CN113717871A - 重组解脂耶氏酵母菌及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组解脂耶氏酵母菌及其构建方法和应用，该重组解脂耶氏酵母菌是在解脂耶氏酵母基因组中***密码子优化的环氧合酶OAC基因表达盒和聚酮合酶OLS基因表达盒后得到；本发明的重组解脂耶氏酵母菌用于高效合成橄榄醇酸，构建方法高效，操作简单，可绿色高效生产橄榄醇酸。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种重组解脂耶氏酵母菌，具体地说是一种重组解脂耶氏酵母菌及其构建方法和应用。
背景技术
单芳族化合物橄榄醇酸(OA)除具有抗微生物，细胞毒性和光保护活性等功效外，还可在***素的生物合成过程中充当烷基间苯二酚，因其独特的药理特性，在药理化合物合成中有着广阔应用前景。
目前，OA及其衍生物的获取仍依赖于直接从植物中提取，这种植物提取法严重受植物生长周期和条件限制，地理和气候条件则显著影响所合成OA前体化合物的质量，提取周期极长。而现有的OA的化学合成法往往步骤繁琐，收率低。因此，寻找新的OA生产途径，尤其是绿色高效是今后OA工业化生产的必然发展趋势。
解脂耶氏酵母是经FDA认证的非常规安全产油酵母，具有胞内乙酰CoA/辅因子供应充足、细胞耐受性好及生成的油脂可包裹亲脂性萜类增强萜类存储能力等优势，同时，解脂耶氏酵母中的基因组操作工具相对成熟也建立了包括Gibson、Gateway、BioBricks及体内一步组装法的方法体系。通过基因工程利用解脂耶氏酵母生产OA相较于传统方法更绿色高效，但环氧合酶OAC基因及聚酮合酶OLS基因在解脂耶氏酵母中的异源高效表达效果不佳。
发明内容
本发明的目的，是要提供一种重组解脂耶氏酵母菌及其构建方法，通过基因工程手段构建，以达到用于绿色高效生产橄榄醇酸的目的；
本发明的还有一个目的，是要提供上述重组解脂耶氏酵母菌在发酵生产橄榄醇酸中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种重组解脂耶氏酵母菌，该重组解脂耶氏酵母菌的基因组包括解脂耶氏酵母的基因组、环氧合酶OAC基因表达盒和聚酮合酶OLS基因表达盒。
其中，所述环氧合酶OAC基因表达盒和聚酮合酶OLS基因表达盒通过质粒形式导入所述解脂耶氏酵母，然后整合到解脂耶氏酵母基因组上。将环氧合酶OAC基因及聚酮合酶OLS基因导入解脂耶氏酵母基因组中，会产生环氧合酶OAC与聚酮合酶OLS，这两个酶反应生成橄榄醇酸OA。
作为一种限定，所述解脂耶氏酵母为Yarrowia lipolytica Po1f-Δku70。
作为另一种限定，所述环氧合酶OAC基因表达盒包括启动子、终止子、连接有启动子同源臂的OAC基因和连接有终止子同源臂的OAC基因；
所述聚酮合酶OLS基因表达盒包括启动子、终止子、连接有启动子同源臂的OLS基因和连接有终止子同源臂的OLS基因。
作为进一步限定，所述环氧合酶OAC基因表达盒中启动子为来源于解脂耶氏酵母的PTEFin启动子、PTEF启动子或PEXP启动子；
所述环氧合酶OAC基因表达盒中终止子为来源于解脂耶氏酵母的TXPR2T终止子、TCYC1t终止子或Tliplt终止子。
作为进一步限定，所述聚酮合酶OLS基因表达盒中启动子为来源于解脂耶氏酵母的PTEFin启动子、PTEF启动子或PGPD启动子；
所述聚酮合酶OLS基因表达盒中终止子为来源于解脂耶氏酵母的TXPR2T终止子、TCYC1t终止子或Tliplt终止子。
其中，启动子和终止子本领域技术人员可在防止错配的前提下根据需求搭配使用。
作为第三种限定，所述环氧合酶OAC基因表达盒中OAC基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；所述聚酮合酶OLS基因表达盒中OLS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
SEQ ID NO.1：OAC基因的核苷酸序列
ATGGCTGTCAAGCATCTGATTGTTCTCAAGTTCAAAGACGAGATCACCGAGGCCCAGAAGGAGGAGTTCTTCAAGACTTACGTTAATTTGGTCAACATCATCCCCGCCATGAAGGATGTCTACTGGGGCAAGGACGTAACACAAAAGAACAAGGAAGAAGGCTACACTCACATTGTGGAGGTGACTTTTGAGTCCGTTGAAACCATCCAGGACTACATTATCCACCCTGCACATGTGGGTTTTGGAGATGTGTACAGATCTTTCTGGGAGAAGCTGCTTATTTTTGACTATACGCCACGAAAATGA
SEQ ID NO.2:OLS基因的核苷酸序列
ATGAACCACCTCCGTGCCGAGGGACCGGCAAGTGTCTTAGCGATTGGAACAGCCAATCCCGAAAACATTCTGCTGCAGGATGAGTTCCCCGACTACTACTTCCGGGTCACCAAGAGCGAGCACATGACCCAGCTGAAAGAGAAGTTCCGAAAAATTTGTGACAAGTCCATGATCCGAAAGCGAAACTGTTTCCTCAACGAGGAGCATCTCAAGCAGAACCCCCGACTAGTCGAACACGAGATGCAGACGCTGGACGCTCGGCAAGATATGCTCGTAGTAGAGGTGCCAAAGCTCGGCAAGGATGCCTGTGCTAAGGCTATCAAGGAGTGGGGACAACCCAAGTCAAAGATTACTCACCTGATCTTCACCTCCGCTAGCACGACTGACATGCCTGGCGCCGATTACCACTGTGCAAAGCTCCTGGGGCTTTCCCCTTCGGTCAAGAGAGTGATGATGTACCAGCTCGGATGCTACGGCGGAGGCACGGTGCTGCGAATCGCCAAAGACATCGCCGAGAATAACAAGGGCGCTAGGGTTCTCGCGGTCTGCTGCGACATCATGGCATGTCTGTTTAGAGGTCCTTCTGAATCTGATCTCGAGCTTCTGGTCGGACAGGCCATTTTTGGAGACGGTGCCGCTGCGGTCATTGTCGGAGCTGAGCCAGATGAGTCCGTTGGGGAACGACCTATTTTCGAGCTGGTGTCCACTGGCCAGACCATTCTACCCAATTCAGAAGGAACCATCGGTGGGCACATCAGAGAGGCCGGTTTGATATTTGACTTGCATAAGGACGTGCCCATGCTGATTTCCAACAACATCGAGAAATGCCTTATTGAGGCTTTCACCCCTATTGGTATCAGCGACTGGAACTCGATCTTCTGGATCACCCATCCCGGAGGGAAGGCCATTCTGGATAAGGTGGAAGAAAAACTGCACCTCAAATCTGACAAGTTTGTGGACTCTCGACATGTTCTTTCTGAGCATGGCAACATGTCTAGTTCGACAGTCTTGTTTGTGATGGACGAGCTGCGCAAGCGGTCGCTGGAGGAAGGCAAGTCTACTACAGGTGATGGCTTCGAATGGGGCGTTTTGTTTGGTTTTGGTCCCGGACTTACTGTGGAGCGAGTGGTTGTGCGTTCCGTTCCGATTAAGTATTGA
本发明还提供了上述重组解脂耶氏酵母菌的一种构建方法，它包括依次进行的以下步骤：
S1.重组质粒pUC57-SCP2-HUH-OAC的构建
构建环氧合酶OAC基因表达盒，在pUC57-SCP2-HUH骨架中***来源于Yarrowialipolytica Polf-Δku70的染色体A中SCP2位点上下游同源臂，
在所述SCP2位点上下游同源臂之间***环氧合酶OAC基因表达盒，得重组质粒pUC57-SCP2-HUH-OAC；
S2.重组质粒pUC57-SCP2-HUH-OAC-OLS的构建
构建聚酮合酶OLS基因表达盒，取所述重组质粒pUC57-SCP2-HUH-OAC作骨架，在所述SCP2位点上下游同源臂之间***聚酮合酶OLS基因表达盒，得重组质粒pUC57-SCP2-HUH-OAC-OLS；
S3.重组解脂耶氏酵母菌的构建
将所述重组质粒pUC57-SCP2-HUH-OAC-OLS转化入Yarrowia lipolytica Polf-Δku70，得重组解脂耶氏酵母菌。
作为一种限定，所述SCP2位点上下游同源臂的序列为SCP2位点上游1523bp至下游1524bp之间的序列。
本发明也提供了上述重组解脂耶氏酵母菌在发酵生产橄榄醇酸中的应用。
作为限定，所述发酵条件为28-30℃，200-240rpm，发酵培养基中葡萄糖浓度为40-80g/L。
其中，采用发酵培养基培养重组解脂耶氏酵母菌，得到发酵产物，通过有机溶液萃取发酵产物，收集有机相得橄榄醇酸。
进一步地，采用乙酸乙酯萃取培养四天的发酵液，旋蒸干燥后，即得橄榄醇酸，可溶于色谱级甲醇储存备用。
除旋蒸干燥外，还可采用氮气吹干。
由于采用了上述技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：
1)本发明构建的重组解脂耶氏酵母，是基于敲除了负责编码非同源重组基因ku70的解脂耶氏酵母菌株，使其同源重组能力增强，构建过程中将连接有上下游同源臂的目的基因***SCP2位点上下游，通过解脂耶氏酵母自身的同源重组功能实现基因的整合，能大幅度提高导入的基因的遗传稳定性，该重组解脂耶氏酵母菌株的构建方法高效，操作简单；
2)解脂耶氏酵母为一种安全认证的产油酵母，其本身具有很强的油脂合成能力，而目标产物橄榄醇酸易溶于脂溶性环境，这为橄榄醇酸在解脂耶氏酵母体内生产提供良好的胞内环境；
3)重组解脂耶氏酵母菌株通过引入环氧合酶OAC基因和聚酮合酶OLS编码基因，实现了橄榄醇酸的异源合成；
本发明的重组解脂耶氏酵母菌适于绿色高效工业化生产橄榄醇酸。
下面结合附图及具体实施例对本发明作详细说明。
附图说明
图1为本发明实施例1中重组质粒pUC57-SCP2-HUH-OAC的结构图，其中SCP2-up表示SCP2位点上游序列，SCP-dn表示SCP2位点下游序列，xpr2t表示终止子，TEFin表示启动子；
图2为本发明实施例1中重组质粒pUC57-SCP2-HUH-OAC-OLS的的结构图，其中SCP2-up表示SCP2位点上游序列，SCP-dn表示SCP2位点下游序列，Mig1t表示终止子，GPD表示启动子。
具体实施方式
下面通过具体实施例和附图对本发明做进一步详细说明，应当理解所描述的实施例仅用于解释本发明，并不限定本发明。
本发明实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。
Yarrowia lipolytica Po1f-Δku70(MatA，ura3-302，leu2-270，xpr2-322，axp2-delta，NU49，XPR2::SUC2 MYA2613Δku70::hisG)为解脂耶氏酵母，原始菌株MYA2613购自于美国菌种保藏中心(ATCC)，经敲除负责非同源重组的编码基因ku70，得到Yarrowialipolytica Po1fΔku70(MYA2613Δku70)。(具体方法参考Gao S,Tong Y,Zhu L,etal.Iterative integration of multiple-copy pathway genes in Yarrowialipolytica for heterologousβ-carotene production[J].Metabolic Engineering,2017:192.)
实施例1一种重组解脂耶氏酵母菌的构建方法
本实施例中重组解脂耶氏酵母菌的构建方法，包括依次进行的以下步骤：I)目的基因的制备
i)目的基因序列优化
根据NCBI上提供的来源于***的环氧合酶OAC基因的核苷酸序列，经过密码子优化后，委托擎科生物有限公司合成优化后的环氧合酶OAC基因，并***质粒pUC57中，得到质粒pUC57-OAC，优化后人工合成的OAC的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
根据NCBI上提供的来源于紫花苜蓿的聚酮化合物合酶OLS基因的核苷酸序列，经过密码子优化后，委托擎科生物有限公司合成优化后的聚酮化合物合酶OLS基因，并***质粒pUC57-OAC中，得到质粒pUC57-OAC-OLS，优化后的OLS的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
ii)质粒pUC-hisG-ura-hisG构建
根据NCBI上提供的Yarrowia lipolytica中的乳清酸核普-5'-磷酸脱浚酶编码基因ura的核苷酸序列(genebank登录号AJ306421.1)和hisG标签(genebank登录号AF324729.1)，委托擎科生物科技有限公司合成，将两个hisG标签编码基因序列***质粒PUC中，具体使用pUC57作为骨架，使用ECORI和HindIII酶切后回收骨架，将hisG标签编码基因采用ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit一步克隆，构建得到质粒pUC-hisG-hisG，再以此为骨架，采用HindIII酶切后回收骨架，将ura编码基因采用ClonExpressMultiS One Step Cloning Kit一步克隆，构建使得在两个hisG标签编码基因序列中***ura编码基因，以实现ura标记回收，得到质粒pUC-hisG-ura-hisG(即pUC-HUH)。
II)重组质粒的构建
启动子及终止子的选择：
环氧合酶OAC基因表达盒中：启动子PTEFin的核甘酸序列如SEQ ID NO.3所示，终止子Txpr2t核酸序列如SEQ IDNO.4所示；
聚酮合酶OLS基因表达盒中：启动子PGPD的核甘酸序列如SEQ ID NO.5所示，终止子TMig1t核酸序列如SEQ IDNO.6所示。
S1)重组质粒pUC57-SCP2-HUH-OAC的构建
i)构建环氧合酶OAC基因表达盒：
以TEFin-OAC-F(SEQ ID NO.7)和TEFin-OAC-R(SEQ ID NO.8)为引物，以Yarrowialipolytica Polf-Δku70基因组DNA为模板，扩增环氧合酶OAC表达盒启动子PTEFin。
以xpr2t-OAC-F(SEQ ID NO.9)和xpr2t-OAC-R(SEQ ID N.10)为引物，以Yarrowialipolytica Polf-Δku70基因组DNA为模板扩增环氧合酶OAC表达盒终止子Txpr2t。
以质粒pUC57-OAC为模板，以OAC-F(SEQID NO.11)和OAC-R(SEQ ID NO.12)为引物，扩增两端分别带有启动子PTEFin-OAC和终止子Txpr2t-OAC同源臂的OAC基因。
上述PCR扩增体系如下表1：
表1 PCR扩增体系
上述PCR的程序均为：98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸(延伸时间＝目标片段长度/1kb，单位min)，重复35个循环。
其中，上述PCR扩增体系本领域技术人员可根据需求对用量调整。
用AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit(购自康宁生命科学(吴江)有限公司)纯化回收，得环氧合酶OAC基因表达盒各片段。
将质粒pUC-hisG-ura-hisG用NEB公司的限制性内切酶HindⅢ酶切后，再用琼脂糖凝胶电泳胶回收，得线性化质粒。
ii)构建重组质粒pUC57-SCP2-HUH-OAC：
将线性化质粒和环氧合酶OAC基因表达盒各片段(启动子PTEFin、终止子Txpr2t、带有启动子PTEFin-OAC和终止子Txpr2t-OAC同源臂的OAC基因)利用南京诺唯赞生物科技有限公司的ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit一步克隆，反应体系见表2，将反应体系在50℃孵育15-30min后，得环状的重组质粒pUC57-SCP2-HUH-OAC，结构如图1，在pUC57-SCP2-HUH骨架中***了来源于Yarrowia lipolytica Polf-Δku70染色体A中SCP2位点上下游同源臂，且上下游同源臂之间成功***环氧合酶OAC基因表达盒。
表2一步克隆反应体系
| 组分 | 重组反应 |
| 线性化载体 | X ul |
| N个***片段 | Y<sub>1</sub>+Y<sub>2</sub>+…Y<sub>n</sub> ul |
| 2×ClonExpress Mix | 5ul |
| ddH<sub>2</sub>O | To 10ul |
X＝(0.02×克隆载体碱基对数)ng(0.03pmol)
Y＝(0.02×每个片段碱基对数)ng(0.03pmol)
S2)重组质粒pUC57-SCP2-HUH-OAC-OLS的构建
以GPD-OLS-F(SEQ ID No.13)和GPD-OLS-R(SEQ ID NO.14)为引物，以Yarrowialipolytica Polf-Δku70基因组DNA为模板，扩增OLS表达盒启动子PGPD-OLS。
以Mig1t-OLS-F(SEQ ID NO.15)和Mig1t-OLS-R(SEQ ID N0.16)为引物，以Yarrowia lipolytica Polf-Δku70基因组DNA为模板，扩增OLS表达盒终止子TMig1t-OLS。
以质粒pUC57-OAC-OLS为模板，以OLS-F(SEQID NO.17)和OLS-R(SEQ ID NO.18)为引物，扩增两端分别带有启动子PGPD-OLS和终止子TMig1t-OLS同源臂的OAC基因。
按照S1)重组质粒pUC57-SCP2-HUH-OAC的构建方法，取构建得到的重组质粒pUC57-SCP2-HUH-OAC作骨架，在SCP2位点上下游同源臂之间***聚酮合酶OLS基因表达盒，得重组质粒pUC57-SCP2-HUH-OAC-OLS；
上述步骤中所用的引物序列SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.18如表3所示。
表4引物序列
S3)重组解脂耶氏酵母菌的构建
将重组质粒pUC57-SCP2-HUH-OAC-OLS转化入Yarrowia lipolytica Polf-Δku70，得重组解脂耶氏酵母菌，具体方法如下：
(1)Yarrowia lipolytica Polf-Δku70于YPD液体培养基(含有2％蛋白胨、1％酵母提取物和2％葡萄糖)中过夜培养，待OD600长到0.8时，制备感受态细胞(试剂盒：ZymogenFrozen EZ Yeast Transformation Kit II，厂家：Zymo Research Corporation)。
(2)利用Zymo Research Corporation的Zymogen Frozen EZ YeastTransformation Kit II将pUC57-SCP2-HUH-OAC-OLS转化Yarrowia lipolytica Polf-Δku70，使其进行同源重组。
(3)采用筛选培养基SD-Leu筛选，将PCR鉴定正确的阳性克隆，命名为重组解脂耶氏酵母菌。其中，筛选培养基SD-Leu含有：葡萄糖20g/L，Yeast Nitrogen Base(YNB,无氨基酵母氮源)6.7g/L，CSM-Leu 0.67g/L，琼脂粉23g/L。
本实施例制备的重组解脂耶氏酵母菌标记为J1，可应用于发酵生产橄榄醇酸。
实施例2～5重组解脂耶氏酵母菌的构建方法
实施例2～5分别为一种重组解脂耶氏酵母菌的构建方法，它们的步骤与实施例1基本相同，不同之处仅在于II)重组质粒的构建中启动子及终止子的选择不同，具体详见表5：
表5重组质粒的构建中启动子及终止子的选择一览表
实施例2-5其它部分的内容，与实施例1相同。
实施例6重组解脂耶氏酵母菌的一种应用
采用实施例1构建的重组解脂耶氏酵母菌J1发酵生产橄榄醇酸，对所得橄榄醇酸LC-MS检测并定量分析。
发酵生产：于YPD液体培养基中30℃、220rpm条件下培养重组解脂耶氏酵母菌J1，16h后得种子液；将种子液以1％体积比的接种量接种于50ml发酵培养基(含有60g/L葡萄糖、10g/L酵母粉和20g/L胰蛋白胨中，在温度30℃、转速220rpm震荡培养4天进行发酵；发酵结束后，将发酵液转移至50ml离心管，5000rpm离心15min，采用乙酸乙酯萃取培养四天的发酵液，旋干后，将橄榄醇酸溶于色谱级甲醇，储存备用。
定量分析：将发酵液中的有机相过有机尼龙滤膜(0.22um)，用LC-MS检测；采用橄榄醇酸的标准品进行定性定量；
LC-MS检测检测条件为：进样口温度250℃，进样体积1ul，分流比为20:1；
色谱柱：Shim-pack XR-ODS II C18，2.0mm×75mm(Shimadzu)；
色谱条件：①溶剂选择：溶剂A为0.1％甲酸的水溶液，溶剂B为甲醇；流速为0.25mL/min；②程序选择：
0-2.5分钟，95％A和5％B；
2.5-20分钟，95％A和5％B梯度进液至5％A和95％B；
20-23分钟，5％A和95％B；
23-24分钟，5％A和95％B梯度进液至95％A和5％B；
24-30分钟，95％A和5％B；
结果表明：发酵4天后，重组菌的橄榄醇酸(OA)产量为3mg/L。
实施例7-10重组解脂耶氏酵母菌的应用
实施例7-10分别采用重组解脂耶氏酵母菌J2-J5依次发酵生产橄榄醇酸，对所得橄榄醇酸LC-MS检测并定量分析。
发酵生产方法与实施例6基本相同，不同之处在于发酵条件中实施例7-10的温度依次为28℃、30℃、29℃及28.3℃；转速依次为200rpm、240rpm、235rpm及230rpm；发酵培养基中葡萄糖浓度依次为80g/L、70g/L、40g/L及56g/L；实施例7-10发酵生产方法中的其它部分与实施例6均相同。
经与实施例6相同的定量分析检测，结果表明，实施例7-10发酵4天后，重组菌的橄榄醇酸产量依次为3.2mg/L、2.8mg/L、3.1mg/L及3mg/L。
需要说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域技术人员来说，其依然可以对上述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明权利要求保护的范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京师范大学
<120> 重组解脂耶氏酵母菌及其构建方法和应用
<130> 6
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 306
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atggctgtca agcatctgat tgttctcaag ttcaaagacg agatcaccga ggcccagaag 60
gaggagttct tcaagactta cgttaatttg gtcaacatca tccccgccat gaaggatgtc 120
tactggggca aggacgtaac acaaaagaac aaggaagaag gctacactca cattgtggag 180
gtgacttttg agtccgttga aaccatccag gactacatta tccaccctgc acatgtgggt 240
tttggagatg tgtacagatc tttctgggag aagctgctta tttttgacta tacgccacga 300
aaatga 306
<210> 2
<211> 1158
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgaaccacc tccgtgccga gggaccggca agtgtcttag cgattggaac agccaatccc 60
gaaaacattc tgctgcagga tgagttcccc gactactact tccgggtcac caagagcgag 120
cacatgaccc agctgaaaga gaagttccga aaaatttgtg acaagtccat gatccgaaag 180
cgaaactgtt tcctcaacga ggagcatctc aagcagaacc cccgactagt cgaacacgag 240
atgcagacgc tggacgctcg gcaagatatg ctcgtagtag aggtgccaaa gctcggcaag 300
gatgcctgtg ctaaggctat caaggagtgg ggacaaccca agtcaaagat tactcacctg 360
atcttcacct ccgctagcac gactgacatg cctggcgccg attaccactg tgcaaagctc 420
ctggggcttt ccccttcggt caagagagtg atgatgtacc agctcggatg ctacggcgga 480
ggcacggtgc tgcgaatcgc caaagacatc gccgagaata acaagggcgc tagggttctc 540
gcggtctgct gcgacatcat ggcatgtctg tttagaggtc cttctgaatc tgatctcgag 600
cttctggtcg gacaggccat ttttggagac ggtgccgctg cggtcattgt cggagctgag 660
ccagatgagt ccgttgggga acgacctatt ttcgagctgg tgtccactgg ccagaccatt 720
ctacccaatt cagaaggaac catcggtggg cacatcagag aggccggttt gatatttgac 780
ttgcataagg acgtgcccat gctgatttcc aacaacatcg agaaatgcct tattgaggct 840
ttcaccccta ttggtatcag cgactggaac tcgatcttct ggatcaccca tcccggaggg 900
aaggccattc tggataaggt ggaagaaaaa ctgcacctca aatctgacaa gtttgtggac 960
tctcgacatg ttctttctga gcatggcaac atgtctagtt cgacagtctt gtttgtgatg 1020
gacgagctgc gcaagcggtc gctggaggaa ggcaagtcta ctacaggtga tggcttcgaa 1080
tggggcgttt tgtttggttt tggtcccgga cttactgtgg agcgagtggt tgtgcgttcc 1140
gttccgatta agtattga 1158
<210> 3
<211> 531
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
agagaccggg ttggcggcgt atttgtgtcc caaaaaacag ccccaattgc cccaattgac 60
cccaaattga cccagtagcg ggcccaaccc cggcgagagc ccccttcacc ccacatatca 120
aacctccccc ggttcccaca cttgccgtta agggcgtagg gtactgcagt ctggaatcta 180
cgcttgttca gactttgtac tagtttcttt gtctggccat ccgggtaacc catgccggac 240
gcaaaataga ctactgaaaa tttttttgct ttgtggttgg gactttagcc aagggtataa 300
aagaccaccg tccccgaatt acctttcctc ttcttttctc tctctccttg tcaactcaca 360
cccgaaatcg ttaagcattt ccttctgagt ataagaatca ttcaaaatgg tgagtttcag 420
aggcagcagc aattgccacg ggctttgagc acacggccgg gtgtggtccc attcccatcg 480
acacaagacg ccacgtcatc cgaccagcac tttttgcagt actaaccgca g 531
<210> 4
<211> 516
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gatccaacta cggaacttgt gttgatgtct ttgcccccgg ctccgatatc atctctgcct 60
cttaccagtc cgactctggt actttggtct actccggtac ctccatggcc tgtccccacg 120
ttgccggtct tgcctcctac tacctgtcca tcaatgacga ggttctcacc cctgcccagg 180
tcgaggctct tattactgag tccaacaccg gtgttcttcc caccaccaac ctcaagggct 240
ctcccaacgc tgttgcctac aacggtgttg gcatttaggc aattaacaga tagtttgccg 300
gtgataattc tcttaacctc ccacactcct ttgacataac gatttatgta acgaaactga 360
aatttgacca gatattgttg taaatagaaa atctggcttg taggtggcaa aatcccgtct 420
ttgttcatca attccctctg tgactactcg tcatcccttt atgttcgact gtcgtatttt 480
tattttccat acatacgcaa gtgagatgcc cgtgtc 516
<210> 5
<211> 933
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gacgcagtag gatgtcctgc acgggtcttt ttgtggggtg tggagaaagg ggtgcttgga 60
gatggaagcc ggtagaaccg ggctgcttgg ggggatttgg ggccgctggg ctccaaagag 120
gggtaggcat ttcgttgggg ttacgtaatt gcggcatttg ggtcctgcgc gcatgtccca 180
ttggtcagaa ttagtccgga taggagactt atcagccaat cacagcgccg gatccacctg 240
taggttgggt tgggtgggag cacccctcca cagagtagag tcaaacagca gcagcaacat 300
gatagttggg ggtgtgcgtg ttaaaggaaa aaaaaagaag cttgggttat attcccgctc 360
tatttagagg ttgcgggata gacgccgacg gagggcaatg gcgccatgga accttgcgga 420
tatcgatacg ccgcggcgga ctgcgtccga accagctcca gcagcgtttt ttccgggcca 480
ttgagccgac tgcgaccccg ccaacgtgtc ttggcccacg cactcatgtc atgttggtgt 540
tgggaggcca ctttttaagt agcacaaggc acctagctcg cagcaaggtg tccgaaccaa 600
agaagcggct gcagtggtgc aaacggggcg gaaacggcgg gaaaaagcca cgggggcacg 660
aattgaggca cgccctcgaa tttgagacga gtcacggccc cattcgcccg cgcaatggct 720
cgccaacgcc cggtcttttg caccacatca ggttacccca agccaaacct ttgtgttaaa 780
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<210> 6
<211> 501
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cactggccgg tcgataattt aacgtgctga gctcagcaca cgcattgccc attggctgta 60
tatagatgaa tgtaatgata ccgtaagaga atgagagcac ggtattgtat tacaggggat 120
taagtacaca ttacttggag ttctgtacca gaagacacta ctatacatgg tattacttac 180
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gccttcggcc cttttgggtt t 501
Claims (10)
1.一种重组解脂耶氏酵母菌，其特征在于，该重组解脂耶氏酵母菌的基因组包括解脂耶氏酵母的基因组、环氧合酶OAC基因表达盒和聚酮合酶OLS基因表达盒。
2. 根据权利要求1所述的重组解脂耶氏酵母菌，其特征在于，所述解脂耶氏酵母为Yarrowia lipolytica Po1f -Δku70。
3.根据权利要求1或2所述的重组解脂耶氏酵母菌，其特征在于，所述环氧合酶OAC基因表达盒包括启动子、终止子、连接有启动子同源臂的OAC基因和连接有终止子同源臂的OAC基因；
所述聚酮合酶OLS基因表达盒包括启动子、终止子、连接有启动子同源臂的OLS基因和连接有终止子同源臂的OLS基因。
4.根据权利要求3所述的重组解脂耶氏酵母菌，其特征在于，所述环氧合酶OAC基因表达盒中启动子为来源于解脂耶氏酵母的PTEFin启动子、PTEF启动子或PEXP启动子；
所述环氧合酶OAC基因表达盒中终止子为来源于解脂耶氏酵母的TXPR2T终止子、TCYC1t终止子或Tliplt终止子。
5.根据权利要求3所述的重组解脂耶氏酵母菌，其特征在于，所述聚酮合酶OLS基因表达盒中启动子为来源于解脂耶氏酵母的PTEFin启动子、PTEF启动子或PGPD启动子；
所述聚酮合酶OLS基因表达盒中终止子为来源于解脂耶氏酵母的TXPR2T终止子、TCYC1t终止子或Tliplt终止子。
6. 根据权利要求1或2所述的重组解脂耶氏酵母菌，其特征在于，所述环氧合酶OAC基因表达盒中OAC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述聚酮合酶OLS基因表达盒中OLS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
7. 权利要求1-6中任一项所述的重组解脂耶氏酵母菌的一种构建方法，其特征在于，该构建方法包括依次进行的以下步骤：
S1.重组质粒pUC57-SCP2-HUH-OAC的构建
构建环氧合酶OAC基因表达盒，在pUC57-SCP2-HUH骨架中***来源于Yarrowialipolytica Polf-Δku70的染色体A中 SCP2位点上下游同源臂，
在所述SCP2位点上下游同源臂之间***环氧合酶OAC基因表达盒，得重组质粒pUC57-SCP2-HUH-OAC；
S2.重组质粒pUC57-SCP2-HUH-OAC-OLS的构建
构建聚酮合酶OLS基因表达盒，取所述重组质粒pUC57-SCP2-HUH-OAC作骨架，在所述SCP2位点上下游同源臂之间***聚酮合酶OLS基因表达盒，得重组质粒pUC57-SCP2-HUH-OAC-OLS；
S3.重组解脂耶氏酵母菌的构建
将所述重组质粒pUC57-SCP2-HUH-OAC-OLS转化入Yarrowia lipolytica Polf-Δku70，得所述重组解脂耶氏酵母菌。
8.根据权利要求7所述的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法，其特征在于，所述SCP2位点上下游同源臂的序列为SCP2位点上游1523bp至下游1524bp之间的序列。
9.权利要求1-6中任一项所述的重组解脂耶氏酵母菌在发酵生产橄榄醇酸中的应用。
10.根据权利要求9所述的重组解脂耶氏酵母菌的应用，其特征在于，所述发酵条件为28-30℃，200-240rpm；发酵培养基中葡萄糖浓度为40-80g/L。
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| CN112280699A (zh) * | 2020-09-28 | 2021-01-29 | 嘉兴欣贝莱生物科技有限公司 | 生产戊基二羟基苯酸的方法 |
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2021
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JONATHAN VERBEKE等: "Efficient homologous recombination with short length flanking fragments in Ku70 deficient Yarrowia lipolytica strains", 《BIOTECHNOLOGY LETTERS》 * |
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