CN113151006A

CN113151006A - 能够生产活性提高的纤维素酶的里氏木霉菌株及其应用

Info

Publication number: CN113151006A
Application number: CN202110336275.2A
Authority: CN
Inventors: 高乐; 贾文娣
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2021-03-29
Filing date: 2021-03-29
Publication date: 2021-07-23
Anticipated expiration: 2041-03-29
Also published as: CN113151006B

Abstract

本发明公开了能够生产活性提高的纤维素酶的里氏木霉菌株A2H，其被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.21470，保藏时间为：2021年03月17日，保藏单位地址为：中国科学院微生物研究所。本发明还公开了用于生产活性提高的纤维素酶的方法。本发明还公开了纤维素酶和组合物。本发明还公开了里氏木霉菌株A2H或纤维素酶于纤维素降解中或科学研究中或纤维素酶制剂中的应用。本发明的里氏木霉A2H菌株的纤维素酶滤纸酶活力提升46％，胞外蛋白分泌量提升30％以上，水解汽爆玉米秸秆转化率提高了13％以上。

Description

能够生产活性提高的纤维素酶的里氏木霉菌株及其应用

技术领域

本发明属于纤维素降解技术领域，涉及一株能够生产活性提高的纤维素酶的里氏木霉菌株A2H，还涉及用于生产活性提高的纤维素酶的方法，还涉及纤维素酶，还涉及组合物，还涉及里氏木霉菌株A2H或纤维素酶于纤维素降解中或科学研究中或纤维素酶制剂中的应用。

背景技术

纤维素酶是目前影响生物质综合利用，特别是纤维素乙醇成本的主要因素之一。酶成本大约占到纤维素乙醇生产成本的20％-30％左右。纤维素酶加入量通常占木质纤维素原料质量的3％-10％，酶解72h或者更长时间，原料转化率才超过85％。与淀粉酶相比，纤维素酶效率按照g糖/(g酶*h)计，相差1000倍以上，成本相差30倍以上。所以提高纤维素酶的性能、降低纤维素酶的使用成本成为我国发展纤维素乙醇工业亟待解决的重要问题。

国际上最大的几家酶制剂公司Novozymes、Genencor、DSM等均在纤维素乙醇生产专用纤维素酶制剂方面有较大的研发力度，相继推出几款商业纤维素酶制剂(Novozymes2012，Genecor 2012)。Novozymes公司曾宣称其第二代纤维素酶制剂

CTec2的用酶成本为每加仑乙醇约50美分。该公司最新开发了第三代复合纤维酶制

CTec3，宣称生产每吨乙醇需要的酶量是50公斤，酶成本占总成本的20％，可与市场上任何纤维素乙醇用酶制剂在底物转化效率上相媲美(Novozymes 2012)。

通过开发更加高产的纤维素酶生产菌种和优化发酵产酶工艺，进而进行就地生产，也是大幅度地降低纤维素酶在纤维素乙醇成本中所占的比例的一个重要方法。例如：德国克莱恩(Clariant)公司在巴伐利亚州建立的年产1000吨纤维素乙醇示范工厂，在其多年实验运行中对集成现场产酶的优势进行了详细的比较分析，发现可以使纤维素酶在乙醇总生产成本中的比例从外购商品酶时的35％，或异地产酶时的28％，降低到集成现场产酶时的10％，而且可以做到成本和风险可控，使纤维素乙醇具备了市场竞争性(Losordo Z2017)。

由于我国具有自主知识产权菌株酶活力相对偏低，我国的酶制剂成本目前高于国外先进技术(如诺维信)2倍以上，因此，开发高活性纤维素酶系尤为关键。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一株能够生产活性提高的纤维素酶的里氏木霉菌株A2H。

本发明另有一个目的是提供用于生产活性提高的纤维素酶的方法。

本发明另有一个目的是提供纤维素酶。

本发明另有一个目的是提供组合物，用于在纤维素降解中提供降解的作用。

本发明再有一个目的是提供里氏木霉菌株A2H或纤维素酶于纤维素降解中或科学研究中或纤维素酶制剂中的应用。

为此，本发明提供的技术方案为：

能够生产活性提高的纤维素酶的里氏木霉菌株A2H，该里氏木霉菌株A2H，其分类命名：里氏木霉Trichoderma reesei，菌株里氏木霉Trichoderma reesei A2H被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.21470，保藏时间为：2021年03月17日，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

用于生产活性提高的纤维素酶的方法，包括如下步骤：

1)将里氏木霉菌株A2H于接种于培养基中进行培养；

2)以步骤1)中生长的里氏木霉菌株A2H的培养液的形式从培养基中收获纤维素酶。

优选的是，所述的用于生产活性提高的纤维素酶的方法中，所述培养的条件为：温度为24℃～28℃，pH4.8～5.2，转速250～300rpm，发酵液中溶氧量25～35％(v/v)，培养一定时间。

优选的是，所述的用于生产活性提高的纤维素酶的方法中，所述培养一定时间为24～120小时。

优选的是，所述的用于生产活性提高的纤维素酶的方法中，所述培养的条件为：温度为26℃，pH5.0，发酵液中溶氧量30％(v/v)。

优选的是，所述的用于生产活性提高的纤维素酶的方法中，所述培养中，所述培养基包含如下组分：葡萄糖20～30g/L，玉米浆干粉2～6g/L，KOH 1.60～1.72g/L，(NH₄)₂SO₄2.6～3.0g/L和MgSO₄ 0.4～0.8g/L。

优选的是，所述的用于生产活性提高的纤维素酶的方法中，所述培养中，所述培养基包含如下组分：葡萄糖25g/L，玉米浆干粉4g/L，KOH 1.66g/L，(NH₄)₂SO₄ 2.8g/L和MgSO₄0.6g/L。

纤维素酶，所述纤维素酶来自所述的里氏木霉菌株A2H或所述的方法。

组合物，其包含如所述的纤维素酶，所述组合物在纤维素降解中提供降解的功能。

所述的里氏木霉菌株A2H或所述的纤维素酶于纤维素降解中或科学研究中或纤维素酶制剂中的应用。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明利用丝状真菌微流控高通量筛选技术，突破传统的菌种选育技术，精准定向提升具有自主知识产权菌株的纤维素酶酶活力，大幅度提高菌株选育的效率和成功率。首次创制出具有自主知识产权纤维素酶菌株，打破国外酶制剂的垄断。

本发明的里氏木霉A2H菌株的纤维素酶滤纸酶活力提升46％，胞外蛋白分泌量提升30％以上,水解汽爆玉米秸秆转化效率提高13％以上。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明中里氏木霉RUT-C30和DES-15菌株的菌丝形态的电镜图；

图2为本发明其中一种技术方案中的葡萄糖的标准曲线图；

图3为本发明其中一种技术方案中的牛血清白蛋白的标准曲线图；

图4为本发明其中一种技术方案中里氏木霉RUT-C30、DES-15和A2H菌株的纤维素酶滤纸酶活力的曲线图；

图5为本发明其中一种技术方案中里氏木霉RUT-C30、DES-15和A2H菌株的胞外分泌蛋白量的曲线图；

图6为本发明其中一种技术方案中里氏木霉RUT-C30、DES-15和A2H菌株的纤维素酶的水解效率比较图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

本发明提供能够生产活性提高的纤维素酶的里氏木霉菌株A2H，该里氏木霉菌株A2H，其分类命名：里氏木霉Trichoderma reesei，菌株里氏木霉Trichoderma reesei A2H被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.21470，保藏时间为：2021年03月17日，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明还提供用于生产活性提高的纤维素酶的方法，包括如下步骤：

1)将里氏木霉菌株A2H接种于培养基中进行培养；

2)以步骤1)中生长的里氏木霉菌株A2H的培养液的形式从培养基中收获纤维素酶。作为优选，将发酵后的培养基离心取上清液即得到含有纤维素酶的产物。

在本发明的其中一些实施例中，作为优选，所述培养的条件为：温度为24℃～28℃，pH4.8～5.2，转速250～300rpm，发酵液中溶氧量25～35％(v/v)，培养一定时间。

在本发明的其中一些实施例中，作为优选，所述培养一定时间为24～120小时。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述培养的条件为：温度为26℃，pH5.0，发酵液中溶氧量30％(v/v)。

在本发明的其中一些实施例中，作为优选，所述培养中，所述培养基包含如下组分：葡萄糖20～30g/L，玉米浆干粉2～6g/L，KOH 1.60～1.72g/L，(NH₄)₂SO₄ 2.6～3.0g/L和MgSO₄ 0.4～0.8g/L。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述培养中，所述培养基包含如下组分：葡萄糖25g/L，玉米浆干粉4g/L，KOH 1.66g/L，(NH₄)₂SO₄ 2.8g/L和MgSO₄ 0.6g/L。

本发明还提供纤维素酶，所述纤维素酶来自所述的里氏木霉菌株A2H或所述的方法。

本发明还提供组合物，其包含所述的纤维素酶，所述组合物在纤维素降解中提供降解的功能。

本发明还提供所述的里氏木霉菌株A2H或所述的纤维素酶于纤维素降解中或科学研究中或纤维素酶制剂中的应用。

为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，现提供如下的实施例进行说明：

本发明的出发菌株是里氏木霉RUT-C30，如图1所示，以里氏木霉RUT-C30为基础，进行诱变，获得里氏木霉DES-15菌株，最大的特点，是菌丝形态发生改变，纤维素酶酶活力提升。结合诱变及高通量筛选技术的菌种选育改造技术成功筛选到高产纤维素酶的菌株，目的菌株DES-15与出发菌株相比，菌丝0.6倍、直径1.6倍、分支数2倍左右，发酵优化后酶活达提升31％左右。

以菌株DES-15为基础，发明人通过ARTP诱变，借助液滴微流控高通量平台，通过对里氏木霉液滴生成、分选芯片以及液滴大小等条件优化，克服了里氏木霉菌丝生长过程会导致包裹液滴刺破造成液滴间交叉代谢物污染的弊端，同时对结合的荧光底物进行筛选及标记达到分选里氏木霉微液滴的目的，首次创建里氏木霉液滴微流控高通量筛选技术，筛选通量可达10000个/h，将传统方法的筛选周期从7-15天缩减到24h内完成，突破传统丝状真菌筛选方法的技术瓶颈，精准定向提升具有自主知识产权菌株的纤维素酶酶活力，大幅度提高菌株选育的效率和成功率，里氏木霉A2H的菌丝形态与菌株DES-15相比，变化不明显，但里氏木霉A2H菌株实现了纤维素酶滤纸酶活力提升46％，胞外蛋白分泌量提升30％以上。

三株菌株纤维素酶酶活力，胞外蛋白分泌量评价如下：

培养方法：发酵培养基和种子培养基均为：葡萄糖25g/L，玉米浆干粉4g/L，KOH1.66g/L，(NH₄)₂SO₄ 2.8g/L，MgSO₄ 0.6g/L。

发酵罐控制条件：pH5.0，温度26℃，250-300rpm，溶氧30％。发酵时间12，24，36，48，60，72，84，96，120h取样，离心获得上清液，进行酶活力和蛋白含量测定。整个发酵过程中选育的高产纤维素酶的菌株A2H滤纸酶活力和蛋白分泌量明显高于出发菌株RUT-C30和DES-15。

纤维素酶滤纸酶活的测定：在比色管中放入一条经过折叠的Whatman滤纸条(50±1mg)，依次加入1mL 0.05M pH＝4.8醋酸-醋酸钠缓冲液、0.5mL经过稀释的酶液，然后置于50℃水浴反应1小时，然后采用DNS法测定生成的葡萄糖的生成量，具体步骤为：反应结束后加入3mL的DNS试剂，煮沸5min，然后吸取200微升反应液加入1mL蒸馏水进行稀释，取稀释后的溶液200微升，测OD540的吸光值，通过与已制作的葡萄糖标准曲线比对，得到葡萄糖的含量，从而求出滤纸酶活。滤纸酶活的定义为每分钟转化底物生成1微摩尔的葡萄糖所需要的酶量为1个活力单位。

1.葡萄糖-DNS标准曲线

①葡萄糖标准曲线的绘制

用蒸馏水配制浓度为100g/L的葡萄糖，并按下表进行稀释。取稀释的葡萄糖溶液0.5mL，加1mL的0.05mol/L，pH4.8的柠檬酸缓冲液，以1.5mL的0.05mol/L，pH4.8的柠檬酸缓冲液作为零点对照，添加3mL的DNS反应液后，沸水浴加热5min，用蒸馏水适当稀释(一般取0.2mL加入到1mL蒸馏水中稀释)后，取0.2mL到96孔板中，540nm下测定吸光值。

表1葡萄糖标准液

当葡萄糖浓度在10g/L-34g/L的范围内时，在540nm时的吸光度和葡萄糖浓度之间有良好的线性关系，相关系R²为0.997，公式为y＝3.005x+0.145，其中y为540nm时的吸光度，x为葡萄糖浓度(％)。如图2所示。

②滤纸酶活力计算公式＝葡萄糖释放量(μmol/L)/mL酶液/分钟

原始数据如下：

利用公式计算滤纸酶活力计算结果如下，并绘制得到如图4所示的曲线图：

2.发酵液蛋白浓度测定

蛋白浓度采用Bradford法进行测定：标准曲线的绘制使用牛血清白蛋白为标品。向试管中加入100μL经过稀释的酶液，然后加入1mL的考马斯亮蓝工作液中，注意考马斯亮蓝工作液和酶液的体积比应保持为10:1左右，混合均匀后，静置5min，然后吸取200微升于96孔板中测定OD595的值，通过标准曲线求出蛋白浓度。

①牛血清白蛋白标准曲线的绘制

如图3所示为牛血清白蛋白的标准曲线，由图3可知，当蛋白浓度在0.02g/L-0.2g/L的范围内时，在595nm时的吸光度和蛋白质浓度之间有良好的线性关系，相关系数R2＝0.992，公式为y＝1.679x+0.014，其中y为595nm时的吸光度，x为蛋白质浓度(g/L)②发酵液蛋白浓度测定原始数据

通过牛血清蛋白标准曲线计算发酵液中蛋白含量，并绘制得到如图5所示的曲线图。

为了进一步说明高产菌株A2H在生产纤维素酶方面的优越性，将高产纤维素酶菌株A2H的酶活力最高值，蛋白分泌量最高值，与出发菌株进行比较，并计算滤纸酶活力的提高率。里氏木霉菌株A2H发酵120h，滤纸酶活力可以达到29.00FPU/ml，相比于DES-15提高了46.5％；里氏木霉菌株A2H发酵120h，胞外蛋白分泌量达到13.5g/L，相比于DES-15提高了31.1％；从纤维素酶生产效率来说，菌株A2H生产纤维素酶的效率更高，相比于DES-15提高了46.5％。

3.汽爆玉米秸秆糖化水解实验

为了进一步评价不同菌株生产纤维素酶的性能差异，发明人选择木质纤维素水解条件，比较纤维素酶的水解效率。

汽爆玉米秸秆糖化水解实验在20mL的反应体系，酶的用量为10FPU/g底物，底物采用汽爆处理的玉米秸杆，反应体系中加入2.0g底物(总体积的10％)，pH 4.8，50℃糖化72h，同时进行三组平行实验。分别于24，48，72h取样，离心后取50微升上清测定葡萄糖含量。用水稀释10～100倍不等后采用生物传感分析仪对葡萄糖的产量进行测定。

利用葡萄糖的产生量计算纤维素转化率。从图6和下表可以明显看出，高产菌株A2H生产的纤维素酶性能更为优越，72小时水解后，汽爆预处理秸秆纤维素转化率超过95％。里氏木霉菌株DES-15产的纤维素酶水解汽爆预处理秸秆72小时后，纤维素转化率为82.4％。菌株A2H产的纤维素酶制剂水解效率大约提高了13％，水解性能更优。

这里说明的模块数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的能够生产活性提高的纤维素酶的里氏木霉菌株及其应用的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims

1.能够生产活性提高的纤维素酶的里氏木霉菌株A2H，该里氏木霉菌株A2H，其分类命名：里氏木霉Trichoderma reesei，菌株里氏木霉Trichoderma reesei A2H被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.21470，保藏时间为：2021年03月17日，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

2.用于生产活性提高的纤维素酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将里氏木霉菌株A2H接种于培养基中进行培养；

3.如权利要求2所述的用于生产活性提高的纤维素酶的方法，其特征在于，所述培养的条件为：温度为24℃～28℃，pH4.8～5.2，转速250～300rpm，发酵液中溶氧量25～35％(v/v)，培养一定时间。

4.如权利要求3所述的用于生产活性提高的纤维素酶的方法，其特征在于，所述培养一定时间为24～120小时。

5.如权利要求3所述的用于生产活性提高的纤维素酶的方法，其特征在于，所述培养的条件为：温度为26℃，pH5.0，发酵液中溶氧量30％(v/v)。

6.如权利要求2所述的用于生产活性提高的纤维素酶的方法，其特征在于，所述培养中，所述培养基包含如下组分：葡萄糖20～30g/L，玉米浆干粉2～6g/L，KOH 1.60～1.72g/L，(NH₄)₂SO₄ 2.6～3.0g/L和MgSO₄ 0.4～0.8g/L。

7.如权利要求6所述的用于生产活性提高的纤维素酶的方法，其特征在于，所述培养中，所述培养基包含如下组分：葡萄糖25g/L，玉米浆干粉4g/L，KOH 1.66g/L，(NH₄)₂SO₄2.8g/L和MgSO₄ 0.6g/L。

8.纤维素酶，所述纤维素酶来自如权利要求1所述的里氏木霉菌株A2H或如权利要求2所述的方法。

9.组合物，其包含如权利要求8所述的纤维素酶，所述组合物在纤维素降解中提供降解的功能。

10.如权利要求1所述的里氏木霉菌株A2H或权利要求8所述的纤维素酶于纤维素降解中或科学研究中或纤维素酶制剂中的应用。