CN113755433A - 一种滑膜间充质干细胞的悬浮液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种滑膜间充质干细胞的悬浮液及其制备方法，属于医学制造技术领域。它包括以下步骤：(1)预处理：取滑膜间充质干细胞的商品化包装细胞；(2)培养：将步骤(1)中滑膜间充质干细胞进行扩增培养，并获取传代培养后的细胞；(3)悬浮液的制备：将步骤(2)中传代培养后的细胞转移至处理液中处理，即得。涉及的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法，工艺简单、易于制作，有利于提高滑膜间充质干细胞的悬浮稳定性。
Description
技术领域
本发明属于医学制造技术领域，具体地说，涉及一种滑膜间充质干细胞的悬浮液及其制备方法。
背景技术
间质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是指来源于间质组织，具有高度增殖和多向分化潜能的克隆细胞。大量研究证实，MSCs具有向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞及肌细胞等的定向分化能力，在组织工程和再生医学等领域日益显现出广阔的应用前景。
同时由于其具有优越的成软骨分化潜能，被认为是软骨损伤修复最理想的种子细胞。但间质干细胞的相关研究较少，对其生物学特征及可能存在的作用知之甚少。目前，可利用小鼠的滑膜间充质干细胞进行模拟实验研究。例如中国发明专利，申请号：CN201810155580.X，公开号：CN108456655A，公开了一种间充质干细胞悬浮液及其制备方法与应用，其技术方案如下：“获取间充质干细胞原代细胞；间充质干细胞原代细胞的培养扩增：间充质干细胞原代细胞培养5-10天后换成无血清DMEM营养液，至细胞65～75％融合，移去培养上清液，然后添加第一消化液，消化0.5-2min，细胞收缩后加入所移去的培养上清液中和后进行离心分离，重新加入完全培养基重悬，按照1传1～1.5接种，培养4～5天后，细胞65～75％融合时以1：6～8的比例进行传代培养；及间充质干细胞悬浮液的制备：取间充质干细胞原代细胞的培养扩增中P4代细胞培养扩增48-96小时，且细胞融合不超过80％后，用第三消化液消化细胞并洗涤后用5％人白蛋白混悬，再加入生理盐水即可得到所需的间充质干细胞悬浮液”。但该专利并未对DMEM进行改良，致使保藏期短，细胞活性有限。
发明内容
1、要解决的问题
针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种滑膜间充质干细胞的悬浮液及其制备方法，工艺简单、易于制作，有利于提高滑膜间充质干细胞的悬浮稳定性。
2、技术方案
为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。
一种滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法，包括以下步骤：
（1）预处理：取滑膜间充质干细胞的商品化包装细胞；
（2）培养：将步骤（1）中滑膜间充质干细胞进行扩增培养，并获取传代培养后的细胞；
（3）悬浮液的制备：将步骤（2）中传代培养后的细胞转移至处理液中处理，即得。
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，
步骤（1）中所述的滑膜间充质干细胞为小鼠滑膜间充质干细胞，其货号为货号：CP-M236，并采购自武汉普诺赛生命科技有限公司。
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，
步骤（2）中扩增培养的方法如下：
将步骤（1）中滑膜间充质干细胞作为原代细胞，进行第一次培养，接着换成改良的DMEM培养基进行第二次培养，随后加入质量分数为0.50%的胰蛋白酶进行消化处理，其中处理温度为37℃，然后4℃下离心处理，取沉淀的细胞，即可。
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，
步骤（2）中第一次培养的条件参数如下：
37℃、体积分数为5%的二氧化碳培养箱、基础培养基、5d培养；
其中基础培养基为HG-DMEM培养基，并在其培养基中添加胎牛血清、青霉素及链霉素，其中胎牛血清的添加量为HG-DMEM培养基体积的10%，其中青霉素的添加量为100U/mL，其中链霉素的添加量为100U/mL。
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，
步骤（2）中第二次培养的条件参数如下：
37℃、体积分数为5%的二氧化碳培养箱、改良的DMEM培养基、7d培养、细胞发生70%的融合现象；
其中改良的DMEM培养基的组分如下：
DMEM培养基 100mL，
重组成纤维生长因子FGF-4 100ng，
重组成纤维生长因子FGF-9 100ng，
乙酸锌 0.2mg。
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，
步骤（2）中传代培养的方法如下：
将扩增培养后的细胞转移至传代培养基中以1：3进行传代培养，每3d更换一次传代培养基；其中传代培养基为DMEM培养基；其中传代培养的条件参数如下：
37℃、体积分数为5%的二氧化碳培养箱；
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，
步骤（3）中处理液的组分如下：
生理盐水 100mL，
胰蛋白酶 1mg，
透明质酸 0.3mL。
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，步骤（3）中处理的温度为10℃。
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，步骤（3）中处理后的保藏温度为4℃。
一种滑膜间充质干细胞的悬浮液，利用上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法制备得到。
3、有益效果
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明创新性引入改良的DMEM培养基，其中新的添加剂乙酸锌起到关键性作用，此外，透明质酸也起到一定的促进作用，与传统技术相比，改良的培养基可以有效促进滑膜间充质干细胞后续的悬浮稳定，降低死亡率。
附图说明
图1是实施例1中激光共聚焦的结果图；
图2是对比例1中激光共聚焦的结果图；
图3是对比例2中激光共聚焦的结果图；
图4是对比例3中激光共聚焦的结果图；
图5是对比例4中激光共聚焦的结果图；
图6是对比例5中激光共聚焦的结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
需要提醒的是，本申请研究的滑膜间充质干细胞为小鼠滑膜间充质干细胞，主要用于探究其干细胞的悬浮稳定性，并结合活-死细胞染色试剂盒等仪器检测干细胞活性。
实施例1
本实施例的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法，包括以下步骤：
（1）预处理：取滑膜间充质干细胞的商品化包装细胞；
（2）培养：将步骤（1）中滑膜间充质干细胞进行扩增培养，并获取传代培养后的细胞；
（3）悬浮液的制备：将步骤（2）中传代培养后的细胞转移至处理液中处理，即得。
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，
步骤（1）中所述的滑膜间充质干细胞为小鼠滑膜间充质干细胞，其货号为货号：CP-M236，并采购自武汉普诺赛生命科技有限公司。
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，
步骤（2）中扩增培养的方法如下：
将步骤（1）中滑膜间充质干细胞作为原代细胞，进行第一次培养，接着换成改良的DMEM培养基进行第二次培养，随后加入质量分数为0.50%的胰蛋白酶进行消化处理，其中处理温度为37℃，然后4℃下离心处理，取沉淀的细胞，即可。
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，
步骤（2）中第一次培养的条件参数如下：
37℃、体积分数为5%的二氧化碳培养箱、基础培养基、5d培养；
其中基础培养基为HG-DMEM培养基，并在其培养基中添加胎牛血清、青霉素及链霉素，其中胎牛血清的添加量为HG-DMEM培养基体积的10%，其中青霉素的添加量为100U/mL，其中链霉素的添加量为100U/mL。
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，
步骤（2）中第二次培养的条件参数如下：
37℃、体积分数为5%的二氧化碳培养箱、改良的DMEM培养基、7d培养、细胞发生70%的融合现象；
其中改良的DMEM培养基的组分如下：
DMEM培养基 100mL，
重组成纤维生长因子FGF-4 100ng，
重组成纤维生长因子FGF-9 100ng，
乙酸锌 0.2mg。
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，
步骤（2）中传代培养的方法如下：
将扩增培养后的细胞转移至传代培养基中以1：3进行传代培养，每3d更换一次传代培养基；其中传代培养基为DMEM培养基；其中传代培养的条件参数如下：
37℃、体积分数为5%的二氧化碳培养箱；
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，
步骤（3）中处理液的组分如下：
生理盐水 100mL，
胰蛋白酶 1mg，
透明质酸 0.3mL。
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，步骤（3）中处理的温度为10℃。
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，步骤（3）中处理后的保藏温度为4℃。
对比例1
本实施例的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法，包括以下步骤：
（1）预处理：取滑膜间充质干细胞的商品化包装细胞；
（2）培养：将步骤（1）中滑膜间充质干细胞进行扩增培养，并获取传代培养后的细胞；
（3）悬浮液的制备：将步骤（2）中传代培养后的细胞转移至处理液中处理，即得。
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，
步骤（1）中所述的滑膜间充质干细胞为小鼠滑膜间充质干细胞，其货号为货号：CP-M236，并采购自武汉普诺赛生命科技有限公司。
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，
步骤（2）中扩增培养的方法如下：
将步骤（1）中滑膜间充质干细胞作为原代细胞，进行第一次培养，接着换成改良的DMEM培养基进行第二次培养，随后加入质量分数为0.50%的胰蛋白酶进行消化处理，其中处理温度为37℃，然后4℃下离心处理，取沉淀的细胞，即可。
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，
步骤（2）中第一次培养的条件参数如下：
37℃、体积分数为5%的二氧化碳培养箱、基础培养基、5d培养；
其中基础培养基为HG-DMEM培养基，并在其培养基中添加胎牛血清、青霉素及链霉素，其中胎牛血清的添加量为HG-DMEM培养基体积的10%，其中青霉素的添加量为100U/mL，其中链霉素的添加量为100U/mL。
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，
步骤（2）中第二次培养的条件参数如下：
37℃、体积分数为5%的二氧化碳培养箱、改良的DMEM培养基、7d培养、细胞发生70%的融合现象；
其中改良的DMEM培养基的组分如下：
DMEM培养基 100mL，
重组成纤维生长因子FGF-4 100ng，
重组成纤维生长因子FGF-9 100ng，
乙酸锌 0.2mg。
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，
步骤（2）中传代培养的方法如下：
将扩增培养后的细胞转移至传代培养基中以1：3进行传代培养，每3d更换一次传代培养基；其中传代培养基为DMEM培养基；其中传代培养的条件参数如下：
37℃、体积分数为5%的二氧化碳培养箱；
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，
步骤（3）中处理液的组分如下：
生理盐水 100mL，
胰蛋白酶 1mg，
透明质酸 0.3mL。
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，步骤（3）中处理的温度为10℃。
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，步骤（3）中处理后的保藏温度为4℃。
对比例2
本实施例的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法，包括以下步骤：
（1）预处理：取滑膜间充质干细胞的商品化包装细胞；
（2）培养：将步骤（1）中滑膜间充质干细胞进行扩增培养，并获取传代培养后的细胞；
（3）悬浮液的制备：将步骤（2）中传代培养后的细胞转移至处理液中处理，即得。
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，
步骤（1）中所述的滑膜间充质干细胞为小鼠滑膜间充质干细胞，其货号为货号：CP-M236，并采购自武汉普诺赛生命科技有限公司。
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，
步骤（2）中扩增培养的方法如下：
将步骤（1）中滑膜间充质干细胞作为原代细胞，进行第一次培养，接着换成改良的DMEM培养基进行第二次培养，随后加入质量分数为0.50%的胰蛋白酶进行消化处理，其中处理温度为37℃，然后4℃下离心处理，取沉淀的细胞，即可。
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，
步骤（2）中第一次培养的条件参数如下：
37℃、体积分数为5%的二氧化碳培养箱、基础培养基、5d培养；
其中基础培养基为HG-DMEM培养基，并在其培养基中添加胎牛血清、青霉素及链霉素，其中胎牛血清的添加量为HG-DMEM培养基体积的10%，其中青霉素的添加量为100U/mL，其中链霉素的添加量为100U/mL。
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，
步骤（2）中第二次培养的条件参数如下：
37℃、体积分数为5%的二氧化碳培养箱、改良的DMEM培养基、7d培养、细胞发生70%的融合现象；
其中改良的DMEM培养基的组分如下：
DMEM培养基 100mL，
重组成纤维生长因子FGF-4 100ng，
重组成纤维生长因子FGF-9 100ng，
乙酸锌 0.2mg。
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，
步骤（2）中传代培养的方法如下：
将扩增培养后的细胞转移至传代培养基中以1：3进行传代培养，每3d更换一次传代培养基；其中传代培养基为DMEM培养基；其中传代培养的条件参数如下：
37℃、体积分数为5%的二氧化碳培养箱；
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，
步骤（3）中处理液的组分如下：
生理盐水 100mL，
胰蛋白酶 1mg。
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，步骤（3）中处理的温度为10℃。
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，步骤（3）中处理后的保藏温度为4℃。
对比例3
本实施例的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法，包括以下步骤：
（1）预处理：取滑膜间充质干细胞的商品化包装细胞；
（2）培养：将步骤（1）中滑膜间充质干细胞进行扩增培养，并获取传代培养后的细胞；
（3）悬浮液的制备：将步骤（2）中传代培养后的细胞转移至处理液中处理，即得。
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，
步骤（1）中所述的滑膜间充质干细胞为小鼠滑膜间充质干细胞，其货号为货号：CP-M236，并采购自武汉普诺赛生命科技有限公司。
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，
步骤（2）中扩增培养的方法如下：
将步骤（1）中滑膜间充质干细胞作为原代细胞，进行第一次培养，接着换成改良的DMEM培养基进行第二次培养，随后加入质量分数为0.50%的胰蛋白酶进行消化处理，其中处理温度为37℃，然后4℃下离心处理，取沉淀的细胞，即可。
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，
步骤（2）中第一次培养的条件参数如下：
37℃、体积分数为5%的二氧化碳培养箱、基础培养基、5d培养；
其中基础培养基为HG-DMEM培养基，并在其培养基中添加胎牛血清、青霉素及链霉素，其中胎牛血清的添加量为HG-DMEM培养基体积的10%，其中青霉素的添加量为100U/mL，其中链霉素的添加量为100U/mL。
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，
步骤（2）中第二次培养的条件参数如下：
37℃、体积分数为5%的二氧化碳培养箱、改良的DMEM培养基、7d培养、细胞发生70%的融合现象；
其中改良的DMEM培养基的组分如下：
DMEM培养基 100mL，
乙酸锌 0.2mg。
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，
步骤（2）中传代培养的方法如下：
将扩增培养后的细胞转移至传代培养基中以1：3进行传代培养，每3d更换一次传代培养基；其中传代培养基为DMEM培养基；其中传代培养的条件参数如下：
37℃、体积分数为5%的二氧化碳培养箱；
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，
步骤（3）中处理液的组分如下：
生理盐水 100mL，
胰蛋白酶 1mg，
透明质酸 0.3mL。
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，步骤（3）中处理的温度为10℃。
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，步骤（3）中处理后的保藏温度为4℃。
对比例4
本实施例的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法，包括以下步骤：
（1）预处理：取滑膜间充质干细胞的商品化包装细胞；
（2）培养：将步骤（1）中滑膜间充质干细胞进行扩增培养，并获取传代培养后的细胞；
（3）悬浮液的制备：将步骤（2）中传代培养后的细胞转移至处理液中处理，即得。
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，
步骤（1）中所述的滑膜间充质干细胞为小鼠滑膜间充质干细胞，其货号为货号：CP-M236，并采购自武汉普诺赛生命科技有限公司。
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，
步骤（2）中扩增培养的方法如下：
将步骤（1）中滑膜间充质干细胞作为原代细胞，进行第一次培养，接着换成改良的DMEM培养基进行第二次培养，随后加入质量分数为0.50%的胰蛋白酶进行消化处理，其中处理温度为37℃，然后4℃下离心处理，取沉淀的细胞，即可。
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，
步骤（2）中第一次培养的条件参数如下：
37℃、体积分数为5%的二氧化碳培养箱、基础培养基、5d培养；
其中基础培养基为HG-DMEM培养基，并在其培养基中添加胎牛血清、青霉素及链霉素，其中胎牛血清的添加量为HG-DMEM培养基体积的10%，其中青霉素的添加量为100U/mL，其中链霉素的添加量为100U/mL。
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，
步骤（2）中第二次培养的条件参数如下：
37℃、体积分数为5%的二氧化碳培养箱、改良的DMEM培养基、7d培养、细胞发生70%的融合现象；
其中改良的DMEM培养基的组分如下：
DMEM培养基 100mL，
重组成纤维生长因子FGF-4 100ng，
重组成纤维生长因子FGF-9 100ng。
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，
步骤（2）中传代培养的方法如下：
将扩增培养后的细胞转移至传代培养基中以1：3进行传代培养，每3d更换一次传代培养基；其中传代培养基为DMEM培养基；其中传代培养的条件参数如下：
37℃、体积分数为5%的二氧化碳培养箱；
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，
步骤（3）中处理液的组分如下：
生理盐水 100mL，
胰蛋白酶 1mg，
透明质酸 0.3mL。
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，步骤（3）中处理的温度为10℃。
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，步骤（3）中处理后的保藏温度为4℃。
对比例5
本实施例的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法，包括以下步骤：
（1）预处理：取滑膜间充质干细胞的商品化包装细胞；
（2）培养：将步骤（1）中滑膜间充质干细胞进行扩增培养，并获取传代培养后的细胞；
（3）悬浮液的制备：将步骤（2）中传代培养后的细胞转移至处理液中处理，即得。
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，
步骤（1）中所述的滑膜间充质干细胞为小鼠滑膜间充质干细胞，其货号为货号：CP-M236，并采购自武汉普诺赛生命科技有限公司。
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，
步骤（2）中扩增培养的方法如下：
将步骤（1）中滑膜间充质干细胞作为原代细胞，进行第一次培养，接着换成DMEM培养基进行第二次培养，随后加入质量分数为0.50%的胰蛋白酶进行消化处理，其中处理温度为37℃，然后4℃下离心处理，取沉淀的细胞，即可。
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，
步骤（2）中第一次培养的条件参数如下：
37℃、体积分数为5%的二氧化碳培养箱、基础培养基、5d培养；
其中基础培养基为HG-DMEM培养基，并在其培养基中添加胎牛血清、青霉素及链霉素，其中胎牛血清的添加量为HG-DMEM培养基体积的10%，其中青霉素的添加量为100U/mL，其中链霉素的添加量为100U/mL。
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，
步骤（2）中第二次培养的条件参数如下：
37℃、体积分数为5%的二氧化碳培养箱、DMEM培养基、7d培养、细胞发生70%的融合现象。
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，
步骤（2）中传代培养的方法如下：
将扩增培养后的细胞转移至传代培养基中以1：3进行传代培养，每3d更换一次传代培养基；其中传代培养基为DMEM培养基；其中传代培养的条件参数如下：
37℃、体积分数为5%的二氧化碳培养箱；
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，
步骤（3）中处理液的组分如下：
生理盐水 100mL，
胰蛋白酶 1mg，
透明质酸 0.3mL。
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，步骤（3）中处理的温度为10℃。
上述所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法中，步骤（3）中处理后的保藏温度为4℃。
实施例6
选择实施例1制备的悬浮液及对比例1-5制备的悬浮液，进行如下的测试：
将上述制备的悬浮液，放置在4℃冷藏一个月后，采用活-死细胞染色试剂盒（采购自武汉艾美捷科技有限公司）并结合激光共聚焦仪器进行观察悬浮液中干细胞的鉴定。
如图1所示，活细胞数量较多，少量死细胞，形态正常，细胞密度正常；
如图2所示，活细胞数量少于图1，死细胞数量多于图1，部分细胞形态出现畸变，整体上死细胞数量多于活细胞，细胞密度少于图1；
如图3所示，活细胞数量少于图2，死细胞数量多于图2，整体上死细胞数量远多于活细胞，部分细胞形态出现畸变，细胞密度少于图1；
如图4所示，活细胞数量最少，死细胞数量多于图3，整体上死细胞数量是活细胞数量5倍，细胞密度最小；
如图5所示，活细胞数量少于图3多于图4，死细胞数量多于图4少于图3，整体上死细胞数量是或细胞数量的2倍，细胞密度多于图4少于图3；
如图6所示，活细胞数量处于图4与图5之间，死细胞数量处于图4与图5之间，整体上死细胞数量与活细胞数量等同，细胞密度处于图4与图5之间。
以上内容是结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。
Claims (10)
1.一种滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法，其特征在于：
包括以下步骤：
（1）预处理：取滑膜间充质干细胞的商品化包装细胞；
（2）培养：将步骤（1）中滑膜间充质干细胞进行扩增培养，并获取传代培养后的细胞；
（3）悬浮液的制备：将步骤（2）中传代培养后的细胞转移至处理液中处理，即得。
2.根据权利要求1所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法，其特征在于：
步骤（1）中所述的滑膜间充质干细胞为小鼠滑膜间充质干细胞，其货号为货号：CP-M236，并采购自武汉普诺赛生命科技有限公司。
3.根据权利要求1所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法，其特征在于：
步骤（2）中扩增培养的方法如下：
将步骤（1）中滑膜间充质干细胞作为原代细胞，进行第一次培养，接着换成改良的DMEM培养基进行第二次培养，随后加入质量分数为0.50%的胰蛋白酶进行消化处理，其中处理温度为37℃，然后4℃下离心处理，取沉淀的细胞，即可。
4.根据权利要求3所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法，其特征在于：
步骤（2）中第一次培养的条件参数如下：
37℃、体积分数为5%的二氧化碳培养箱、基础培养基、5d培养；
其中基础培养基为HG-DMEM培养基，并在其培养基中添加胎牛血清、青霉素及链霉素，其中胎牛血清的添加量为HG-DMEM培养基体积的10%，其中青霉素的添加量为100U/mL，其中链霉素的添加量为100U/mL。
5.根据权利要求1所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法，其特征在于：
步骤（2）中第二次培养的条件参数如下：
37℃、体积分数为5%的二氧化碳培养箱、改良的DMEM培养基、7d培养、细胞发生70%的融合现象；
其中改良的DMEM培养基的组分如下：
DMEM培养基 100mL，
重组成纤维生长因子FGF-4 100ng，
重组成纤维生长因子FGF-9 100ng，
乙酸锌 0.2mg。
6.根据权利要求1所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法，其特征在于：
步骤（2）中传代培养的方法如下：
将扩增培养后的细胞转移至传代培养基中以1：3进行传代培养，每3d更换一次传代培养基；其中传代培养基为DMEM培养基；其中传代培养的条件参数如下：
37℃、体积分数为5%的二氧化碳培养箱。
7.根据权利要求1所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法，其特征在于：
步骤（3）中处理液的组分如下：
生理盐水 100mL，
胰蛋白酶 1mg，
透明质酸 0.3mL。
8.根据权利要求1所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法，其特征在于：
步骤（3）中处理的温度为10℃。
9.根据权利要求1所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法，其特征在于：
步骤（3）中处理后的保藏温度为4℃。
10.一种滑膜间充质干细胞的悬浮液，其特征在于：
利用权利要求1所述的滑膜间充质干细胞的悬浮液的制备方法制备得到。
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- 2021-08-09 CN CN202110907400.0A patent/CN113755433A/zh active Pending
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