CN117568268A - 一种可在体外长期维持牙胚间充质细胞成牙命运的培养方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种可在体外长期维持蕾状期后牙胚间充质细胞(DMCs)成牙命运的培养方法及其应用。本发明提供了一种新的无血清培养***，含有N2和B27补充剂，可以使DMCs的诱导成牙潜能在体外持续长达14天，该培养基环境下，牙胚间充质细胞经体外传代一次后仍然保有一定的诱导上皮组织共同成牙的细胞命运。该培养基能适当维持间充质细胞成牙命运的发现为今后牙齿再生的间充质种子细胞的培养体系的构建及优化提供了重要的研究基础和科学依据。
Description
技术领域
本发明涉及生物再生领域，特别涉及一种可在体外长期维持牙胚间充质细胞成牙命运的培养方法及其应用。
背景技术
牙齿是人体中数量最多的器官，在摄入、消化、发音和面部特征方面起着重要的功能。牙齿脱落和损伤是影响许多人生活质量的常见问题。随着人类对生活质量要求的提升，如何修复或替换缺失或损坏的牙齿成为目前口腔再生领域的研究热点。
牙齿是由牙齿上皮和神经嵴来源的间充质细胞之间的一系列时空相互作用发展而来的，它们经历了从牙板、蕾状、帽状、钟状及萌出等几个形态阶段(Balic and Thesleff2015；Thesleff and Tummers 2008)。经典重组实验证实诱导成牙潜能在蕾状期阶段从牙胚上皮转移到牙胚间充质(Hu et al.2014；Lumsden 1988)，即蕾状期前的牙胚上皮细胞和蕾状期后的牙胚间充质细胞是具有成牙命运的功能性细胞。因此，蕾状后期及其后的牙胚间充质或消化后的牙胚间充质细胞(dental mesenchymal cells,DMCs)被广泛用于牙再生研究，即通过与原生的或诱导获得的牙源或非牙源的上皮重组后移植到寄主体内，经数周培育可形成牙样和骨样结构(Ohazama et al.2004；Cai et al.2009；Wang et al.2010；Angelova Volponi et al.2013；Cai et al.2013；Otsu et al.2014)。然而，仍有两大挑战需要解决。
挑战一，如何在不使用胚胎牙组织或牙胚细胞的情况下诱导获得具有启动成牙命运的功能性细胞，以实现牙齿再生的构建。牙向诱导再生包括牙功能模块再生和全牙再生两类，其中牙功能模块再生包括牙髓、牙根及牙周等功能模块再生，而全牙再生则包括两个层次，一是牙的软硬组织各部分的结构再生，二是牙各部分能配合得当使再生全牙具有牙齿相关功能。目前牙功能组织模块的再生研究已经取得较好的成果，如利用患者自体乳牙牙髓干细胞(SHED)植入牙髓坏死的髓腔内，一年后可发现包含了血管及感觉神经的三维牙髓组织再生，成功地推进了相关研究成果的临床转化进程(PMID:30135248)。此外，相关研究团队结合材料和三维打印等技术进一步优化牙功能组织模块再生体系，并取得了显著的成果，如基于DLP的3D生物打印技术构建牙周功能组织模块(PMID:30475386)，静电液滴法制备GelMA微球用于牙髓再生(PMID:33579484)，构建GelMA/Lap/PL微球用于促进血管化牙髓再生(PMID:34551330)，共轴静电液滴法构建核壳结构微球高效生产预血管化微组织用于牙髓再生(PMID:35364321)等。然而，尚无不依赖胚胎期牙源细胞的生物工程再生全牙构建的相关报道。可见，不依赖牙胚来源细胞的全牙再生必须同时具备的可相互作用的两类种子组织/细胞尚在探索中，其中两个重点：一，两者其一具有诱导成牙命运能力，即诱导成牙潜能；二，两者可以发生相互作用，成就成牙命运。该挑战已经被探索了20余年。
挑战二，基于挑战一，倘若已经获得了具有诱导成牙命运的功能性细胞，如何在体外维持其成牙命运。如前所述，原生的具有诱导成牙命运的功能性细胞，即目前所有牙再生构建的相关报道案例中，再生牙胚的构建或使用了蕾状期前的上皮组织或使用蕾状期后的间充质组织/细胞。而牙胚蕾状期后的间充质细胞成牙潜能的体外维持体系，其相关研究仍然较少。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种可在体外长期维持牙胚间充质细胞成牙命运的培养方法。
本发明的另一目的在于，提供上述培养方法使用的培养基。
本发明的再一目的在于，提供上述培养方法及培养基的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种可在体外长期维持牙胚间充质细胞成牙命运的培养方法，包括如下步骤：
(1)从胚胎的下颌骨中分离磨牙牙胚；
(2)用蛋白酶消化磨牙牙胚；
(3)终止消化后，分离牙胚间充质和牙胚上皮组织；
(4)收集牙胚间充质并用消化液处理；
(5)终止消化，洗涤后，获得单细胞；
(6)将细胞接种在培养皿中；
(7)在接种了细胞的培养皿中加入培养基进行培养。
步骤(1)所述的胚胎为哺乳动物胚胎；优选为小鼠、大鼠、豚鼠、猪、犬、兔、猴中的至少一种；更优选为14～17d的小鼠胚胎。
上述的小鼠为非缺陷品系小鼠；优选为C57BL/6、ICR小鼠、昆明小鼠中的至少一种。
步骤(2)所述的蛋白酶为Dispase II。
步骤(2)所述的消化为消化30～50min。
步骤(4)所述的消化液为Trypsin-EDTA。
步骤(4)所述的处理为37℃处理3分钟。
步骤(7)所述的培养基为N2B27培养基、FBS培养基、KSR培养基中的至少一种。
所述的N2B27培养基包括以下组分：
50％DMEM/F12培养基、50％ Neurobasal培养基、终浓度为1×的N2补充剂、终浓度为1×的B27补充剂、20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、20ng/mL表皮生长因子。
步骤(7)所述的培养的条件为37℃，5％CO2，每3天换一次培养基。
步骤(7)所述的培养的时间为1～17天。
一种可在体外长期维持牙胚间充质细胞成牙命运的培养基，包括以下组分：
50％DMEM/F12培养基、50％ Neurobasal培养基、终浓度为1×的N2补充剂、终浓度为1×的B27补充剂、20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、20ng/mL表皮生长因子。
上述培养方法及培养基在培养牙胚间充质细胞中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)蕾状后期及其之后胚胎发育时期分离的牙胚间充质细胞DMCs是具有成牙命运的细胞，但在培养过程中其维持诱导成牙的潜能迅速下降。含胎牛血清(FBS)的常规培养基可以支持DMCs的增殖，但在24小时后丧失其诱导成牙的潜能(Khan et al.1981，Zheng etal.2016)。我们进一步发现具有敲除血清替代物(KSR)的无血清培养基可以将DMCs的诱导成牙潜能延长到48小时(Zheng et al.2016)。然而，这仍然不足以在体外长期维持DMCs的诱导成牙潜能，即成牙命运。本发明提供一种可在体外适当维持牙胚间充质细胞成牙命运的培养基，发现其可以使蕾状期后的DMCs的诱导成牙潜能在体外持续长达14天，新培养基成分清晰：可促进细胞培养的稳定性，有利于增强批次间细胞培养的一致性；
(2)细胞在新培养基中的状态较好，尤其是从培养的第二天开始直到第二次传代前细胞状态都较传统培养体系中的细胞好；
(3)细胞的成牙潜能在新培养基中得到了较好的维持，比传统培养基中细胞的成牙潜能延长了13天，并经历了至少一次传代。
附图说明
图1是本发明实验方案流程示意图。
图2是实施例1、3、4中培养得到的牙胚间充质细胞的明场图。
图3是实施例1、3、4中牙胚间充质细胞在体外培养后分别和蕾状期后无诱导潜能的牙胚上皮重组后培养的实验结果图；小图右上角代表成牙率，如11/27代表27个样品中有11个形成牙齿样结构。
图4是实施例5中利用非牙源上皮检验N2B27培养的间充质细胞的诱导成牙能力结果图；其中左图为半定量PCR结果，右上为非牙源的肾近端肾小管上皮细胞系的明场图，右中及右下为重组牙胚移植培养3周后的明场图和HE染色图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下面实施方案中若未注明具体试验条件，则通常按照常规试验条件或按照试剂公司所建议的试验条件。所使用的材料、试剂等，若无特殊说明，均为从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1使用N2B27培养基培养蕾状期后的牙胚间充质细胞(DMCs)
(1)在体视镜下，从ICR小鼠胚胎第14.5天(E14.5)的下颌骨中用针切割分离小鼠磨牙牙胚；
(2)在37℃下用0.75mg/mL Dispase II(Gibco)消化35分钟；
(3)加入含有10％FBS的培养基终止消化后，在体视镜下用钨针分离牙胚间充质和牙胚上皮组织；
(4)收集牙胚间充质(DMCs)并用0.25％ Trypsin-EDTA(Gibco)在37℃处理3分钟；
(5)加入含有10％FBS的培养基终止消化洗涤后，用枪吹打均匀获得单细胞；
(6)将细胞沉淀重悬于完全培养基中，将细胞接种在涂有明胶的培养皿中，称为第0代(P0)；
(7)在接种了细胞的培养皿中加入N2B27培养基进行培养，每3天换液一次，37℃，5％CO2；N2B27培养基的配方为：50％ DMEM/F12和50％ Neurobasal(以质量计)，200×N2补充剂(Gibco，培养基中终浓度为1×)、100×B27补充剂(Gibco，培养基中终浓度为1×)、20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和20ng/mL表皮生长因子(EGF)；
(8)在接种后的第7天(D7)，细胞达到90～100％融合度时进行传代，第一次传代后的细胞被称为第1代(P1)，培养得到的牙胚间充质细胞的显微图像如图2所示。
实施例2使用FBS培养基培养蕾状期后的牙胚间充质细胞(DMCs)
分离和培养方法参照实施例1的步骤，区别在于步骤(7)中加入FBS培养基进行培养，FBS培养基的配方为：高糖DMEM+10％FBS(以质量计)+100U/ml penicillin+100g/mlstreptomycin，培养得到的牙胚间充质细胞的显微图像如图2所示，由于FBS培养的牙胚间充质细胞在D7后可继续传代，但根据后续的重组移植研究发现D7的细胞已经丧失成牙潜能，因此本案仅对P0的样本进行研究。
实施例3使用KSR培养基培养蕾状期后的牙胚间充质细胞(DMCs)
分离和培养方法参照实施例1的步骤，区别在于步骤(7)中加入KSR培养基进行培养，KSR培养基的配方为：高糖DMEM+10％ KSR(Invitrogen,Carlsbad,CA，以质量计)，20ng/ml FGF2(R&D system)and 20ng/ml EGF(R&Dsystem)，培养得到的牙胚间充质细胞的显微图像如图2所示，根据后续的重组移植研究发现在KSR培养基中D4的细胞已经丧失成牙潜能，因此本案仅对P0的样本进行研究。
实施例4小鼠牙胚上皮组织的分离
(1)从ICR小鼠胚胎第14天～17天的下颌骨中用针切割分离小鼠磨牙牙胚；
(2)在37℃下用0.75mg/mL Dispase II(Gibco)消化35～45分钟；
(3)加入含有10％FBS的培养基终止消化后用钨针分离牙胚间充质和牙胚上皮组织；
(4)收集牙胚上皮组织置于冰上重组备用，即获得不具有诱导成牙能力的蕾状期后的小鼠牙胚上皮组织。
实施例5牙胚组织的重组、移植及检测
(1)选取实施例1中体外培养P0和P1中Day1、Day4和Day7共6个时间点的牙胚间充质细胞，以及实施例2中体外培养P0中Day1、Day2和Day7共3个时间点的牙胚间充质细胞和实施例3中体外培养P0中Day1、Day2和Day7共3个时间点的牙胚间充质细胞，消化洗涤；
(2)细胞计数后，将每1.0×105个细胞分置于1个1.5毫升EP管中；
(3)4℃，6600rpm离心4.5分钟，使细胞聚集成细胞小球；
(4)细胞小球EP管中，每管保留400毫升培养基，在37℃孵育1-2小时，使小球中的细胞进一步聚集；
(5)将间充质细胞小球从EP管中吸出，置于矩形滤膜上，在体视镜下，将1片实施例3中制备得到的牙胚上皮组织置于一个间充质细胞小球上，即形成重组牙胚，每个时间点的样本至少制备10个重组牙胚进行移植；
(6)将带有滤膜的重组牙胚置于35mm培养皿中的金属支架上，利用经典气液两相组织培养体系进行培养，即培养皿中添加重组牙胚培养基(DMEM+10％胎牛血清FBS)，培养皿置于37℃，5％CO2培养箱中过夜培养；
(7)利用体视镜，将重组牙胚移植到成年雄性ICR小鼠肾包膜下；
(8)在肾包膜下培育3周后，处死宿主小鼠，取出肾脏；
(9)在体视镜下观察肾脏包膜下的移植产物，检查其是否形成钙化组织，并根据需要进行局部取样固定、脱钙、切片及相关染色检测。
实验结果如图3所示，小图右上角代表成牙率，如11/27代表27个样品中有11个形成牙齿样结构，图片右下角为标尺，示意500微米；实施例1中N2B27培养中P0和P1代第1、4、7天(D1,D4,D7)中牙胚间充质细胞分别和蕾状期后无诱导潜能的牙胚上皮重组形成的牙齿样结构，而实施例2中FBS培养的所有重组牙胚和实施例3中KSR培养的所有重组牙胚则无法形成牙齿样结构；实验结果证明，实施例1的培养方法能够使蕾状期后的DMCs的诱导成牙潜能在体外持续长达14天，并能够进行体外传代。
实施例6构建非牙源上皮的重组牙胚，并进行移植及产物检测
(1)细胞系mRTECs(小鼠肾近端肾小管上皮细胞从ScienCell公司购买获得(Catalog NO.#M4100-57)，其来源于C57BL/6小鼠)在无涂层的培养皿中培养，培养基是无角质形成细胞无血清培养基(KSFM)(Life Technologies，Gibco)；
(2)mRTECs计数后，将每1.0×105个细胞分置于1个1.5毫升EP管中；
(3)4℃，6600rpm离心4.5分钟，使细胞聚集成细胞小球；
(4)mRTECs小球EP管中，每管保留400毫升培养基，在37℃孵育1-2小时，使小球中的细胞进一步聚集，得到肾近端肾小管上皮细胞小球；
(5)将肾近端肾小管上皮细胞小球从EP管中吸出，至于小培养皿中备用；
(6)将实施例1中得到的P0代Day4间充质细胞小球置于矩形滤膜上，在体视镜下，将1片肾近端肾小管上皮细胞小球至于间充质细胞小球上，形成重组牙胚；
(7)将带有滤膜的重组牙胚置于35mm培养皿中的金属支架上，利用经典气液两相组织培养体系进行培养，即培养皿中添加重组牙胚培养基(DMEM+10％胎牛血清FBS)，培养皿置于37℃，5％ CO2培养箱中过夜培养；
(8)利用体视镜，将重组牙胚移植到相同品系成年雄性小鼠肾包膜下；
(9)在肾包膜下培育3周后，处死宿主小鼠，取出肾脏；
(10)在体视镜下观察肾脏包膜下的移植产物，检查其是否形成钙化组织，并进行局部取样固定、脱钙、切片及HE染色检测，同时分别对牙胚上皮部分和mRTEC部分取样进行半定量PCR检测，以β-actin为内参基因，检测Nphs1、FGF8、Krt8、Pitx2的表达情况。
表1半定量PCR所用引物
| Forward | Reverse | |
| β-actin | 5’-AGTGTTTCCTCGTCCCGTAG-3’ | 5’-GCCCTTCCACAATGCCAAAG-3’ |
| Npsh1 | 5’-CCTCACTCGGTAGGACTGGA-3’ | 5’-ATACCTGTGAAGGCTTGGCG-3’ |
| Pitx2 | 5’-CCGGCAGAGGACTCATTTCA-3’ | 5’-GGTCGACTGCATACTGGCAA-3’ |
| Fgf8 | 5’-CTCCAAGCCCAGGAAGGC-3’ | 5’-GGCGGGTAGTTGAGGAACTC-3’ |
| Krt8 | 5’-AAGTTCGTGCCCAGTACGAG-3’ | 5’-GCTTCCCATCTCGGGTTTCA-3’ |
实验结果如图4所示，左图为半定量PCR结果，显示特异性标志Nphs1仅在肾近端肾小管上皮细胞系中检测到；Fgf8作为牙胚上皮早期的标志分子仅在10.5天的牙预定的上皮(具有诱导成牙潜能的蕾状期前的牙胚上皮)检测到；Krt8是牙胚上皮各时期普遍表达的标志物；Pitx2在牙胚中仅在上皮特异表达，同时也可以在肾近端肾小管上皮细胞系中检测到；从右图HE染色和显微图片可以看出，实施例1中N2B27培养中P0第4天(P0D4)中牙胚间充质细胞和非牙源的肾近端肾小管上皮细胞重组的样品，在肾包膜下培育3周后形牙齿样结构，其成牙率是3/7，脱钙切片染色后可以观察到在体牙齿萌出前包含的各结构，包括上皮衍生的囊泡(cyst)、分泌釉质的成釉细胞(Ameloblasts,Am)及脱钙后遗留的釉质空白区(enamel space,es)，和间充质细胞衍生的牙周骨结构(Bone,B)、牙本质(dentin,D)及牙髓(dental pulp，dp)；实验结果证明，实施例1中的培养方法得到的间充质细胞，不仅能够与牙胚上皮组织形成具有成牙潜力的重组牙胚，也能与非牙源上皮组织重组形成具有成牙潜力的重组牙胚。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种可在体外长期维持牙胚间充质细胞成牙命运的培养方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)从胚胎的下颌骨中分离小鼠磨牙牙胚；
(2)用蛋白酶消化磨牙牙胚；
(3)终止消化后，分离牙胚间充质和牙胚上皮组织；
(4)收集牙胚间充质并用消化液处理；
(5)终止消化，洗涤后，获得单细胞；
(6)将细胞接种在培养皿中；
(7)在接种了细胞的培养皿中加入培养基进行培养。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：
步骤(1)所述的胚胎为14～17d的小鼠胚胎；
所述的小鼠为非缺陷品系小鼠。
3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：
步骤(2)所述的蛋白酶为Dispase II；
步骤(2)所述的消化为消化30～40min。
4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：
步骤(4)所述的消化液为Trypsin-EDTA；
步骤(4)所述的处理为37℃处理3分钟。
5.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：
步骤(7)所述的培养基为N2B27培养基、FBS培养基、KSR培养基中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于：
所述的N2B27培养基包括以下组分：
50％DMEM/F12培养基、50％Neurobasal培养基、终浓度为1×的N2补充剂、终浓度为1×的B27补充剂、20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、20ng/mL表皮生长因子。
7.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：
步骤(7)所述的培养的条件为37℃，5％CO2，每3天换一次培养基。
8.一种可在体外长期维持牙胚间充质细胞成牙命运的培养基，其特征在于包括以下组分：
50％DMEM/F12培养基、50％Neurobasal培养基、终浓度为1×的N2补充剂、终浓度为1×的B27补充剂、20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、20ng/mL表皮生长因子。
9.权利要求1～7任一所述的培养方法在培养牙胚间充质细胞中的应用。
10.权利要求8所述的培养基在培养牙胚间充质细胞中的应用。
Priority Applications (1)
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