CN113755593A - 检测HLA-A基因SNP标记rs1136697-G的PCR扩增引物、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测HLA‑A基因SNP标记rs1136697‑G的PCR扩增引物，包括上游引物rs113‑SF2和下游rs113‑REV1，rs113‑SF2：5’‑CACACCgTCCAgAggATgAg‑3’；rs113‑REV1：5’‑TgCgCTgCAgCgTCTCCTT‑3’。还公开了相应的试剂盒及检测方法，既可特异性检测HLA‑A基因SNPrs1136697‑G，又可作为内参照，只用一对PCR引物就能实现对PCR‑SSP的检测，扩增过程快速、结果准确，避免出现假阳性、假阴性结果，可用于HLA基因SNPrs1136697‑G分型、鼻咽癌易感标记检测和高危人群筛查与预警等领域。
Description
技术领域
本发明属于鼻咽癌易感标记检测领域，尤其涉及一种用于检测HLA-A基因SNP标记rs1136697-G的PCR扩增引物、试剂盒及检测HLA-A基因SNP标记rs1136697-G的方法。
背景技术
HLA-A基因SNP标记rs1136697-G近期已被证实为中国南方人群鼻咽癌的一个重要的遗传易感标记(OR(95％CI)＝1.79(1.54–2.09),P<0.0001)。现有人类白细胞抗原(HLA)基因分型技术均基于聚合酶链式反应(PCR)，其中PCR-SSP(Sequence specific priming,序列特异性引物技术)因具有快速、实验操作简洁的特点，被广泛应用。该技术利用了PCR扩增很大程度上依赖引物3’末端与待测序列的互补性这一原理，但现有的PCR-SSP技术至少需要设计2对PCR引物，除特异性引物外，另有一对为内参照引物，由于内参照引物与特异性引物在同一PCR体系内扩增，彼此间存在相互竞争与干扰，需反复优化实验参数和各组分浓度，可出现结果难以判定乃至假阳性、假阴性结果。
因此，开发一套既能检测HLA靶基因SNP标记、又可同时作为内参照的PCR引物具有十分重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，以鼻咽癌易感标记之一——HLA-A基因SNP rs1136697-G为研究对象，研发一种既能检测靶标记、又可同时作为内参照的PCR扩增引物、试剂盒及检测HLA-A基因SNP标记rs1136697-G的方法。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
一种检测HLA-A基因SNP标记rs1136697-G的PCR扩增引物，包括上游引物rs113-SF2和下游rs113-REV1，其碱基序列如下：
rs113-SF2：5’-CACACCgTCCAgAggATgAg-3’(由SEQ ID NO:1所示)；
rs113-REV1：5’-TgCgCTgCAgCgTCTCCTT-3’(由SEQ ID NO:2所示)。
该PCR扩增引物是在HLA-A基因第3外显子设计的一套PCR引物，通过在上游引物3’末端第2位碱基人为引入错配特异性扩增rs1136697-G，PCR产物长度为268bp；该引物对并识别人类血管生成素(ANG)基因保守区域，PCR产物扩增长度为360bp，可作为PCR反应的内参照。该PCR扩增引物既可检测HLA基因SNP标记，同时又可作为内参照，扩增过程快速、结果准确。
基于一个总的发明构思，本发明还提供一种试剂盒，包含SEQ ID NO:1-2所述的PCR扩增引物。
上述的HLA-A基因的试剂盒，进一步的，包含：1.3pmole上游引物rs113-SF2、1.3pmole下游引物rs113-REV1、5μL 2×Taq MastMix和ddH2O。
基于一个总的发明构思，本发明还提供一种检测HLA-A基因SNP标记rs1136697-G的方法，包括如下步骤：
(1)提取样本DNA；
(2)利用所述的PCR扩增引物，对所述步骤(1)得到的样本DNA进行PCR扩增；
(3)将所述步骤(2)得到的PCR扩增产物进行琼脂糖电泳，读取电泳结果；若同时出现268bp和360bp的条带，则鉴定为rs1136697-G阳性样本；若仅出现360bp的条带，则鉴定为rs1136697-G阴性样本。
上述的方法，进一步的，所述PCR扩增的反应体系含：2×Taq MastMix 5μL、上游引物rs113-SF2 1.3pmole、下游引物rs113-REV1 1.3pmole、基因组DNA 50ng，用灭菌ddH2O补足反应体系至10μL。
进一步的，所述PCR扩增的反应参数条件为：预变性95℃，2min；95℃变性30s，63℃退火50s，72℃延伸30s，循环35次，再72℃延伸5min。
进一步的，所述琼脂糖电泳的参数条件为：采用2％琼脂糖电泳，200V，电泳15min。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明的PCR扩增引物，既可检测特异性靶序列(HLA-A基因SNPrs1136697-G)，同时又可作为内参照，只用一对PCR引物就能实现对PCR-SSP的检测，扩增过程快速、结果准确，避免出现假阳性、假阴性结果，可用于HLA基因SNPrs1136697-G分型、鼻咽癌易感标记检测和高危人群筛查与预警等领域。
2、本发明的检测方法，以人类外周血基因组DNA为模板，经PCR扩增后行2％琼脂糖电泳，根据PCR产物带型即可判定结果；采用单盲法对经Sanger测序的HLA-A基因型数据进行检测，证实该方法快速、准确。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的PCR扩增引物与HLA-A基因SNP标记rs1136697序列比对；
图2为本发明的PCR扩增引物核心序列与人类血管生成素(Homo sapiensangiogenin，ANG)基因序列比对；
图3是实施例的PCR扩增产物的琼脂糖电泳结果；
图4是实施例的Sanger测序结果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例：
一种用于检测HLA-A基因SNP标记rs1136697-G的PCR扩增引物，PCR扩增引物信息如下表1所示：
表1：本发明的PCR扩增引物信息
| 引物名称 | 序列(5’-3’) |
| rs113-SF2 | 5’-CACACCgTCCAgAggATgAg-3’(由SEQIDNO:1所示) |
| rs113-REV1 | 5’-TgCgCTgCAgCgTCTCCTT-3’(由SEQIDNO:2所示) |
该PCR扩增引物是在HLA-A基因第3外显子设计的一套PCR引物，通过在上游引物3’末端第2位碱基人为引入错配特异性扩增rs1136697-G，PCR产物长度为268bp；该引物对并识别人类血管生成素(ANG)基因保守区域，PCR产物扩增长度为360bp，可作为PCR反应的内参照。该PCR扩增引物与HLA-A基因SNP标记rs1136697序列比对情况如图1所示。PCR扩增引物核心序列与人类血管生成素(Homo sapiens angiogenin，ANG)基因序列比对情况如图2所示。
上述PCR扩增引物还可以制成试剂盒，包含：1.3pmole上游引物rs113-SF2、1.3pmole下游引物rs113-REV1、5μL 2×Taq MastMix和灭菌ddH2O。
采用上述PCR扩增引物检测HLA-A基因SNP标记rs1136697-G的方法，包括如下步骤：
(1)人外周血基因组DNA提取：
取5％EDTA-Na2抗凝外周血0.5mL，加1mL红细胞裂解液，混匀，13000rpm离心1min，去上清，用1ml ddH2O洗涤细胞沉淀，去上清后加80μL蛋白酶K缓冲液，40μL 10％SDS，30μL蛋白酶K，220μL ddH2O混匀，56℃孵育10min。加入1/4体积饱和醋酸钠，剧烈震荡15秒，13000rpm离心6min，将上清转移至另一灭菌Eppendorf管内，加入等体积异丙醇，轻轻混匀至DNA呈絮状析出，13000rpm离心1min，收集DNA。用预冷的70％乙醇溶液洗涤DNA，共3次。去上清，于室温放置3～5分钟后加TE液200μL，-20℃保存备用。
(2)PCR扩增：
PCR反应体系含：2×Taq MastMix 5μL、rs113-SF2和rs113-REV1引物各1.3pmole、基因组DNA 50ng，用灭菌ddH2O补足反应体系至10μL；
PCR扩增参数为：预变性95℃，2min；95℃变性30s，63℃退火50s，72℃延伸30s，循环35次，再72℃延伸5min；
(3)PCR产物的2％琼脂糖电泳：200V，电泳15min；
(4)结果记录与分析：读取电泳结果，若同时出现268bp和360bp的条带，则鉴定为rs1136697-G阳性样本；若仅出现360bp的条带，则鉴定为rs1136697-G阴性样本。
上述2％琼脂糖电泳结果如图3所示，DNA标本5-6为rs1136697-G阳性样本，各泳道有明亮的268bp特异性产物，并有360bp条带；(2)DNA标本1-4、7、9-12为rs1136697-G阴性样本，各泳道仅有360bp产物条带；第8孔为空白对照(ddH2O作为模板)，M为100bp DNAladder，最小片段为100bp。
上述rs1136697-G阳性、阴性DNA样本均已经Sanger测序做HLA-A基因型测定。对上述360bp条带采用Sanger方法测序(如图4所示)，证实均为人类血管生成素(ANG)序列。说明本发明的PCR扩增引物既可检测特异性靶序列(HLA-A基因SNPrs1136697-G)，同时又可作为内参照，根据PCR产物的电泳结果带型即可判定HLA-A基因SNP rs1136697-G的检测结果。采用单盲法对经Sanger测序的HLA-A基因型数据进行检测，证实该方法快速、准确。
序列表
<110> 中南大学
<120> 检测HLA-A基因SNP标记rs1136697-G的PCR扩增引物、试剂盒及方法
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Claims (7)
1.一种检测HLA-A基因SNP标记rs1136697-G的PCR扩增引物，其特征在于，包括上游引物rs113-SF2和下游rs113-REV1，其碱基序列如下：
rs113-SF2：5’-CACACCgTCCAgAggATgAg-3’；
rs113-REV1：5’-TgCgCTgCAgCgTCTCCTT-3’。
2.一种试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1所述的PCR扩增引物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，包含：1.3pmole上游引物rs113-SF2、1.3pmole下游引物rs113-REV1、5μL 2×Taq MastMix和ddH2O。
4.一种检测HLA-A基因SNP标记rs1136697-G的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取样本DNA；
(2)利用权利要求1所述的PCR扩增引物，对所述步骤(1)得到的样本DNA进行PCR扩增；
(3)将所述步骤(2)得到的PCR扩增产物进行琼脂糖电泳，读取电泳结果；若同时出现268bp和360bp的条带，则鉴定为rs1136697-G阳性样本；若仅出现360bp的条带，则鉴定为rs1136697-G阴性样本。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系含：2×TaqMastMix5μL、上游引物rs113-SF2 1.3pmole、下游引物rs113-REV1 1.3pmole、基因组DNA50ng，用灭菌ddH2O补足反应体系至10μL。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应参数条件为：预变性95℃，2min；95℃变性30s，63℃退火50s，72℃延伸30s，循环35次，再72℃延伸5min。
7.根据权利要求4-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述琼脂糖电泳的参数条件为：采用2％琼脂糖电泳，200V，电泳15min。
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- 2021-09-23 CN CN202111112575.9A patent/CN113755593B/zh active Active
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
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Also Published As
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|---|---|
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