CN113831414B - 猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白及其制备方法、基因及构建方法和应用 - Google Patents

猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白及其制备方法、基因及构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种猪圆环病毒2b型Capsid‑Fc融合蛋白及其制备方法、基因及构建方法和应用，通过对现有PCV 2b 41513病毒毒株的衣壳蛋白改造去除N端41个氨基酸，C端连接多肽linker并融合猪IgG Fc片段，得到新型猪圆环病毒2b型Capsid‑Fc融合蛋白基因的N端依次添加Kozak序列和人IgG2H重链信号肽后进行全基因密码子优化，得到编码猪圆环病毒2b型Capsid‑Fc融合蛋白的表达基因，依次经重组质粒构建、转染、表达、分离纯化等得猪圆环病毒2b型Capsid‑Fc融合蛋白，其作为活性成分所得猪圆环病毒2b型Capsid‑Fc融合蛋白亚单位疫苗能够很好刺激小鼠机体产生高浓度的抗体。

Description

猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白及其制备方法、基因及构 建方法和应用
技术领域
本发明涉及生物工程学与免疫学领域，特别涉及一种猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白及其制备方法、基因及构建方法和应用。
背景技术
猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus type 2，以下简称PCV2病毒)属于圆环病毒科，其基因组为单股环状DNA，病毒粒子无囊膜，由60个蛋白单体组装形成二十面体，是目前已知的最小病毒之一。PCV2基因组长1767bp或1768bp，基因组两个主要的开放阅读框ORF1和ORF2，分别编码Cap蛋白和Rep蛋白。Pep蛋白是PCV2病毒复制的必要蛋白。Cap蛋白是形成PCV2病毒外壳的衣壳蛋白，具有结合宿主细胞受体的能力，并且是主要的免疫抗原，常被用于制备PCV2病毒特异性疫苗及血清学诊断的目标蛋白。PCV2病毒衣壳蛋白呈二十面体对称。
PCV2病毒1998年在加拿大首次被发现，并确认是造成母猪繁殖障、肉芽肿性肠炎、先天性震颤间质性肺炎、断奶后多***衰竭综合征、猪皮炎与肾病综合征等多种疾病的重要病原体。
目前市场开发出多种PCV2病毒疫苗，主要以猪圆环病毒2a型病毒(以下简称PCV2a病毒)毒株研发的灭活疫苗、减毒疫苗和重组疫苗。也有一部分以猪圆环病毒2b型病毒(以下简称PCV 2b病毒)毒株研发的灭活疫苗。
这些PCV 2b病毒疫苗在控制PCV 2b病毒感染上发挥重要作用，但免疫效果仍然有待进一步提高。且由于PCV 2b病毒变种的基因型较多，现已多次出现免疫失败的案例，即使在接种PCV 2b病毒疫苗的猪场，仍有PCV 2b病毒感染流行暴发等问题。
综上所述，目前PCV 2b病毒疫苗还存在产生的抗体效价低，存在对免疫对象保护不够的等技术问题。因此亟待对现有PCV 2b病毒疫苗进行更新升级，提高抗体效价，获得更好的免疫原性和扩大免疫覆盖率，从而提高对免疫对象的保护。
参考文献
1、Allan,G.,Meehan,B.,Todd,D.,Kennedy,S.,McNeilly,F.,Ellis,J.,Clark,E.G.,Harding,J.,Espuna,E.,Botner,A.,Charreyre,C.,1998.Novel porcinecircoviruses from pigs with wasting disease syndromes.Vet.Rec.142,467–468；
2、de Boisseson C,Beven V,Bigarre L,Thiery R,Rose N,Eveno E,etal.Molecular characterization of Porcine circovirus type 2isolates from post-weaning multisystemic wasting syndrome-affected and non-affected pigs.J GenVirol2004；85(February(Pt 2)):293–304；
3、Constans M,Ssemadaali M,Kolyvushko O,et al.Antigenic Determinantsof Possible Vaccine Escape by Porcine Circovirus Subtype 2b Viruses[J].Bioinformatics and Biology Insights,2015,9s2:BBI.S30226；
4、CN201510413407.1猪圆环病毒双亚型ORF2共表达载体构建及疫苗制备；
5、CN201480045584.2猪圆环病毒2型(PCV2)亚单位疫苗；
6、CN201180024467.4活的减毒嵌合猪圆环病毒疫苗。
发明内容
本发明的目的之一是为了解决上述的目前PCV 2b病毒疫苗存在产生的抗体效价低，对免疫对象保护不够的等技术问题而提供一种猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗，该猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗具有产生高的抗体效价能力，同时对可增强免疫对象的体液和细胞免疫的响应能力。
本发明的目的之二是提供上述的一种猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗中所用的一种猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白及其制备方法。
本发明的目的之三是提供上述的一种猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白的表达基因及其构建方法。
本发明的技术原理：
采用对现有猪圆环病毒2型疫苗免疫失败的PCV 2b 41513病毒毒株的衣壳蛋白，工程改造去除该衣壳蛋白N端41个氨基酸，在C端连接多肽linker，并融合猪IgG Fc片段，产生一种新型猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白即PCV2b Capsid-Fc融合蛋白；
将编码上述的新型猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白的DNA进行全基因密码子优化，得到猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白的表达基因，即猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白的表达基因，其基因序列具体见SEQ ID No.1，然后通过全基因合成及EcoRI/HindIII酶双酶切法将其基因***到pEM表达质粒，得到pEM-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒。另外，通过引物扩增，NheI/HindIII酶双酶切法将PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白基因***到pCDNA3.1(+)质粒中，得到pCDNA3.1(+)-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒；重组质粒转染到大肠杆菌DH5α，得到含有pEM-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒或含有pCDNA3.1(+)-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒的重组大肠杆菌DH5α；分别通过重组大肠杆菌DH5α进行扩增，得到转染级重组质粒；
将上述的转染级的pEM-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒或转染级的pCDNA3.1(+)-PCV2b Capsid-Fc重组质粒转染到哺乳细胞HEK293F后依次经悬浮培养后，经分离、纯化，获得目标猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白产物。
注：PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白中的Capsid是描述为N端切除41个氨基酸的PCV2b衣壳蛋白。
该PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白在透射电子显微镜观测发现，能够形成约平均大小为41nm纳米颗粒。通过在BLAB/c小鼠免疫实验结果显示，其具有很好刺激小鼠机体产生体液免疫和细胞免疫响应。
本发明的技术方案：
一种猪圆环2b型病毒Capsid-Fc融合蛋白，即为PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白，在宿主中表达所述PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白，优选以宿主为哺乳动物细胞HEK293F细胞进行表达，以pEM质粒或pcDNA3.1(+)质粒为载体构建编码所述PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的重组载体，本发明的实施例中以pEM-PCV2b Capsid-Fc融合蛋白重组质粒转染哺乳细胞HEK293F表达，以及pcDNA3.1(+)质粒为载体构建编码所述PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的重组载体转染哺乳细胞HEK 293F进行表达，同时宿主并不限于哺乳动物细胞，还可以采用真核毕氏酵母为宿主菌进行表达，优选采用毕氏酵母GSl15菌种进行表达时，此时优选的载体为pIC9K，本发明的实施例中也仅以重组载体转染到HEK293F细胞，使HEK293F细胞表达PCV2b Capsid-Fc融合蛋白为例进行说明，但不限制真核毕氏酵母为宿主菌进行表达的应用。
上述的猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白，即PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的制备过程，具体包括如下步骤：
(1)PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的表达基因序列合成
①新型PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的表达基因合成
PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的表达基因序列包括如下三部分区段序列组成：
以Porcinecircovirustype2-BstrainNDSU41513毒株编码PCV2衣壳蛋白基因，即序列ID为GenBankaccessionnumberALD62452.1为基础，去除该衣壳蛋白N端41个氨基酸后，按照哺乳细胞的密码子偏好性进行密码子优化得到PCV2衣壳区段序列，见SEQ ID No.3；
以猪IgG重链Fc区域基因，序列ID为Gen Bank accession numberAAD38418.1的Fc区段序列，见SEQ ID No.7；
以DNA序列如SEQ ID No.5作为linker连接区段序列；
将上述三部分区段序列按照哺乳细胞的密码子偏好性进行密码子优化，得到新型PCV2bCapsid-Fc融合蛋白基因；其序列见SEQ ID No.1；
②PCV 2b Capsid-Fc的基因的合成
在上述步骤①所得的新型PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的前后两端含有酶切位点EcoRI-HindIII，***Kozak序列和人IgG2H重链信号肽序列，其顺序依次为Kozak序列,人IgG2H重链信号肽序列，从而得到猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白的表达基因序列，其序列见SEQ ID No.1；
上述的Kozak序列见SEQ ID No.11；上述的人IgG2H重链信号肽序列见SEQ IDNo.12；
(2)含有PCV 2b Capsid-Fc的基因的pEM-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒的构建
在PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的基因的N端和C端两端，设计酶切位点EcoRI和HindIII，序列通过人工基因合成方式合成，再通过双酶切法将PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的基因***到表达载体pEM质粒中，得到pEM-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒；
(3)含有PCV 2b Capsid-Fc的基因的pCDNA3.1(+)-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒的构建
将酶切位点NheI和HindIII设计在序列如SEQ ID No.9的引物PcfF序列和序列如SEQ ID No.10引物PcfR序列中，通过引物PcfF和PcfR对合成PCV 2b Capsid-Fc的表达基因序列如SEQ ID No.1进行PCR扩增，获得包含有酶切位点NheI和HindIII的表达片段，然后再将PCR扩增片段进行NheI/HindIII双酶切，再连接到同样NheI/HindIII双酶切处理的pCDNA3.1(+)质粒表达载体上，得到pCDNA3.1(+)-PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白重组质粒；
(4)pEM-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒或pCDNA3.1(+)-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒转染到大肠杆菌DH5α；
吸取步骤(2)所得的pEM-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒或步骤(3)所得的pCDNA3.1(+)-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒80-100ng加入到已制备的DH5α感受态细胞中，然后加入到LB液体培养基，放入摇床控制温度为37℃、转速为200rpm震荡培养约30min，然后分离出DH5α感受态细胞，得到含有pEM-PCV2b Capsid-Fc重组质粒或pCDNA3.1(+)-PCV 2bCapsid-Fc重组质粒的重组大肠杆菌DH5α；
(5)转染级质粒的提取
将上述步骤(4)得到的含有pEM-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒或含有pCDNA3.1(+)-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒的大肠杆菌DH5α，在新鲜的培养板中挑取单克隆于2-5mLLB培养基，控制温度为37℃、转速200rpm培养8h后得种子液。然后按体积比1/500的比例，将种子液接种于200mLLB培养基中，继续控制温度为37℃、转速200rpm培养16h后得含有上述重组质粒的菌液，然后将菌液转速为4000r/min，离心10min去掉上清，将收获所得的沉淀采用OmegaBiotek公司的E.Z.N.A.Endo-Free Plasmid DNA Maxi Kit质粒大抽试剂盒，D6926-01，按试剂盒所述的方法进行转染级质粒的提取，最终得到转染级pEM-PCV2bCapsid-Fc重组质粒或转染级pCDNA3.1(+)-PCV2b Capsid-Fc重组质粒；
(6)哺乳动物细胞表达PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白
①HEK293细胞复苏与扩增培养
A：提前将水浴锅打开37℃，Union-293无血清新鲜培养基提前在37℃预热；从液氮罐中取出冻存的装有HEK293F细胞冻存管，把冻存细胞立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动使其在1min内快速融化，取出后用75％乙醇消毒装有HEK293F细胞冻存管的外壁，放入生物安全柜内，转移到装有10mLUnion-293无血清培养基的15mL离心管中，控制转速为800rpm离心5min，离心后去掉上清，取新鲜Union-293无血清培养基重悬离心管中的HEK293F细胞，然后转移到培养瓶中，加入Union-293无血清培养基摇动，使细胞分散均匀，取细胞计数及活力检测，控制活细胞密度在6-8×105个细胞/mL，测定细胞活力，当细胞活力低于80％时，重新复苏，当细细胞活力在大于80％，细胞培养液置于CO2体积百分比浓度为5％的CO2培养箱中，控制温度为37℃、转速为110rpm进行培养2-3天，去除10mL细胞培养液，再添加10mL新鲜培养基，直至细胞活力大于90％，得到含有复苏HEK293细胞的培养液；
B：将上述A中所得的含有复苏HEK293细胞的培养液置于CO2体积百分比浓度为5％的CO2培养箱中，控制温度为37℃、转速为110rpm进行培养2-3天，至细胞浓度达到2-3×106个HEK293细胞/mL培养液，完成对HEK293细胞进行第一次细胞扩增培养：
将30mL新鲜培养基添加到上述15mL第一次细胞扩增培养后所得的HEK293细胞培养液中，然后放入CO2体积百分比浓度为5％的CO2培养箱中，控制温度为37℃、转速为110rpm进行继续培养，每天需对HEK293细胞浓度及细胞活力检测，当细胞浓度达到2-3×106个HEK293细胞/mL培养液，完成对HEK293细胞进行第二次细胞扩增培养，培养体积达到约45mL；
将90mL新鲜培养基添加到上述45mL第一次细胞扩增培养后所得的HEK293细胞培养液中，然后放入CO2体积百分比浓度为5％的CO2培养箱中，控制温度为37℃、转速为110rpm进行继续培养，每天需对HEK293细胞浓度及细胞活力检测，当细胞浓度达到2-3×106个HEK293细胞/mL培养液，完成对HEK293细胞进行第三次细胞扩增培养，得到经过三次扩增培养后的HEK-293F细胞培养液，培养体积达到约135mL；
②含有转染级pEM-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒的Union-293无血清培养液的制备：
将步骤(5)所得的转染级pEM-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒添加到的Union-293无血清培养基中，得到20μg/ml的含有转染级pEM-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒的Union-293无血清培养液；
③含有聚乙烯亚胺的Union-293无血清培养液的制备
将转染试剂聚乙烯亚胺添加到Union-293无血清培养基中，得到80μg/ml的含聚乙烯亚胺的Union-293无血清培养液；
④步骤③所得的含聚乙烯亚胺的Union-293无血清培养液和步骤②含有转染级pEM-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒的Union-293无血清培养液按照体积比为1:1的比例混合，在室温下静止20-30min后，得到PEI/DNA的Union-293无血清培养液；
⑤含有转染级pEM-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒转染至HEK293细胞
将步骤④所得的PEI/DNA的Union-293无血清培养液加入到步骤①所得经过三次扩增培养后的HEK-293F细胞培养液中，然后放入CO2体积百分比浓度为5％的CO2培养箱中控制温度为37℃、转速为110rpm进行培养4-6天，得到的细胞培养液控制转速为1000rpm离心10min，所得的沉淀即含有PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的HEK293F细胞；
上述的PEI/DNA的Union-293无血清培养液和经过三次扩增培养后的HEK-293F细胞培养液的用量，按PEI/DNA的Union-293无血清培养液：经过三次扩增培养后的HEK-293F细胞培养液的体积比为1：10的比例计算；
(7)PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的分离
将步骤(6)中所得的含有PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的HEK293F细胞，用超声裂解缓冲液重悬，然后使用QsonicaLLC公司的型号Q125的超声破碎仪，控制振幅强度输出为34％，工作3秒，停息7秒，总工作时间30min进行超声裂解液，然后控制温度为4℃、转速为12,000rpm离心20min，收集上清液；
所述的超声裂解缓冲液，按每升计算，含50mM Tris、300mM NaCl、20mM pH8.0的咪唑、10gTritonX-100、1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)，余量是水；
含有PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的HEK293F细胞和超声裂解缓冲液的用量，按含有PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的HEK293F细胞的湿重:超声裂解缓冲液为1g:10mL的比例计算；
所述的含有PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的HEK293F细胞的湿重即上述步骤(5)中的⑤离心所得的沉淀的实际质量；
(8)PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的纯化
将步骤(7)中离心后收集的上清液上样到Protein A琼脂糖凝胶层析柱(德泰生物科技(南京)有限公司)，按Protein A琼脂糖凝胶层析柱的使用要求进行，依次进行平衡色谱柱、上样、洗杂、洗脱、收集、收集样品中和，再经0.22微米过滤器过滤，得到含有PCV 2bCapsid-Fc融合蛋白的过滤液。
所得的含有PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的过滤液保存在-70℃下，用于后续实验。
上述的一种PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白在制备用于抗猪圆环病毒2b型感染的PCV2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗中的应用，所述的PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗由活性成分PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白和佐剂组成，按质量体积比计算，其中PCV 2bCapsid-Fc融合蛋白：佐剂为3.3mg：100mL；其中所述的佐剂为完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂；
其中的活性成分为PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白自组装成病毒样纳米颗粒。
上述的一种PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗的制备方法，具体步骤如下：
按PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗中PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白：佐剂为3.3mg：100mL的比例进行制备，即将上述用0.22微米滤器过滤后所得的滤液用pH7.4的1xPBS溶液稀释一倍后，与预热至37℃的弗氏完全佐剂或预热至37℃的弗氏非完全佐剂振荡混合，以实现对PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白进行乳化，直至形成稳定的乳化体系，即得到PCV2 Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗。
上述的PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗中，经扫描电镜测定，活性成分PCV2b Capsid-Fc融合蛋白自组装成病毒样纳米颗粒，其粒径约为41nm。
上述的一种猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白也可以适用于在制备用于抗猪圆环病毒2b型感染的抗体药物试剂和/或试剂盒中的应用。
本发明的有益效果：
本发明公开一种猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白的表达基因编码PCV2bCapsid-Fc融合蛋白，其作为活性成分所得猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗能够很好刺激小鼠机体产生高浓度的抗体从而提高细胞和体液的免疫力。特别是以PCV 2bCapsid-Fc融合蛋白为活性物质的亚单位疫苗通过在BLAB/c小鼠免疫实验结果显示，初次免疫后第12天，抗体水平微弱增加，而第二次加强免疫后，能够高水平产生针对PCV2衣壳的特异性抗体，抗体浓度超过500ng/mL，比商业亚单位疫苗免疫的BLAB/c小鼠组相比抗体浓度水平提高1倍以上，同时以PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白为活性物质的亚单位疫苗能够很好的刺激小鼠机体产生体液免疫和细胞免疫应答。
附图说明
图1：实施例2所得的pCDNA3.1(+)-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒的PCR鉴定结果示意图；其中M,DNA marker 1kb DNA；1-2.PCV 2b Capsid-Fc PCR产物；
图2：实施例2所得的pCDNA3.1(+)-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒的PCV2b Capsid-Fc的NheI/HindIII酶双酶切后的核酸片段的示意图，其中M.DNA Marker；1.提取的重组质粒；2.NheI/HindIII酶双酶切重组质粒pCDNA3.1(+)-PCV 2b Capsid-Fc；
图3：实施例2所得的pEM-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒的PCV 2b Capsid-Fc的NcoI/ApaI双酶切后的核酸片段的示意图，其中M.DNA Marker；1.提取的重组质粒；2.用NcoI/ApaI酶双酶切pEM-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒；
图4：实施例4所得的PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的组成结构示意图；
图5：实施例4所得的PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的3D预测结构图；
图6：实施例4所得的PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白SDS-PAGE和Western Blot分析图；
图7：应用实施例1中选用的灭活病毒在4K-300K倍率下(200nm)的透射电镜观测图；
图8：应用实施例1中选用的PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白在4K-300K倍率下(200nm)的透射电镜观测图；
图9：应用实施例1中选用的商业亚单位疫苗在4K-300K倍率下(200nm)的透射电镜观测图；
图10：应用实施例1中选用的灭活病毒在4K-300K倍率下(200nm)的透射电镜观测图；
图11：应用实施例1中选用的PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白在4K-300K倍率下(100nm)的透射电镜观测图；
图12：应用实施例1中选用的商业亚单位疫苗在4K-300K倍率下(100nm)的透射电镜观测图；
图13：应用实施例1中选用的灭活病毒在4K-300K倍率下(50nm)的透射电镜观测图；
图14：应用实施例1中选用的PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白在4K-300K倍率下(50nm)的透射电镜观测图；
图15：应用实施例1中选用的商业亚单位疫苗在4K-300K倍率下(50nm)的透射电镜观测图；
图16：动物细胞实验中对免疫小鼠脾脏细胞进行淋巴细胞增殖测定分析图，其中EFSV为本发明的PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗试验组，CSV为商业亚单位疫苗组，ConA为5μg/ml的ConA作为阳性对照，数据表示为SI平均值±SD，*P＜0.05，**P＜0.01；
图17：抗体滴度测定中PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗免疫小鼠特异性抗体滴度变化示意图；
图18：抗体滴度测定中PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗和商业亚单位疫苗免疫小鼠特异性抗体效价示意图。
图19：细胞因子IFN-γ分泌浓度测定中PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗和商业亚单位疫苗免疫小鼠细胞因子IFN-γ分泌浓度差异示意图。
图20：细胞因子IL-10分泌浓度测定中PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗和商业亚单位疫苗免疫小鼠细胞因子IL-10分泌浓度差异示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施例并结合附图对本发明进一步阐述，但并不限制本发明。
本发明的实施例中所用的：
出发毒株名称：Porcine circovirus type 2-B strain NDSU 41513，衣壳蛋白氨基酸序列来自protein_id＝"ALD62452.1"；
pEM质粒，来源于德泰生物科技(南京)有限公司
质粒pcDNA3.1(+)，德泰生物科技(南京)有限公司
大肠杆菌DH5α，德泰生物科技(南京)有限公司；
HEK 293F(人胚胎肾细胞293F)，来源于华东理工大学实验室；
引物序列如下：
大肠杆菌DH5α细胞培养所使用的LB液体培养基，按质量百分比计算，其组成及含量为1.0％氯化钠，1.0％蛋白胨，0.5％的酵母提取物，余量为水。
HEK 293F细胞培养所使用的培养基，为市售无血清Union-293培养基，本发明实施例采用无血清Union-293培养基的是永联生物科技(上海)有限公司生产的。
细胞转染，利用上海懋康生物科技有限公司提供的40-kDa linearpolyethylenimine(PEI)转染试剂，根据说明书进行操作。
本发明实施例中所用的SDS-PAGE和Western Blot分析方法如下：
浓度为12.5％聚丙烯酰胺凝胶上采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法分离鉴定细胞裂解液和富集的PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白组份蛋白条带。聚丙烯酰胺凝胶用考马斯亮蓝G250染色以显示蛋白质条带。在SDS-PAGE凝胶上分离的蛋白质凝胶上，再通过湿式Western印迹转移模式将分离蛋白转移到PVDF膜上。将蛋白已转移到PVDF膜在QuickBlockTM Western封闭缓冲液中于4℃封闭过夜，然后与抗猪圆环病毒单抗(1：1000稀释；Abcam，美国)在TBST中于室温孵育2h。使用HRP标记的山羊抗兔抗体(SAB，中国)作为二抗。用TBST洗涤3次后，使用ECL化学发光***BeyoECL Plus(超敏ECL化学发光试剂盒)(P0018S)、碧云天生物技术有限公司和Tanon的凝胶图像***(GIS)软件包、上海天能科技有限公司的全自动数码凝胶图像分析***进行检测成像后的蛋白条带。
本发明的所用的主要试剂的名称、规格、生产厂家信息如下：
本发明的实施例中的细胞数量的测定方法采用台盼蓝染色法测定此方法是细胞数量测定最常见的方法，测定所用的仪器CountStar自动计数细胞分析仪。
BCA蛋白定量试剂盒方法(碧云天生物科技有限公司)，按照产品说明书操作测定。
数据统计
数据以平均值±标准误差表示使用Student’s t-检验(GraphPadSoftware Inc.，San Diego，CA，USA)。使用GraphPadPrism 8执行图形和数据统计分析。P值<0.05被认为具有统计学意义。*0.05<P<0.01，**0.01<P<0.001
实施例1
一种猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白的表达基因，其碱基序列见SEQ IDNo.1，其编码由PCV2衣壳区段序列，linker区段序列和Fc区段序列三部分组成；其中所述PCV2衣壳区段序列为SEQ ID No.3；所述linker区段序列为SEQ ID No.5；所述Fc区段序列为Pig IgG重链Fc片段的编码序列为SEQ ID No.7,其构建过程的具体步骤如下：
(1)表达新型PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的基因序列密码子优化
首先，选以Porcine circovirus type 2-B strain NDSU 41513毒株编码PCV2衣壳蛋白基因，即序列ID为Gen Bank accession number ALD62452.1为基础，去除该衣壳蛋白N端41个氨基酸后，采用德泰生物科技(南京)有限公司密码子优化软件，按照哺乳细胞的密码子偏好性进行密码子优化得到PCV 2b衣壳区段序列；以linker为连接肽(连接肽的氨基酸序列为SEQ ID No.4)，按照哺乳细胞的密码子偏好性进行密码子优化得到linker区段序列；以猪IgG重链Fc区域基因，序列ID为Gen Bank accession number AAD38418.1的Fc区段序列；将上述三部分区段序列采用德泰生物科技(南京)有限公司密码子优化软件，按照哺乳细胞的密码子偏好性进行密码子优化，进行全基因合成得到新型PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白基因；其序列见SEQ ID No.1。
(2)添加表达新型PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的基因N端、C端表达序列元件
在上述步骤(1)所得的新型PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的前后两端设计添加含有酶切位点EcoRI-HindIII，***Kozak序列和人IgG2H重链信号肽序列，其顺序依次为Kozak序列,人IgG2H重链信号肽序列。将上述添加了Kozak序列,人IgG2H重链信号肽序列元件的新型表达PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的基因进行密码子优化，按照哺乳细胞的密码子偏好性，采用德泰生物科技(南京)有限公司密码子优化软件进行密码子优化。
(3)添加新型表达PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的基因N端、C端表达序列元件的序列基因合成
对上述序列进行全基因合成从而得到包含表达重组猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白的基因序列，其序列见SEQ ID No.13。上述的Kozak序列见SEQ ID No.11；上述的人IgG2H重链信号肽序列见SEQ ID No.12；采用Applied Biosystems公司的3730XL测序仪对上述所得的表达猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白的基因进行测序，结果与SEQ IDNo.13结果一致。
实施例2
一种含有PCV 2b Capsid-Fc的基因的重组质粒，其构建过程具体如下：
(1)含有PCV 2b Capsid-Fc的基因的pEM-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒的构建
在PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的基因的N端和C端两端，设计酶切位点EcoRI和HindIII，序列通过人工基因合成方式合成，再通过双酶切法将PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的基因***到表达载体pEM质粒中，得到pEM-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒；
(2)含有PCV 2b Capsid-Fc的基因的pCDNA3.1(+)-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒的构建
将酶切位点NheI和HindIII设计在序列如SEQ ID No.9的引物PcfF序列和序列如SEQ ID No.10引物PcfR序列中，通过引物PcfF和PcfR对合成表达PCV2b Capsid-Fc的基因序列如SEQ ID No.1进行PCR扩增，获得包含有酶切位点NheI和HindIII的氨基酸表达片段，然后再将PCR扩增片段进行NheI/HindIII双酶切，再连接到同样NheI/HindIII双酶切处理的pCDNA3.1(+)质粒表达载体上，得到pCDNA3.1(+)-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒；
上述所得的pCDNA3.1(+)-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒的PCR鉴定结果示意图见图1；其中M,DNA marker 1kb DNA；1-2.PCV 2b Capsid-Fc PCR产物，从图1中可以看出重组质粒中含有PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白基因。
上述所得的pCDNA3.1(+)-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒的PCV 2b Capsid-Fc的NheI/HindIII酶双酶切后的核酸片段的示意图见图2，其中M.DNA Marker；1.提取的重组质粒；2.NheI/HindIII酶双酶切pCDNA3.1(+)-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒的PCV 2b Capsid-Fc，从图2中中可以看出成功构建了表达质粒pCDNA3.1(+)-PCV 2b Capsid-Fc。
上述所得的pEM-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒的PCV 2b Capsid-Fc的NcoI/ApaI酶双酶切后的核酸片段的示意图见图3，其中M.DNA Marker；1.提取的重组质粒；2.用NcoI/ApaI酶双酶切，从图3中可以看出成功构建了pEM-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒。
实施例3
转染级pCDNA3.1(+)-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒或转染级pEM-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒的制备，具体包括如下步骤：
(1)pEM-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒或pCDNA3.1(+)-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒转染到大肠杆菌DH5α；吸取实施例2所得的pEM-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒或pCDNA3.1(+)-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒80-100ng加入到已制备的DH5α感受态细胞中，然后加入到LB液体培养基，放入摇床控制温度为37℃、转速为200rpm震荡培养约30min，然后分离出DH5α感受态细胞，得到含有pEM-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒或pCDNA3.1(+)-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒的重组大肠杆菌DH5α；
(2)转染级质粒的提取
将上述步骤(1)得到的含有转染级pEM-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒或pCDNA3.1(+)-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒的大肠杆菌DH5α，在新鲜的培养板中挑取单克隆于2-5mLLB培养基，控制温度为37℃、转速200rpm培养8h后得种子液，然后按体积比1/500的比例，将种子液接种于200mL LB培养基中，继续控制温度为37℃、转速200rpm培养16h后得含有上述重组质粒的菌液，然后将菌液控制转速4000rpm离心10min，去掉上清，收获所得的沉淀采用Omega Biotek公司的E.Z.N.A.Endo-Free Plasmid DNA Maxi Kit质粒大抽试剂盒，D6926-01，按试剂盒所述的方法进行转染级质粒的提取，最终得到转染级pEM-PCV 2bCapsid-Fc重组质粒或转染级pCDNA3.1(+)-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒。
实施例4
一种PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白，其通过使用40kDa线性聚乙烯亚胺(PEI)作为转染试剂，将实施例3所得的转染级pEM-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒瞬时转染至HEK 293F悬浮细胞，然后依次经培养、分离、纯化最终得到PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白，其制备过程具体包括如下步骤：
(1)HEK293细胞复苏与传代
①提前将水浴锅打开37℃，Union-293无血清新鲜培养基提前在37℃预热；从液氮罐中取出冻存的装有HEK293F细胞冻存管，把冻存细胞立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动使其约1min内快速融化，取出后用75％乙醇消毒装有HEK293F细胞冻存管的外壁，放入生物安全柜内，转移到装有10mLUnion-293无血清培养基中培养基的15mL离心管中，控制转速为800rpm离心5min，离心后离心管去掉上清，取少许新鲜培养基重悬离心管中的HEK293F细胞，然后转移到培养瓶中，加入Union-293无血清培养基轻轻摇动，使细胞分散均匀，取细胞计数及活力检测，控制活细胞密度在6-8×105个细胞/mL，测定细胞活力(所述的细胞活力即为活细胞与总细胞的比例)，当细胞活力低于80％时，重新复苏，当细细胞活力在大于80％，细胞培养液置于CO2体积百分比浓度为5％的CO2培养箱中，控制温度为37℃、转速为110rpm进行培养2-3天，至密度达到2-3×106个HEK293细胞/mL培养液中时，去除10mL细胞培养液，再添加10mL新鲜培养基，直至细胞活力大于90％，得到含有复苏HEK293细胞的培养液；②将上述①中所得的含有复苏HEK293细胞的培养液置于CO2体积百分比浓度为5％的CO2培养箱中，控制温度为37℃、转速为110rpm进行培养2-3天，至细胞浓度达到2-3×106个HEK293细胞/mLHEK293细胞培养液，完成对HEK293细胞进行第一次细胞扩增培养：将30mL新鲜培养基添加到上述15mL第一次细胞扩增培养后所得的HEK293细胞培养液中，然后放入CO2体积百分比浓度为5％的CO2培养箱中，控制温度为37℃、转速为110rpm进行继续培养，每天需对HEK293细胞浓度及细胞活力检测，当细胞浓度达到2×106个HEK293细胞/mL培养液，完成对HEK293细胞进行第二次细胞扩增培养，培养体积达到约45mL；将90mL新鲜培养基添加到上述45mL第二次细胞扩增培养后所得的HEK293细胞培养液中，然后放入CO2体积百分比浓度为5％的CO2培养箱中，控制温度为37℃、转速为110rpm进行继续培养，每天需对HEK293细胞浓度及细胞活力检测，当细胞浓度达到2-3×106个HEK293细胞/mL培养液，完成对HEK293细胞进行第三次细胞扩增培养，培养体积达到约135mL；
(2)含有pEM-PCV 2b Capsid-Fc或pCDNA3.1(+)-PCV 2b Capsid-Fc转染级质粒的Union-293无血清培养液的制备：
将实施例3所得的转染级pEM-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒添加到的Union-293无血清培养基中，得到20μg/ml的含有转染级pEM-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒的Union-293无血清培养液；
(3)含聚乙烯亚胺的Union-293无血清培养液的制备：
将转染试剂聚乙烯亚胺添加到Union-293无血清培养基中，得到80μg/ml的含聚乙烯亚胺的Union-293无血清培养液；
(4)PEI/DNA的Union-293无血清培养液的制备：
将上述所得的20μg/ml的含有转染级pEM-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒的Union-293无血清培养液与80μg/ml的含聚乙烯亚胺的Union-293无血清培养液按照体积比为1:1的比例混合，在室温下静止20-30min后，得到PEI/DNA的Union-293无血清培养液；
(5)质粒转染HEK293细胞：
取13.5ml PEI/DNA的Union-293无血清培养液加入到135mL步骤(1)中①所得的经过三次扩增培养后的HEK-293F培养液中，然后放入CO2体积百分比浓度为5％的CO2培养箱中控制温度为37℃、转速为110rpm进行培养4-6天，得到的细胞培养液控制转速为1000rpm离心10min，所得的沉淀即含有PCV2b Capsid-Fc融合蛋白的HEK293F细胞；
(6)PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的分离：
将步骤(5)所得的含有PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的HEK293F细胞，用超声裂解缓冲液重悬，然后使用Qsonica LLC公司的型号Q125的超声破碎仪，控制振幅强度输出为34％，工作3秒，停息7秒，总工作时间30min进行超声裂解液，然后控制温度为4℃、转速为12,000rpm离心20min，收集上清液；
所述的超声裂解缓冲液，按每升计算，含50mM Tris、300mM NaCl、20mM pH8.0的咪唑、10g TritonX-100、1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)，余量是水；
含有PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的HEK293F细胞和超声裂解缓冲液的用量，按含有PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的HEK293F细胞的湿重:超声裂解缓冲液为1g:10mL的比例计算；
所述的含有PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的HEK293F细胞的湿重，即为步骤(5)离心后所得的沉淀的实际质量；
(7)PCV2 Capsid-Fc融合蛋白的纯化：
将步骤(6)中离心后收集的上清液上样到Protein A琼脂糖凝胶层析柱(德泰生物科技(南京)有限公司)，按Protein A琼脂糖凝胶层析柱的使用要求进行，依次进行平衡色谱柱、上样、洗杂、洗脱、收集、收集样品中和，再经0.22微米过滤器过滤，得到含有PCV 2bCapsid-Fc融合蛋白的过滤液。
对上述所得的含有PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的过滤液中PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白进行氨基酸序列的测定，其与预期的氨基酸序列与SEQ ID No.2是一致的。
上述所得的一种PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白，其组成结构示意图如图4所示，从图4中可以看出；PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白通过Fc片段的二硫键，能够将单体的PCV 2bCapsid-Fc融合蛋白形成PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白二聚体；
使用I-TRASSER Server以丝带模型对上述所得的PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的3D结构进行预测，其预测结构图如图5所示，从图5中可以看出；PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的衣壳蛋白部分与Fc部分在结构上，不会产生互相干扰，分别有足够的空间构想来发挥个自的功能。
上述所得的PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的SDS-PAGE和Western Blot分析图见图6，其中的A为HEK293F细胞表达后的细胞裂解物和纯化的PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白在变性条件下在12.5％的聚丙烯酰胺凝胶上的电泳图，其中M为marker，泳道1，超声处理后细胞裂解物的上清液泳道2为流穿液，泳道3-8为洗脱液；泳道a超声处理后细胞裂解液的上清液，泳道b为流穿液，泳道c-e为洗脱液，凝胶用考克兰染色进行的SDS-PAGE分析，B为Western Blot蛋白质印迹分析，检测到约59kDa蛋白的特异性条带。从图6中可以看出，在约59kDa位置上有预期条带。由此表明了对细胞表达的裂解物进行纯化，最终获得目标蛋白产物，PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白。
应用实施例
上述的一种PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白在制备用于抗猪圆环病毒2b型感染的PCV2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗中的应用，所述的PCV2 Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗由活性成分PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白和佐剂组成，按质量体积比计算，其中PCV 2bCapsid-Fc融合蛋白∶佐剂为3.3mg∶100mL；
其中所述的佐剂为完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂；
其中的活性成分为PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白自组装成病毒样纳米颗粒。
上述的一种PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗的制备方法，具体步骤如下：
将上述实施例4的步骤(7)中所得的含有PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的过滤液通过透析的方法置换到pH 7.4、含有甘油的体积百分比浓度为10％的1xPBS中后，用0.22微米滤器过滤，然后将经0.22微米滤器过滤后所得的滤液采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定，PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白浓度为66μg/mL。
PCV 2b将上述用0.22微米滤器过滤后所得的滤液取1体积，用pH7.4的1xPBS溶液稀释一倍后，均分两等分，分别与1体积预热至37℃的弗氏完全佐剂和1体积预热至37℃的弗氏非完全佐剂等体积振荡混合，以实现对PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白进行乳化，直至形成稳定的乳化体系，即得到PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗。
上述的PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗，经扫描电镜测定，活性成分PCV2b Capsid-Fc融合蛋白自组装成病毒样纳米颗粒，其粒径约为41nm。
以商业亚单位疫苗(以下简称CSV，即青岛易邦生物工程有限公司生产的抗PCV2亚单位疫苗)、灭活病毒(德国勃林格殷格翰(上海)动物保健品有限公司生产的)为对照，将上述所得的PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗分别采用透射电镜进行扫描，所得的扫描透射电镜图如图7、8、9、10、11、12、13、14、15所示，从图7、8、9的对比中可以看出灭活病毒，PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗和商业亚单位疫苗形态各不相同，从图10、11、12的对比中可以看出灭活病毒与PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗都能形成有规则颗粒状，而商业亚单位疫苗以穗状无规则；从图13、14、15的对比中可以看出灭活病毒大小在15-20纳米左右，PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗纳米颗粒大小约41nm；由此表明了PCV2b Capsid-Fc融合蛋白能够自发形成形态规则的纳米颗粒，平均大小约41n m，为更好激发机体产生免疫响应提供了结构基础。
动物细胞实验
以商业亚单位疫苗(即青岛易邦生物工程有限公司生产的抗PCV2亚单位疫苗)、灭活病毒(德国勃林格殷格翰(上海)动物保健品有限公司生产的)为对照，将上述所得的PCV2b Capsid-Fc蛋白亚单位疫苗分别进行动物细胞免疫实验；
以雌性BLAB/c小鼠(6-8周龄)为实验对象，在华东理工大学生物工程学院特定无病原体动物(SPF)级动物实验室饲养，在正式实验前饲养7天，然后将动物随机分为三个实验组(n＝3只小鼠/组)，并保持在温度和光照受控的环境以及可随意获取食物和水条件；
以腹膜内方式免疫小鼠，用6.6ug疫苗/只小鼠的用量，本发明的PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗和市售抗PCV2亚单位疫苗。对照组为仅接受无菌PBS溶液。PBS溶液配制如下，按每升所含的各物质含量；NaCl，8.0g；KH2PO4，0.2g；Na2HPO4.12H2O，2.9g；KCl，0.2g；再定容至1000mL，调pH值至7.4；
初次免疫后第12、24、36、59、64和70天，从每组小鼠中收集血清，分别测定血清中抗PCV2衣壳蛋白抗体浓度。
淋巴细胞增殖测定和细胞因子测定
从小鼠免疫70天后的免疫小鼠中分离出脾细胞。将脾细胞(5×105细胞/孔)接种到96圆孔板中，添加200μl含10％FBS的RPMI 1640进行培养。用伴刀豆球蛋白ConA(5μg/mL)或疫苗刺激这些脾细胞。在37℃下培养72小时后，然后按等体积100uL的试剂添加到每孔中，并在37℃下孵育15分钟。所使用/>发光细胞活力测定试剂盒(美国Promega)，根据制造商的规程操作，使用自动细胞分析仪在96孔，平坦，透明底部，不透明壁的微孔板中测量淋巴细胞的增殖情况，结果表示为刺激指数(SI)，其根据下式计算：SI＝(免疫组的细胞数–空白对照的细胞数)/(阴性对照组的细胞数–空白对照的细胞数)。
淋巴细胞的增殖情况具体如图16所示，图中EFSV为本发明的PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗，CSV为商业亚单位疫苗、ConA为阳性对照、Control为RPMI 1640对照组，从图16中可以看出，本发明的PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗和商业亚单位疫苗均具有强烈的淋巴细胞刺激作用，并引起增殖反应。用本发明的PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗和商业亚单位疫苗免疫的两组小鼠的SI分别为1.728±0.259，1.430±0.212，都高于RPMI 1640对照组(P<0.05)，而本发明的PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗免疫组SI数值也高于商业亚单位疫苗免疫组。ConA(阳性对照)对照的SI值为2.967±0.713，表明ConA有效地发挥了作用。这些结果表明，本发明的Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗在小鼠中诱导了显著的细胞免疫应答。
抗体滴度的测定
为了进一步研究本发明的PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗即PCV 2bCapsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗和商业亚单位疫苗免疫应答的程度，通过间接ELISA分析，再对取得的自免疫小鼠血清测量PCV2 Capsid衣壳蛋白的特异性抗体水平，具体结果见图17、图18；
从图17中可以看出，初次免疫后第12天，抗体水平微弱增加，第二次加强免疫后，能够高水平产生针对PCV2 Capsid的特异性抗体，抗体浓度超过500ng/ml，并且在整个实验阶段，抗体浓度并保持很高水平，由此表明本发明的PCV2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗能够激发小鼠产生高浓度的PCV2 Capsid特异性抗体抗体，抗体浓度维持高水平；
进一步，从图17中可以看出，用本发明的PCV2 Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗免疫的组中针对PCV2 Capsid衣壳蛋白的特异性抗体的平均水平，在12和24天时间抗体浓度快速提高，从222.38ng/mL提升到461.23ng/mL。36天后，抗体浓度都维持在540ng/mL以上的浓度水平。
图18中对照组为PBS溶液免疫小鼠，EFSV免疫小鼠组为本发明的PCV2bFc融合蛋白亚单位疫苗免疫小鼠组、CSV表示商业亚单位疫苗免疫小鼠组，其中*P＜0.05，**P＜0.01，从图18中可以看出，本发明的PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗和商业亚单位疫苗都能诱导产生抗小鼠PCV2抗体，而本发明的PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗免疫的小鼠组诱导产生的抗体浓度显著高于商业亚单位疫苗免疫的小鼠组，在用商品亚基疫苗免疫的小鼠组，PCV2 Capsid衣壳蛋白的特异性抗体的水平在200-250ng/mL，因此，本发明的PCV2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗与商业亚单位疫苗免疫的小鼠组相比抗体浓度水平提高1倍以上，统计分析，具有显著性差异(P<0.05)，由此表明，本发明的PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗能够很好的刺激小鼠机体产生高浓度的抗体从而提高细胞和体液的免疫力。
为了进一步表征用本发明的PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗(EFSV)和商业亚基疫苗(CSV)免疫的小鼠的抗原特异性细胞免疫特性，本发明人评估了使用本发明的PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗和商业亚单位疫苗来刺激免疫小鼠脾脏T细胞所分泌的细胞因子。测定采用商业化小鼠IFN-γ和IL-10ELISA试剂盒测定(江苏酶免实业有限公司)。与PBS对照组相比，细胞因子IFN-γ分泌浓度为230.76±16.97和237.28±20.11pg/ml，使用本发明的PCV2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗和商业亚基疫苗刺激的免疫小鼠T细胞，T细胞分泌产生的IFN-γ细胞因子分别达到292.17±13.80和293.80±30.50pg/ml，从该数据结果统计学分析，具有显著性差异(P＜0.01，P＜0.05，结果见图19所示；
此外，在以EFSV免疫小鼠脾T细胞用培养基刺激，对比以EFSV免疫小鼠脾T细胞用PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白(PCFFP)刺激，两者平均细胞因子IL-10的分泌浓度分别为17.17±0.85ng/mL和19.11±0.26ng/mL，统计学对两组数据分析显示，具有显著性差异(P<0.05)，然而，在用CSV免疫和用CSV刺激的小鼠中未检测到IL-10分泌的显着差异，结果见图20所示；以上结果表明了本发明的PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗能够更好的诱导小鼠的体液和细胞的免疫反应。
综上所述，本发明提供的一种猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白的表达基因所编码的猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白，其作为活性成分所得的猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗能够更好诱导小鼠的体液和细胞产生免疫反应。
猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白能够形成类病毒样纳米颗粒，具有很好的结构属性，易于激发机体的免疫***产生应激免疫反应。以上数据结果显示，猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白不仅能够诱导小鼠体液免疫和细胞免疫反应，在与商业化亚单位疫苗相比较，以猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白为活性成分的实验疫苗，在有些指标更优于商业化亚单位疫苗。因此，猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白是一种具有很好潜力的防治猪圆环病毒感染的候选疫苗。
以上所述仅是本发明的实施方式的举例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 上海中鹰科技实业有限公司
<120> 猪圆环病毒2b型 Capsid-Fc融合蛋白及其制备方法、基因及构建方法和应用
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1605
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aacggcatct tcaacaccag gctgtccagg accttcggct acaccatcaa gcggaccacc 60
gtgcggacac cttcttgggc cgtggacatg atgcgcttca acatcaacgc cttcctgccc 120
ccaggcggag gctctaatcc tagaagcgtg cctttcgagt actaccggat ccggaaggtg 180
aaggtggagt tttggccttg cagccccatc acccagggag atagaggagt gggaagtagc 240
gccgtgatcc tggacgacaa cttcgtgacc aaggccacag ccctgaccta cgatccttac 300
gtgaactaca gcagccggca caccatcacc cagcccttca gctaccacag ccgctacttc 360
acccctaaac ccgtgctgga cagcaccatc gactacttcc agcccaacaa caagcggaac 420
cagctctggc tgagactgca gacagcaggc aacgtggatc acgtgggact gggaacagcc 480
ttcgagaaca gcatctacga ccagggctac aacatccgcg tgaccatgta cgtgcagttc 540
cgggagttca acctgaagga cccccccctg aatccaggaa gcggaggagg aagcggagga 600
ggaggaagcg gaggaggaag cgcccctaaa acagctccta gcgtgtatcc tctggcccct 660
tgtggcagag atacaagcgg ccctaacgtg gctctgggct gtctggcctc tagctacttc 720
ccagagcccg tgaccatgac ttggaacagc ggagccctga caagcggagt gcacaccttt 780
cctagcgtgc tgcagcctag cggactgtat agcctgagca gcatggtgac agtgccagcc 840
tctagcctga gcagcaagag ctacacttgc aacgtgaacc accccgccac cacaacaaag 900
gtggacaagc gcgtgggcac caagacaaag cctccttgcc ccatttgtcc aggttgcgag 960
gtggccggcc ctagcgtgtt tatcttccct cctaagccca aggacaccct gatgatcagc 1020
cagaccccag aagtgacttg cgtggtggtg gacgtgtcta aggagcacgc cgaggtgcag 1080
ttcagttggt acgtggacgg cgtggaagtg cacacagccg agacaagacc caaggaggag 1140
cagttcaaca gcacctaccg cgtggtgtcc gtgctgccta tccagcacca ggattggctg 1200
aagggcaagg agttcaagtg caaggtcaac aacgtggacc tgccagcccc tatcaccaga 1260
acaatcagca aggccatcgg acagagcagg gagcctcagg tgtacacact gcctcctcca 1320
gcagaggagc tgagcaggag caaagtgacc gtgacctgcc tggtcatcgg cttttacccc 1380
ccagacatcc acgtcgagtg gaagagtaac gggcagccag agccagaggg caactacaga 1440
accacacctc ctcagcagga cgtggacgga acattcttcc tgtacagcaa gctggccgtg 1500
gacaaagctc gctgggatca cggggagacc ttcgaatgcg cagtgatgca cgaggccctg 1560
cataaccact acacccagaa gagcatcagc aagacccagg gcaag 1605
<210> 2
<211> 535
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Ile
1 5 10 15
Lys Arg Thr Thr Val Arg Thr Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg
20 25 30
Phe Asn Ile Asn Ala Phe Leu Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Arg
35 40 45
Ser Val Pro Phe Glu Tyr Tyr Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe
50 55 60
Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser
65 70 75 80
Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr
85 90 95
Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro
100 105 110
Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser
115 120 125
Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu
130 135 140
Arg Leu Gln Thr Ala Gly Asn Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala
145 150 155 160
Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp Gln Gly Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met
165 170 175
Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro
180 185 190
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala
195 200 205
Pro Lys Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Cys Gly Arg Asp
210 215 220
Thr Ser Gly Pro Asn Val Ala Leu Gly Cys Leu Ala Ser Ser Tyr Phe
225 230 235 240
Pro Glu Pro Val Thr Met Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
245 250 255
Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Pro Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
260 265 270
Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ala Ser Ser Leu Ser Ser Lys Ser Tyr
275 280 285
Thr Cys Asn Val Asn His Pro Ala Thr Thr Thr Lys Val Asp Lys Arg
290 295 300
Val Gly Thr Lys Thr Lys Pro Pro Cys Pro Ile Cys Pro Gly Cys Glu
305 310 315 320
Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
325 330 335
Leu Met Ile Ser Gln Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
340 345 350
Ser Lys Glu His Ala Glu Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Gly Val
355 360 365
Glu Val His Thr Ala Glu Thr Arg Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn Ser
370 375 380
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Leu
385 390 395 400
Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Val Asp Leu Pro Ala
405 410 415
Pro Ile Thr Arg Thr Ile Ser Lys Ala Ile Gly Gln Ser Arg Glu Pro
420 425 430
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Pro Ala Glu Glu Leu Ser Arg Ser Lys
435 440 445
Val Thr Val Thr Cys Leu Val Ile Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile His
450 455 460
Val Glu Trp Lys Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Gly Asn Tyr Arg
465 470 475 480
Thr Thr Pro Pro Gln Gln Asp Val Asp Gly Thr Phe Phe Leu Tyr Ser
485 490 495
Lys Leu Ala Val Asp Lys Ala Arg Trp Asp His Gly Glu Thr Phe Glu
500 505 510
Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
515 520 525
Ile Ser Lys Thr Gln Gly Lys
530 535
<210> 3
<211> 576
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aacggcatct tcaacaccag gctgtccagg accttcggct acaccatcaa gcggaccacc 60
gtgcggacac cttcttgggc cgtggacatg atgcgcttca acatcaacgc cttcctgccc 120
ccaggcggag gctctaatcc tagaagcgtg cctttcgagt actaccggat ccggaaggtg 180
aaggtggagt tttggccttg cagccccatc acccagggag atagaggagt gggaagtagc 240
gccgtgatcc tggacgacaa cttcgtgacc aaggccacag ccctgaccta cgatccttac 300
gtgaactaca gcagccggca caccatcacc cagcccttca gctaccacag ccgctacttc 360
acccctaaac ccgtgctgga cagcaccatc gactacttcc agcccaacaa caagcggaac 420
cagctctggc tgagactgca gacagcaggc aacgtggatc acgtgggact gggaacagcc 480
ttcgagaaca gcatctacga ccagggctac aacatccgcg tgaccatgta cgtgcagttc 540
cgggagttca acctgaagga cccccccctg aatcca 576
<210> 4
<211> 192
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Ile
1 5 10 15
Lys Arg Thr Thr Val Arg Thr Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg
20 25 30
Phe Asn Ile Asn Ala Phe Leu Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Arg
35 40 45
Ser Val Pro Phe Glu Tyr Tyr Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe
50 55 60
Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser
65 70 75 80
Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr
85 90 95
Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro
100 105 110
Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser
115 120 125
Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu
130 135 140
Arg Leu Gln Thr Ala Gly Asn Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala
145 150 155 160
Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp Gln Gly Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met
165 170 175
Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro
180 185 190
<210> 5
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggaagcggag gaggaagcgg aggaggagga agcggaggag gaagc 45
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 7
<211> 984
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gcccctaaaa cagctcctag cgtgtatcct ctggcccctt gtggcagaga tacaagcggc 60
cctaacgtgg ctctgggctg tctggcctct agctacttcc cagagcccgt gaccatgact 120
tggaacagcg gagccctgac aagcggagtg cacacctttc ctagcgtgct gcagcctagc 180
ggactgtata gcctgagcag catggtgaca gtgccagcct ctagcctgag cagcaagagc 240
tacacttgca acgtgaacca ccccgccacc acaacaaagg tggacaagcg cgtgggcacc 300
aagacaaagc ctccttgccc catttgtcca ggttgcgagg tggccggccc tagcgtgttt 360
atcttccctc ctaagcccaa ggacaccctg atgatcagcc agaccccaga agtgacttgc 420
gtggtggtgg acgtgtctaa ggagcacgcc gaggtgcagt tcagttggta cgtggacggc 480
gtggaagtgc acacagccga gacaagaccc aaggaggagc agttcaacag cacctaccgc 540
gtggtgtccg tgctgcctat ccagcaccag gattggctga agggcaagga gttcaagtgc 600
aaggtcaaca acgtggacct gccagcccct atcaccagaa caatcagcaa ggccatcgga 660
cagagcaggg agcctcaggt gtacacactg cctcctccag cagaggagct gagcaggagc 720
aaagtgaccg tgacctgcct ggtcatcggc ttttaccccc cagacatcca cgtcgagtgg 780
aagagtaacg ggcagccaga gccagagggc aactacagaa ccacacctcc tcagcaggac 840
gtggacggaa cattcttcct gtacagcaag ctggccgtgg acaaagctcg ctgggatcac 900
ggggagacct tcgaatgcgc agtgatgcac gaggccctgc ataaccacta cacccagaag 960
agcatcagca agacccaggg caag 984
<210> 8
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Ala Pro Lys Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Cys Gly Arg
1 5 10 15
Asp Thr Ser Gly Pro Asn Val Ala Leu Gly Cys Leu Ala Ser Ser Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Met Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Pro Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ala Ser Ser Leu Ser Ser Lys Ser
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Pro Ala Thr Thr Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Gly Thr Lys Thr Lys Pro Pro Cys Pro Ile Cys Pro Gly Cys
100 105 110
Glu Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Gln Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser Lys Glu His Ala Glu Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Thr Ala Glu Thr Arg Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
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Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Val Asp Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Thr Arg Thr Ile Ser Lys Ala Ile Gly Gln Ser Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Pro Ala Glu Glu Leu Ser Arg Ser
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Lys Val Thr Val Thr Cys Leu Val Ile Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile
245 250 255
His Val Glu Trp Lys Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Gly Asn Tyr
260 265 270
Arg Thr Thr Pro Pro Gln Gln Asp Val Asp Gly Thr Phe Phe Leu Tyr
275 280 285
Ser Lys Leu Ala Val Asp Lys Ala Arg Trp Asp His Gly Glu Thr Phe
290 295 300
Glu Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
305 310 315 320
Ser Ile Ser Lys Thr Gln Gly Lys
325
<210> 9
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctcactatag ggagacccaa gctggctagc ccgccgccac catgggctgg agct 54
<210> 10
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
actagtggat ccgagctcgg taccaagctt ttatcacttg ccctgggtct tgct 54
<210> 11
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gccgccacca tgg 13
<210> 12
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atgggctgga gctgcatcat cctgttcctc gtggccacag ccacaggagt gcactct 57
<210> 13
<211> 1691
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gctagcccgc cgccaccatg ggctggagct gcatcatcct gttcctcgtg gccacagcca 60
caggagtgca ctctaacggc atcttcaaca ccaggctgtc caggaccttc ggctacacca 120
tcaagcggac caccgtgcgg acaccttctt gggccgtgga catgatgcgc ttcaacatca 180
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ggatccggaa ggtgaaggtg gagttttggc cttgcagccc catcacccag ggagatagag 300
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gactgggaac agccttcgag aacagcatct acgaccaggg ctacaacatc cgcgtgacca 600
tgtacgtgca gttccgggag ttcaacctga aggacccccc cctgaatcca ggaagcggag 660
gaggaagcgg aggaggagga agcggaggag gaagcgcccc taaaacagct cctagcgtgt 720
atcctctggc cccttgtggc agagatacaa gcggccctaa cgtggctctg ggctgtctgg 780
cctctagcta cttcccagag cccgtgacca tgacttggaa cagcggagcc ctgacaagcg 840
gagtgcacac ctttcctagc gtgctgcagc ctagcggact gtatagcctg agcagcatgg 900
tgacagtgcc agcctctagc ctgagcagca agagctacac ttgcaacgtg aaccaccccg 960
ccaccacaac aaaggtggac aagcgcgtgg gcaccaagac aaagcctcct tgccccattt 1020
gtccaggttg cgaggtggcc ggccctagcg tgtttatctt ccctcctaag cccaaggaca 1080
ccctgatgat cagccagacc ccagaagtga cttgcgtggt ggtggacgtg tctaaggagc 1140
acgccgaggt gcagttcagt tggtacgtgg acggcgtgga agtgcacaca gccgagacaa 1200
gacccaagga ggagcagttc aacagcacct accgcgtggt gtccgtgctg cctatccagc 1260
accaggattg gctgaagggc aaggagttca agtgcaaggt caacaacgtg gacctgccag 1320
cccctatcac cagaacaatc agcaaggcca tcggacagag cagggagcct caggtgtaca 1380
cactgcctcc tccagcagag gagctgagca ggagcaaagt gaccgtgacc tgcctggtca 1440
tcggctttta ccccccagac atccacgtcg agtggaagag taacgggcag ccagagccag 1500
agggcaacta cagaaccaca cctcctcagc aggacgtgga cggaacattc ttcctgtaca 1560
gcaagctggc cgtggacaaa gctcgctggg atcacgggga gaccttcgaa tgcgcagtga 1620
tgcacgaggc cctgcataac cactacaccc agaagagcat cagcaagacc cagggcaagt 1680
gataaaagct t 1691

Claims (7)

1.一种猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNo.2。
2.一种编码表达猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白的基因，其特征在于，其碱基序列表如SEQ ID No.1。
3.一种表达重组猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白的重组载体，其特征在于，含有编码表达重组猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白的基因序列如SEQ ID No.13所示。
4.如权利要求3中所述的编码表达重组猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白的基因的构建方法，其特征在于，对现有猪圆环病毒2型疫苗免疫失败的GenBank accession numberALD 62452.1的PCV 2b 41513病毒毒株的衣壳蛋白改造，去除该衣壳蛋白N端41个氨基酸，在C端连接多肽linker，并融合猪IgG Fc片段，在N端依次添加Kozak序列和人IgG2 H重链信号肽，然后进行全基因密码子优化，得到猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白的表达基因。
5.如权利要求3所述的一种表达猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白的重组载体，其特征在于，所述重组载体制备所用的质粒为pCDNA3.1（+）质粒。
6.如权利要求1所述的猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
（1）根据权利要求4所述方法构建所述的猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白的表达基因；
（2）含有猪圆环病毒2b型 Capsid-Fc融合蛋白表达基因的pCDNA3.1（+）-PCV 2bCapsid-Fc重组质粒的构建；
（3）重组质粒转染到大肠杆菌DH5α：将步骤（2）所得的pCDNA3.1（+）-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒转染到大肠杆菌DH5α，得到含有pCDNA3.1（+）-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒的大肠杆菌DH5α；
（4）分别通过重组大肠杆菌DH5α进行扩增，得到转染级的pCDNA3.1（+）-PCV 2bCapsid-Fc重组质粒；
（5）将上述的转染级的pCDNA3.1（+）-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒转染到哺乳细胞HEK293F后依次经悬浮培养后，经分离、纯化，获得目标猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白产物。
7.如权利要求1所述的猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白用于制备抗猪圆环病毒2b型感染的猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗。
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