tgaccagccg ctacttctgc 780 gagagctgca gcggtaaaga actgcgtaaa ttcctgatcg aaaacacgag catttacaag 840 atcattgatt tttacggcat ccgcccgttc aaacgcgtgg gtatcgatcc gatgattatt 900 tttctggttc gtacgaagaa ctggaacaat aacattgaaa ttattcgccc gaacaagatt 960 gaaaagaacg aaaagaacaa attcctggat agcctgttcc tggacaaaag cgaaaagtgt 1020 aaaaagttta gcattagcca gaaaagcatt aataacgatg gctgggtttt cgtggacgaa 1080 gtggagaaaa acattatcga caaaatcaaa gagaaaagca agttcattct gaaagatatt 1140 tgccatagct gtcaaggcat tatcaccggt tgtgatcgcg cctttattgt ggaccgtgat 1200 atcatcaata gccgtaagat cgaactgcgt ctgattaaac cgtggattaa aagcagccat 1260 atccgtaaga atgaagttat taagggcgaa aaattcatca tctatagcaa cctgattgag 1320 aatgaaaccg agtgtccgaa tgcgattaaa tatatcgaac agtacaagaa acgtctgatg 1380 gagcgccgcg aatgcaaaaa gggcacgcgt aagtggtatg aactgcaatg gggccgtaaa 1440 ccggaaatct tcgaagaaaa gaaaattgtt ttcccgtata aaagctgtga caatcgtttt 1500 gcactggata agggtagcta ttttagcgca gacatttata gcctggttct gaagaaaaat 1560 gtgccgttca cctatgagat cctgctgaat atcctgaata gcccgctgta cgagttttac 1620 tttaagacct tcgcgaaaaa gctgggcgag aatctgtacg agtactatcc gaacaacctg 1680 atgaagctgt gcatcccgag catcgatttc ggcggtgaga acaatattga gaaaaagctg 1740 tatgatttct ttggtctgac ggataaagaa attgagattg tggagaagat caaagataac 1800 tgctaa 1806

Claims (16)

1. CO 및/또는 CO₂를 3-하이드록시프로피오네이트(3-HP)로 전환하는 방법으로서,
   가스 CO-함유 및/또는 CO₂-함유 기질을 배양 배지에서 일산화탄소영양(carboxydotrophic), 초산생성 박테리아의 배양물을 포함하는 생물반응기로 통과시켜, 상기 박테리아가 CO 및/또는 CO₂를 3-HP로 전환시키게 하는 단계, 및
   상기 생물반응기로부터 상기 3-HP를 회수하는 단계
   를 포함하고, 상기 일산화탄소영양 초산생성 박테리아는 말로닐-조효소 A 환원효소를 발현하도록 유전적으로 조작되며,
   상기 박테리아는 클로스트리디움 아우토에타노제늄(Clostridium autoethanogenum), 클로스트리디움 리융다흘리(Clostridium ljungdahlii), 클로스트리디움 라그스달레이(Clostridium ragsdalei), 클로스트리디움 카복시디보란스(Clostridium carboxidivorans), 클로스트리디움 드라케이(Clostridium drakei), 클로스트리디움 스카토로제네스(Clostridium scatologenes), 클로스트리디움 아세티쿰(Clostridium aceticum), 클로스트리디움 포르미코아세티쿰(Clostridium formicoaceticum), 클로스트리디움 마그눔(Clostridium magnum), 부티리박테리움 메틸로트로피쿰(Butyribacterium methylotrophicum), 아세토박테리움 우디(Acetobacterium woodii), 알칼리바쿨룸 바크히(Alkalibaculum bacchii), 블라우티아 프로덕타(Blautia producta), 유박테리아 리모섬(Eubacterium limosum), 모렐라 써마우토트로피카(Moorella thermautotrophica), 스포로무사 오바타(Sporomusa ovata), 스포로무사 실바세티카(Sporomusa silvacetica), 스포로무사 스파에로이데스(Sporomusa sphaeroides), 옥소박터 프테니지(Oxobacter pfennigii) 및 써모아나에로박터 키우비(Thermoanaerobacter kiuvi)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
2. 유전적으로 조작된, 일산화탄소영양, 초산생성 박테리아로서, 말로닐-조효소 A 환원효소를 코딩하는 핵산을 포함하고, 이로써 상기 박테리아는 말로닐-조효소 A 환원효소를 발현하고, 상기 박테리아는 CO 또는 CO₂의 3개의 분자들을 3-하이드록시프로피오네이트(3-HP)의 1개의 분자에 고정할 수 있고,
   상기 박테리아는 클로스트리디움 아우토에타노제늄(Clostridium autoethanogenum), 클로스트리디움 리융다흘리(Clostridium ljungdahlii), 클로스트리디움 라그스달레이(Clostridium ragsdalei), 클로스트리디움 카복시디보란스(Clostridium carboxidivorans), 클로스트리디움 드라케이(Clostridium drakei), 클로스트리디움 스카토로제네스(Clostridium scatologenes), 클로스트리디움 아세티쿰(Clostridium aceticum), 클로스트리디움 포르미코아세티쿰(Clostridium formicoaceticum), 클로스트리디움 마그눔(Clostridium magnum), 부티리박테리움 메틸로트로피쿰(Butyribacterium methylotrophicum), 아세토박테리움 우디(Acetobacterium woodii), 알칼리바쿨룸 바크히(Alkalibaculum bacchii), 블라우티아 프로덕타(Blautia producta), 유박테리아 리모섬(Eubacterium limosum), 모렐라 써마우토트로피카(Moorella thermautotrophica), 스포로무사 오바타(Sporomusa ovata), 스포로무사 실바세티카(Sporomusa silvacetica), 스포로무사 스파에로이데스(Sporomusa sphaeroides), 옥소박터 프테니지(Oxobacter pfennigii) 및 써모아나에로박터 키우비(Thermoanaerobacter kiuvi)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 유전적으로 조작된, 일산화탄소영양, 초산생성 박테리아.
3. 제2항에 있어서, 아세틸-조효소 A 카복실라제를 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는, 유전적으로 조작된, 일산화탄소영양, 초산생성 박테리아.
4. 삭제
5. 제2항에 있어서, C. 리융다흘리 및 C. 아우토에타노제늄으로 이루어진 군으로부터 선택되는 클로스트리디움 종인, 유전적으로 조작된, 일산화탄소영양, 초산생성 박테리아.
6. 제3항에 있어서, 상기 아세틸-조효소 A 카복실라제는 클로스트리디움 리융다흘리, 클로스트리디움 아우토에타노제늄, 클로로플렉수스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus), 메탈로스파에라(Metallosphaera) 또는 설포로부스 종(Sulfolobus spp.)으로부터 유래한 것인, 유전적으로 조작된, 일산화탄소영양, 초산생성 박테리아.
7. 제2항에 있어서, 상기 말로닐-조효소 A 환원효소는 클로로플렉서스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)로부터 유래한 것인, 유전적으로 조작된, 일산화탄소영양, 초산생성 박테리아.
8. 제2항에 있어서, 상기 말로닐-조효소 A 환원효소를 코딩하는 핵산은 코돈 최적화된 것인, 유전적으로 조작된, 일산화탄소영양, 초산생성 박테리아.
9. 가스 탄소원을 포함하는 배지에서 박테리아를 성장시키는 단계를 포함하는 제2항의 유전적으로 조작된, 일산화탄소영양, 초산생성 박테리아를 배양하는 방법으로서, 상기 탄소원은 CO 및/또는 CO₂를 포함하는 것인 방법.
10. 에너지원을 포함하는 배지에서 박테리아를 성장시키는 단계를 포함하는 제2항의 유전적으로 조작된, 일산화탄소영양, 초산생성 박테리아를 배양하는 방법으로서, 상기 에너지원은 CO 및/또는 CO₂를 포함하는 것인 방법.
11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 배양은 엄격히 무산소성인 것인 방법.
12. 제9항에 있어서, 상기 탄소원은 산업용 폐기물 또는 배출 가스를 포함하는 것인 방법.
13. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 박테리아는 아세틸-조효소 A 카복실라제를 코딩하는 외인성 핵산을 추가로 포함하는 것인 방법.
14. 제13항에 있어서, 아세틸-조효소 A 카복실라제가 클로스트리디움 리융다흘리, 클로스트리디움 아우토에타노제늄, 클로로플렉수스 아우란티아쿠스, 메탈로스파에라 또는 설포로부스 종으로부터 유래한 것인 방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 말로닐-조효소 A 환원효소는 클로로플렉수스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)로부터 유래한 것인 방법.
16. 제2항에 있어서, 상기 말로닐-조효소 A 환원효소는 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열과 적어도 85% 동일한 것인, 유전적으로 조작된, 일산화탄소영양, 초산생성 박테리아.

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