CN106755496A - 基于高通量测序技术检测遗传性耳聋基因的多重pcr特异性引物、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因检测领域，特别涉及一种基于高通量测序技术检测遗传性耳聋基因的多重PCR特异性引物、试剂盒及方法。所述引物包括52对特异性引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：104所示；所述试剂盒还包括所述特异性引物、通用引物、酶混合物、质控品、无核酸酶水。本发明还公开了运用所述引物或试剂盒用一次PCR扩增反应捕获和扩增遗传性耳聋基因的检测方法。本发明方案有效提高检测效率、准确率，同时降低成本、简化操作步骤。
Description
技术领域
本发明属于基因检测领域，特别涉及一种基于高通量测序技术检测遗传性耳聋基因的多重PCR特异性引物、试剂盒及检测方法。
背景技术
耳聋属于临床常见出生缺陷，在中国，听力语言残疾患者超过2700万，居各类残疾之首。在新生儿群体中，先天性听力障碍的发生率高达1-3/1000，据估算，我国每年新增3-6万耳聋患者，而这些耳聋残疾约60％由遗传因素引起的。
遗传性耳聋基因检测是通过检测受检者耳聋致病基因情况，指导耳聋患者或高风险人群的干预和治疗，同时通过对耳聋基因检测结果的分析，确定遗传方式，对患者家庭成员的患病风险，基因携带风险，子代患病风险等作出科学评估，指导科学婚育，从源头上预防耳聋出生缺陷。
目前检测耳聋遗传病基因常见方法有Sanger法、基因芯片法、荧光定量PCR法、多色荧光溶解曲线分析法、高通量测序法等。Sanger测序法测序每次只能对一个样品的某一段区域进行测序，检测效率低、成本高，且灵敏度低(20％)。基因芯片法、荧光定量PCR法检测耳聋遗传病基因，该方法只能针对一个或数个已知突变的位点设计检测探针形成检测芯片，因此无法用于检测未知突变位点，检测的结果也就不够全面、准确。多色荧光溶解曲线分析法，所用的荧光染料是通用的双链DNA嵌入剂，对引物二聚体和非特异扩增产物无法识别，容易造成假阳性。高通量测序法主要是由测序仪器提供商提供的测序仪配套文库构建试剂盒，经过了供应公司严格的质控评估，具有较好的建库效果，但缺点是试剂盒货期长、试剂盒包装规格固定、试验灵活性不够等。一些试剂厂商根据文献中分享报道的实验方法进行建库，但所完成的实验效果参差不齐，测序质量不高，影响临床参考价值。
目前，市面上检测耳聋基因主流为GJB2(基因突变临床表现为先天性重度耳聋)、GJB3(基因突变临床表现为后天高频感音神经性耳聋)、SLC26A4(基因突变临床表现为先天性或迟发型耳聋)、MT-RNR1(基因突变临床表现为药物性耳聋，携带基因突变的个体对氨基糖苷类药物敏感，就是常说的“一针致聋”)4个常见遗传性耳聋基因，且检测多以位点筛查为主，检测的基因突变信息少，不足以反映遗传性耳聋的突变整体情况。
由此可见，现有技术还有待改进。
发明内容
鉴于此，有必要针对上述问题提供一种基于高通量测序技术检测遗传性耳聋基因的多重PCR特异性引物、试剂盒及检测方法。所述引物覆盖GJB2、GJB3、SLC26A4、MT-RNR1、FOXI1、KCNJ10六种基因全外显子中所有常见与罕见的突变位点；能够同时检测多个样本多个遗传性耳聋易感基因，有效提高检测效率、准确率，同时降低成本、简化操作步骤。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种基于高通量测序技术检测遗传性耳聋致病基因的多重PCR特异性引物，包括52对特异性引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：104所示。
进一步的，所述特异性引物为经过修饰的引物。
进一步的，所述特异性引物的修饰方法为硫代修饰、脱氧尿嘧啶修饰、5’反向dT修饰中的一种或几种。
进一步的，所述特异性引物的Tm值为58-62℃。
一种基于高通量测序技术检测遗传性耳聋致病基因的试剂盒，包括上述引物中的至少两对。
进一步的，所述试剂盒还包括通用引物、酶混合物、质控品、无核酸酶水；所述酶混合物包括：高保真DNA聚合酶、PCR Buffer、dNTP混合物等。
进一步的，所述质控品为人正常基因组DNA，来源于市售。
进一步的，所述特异性引物3’端和5’端分别标记Tag1和Tag2。
进一步的，所述特异性引物3’端Tag1序列与目标区域完全互补或部分互补；特异性引物5’端Tag2与通用引物完全互补或部分互补。
进一步的，所述通用引物用于对特异引物扩增目标区域的扩增产物进行再次扩增，对不同待测样品的目标区域扩增产物进行标记。
进一步的，所述通用引物3’端Tag3与特异引物Tag2完全互补或部分互补，长度为50-70bp。
进一步的，所述特异性引物或试剂盒应用于遗传性耳聋致病基因检测。
基于高通量测序技术检测遗传性耳聋致病基因的方法，包括：
S1：使用磁珠法对样本进行核酸提取，然后进行浓度及纯度的测定，测定合格后进行定量稀释，备用；
S2：用含所述特异性引物的反应体系或所述试剂盒对S1中所提取的核酸的目标区域进行一次PCR扩增，收集扩增产物备用；
S3：使用磁珠法对S2中扩增产物进行核酸纯化，进行浓度及纯度的测定，混样，定量，上机测序。
进一步的，含所述特异性引物的反应体系为：
所述酶混合物包括：高保真DNA聚合酶、PCR Buffer、dNTP混合物等。
进一步的，所述PCR扩增的反应程序为：
进一步的，所述遗传性耳聋致病基因包括FOXI1(引物序列SEQ ID NO:1-SEQ IDNO:10)、KCNJ10(引物序列SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:34)、SLC26A4(引物序列SEQ ID NO:35-SEQ ID NO:78)、GJB2(引物序列SEQ ID NO:79-SEQ ID NO:90)、GJB3(引物序列SEQ IDNO:91-SEQ ID NO:100)、MT-RNR1(引物序列SEQ ID NO:101-SEQ ID NO:104)六个基因。
进一步的，步骤(2)中所述的核酸的目标区域，包括但不限于GJB2、GJB3、SLC26A4、MT-RNR1、FOXI1、KCNJ10六个基因上的内部序列、基因的外部调控序列；所述基因内部序列，包括但不限于基因的内含子区域、外显子区域、同时含有内含子与外显子的区域。
进一步的，所述检测方法的检测样本包括离体的全血、口腔脱落细胞和组织样品等；所述组织样品包括石蜡包埋组织、新鲜组织和冰冻切片等。
上述高通量测序平台包含但不限于Illumina HiSeq/MiSeq、Life的Ion Torrent/Proton平台、华大基因的BGISEQ-500/50等测序平台。
本发明有益效果：
本发明提供的基于高通量测序技术检测遗传性耳聋基因的多重PCR特异性引物，检测基因范围除了常见的GJB2、GJB3、SLC26A4、MT-RNR1基因全部外显子检测，还包括其它耳聋致病基因相关基因FOXI1(叉头转录因子家族)、KCNJ10(内向整流型钾通道家族)基因全部外显子检测，覆盖上述六种基因所有常见与罕见得突变位点；能够同时检测多个样本、多个遗传性耳聋易感基因，有效提高检测效率、准确率，同时降低成本、简化操作步骤等。
本发明提供的引物是针对遗传性耳聋致病基因GJB2、GJB3、SLC26A4、MT-RNR1、FOXI1、KCNJ10的全外显子设计的引物，覆盖范围广、检测位点多。每对特异性引物扩增目标区域大小为450-550bp，所有引物Tm值统一设计为58-62℃。
本发明提供的多重PCR引物设计时引进修饰，比如硫代修饰、脱氧尿嘧啶修饰、5’反向dT修饰等修饰方法，修饰后的引物不易被核酸酶降解，确保PCR扩增特异性的同时保证其扩增效率；且具有相对均一的Tm值，在多重扩增时表现出很好的特异性、稳定性及均一性，同时不存在非特异扩增，此方法省去多轮引物筛选的工作。具体的，硫代修饰后的引物序列寡核苷酸链上带双键的氧原子被硫原子取代的衍生物，能够抵抗核酸酶的降解，增强引物稳定性；脱氧尿嘧啶修饰后的引物寡核苷酸序列中每个脱氧胸腺嘧啶被脱氧尿嘧啶替代，可以使双链溶解温度增长1.7℃，从而增加双链的稳定性；5’反向dT修饰后的引物寡核苷酸序列5’末端含有反向dT，从而形成交联，形成的交联可以抑制在DNA聚合酶延伸过程中的外切核酸酶的降解作用。
本发明的基于高通量测序平台的针对遗传性耳聋发病率较高的致病基因的多重PCR引物、试剂盒和检测方法，能够用一次PCR扩增反应捕获和扩增多个样本多个遗传性耳聋致病基因，包括点突变、短片段***缺失等遗传性突变，有效提高检测效率、准确率，同时降低成本、简化操作步骤、灵活提供试剂盒包装规格等。
本发明利用高通量基因测序技术突破传统检测技术的限制，提高检测灵敏度；同时还能检测包括已知突变和未知突变位点的变异情况，得到全面准确的检测结果。通过对遗传性耳聋致病基因及其突变位点进行测序，可得到具体的基因序列信息，进而评估耳聋的遗传风险，指导耳聋患者或高风险人群的干预和治疗，同时通过对耳聋基因检测结果的分析，确定遗传方式，对患者家庭成员的患病风险，携带着风险，子代患病风险等作出科学评估，指导科学婚育，从源头上预防耳聋出生缺陷。
本发明采用磁珠纯化核酸的方式，省去了传统建库中的离心柱式纯化，操作简单；其次，本发明针对高通量测序平台设计的引物只需要一轮PCR，通过选取温度梯度、时间梯度、循环数经过大量正交实验，优化PCR反应程序，将样品建库的两次扩增融合在一个PCR反应体系进行，且本发明方法用引物直接在目标基因链中捕获目标区域并进行扩增，不需要对目标基因进行截断修饰等处理，节省了检测时间和成本。
附图说明
图1为检测遗传性耳聋致病基因的方法流程图。
图2为目标基因建库PCR扩增的原理图。
图3引物特异性验证结果图；其中，M：Marker；N：阴性对照；P：阳性对照；1-3：1-3号全血样品验证；4-6：4-6号口腔脱落细胞样品验证；7-9：7-9号石蜡组织样品验证。
图4引物灵敏度验证结果图；其中，M：Marker；N：阴性对照；P：阳性对照；1-3：1号全血样品三种模板浓度灵敏度验证；4-6：4号口腔脱落细胞样品三种模板浓度灵敏度验证；7-9：7号石蜡组织样品三种模板浓度灵敏度验证。
图5引物重复性验证结果图；其中，M：Marker；N：阴性对照；P：阳性对照；1-3：实验员A检测2号全血样品、5号口腔脱落细胞样品、8号石蜡组织样品验证结果；4-6：实验员B检测2号全血样品、5号口腔脱落细胞样品、8号石蜡组织样品验证结果。
具体实施方式
为了更好地说明本发明所解决的问题、所采用的技术方案和所达到的效果，现结合具体实施例和相关资料进一步阐述。需要说明的是，本发明内容包含但不限于以下实施例及其组合实施方式。
实施例1基于高通量测序技术检测遗传性耳聋致病基因的多重PCR特异性引物、试剂盒及检测方法
1、引物的设计
所述对遗传性耳聋致病基因序列选自于University of California Santa Cruz(UCSC)数据库，选用Primer3引物设计软件进行易感基因全外显子引物设计，设计范围包含了该基因中所有常见和不常见的突变热点。
所述对遗传性耳聋致病基因全外显子进行设计的引物共52对，每对特异性引物扩增目标区域大小为450-550bp，覆盖范围广、检测位点多；特异引物设计时引进特异性修饰，修饰后的引物不易被核酸酶降解，且具有相对均一的Tm值，统一设计为60℃左右(±2℃)；所述引物在多重扩增时表现出很好的特异性、稳定性及均一性，同时不存在非特异扩增。具体的，所述引物特异修饰方法为硫代修饰、脱氧尿嘧啶修饰、5’反向dT修饰中的一种或几种。所述硫代修饰后的引物序列寡核苷酸链上带双键的氧原子被硫原子取代的衍生物，能够抵抗核酸酶的降解，增强引物稳定性；所述脱氧尿嘧啶修饰后的引物寡核苷酸序列中每个脱氧胸腺嘧啶被脱氧尿嘧啶替代，可以增长双链溶解温度1.7℃，从而增加双链的稳定性；所述5’反向dT修饰后的引物寡核苷酸序列5’末端含有反向dT，从而形成交联，形成的交联可以抑制在DNA聚合酶延伸过程中的外切核酸酶的降解作用。
本发明的测序引物为经过特异修饰引物，可确保PCR扩增特异性的同时保证其扩增效率。
2、检测遗传性耳聋致病基因试剂盒
本发明的检测遗传性耳聋致病基因方法的试剂盒，包括：
遗传性耳聋致病基因特异性引物：用于扩增待测样品中多个目标区域，扩增范围至少覆盖目标基因的全外显子区域；
通用引物：用于在文库构建过程中，对特异引物扩增目标区域的扩增产物进行再次扩增，对不同待测样品的测序文库进行标记，进而区分不同样品；
PCR反应液：包括酶混合物、无核酸酶水；所述酶混合物包括高保真DNA聚合酶(用量为1.25U/反应)、PCR Buffer(用量为1×)、dNTP混合物(用量为200μM/种/反应)；
质控品：人正常基因组DNA，来源于正常人全血样本；本发明质控品来源于市售。
3、基于高通量测序技术检测遗传性耳聋致病基因的方法
包括以下步骤：
S1：利用纳米级超顺磁性羧基磁珠在不同盐浓度及疏水环境下与核酸分子可逆吸附的原理，特异吸附核酸分子，通过后续地洗涤及洗脱步骤，获得高纯度的核酸样本，使用Qubit或NanoDrop进行浓度及纯度的测定，根据测定的核酸样本浓度结果，使用10mM Tris将核酸样本稀释至50-250ng/μL，优选的50-100ng/μL作为扩增建库的起始浓度。
使用1.5％琼脂糖凝胶电泳40min，对稀释后核酸的质量进行评估，根据琼脂糖凝胶电泳结果的均一性及完整性判断提取核酸的质量，核酸完整性好或发生轻微降解不影响建库效果。所提取的核酸浓度、纯度测定及琼脂糖凝胶电泳检测合格后入组并分别进行标记。所述样本合格的标准为核酸浓度＞50ng/μL，OD260/OD280＝1.7-2.0，1％琼脂糖凝胶电泳检测样品条带完整、均一，无明显拖尾。
S2：用本发明的特异性引物或试剂盒对S1中待测样品中的致病基因目标区域进行一次PCR扩增，收集扩增产物，得到建库产物；所述扩增产物片段长度为特异引物扩增片段与通用引物之和；
PCR扩增反应体系为：特异引物混合物2μL；通用引物2μL；模板/质控品100ng；酶混合物12.5μL；无核酸酶水将体积补足至25μL。
PCR扩增反应程序为：
当待测遗传性耳聋致病基因有多个时，同一待测样品的不同遗传性耳聋致病基因的扩增可同时进行或部分同时进行。在具体的实验过程中，可根据需要选用上述任一种方案进行。若分别进行扩增时，需要保证用于构建测序文库的扩增产物的量是一致的。当待测样品有多个时，不同样品的遗传性耳聋致病基因的扩增必须分别进行。
S3：利用纯化磁珠分别对各样品的建库产物进行纯化。去除PCR产物中剩余的引物及dNTP等，回收扩增产物；进行浓度、纯度测定及1％琼脂糖凝胶电泳检测样品质量，所述样本合格的标准为核酸浓度＞2ng/μL，OD260/OD280＝1.7-2.0，1％琼脂糖凝胶电泳检测样品条带完整、均一，无明显拖尾。将所有合格核酸样品(不超过96个)浓度分别稀释至2nmol/L，并等体积混样，统一上机测序。
对照试验：
阳性对照反应体系包括：特异引物混合物2μL；通用引物2μL；酶混合物12.5μL；质控品100ng；无核酸酶水将体积补足至25μL。阳性对照用于检查反应体系的扩增能力是否正常和样本是否异常。
阴性对照反应体系包括：特异引物混合物2μL；通用引物2μL；酶混合物12.5μL；无核酸酶水将体积补足至25μL。阴性对照用于检查反应体系是否存在核酸物质污染。
阳性对照和阴性对照的反应程序同步骤S2的扩增反应程序。
实施例2引物特异性验证
利用实施例1中S1方法从全血样品(编号：1-3)、口腔脱落细胞样品(编号：4-6)、石蜡组织样品(编号：7-9)中提取核酸，进行浓度、纯度测定后，取合格样品使用10mM Tris将每例样品稀释至100ng/μL，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测每例样品质量(合格标准同实施例1中S1步骤)，合格后入组并分别进行标记。利用实施例1中S2方法对上述9例合格样本进行扩增，上样量为各1μL，扩增后产物纯化后进行1％琼脂糖凝胶电泳检测(合格标准同实施例1中S3步骤)。9例样本使用遗传性耳聋致病基因特异引物扩增及检测方法进行检测。对照试验同实施例一，检测方法与样本检测方法相同。检测结果见图3。
检测结果表示，阴性对照除残留引物外，无任何非特异条带，说明反应体系是无污染；阳性对照条带明亮，大小正确，说明反应体系的扩增能力正常。检测的9例样本扩增产物主要集中在600bp，无其他非特异性条带，与预期设计相符，且引物二聚体含量极少，且引物二聚体大小与扩增目标片段差异明显。由此可以看出，本发明的PCR扩增引物及检测方法能突破传统方法产生大量引物二聚体的限制，增强了引物特异性。
实施例3引物检测灵敏度验证
利用实施例1中质检合格的全血样品(编号：1)、口腔脱落细胞样品(编号：4)、石蜡组织样品(编号：7)提取的基因组样品进行引物检测灵敏度验证。每例样品起始浓度为100ng/μL，按照5倍、10倍、20倍浓度梯度稀释，稀释后每例样品浓度分别为20ng/μL、10ng/μL和5ng/μL，并分别进行样品名称及浓度标记。利用实施例1中S2方法对上述9例合格稀释样本进行扩增，上样量为各1μL，9例样本使用遗传性耳聋致病基因特异引物扩增及检测方法进行检测。对照试验同实施例一，检测方法与样本检测方法相同。检测结果见图4。
检测结果表示，阴性对照除残留引物外，无任何非特异条带，说明反应体系是无污染；阳性对照条带明亮，大小正确，说明反应体系的扩增能力正常。检测的9例样本扩增产物主要集中在600bp，无其他非特异性条带，与预期设计相符，同时引物二聚体含量极少，且引物二聚体大小与扩增目标片段差异明显。同时，即使模板含量低至5ng，依然能够成功扩增出目标条带，由此可以看出，本发明的PCR扩增引物及检测方法能突破传统方法的限制，提高了检测灵敏度。
实施例4引物检测重复性验证
利用实施例1中质检合格的全血样品(编号：2)、口腔脱落细胞样品(编号：5)、石蜡组织样品(编号：8)提取的基因组样品进行引物检测重复性验证。每例样品由2名不同的操作员在2个不同的实验室平台按照实施例1中S2方法对上述3例样品进行扩增，上样量为1μL，3例样本使用遗传性耳聋致病基因特异引物由不同操作员在不同的实验室扩增及检测方法进行检测。对照试验同实施例一，检测方法与样本检测方法相同。检测结果见图5。
检测结果表示，阴性对照除残留引物外，无任何非特异条带，说明反应体系是无污染；阳性对照条带明亮，大小正确，说明反应体系的扩增能力正常。检测的3例样品共6个扩增产物主要集中在600bp，无其他非特异性条带，与预期设计相符，同时引物二聚体含量极少，且引物二聚体大小与扩增目标片段差异明显。同时，不同的操作员及不同的实验平台检测结果无差异。由此可以看出，本发明的PCR扩增引物及检测方法重复性好。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
<110> 广州奇辉生物科技有限公司
<120> 基于高通量测序技术检测遗传性耳聋基因的多重PCR特异性引物、试剂盒及方法
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<213> 人工序列
<400> 9
tccaggtcta tgtgatcctc ag 22
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ctggggtggg aggatttag 19
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ggtgagggtt aggagtcagc 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gcaataagaa gcacaatggc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
agccttcctc ttctcccttg 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
aaagtcaccc tcaccactgc 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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agacacagcc tctgacagcc 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
tattccttac cagggcattg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
aatgtctgat gacctgttcc c 21
<210> 18
<211> 22
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<213> 人工序列
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gaccacaaag tgaccatcag ag 22
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
tggtgacttg aggctggag 19
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
atattggctt gggtccttcc 20
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
tgactaacac aagttgttat ctaaacc 27
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
agggcactgg gaggtgtaac 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
tgttaaggtt tgggcaggag 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
aacaattggc tgagaccacc 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
tggtaccaag gaagcctcac 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
cttggcaatg gataggaagg 20
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
ccttatttct ttcagtgtgt aggg 24
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
ggcccatttc tcaccagac 19
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
cccctacagg gaacaactac c 21
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
aaatctgggt gtcctacccc 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
acaagaagtg gggaggcttg 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
ctgagtttga tttcaggggc 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
tacactgtgt gtccccatcc 20
<210> 34
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
gattttatta ggctgacagg gg 22
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
aggtgatccc gttctttctg 20
<210> 36
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
ggcctctggg agaagcag 18
<210> 37
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
gcagaatcca gttcataact ttg 23
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
cagacctatg gtagctgggg 20
<210> 39
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
cattgtaagt tgaggacttt ctgc 24
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
aatgcactta atatagccaa aacac 25
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
tgcagacaca ttgaacattt g 21
<210> 42
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
ttccaggaaa ttactttgtt ttg 23
<210> 43
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
ttttgtgcta taggcaggct ac 22
<210> 44
<211>
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
ctcctgggct caagcaatc 19
<210> 45
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
gtgtgtgtgc tcgtgtgc 18
<210> 46
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
gaaggagtat cagtgaaatg aagc 24
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
tagcatttga tgagatgggg 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
ctggtgaaag aatccaaccc 20
<210> 49
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
cctgaaatac tcagcgaagg tc 22
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
gccttcctct gttgccattc 20
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
tccagtgagc tggaagacac 20
<210> 52
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
ggggaatata gtgatatggc agg 23
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
tgggcaatag agtgtgaccc 20
<210> 54
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
aacgaaagaa agtggcttca c 21
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
aacaccagaa tgatgggctc 20
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
ccctttggct accttgtacg 20
<210> 57
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
gcaactgtga cttgactcct tg 22
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 58
gggtctaggg cctattcctg 20
<210> 59
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 59
aatagccttt ccagataaca gttg 24
<210> 60
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 60
tttagaccct ctaactgctc tcatc 25
<210> 61
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 61
ttggataatt tgatatgaat ggttg 25
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 62
tgcaatactg gacaacccac 20
<210> 63
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 63
tgaatgctac tgaattatgg gc 22
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 64
tcccagatag gagaaagggc 20
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 65
agtgagcaat gatgccactg 20
<210> 66
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 66
tgaggctcca tgaagttata tagg 24
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 67
tttcagtgga gcatcaggtg 20
<210> 68
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 68
ggggaattat gttccctgac 20
<210> 69
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 69
gatgagtagc agtaagcaat caatac 26
<210> 70
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 70
ttacatggtg atcagtgcag c 21
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 71
cctctgtggt caagcgagtc 20
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 72
acctatacat gcctccatgc 20
<210> 73
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 73
cctaaaagct acagaaccag gc 22
<210> 74
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 74
aagtccccaa gatcaaagcc 20
<210> 75
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 75
tgcatggagg catgtatagg 20
<210> 76
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 76
cgcctggcct acattcac 18
<210> 77
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 77
tgaaatacaa ccagaaacaa tgtg 24
<210> 78
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 78
cgtaactttg gcatttcctt c 21
<210> 79
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 79
ccgggaagct ctgaggac 18
<210> 80
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 80
gcaaccgctc tgggtctc 18
<210> 81
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 81
gcatgcttgc ttacccagac 20
<210> 82
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 82
tctgggtttt gatctcctcg 20
<210> 83
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 83
ggcctaccgg agacatgag 19
<210> 84
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 84
tccctctcat gctgtctatt tc 22
<210> 85
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 85
tttgctaatt agatattgtt ctggg 25
<210> 86
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 86
aaccccagga ggacaccc 18
<210> 87
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 87
ggctgttagg ggttattggt g 21
<210> 88
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 88
gacatgaggc catttgctat c 21
<210> 89
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 89
tggttatgaa tactttgcag cac 23
<210> 90
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 90
tgaaggggta agcaaacaaa c 21
<210> 91
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 91
aaactagcgt gggcgagtc 19
<210> 92
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 92
gaggattgag aggtacgggg 20
<210> 93
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 93
aacaagtcag aactcagaac actg 24
<210> 94
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 94
gttgtcgtac agcttggcg 19
<210> 95
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 95
cttcgtcaca tgcccctc 18
<210> 96
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 96
gaggcttgtc cttgtgcag 19
<210> 97
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 97
ccgtctgcat cgtactcacc 20
<210> 98
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 98
gtgggttacc tatacccggc 20
<210> 99
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 99
tgaccccact ctgagttcac 20
<210> 100
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 100
tcctctccac tgcaggaatc 20
<210> 101
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 101
gcagtgatta acctttagca ataaac 26
<210> 102
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 102
cctttgagtt ttaagctgtg gc 22
<210> 103
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 103
ccaaactggg attagatacc cc 22
<210> 104
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 104
tgctaaatcc accttcgacc 20
Claims (10)
1.一种基于高通量测序技术检测遗传性耳聋致病基因的多重PCR特异性引物，其特征在于，所述多重PCR特异性引物包括52对特异性引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1至SEQID NO：104所示。
2.根据权利要求1所述的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物为经过修饰的引物。
3.根据权利要求2所述的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物的修饰方法为硫代修饰、脱氧尿嘧啶修饰、5’反向dT修饰中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物的Tm值为58-62℃。
5.一种基于高通量测序技术检测遗传性耳聋致病基因的试剂盒，其特征在于，包括上述权利要求1-4任一项所述的特异性引物中的至少两对。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括通用引物、酶混合物、质控品、无核酸酶水。
7.权利要求1-4任一项所述特异性引物或权利要求5-6任一项所述的试剂盒应用于遗传性耳聋致病基因检测。
8.基于高通量测序技术检测遗传性耳聋致病基因的方法，包括以下步骤：
S1：使用磁珠法对样本进行核酸提取，然后进行浓度及纯度的测定，测定合格后进行定量稀释，备用；
S2：用含权利要求1-4任一项所述特异性引物或权利要求5-6任一项所述试剂盒对S1中所提取的核酸的目标区域进行一次PCR扩增，收集扩增产物备用；
S3：使用磁珠法对S2中扩增产物进行核酸纯化，进行浓度及纯度的测定，混样，定量，上机测序。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，含所述特异性引物的反应体系为：
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：
98℃，激活20min；循环1次；
72℃，延伸10min；循环1次。
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Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106591480A (zh) * | 2017-01-23 | 2017-04-26 | 中南大学湘雅医院 | 基于高通量测序检测大前庭导水管综合征致病基因的多重pcr特异性引物、试剂盒及方法 |
| CN109355374A (zh) * | 2018-11-30 | 2019-02-19 | 中国人民解放军第四军医大学 | 前庭导水管扩大/Pendred综合征致病基因SLC26A4突变检测试剂盒 |
| CN111979313A (zh) * | 2020-09-21 | 2020-11-24 | 郑州桑林生物科技有限公司 | 一种基于多重pcr及高通量测序技术检测耳聋基因致病变异的特异性引物、试剂盒及应用 |
| CN114686561A (zh) * | 2020-12-28 | 2022-07-01 | 广东菲鹏生物有限公司 | 用于核酸样本扩增的组合物、试剂盒、方法及*** |
| CN114686579A (zh) * | 2020-12-28 | 2022-07-01 | 广东菲鹏生物有限公司 | 用于核酸样本扩增的组合物、试剂盒、方法及*** |
| CN114686580A (zh) * | 2020-12-28 | 2022-07-01 | 广东菲鹏生物有限公司 | 用于核酸样本扩增的组合物、试剂盒、方法及*** |
| CN114686562A (zh) * | 2020-12-28 | 2022-07-01 | 广东菲鹏生物有限公司 | 用于核酸样本扩增的组合物、试剂盒、方法及*** |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102373265A (zh) * | 2010-08-06 | 2012-03-14 | 博奥生物有限公司 | 一种检测遗传性耳聋的试剂盒 |
| CN102453761A (zh) * | 2010-10-27 | 2012-05-16 | 博奥生物有限公司 | 一种磁珠与发光体共标记以检测遗传性耳聋的试剂盒 |
| CN103352080A (zh) * | 2013-07-11 | 2013-10-16 | 无锡中德美联生物技术有限公司 | 一种遗传性耳聋基因检测试剂盒 |
| CN105624796A (zh) * | 2014-11-07 | 2016-06-01 | 天津华大基因科技有限公司 | 芯片及其在检测耳聋相关基因中的用途 |
| CN105936940A (zh) * | 2016-06-30 | 2016-09-14 | 上海凡迪生物科技有限公司 | 检测耳聋基因的核酸序列及其应用 |
-
2017
- 2017-01-23 CN CN201710058615.3A patent/CN106755496A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102373265A (zh) * | 2010-08-06 | 2012-03-14 | 博奥生物有限公司 | 一种检测遗传性耳聋的试剂盒 |
| CN102453761A (zh) * | 2010-10-27 | 2012-05-16 | 博奥生物有限公司 | 一种磁珠与发光体共标记以检测遗传性耳聋的试剂盒 |
| CN103352080A (zh) * | 2013-07-11 | 2013-10-16 | 无锡中德美联生物技术有限公司 | 一种遗传性耳聋基因检测试剂盒 |
| CN105624796A (zh) * | 2014-11-07 | 2016-06-01 | 天津华大基因科技有限公司 | 芯片及其在检测耳聋相关基因中的用途 |
| CN105936940A (zh) * | 2016-06-30 | 2016-09-14 | 上海凡迪生物科技有限公司 | 检测耳聋基因的核酸序列及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| LAURENCE JONARD等: "Screening of SLC26A4 , FOXI1 and KCNJ10 genes in unilateral hearing impairment with ipsilateral enlarged vestibular aqueduct", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF PEDIATRIC OTORHINOLARYNGOLOGY》 * |
| 韩冰等: "新生儿听力及基因联合筛查临床实践及筛查模式研究", 《中华耳科学杂志》 * |
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106591480A (zh) * | 2017-01-23 | 2017-04-26 | 中南大学湘雅医院 | 基于高通量测序检测大前庭导水管综合征致病基因的多重pcr特异性引物、试剂盒及方法 |
| CN109355374A (zh) * | 2018-11-30 | 2019-02-19 | 中国人民解放军第四军医大学 | 前庭导水管扩大/Pendred综合征致病基因SLC26A4突变检测试剂盒 |
| CN111979313A (zh) * | 2020-09-21 | 2020-11-24 | 郑州桑林生物科技有限公司 | 一种基于多重pcr及高通量测序技术检测耳聋基因致病变异的特异性引物、试剂盒及应用 |
| CN111979313B (zh) * | 2020-09-21 | 2023-05-26 | 郑州桑林生物科技有限公司 | 一种基于多重pcr及高通量测序技术检测耳聋基因致病变异的特异性引物、试剂盒及应用 |
| CN114686561A (zh) * | 2020-12-28 | 2022-07-01 | 广东菲鹏生物有限公司 | 用于核酸样本扩增的组合物、试剂盒、方法及*** |
| CN114686579A (zh) * | 2020-12-28 | 2022-07-01 | 广东菲鹏生物有限公司 | 用于核酸样本扩增的组合物、试剂盒、方法及*** |
| CN114686580A (zh) * | 2020-12-28 | 2022-07-01 | 广东菲鹏生物有限公司 | 用于核酸样本扩增的组合物、试剂盒、方法及*** |
| CN114686562A (zh) * | 2020-12-28 | 2022-07-01 | 广东菲鹏生物有限公司 | 用于核酸样本扩增的组合物、试剂盒、方法及*** |
| CN114686561B (zh) * | 2020-12-28 | 2024-04-30 | 广东菲鹏生物有限公司 | 用于核酸样本扩增的组合物、试剂盒、方法及*** |
| CN114686579B (zh) * | 2020-12-28 | 2024-04-30 | 广东菲鹏生物有限公司 | 用于核酸样本扩增的组合物、试剂盒、方法及*** |
| CN114686562B (zh) * | 2020-12-28 | 2024-04-30 | 广东菲鹏生物有限公司 | 用于核酸样本扩增的组合物、试剂盒、方法及*** |
| CN114686580B (zh) * | 2020-12-28 | 2024-04-30 | 广东菲鹏生物有限公司 | 用于核酸样本扩增的组合物、试剂盒、方法及*** |
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