CN111304104A - 异源合成白桦脂酸的重组解脂耶氏酵母及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种异源合成白桦脂酸的重组解脂耶氏酵母及其构建方法，构建方法为：利用同源重组方法，向解脂耶氏酵母中导入优化的羽扇豆醇合酶编码基因opAtLUP1、优化的细胞色素P450酶编码基因opCYP716A12和优化的细胞色素P450还原酶1的编码基因opAtCPR1，得到重组菌1；向重组菌1中导入截短的3‑羟基‑3‑甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因tHMG1、鲨烯合酶编码基因Erg9和优化的羽扇豆醇合酶的编码基因opAtLUP1得到重组菌2；实验证明本发明的方法构建的异源合成白桦脂酸的重组解脂耶氏酵母具有高的白桦脂酸的产量。

Description

异源合成白桦脂酸的重组解脂耶氏酵母及其构建方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及异源合成羽扇豆醇和白桦脂酸的重组解脂耶氏酵母及其构建方法。
背景技术
白桦脂酸(Betulinic acid，缩写为BA)是一种羽扇烷型五环三萜，存在于白桦树(Betula pubescens)等多种植物中，具有诸多药理活性如抗肿瘤、抗病毒、抗疟疾等。
由于白桦树皮、悬铃木树皮、蜡烛树皮中的BA含量极少，因此，BA的生产和制备主要通过提取白桦脂酸前体白桦脂醇，进一步通过化学转化或微生物转化合成白桦脂酸，然而这类方法存在以下几个缺点。1)原料短缺。白桦树皮、悬铃木树皮、蜡烛树皮生长周期长，且易受到农药残留污染，导致产品品质无法满足国内外市场需求。2)白桦树皮、悬铃木树皮、蜡烛树皮提取物成分复杂，分离纯化成本较高。3)制备过程往往伴随着对环境的高污染。因此，利用合成生物学的方法，通过微生物发酵生产白桦脂酸将从根本上解决上述问题。
白桦脂酸的合成路径清晰，路径中的关键酶研究透彻，因此近几年，利用酿酒酵母从头合成白桦脂酸的研究已逐步开展。章焰生课题组从2012年开始至今已发表数篇研究酿酒酵母异源白桦脂酸的文章，2012年，其课题组鉴定长春花(Catharanthus roseus)C-28位氧化酶CrAO(即长春花CYP716AL1)，并将基因AtLUP1和CYP716AL1导入基因组已整合AtCPR1基因的酿酒酵母WAT11菌株中，构建基因工程菌株，在酿酒酵母中成功合成出白桦脂酸，但产量较低，仅0.1mg/L。脂肪酸合成途径与萜类合成途径共同使用乙酰辅酶A，因此调节脂肪酸途径有利于萜类合成，2013年，其课题组通过调节白桦脂酸和脂肪酸途径中不同的关键基因，得到九株基因工程菌株，产量为0.1mg/L到10mg/L不等。2014年，其课题组通过辅因子调节，将白桦脂酸产量提高至15mg/L。2016年，其课题组鉴定白桦树C-28位氧化酶BPLO，有报道表明酿酒酵母CEN.PK作为底盘菌株更有利于萜类合成，因此他们在不同底盘WAT11和CEN.PK中导入基因AtLUP1和BPLO，发现WAT11更适用于白桦脂酸的合成，产量为0.16mg/L/OD600(0.8mg/L)，后突变白桦脂酸合成途径中基因的半乳糖诱导型启动子，将产量提高为原来的两倍。
解脂耶氏酵母是除酿酒酵母外的非常规酵母，安全菌株，分子操作手段成熟，异源蛋白表达量大，构建成功的菌株不易退化，底物利用范围广，能利用亲水碳源和疏水碳源。解脂耶氏酵母内含为萜类化合物合成提供前体的MVA途径，能合成白桦脂酸前体2,3-氧化鲨烯，然而，利用合成生物学方法在解脂耶氏酵母中异源合成羽扇豆醇和白桦脂酸还未见报道。本研究获得了异源合成白桦脂酸的重组解脂耶氏酵母及其构建方法，探索新的底盘菌株合成白桦脂酸，为白桦脂酸工业化生产贡献一定的力量。
发明内容
本发明的一个目的是克服现有技术的不足，提供一种异源合成白桦脂酸的重组解脂耶氏酵母。
本发明的第二个目的是提供一种异源合成白桦脂酸的重组解脂耶氏酵母的构建方法。
本发明的技术方案概述如下：
异源合成白桦脂酸的重组解脂耶氏酵母的构建方法，包括如下步骤：
(1)利用同源重组方法，向解脂耶氏酵母中导入优化的羽扇豆醇合酶编码基因opAtLUP1、优化的细胞色素P450酶编码基因opCYP716A12和优化的细胞色素P450还原酶1的编码基因opAtCPR1，得到重组菌1；
所述优化的羽扇豆醇合酶编码基因opAtLUP1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述优化的细胞色素P450酶编码基因opCYP716A12的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述优化的细胞色素P450还原酶1的编码基因opAtCPR1的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。
(2)向重组菌1中导入截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因tHMG1、鲨烯合酶编码基因Erg9和优化的羽扇豆醇合酶的编码基因opAtLUP1得到重组菌2；
所述截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因tHMG1是编码3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因HMG1 5'端截了1500个核苷酸得到；所述编码3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因HMG1的核苷酸序列如SEQ ID NO.54所示；
所述截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因tHMG1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述鲨烯合酶编码基因Erg9的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
上述方法制备的异源合成白桦脂酸的重组解脂耶氏酵母。
本发明的优点：
利用合成生物学方法在解脂耶氏酵母中异源合成白桦脂酸还未见报道。本发明获得了异源合成白桦脂酸的重组解脂耶氏酵母及其构建方法，探索新的底盘菌株合成白桦脂酸，为白桦脂酸工业化生产贡献一定的力量。实验证明本发明的方法构建的异源合成白桦脂酸的重组解脂耶氏酵母具有高的白桦脂酸的产量。
具体实施方式
解脂耶氏酵母Yarrowia lipolyticaATCC 201249，以下简称解脂耶氏酵母。
购买时间，2017.6，网址：https://www.atcc.org/
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
下面实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1.解脂耶氏酵母重组菌1的构建
向解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica，美国ATCC 201249)中导入优化的羽扇豆醇合酶编码基因opAtLUP1、优化的细胞色素P450酶编码基因opCYP716A12和优化的细胞色素P450还原酶1的编码基因opAtCPR1，得到重组菌1；
优化的羽扇豆醇合酶编码基因opAtLUP1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；优化的细胞色素P450酶编码基因opCYP716A12的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述优化的细胞色素P450还原酶1的编码基因opAtCPR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
一、模块构建
羽扇豆醇合酶编码基因(Lupeolsynthase,AtLUP1)来源于植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)，基因由武汉金开瑞生物工程有限公司通过化学合成的方法合成，并针对解脂耶氏酵母进行密码子优化，得到优化的羽扇豆醇合酶编码基因opAtLUP1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
细胞色素P450酶编码基因(CYP716A12)来源于植物蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula),基因由武汉金开瑞生物工程有限公司通过化学合成的方法合成，并针对解脂耶氏酵母进行密码子优化，得到优化的细胞色素P450酶编码基因opCYP716A12，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
细胞色素P450还原酶1的编码基因AtCPR1来源于拟南芥，基因由武汉金开瑞生物工程有限公司通过化学合成的方法合成，并针对解脂耶氏酵母进行密码子优化，得到优化的细胞色素P450还原酶1的编码基因opAtCPR1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
启动子TEF1(SEQ ID NO.6)，启动子EXP1(SEQ ID NO.8)；终止子XPR2(SEQ IDNO.7)，终止子LIP2(SEQ ID NO.9)，rDNAup(SEQ ID NO.12)，rDNAdown(SEQ ID NO.13)均来自解脂耶氏酵母ATCC 201249基因组，筛选标记基因URA3(SEQ ID NO.10)来自质粒pxp218(购自Addgene)。
以解脂耶氏酵母ATCC 201249基因组为模板，
以rDNAup-F(SEQ ID NO 16)，TEF1p-rDNAup-R(SEQ ID NO 17)为引物，扩增rDNAup；以rDNAup-TEF1p-F(SEQ ID NO 18)，opAtLUP1-TEF1p-R(SEQ ID NO 19)为引物扩增启动子TEF1；
以TEF1p-opAtLUP1-F(SEQ ID NO 20)，XPR2t-opAtLUP1-R(SEQ ID NO 21)为引物扩增opAtLUP1；
以opAtLUP1-XPR2t-F(SEQ ID NO 22)，EXP1p-XPR2t-R(SEQ ID NO 26)为引物扩增终止子XPR2；
以XPR2t-EXP1p-F(SEQ ID NO 27)，opMtCYP716A12-EXP1p-R(SEQ ID NO 28)为引物扩增启动子EXP1；
以EXP1p-opMtCYP716A12-F(SEQ ID NO 29)，t45opAtCPR1-opMtCYP716A12-R(SEQID NO 30)为引物扩增opCYP716A12；
以opMtCYP716A12-t45opAtCPR1-F(SEQ ID NO 31)，lip2t-opAtCPR1-R(SEQ IDNO 32)为引物，扩增opAtCPR1；
以opAtCPR1-lip2t-F(SEQ ID NO 33)，ura3-lip2t-R(SEQ ID NO 34)为引物，扩增终止子LIP2；
以ura3-rDNAd-F(SEQ ID NO 24)，rDNAd-R(SEQ ID NO 25)为引物，扩增rDNAdown。
以lip2t-ura3-F(SEQ ID NO 35)，rDNAd-ura3-R(SEQ ID NO 23)为引物，以质粒pxp218为模板扩增ura3；
本发明所用PCR酶为南京诺唯赞生物科技有限公司的
Figure BDA0002381569880000041
Max Super-Fidelity聚合酶。50μL的PCR扩增体系如下：DNA模板，1μL；前引(10μM)和后引(10μM)各2μL；dNTP(10mM)，1μL；2×Phanta Max Buffer，25μL；
Figure BDA0002381569880000042
Max Super-Fidelity聚合酶，1μL；最后用双蒸水补齐50μL。在PCR仪上设置扩增程序。扩增条件为95℃预变性4min(1个循环)；95℃变性15sec、退火60℃15sec、72℃延伸1min(34个循环)；72℃延伸5min(1个循环)。
本发明所用融合PCR体系如下：DNA片段总量800ng，摩尔比1:1；dNTP(10mM)，1μL；2×Phanta Max Buffer，25μL；
Figure BDA0002381569880000043
Max Super-Fidelity聚合酶，1μL；最后用双蒸水补齐至50μL。在PCR仪上设置扩增程序。扩增条件为95℃预变性4min(1个循环)；95℃变性15sec、退火60℃30sec、72℃延伸1min(11个循环)，72℃延伸5min(1个循环)。
最后得到转化解脂耶氏酵母所用的DNA片段，分别连有上游同源臂rDNAup的羽扇豆醇合酶编码基因opAtLUP1表达盒PTEF1-opAtLUP1-TXPR2，细胞色素P450酶和细胞色素P450还原酶1编码基因表达盒PEXP1-opCYP716A12-opAtCPR1-TLIP2和含有筛选标记基因URA3的rDNA位点下游同源臂ura3-rDNAdown。
二、解脂耶氏酵母转化
1.出发菌株解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica,美国ATCC 201249)接种于试管YPD液体培养基中，30℃摇床过夜培养；
2.将过夜培养的酵母菌以1/10的体积比，转接到新的试管YPD液体培养基中，30℃摇床培养4h，使其达到对数生长期；
3.取1mL菌液于无菌的离心管中，5000rpm离心3min，除去上清液，收集底部菌液，并用1mL无菌水将菌体洗一次；
4.将洗涤过的酵母菌用1mL 100mM LiAc重悬，并静置5min；
5. 5000rpm离心3min，除去LiAc溶液，保留底部酵母菌；
6.在含有酵母菌的离心管中配制转化体系，具体加入试剂及顺序如下表：
表1转化体系
Figure BDA0002381569880000051
转化的DNA片段包括rDNAup-PTEF1-opAtLUP1-TXPR2、PEXP1-opCYP716A12-opAtCPR1-TLIP2，URA3-rDNAdown，每种片段大于300ng；
7.其中鲑鱼精DNA需要在沸水中煮沸5min，使其解链，然后迅速转移到冰上冰浴，用以酵母转化；
8.将配好的转化体系，用移液器吹吸，或者放在漩涡振荡器上震荡1min，使体系充分混匀，放入42℃水浴锅中，热激30min；
9.将热激后的酵母菌离心，用移液器移去上清液，加入1mLYPD培养基，在30℃摇床中复苏2h；
10. 5000rpm离心3min，移去YPD液体培养基，并用无菌水洗涤2次；
11.加入100μL无菌水，将酵母细胞重悬，并涂布在缺失尿嘧啶Ura3的SC选择培养基上，30℃培养箱培养2d。
12.待长出单菌落后，进行菌落PCR，需要对基因组进行粗提。本发明采用冻融法粗提解脂耶氏酵母基因组，首先将单菌落挑取到10μL浓度为10mM的NaOH溶液中，在沸水中煮沸10min，再放入-20℃冰箱中冷冻10min，反复冻融三次，即将基因组粗提，可直接当做模板，进行菌落验证。验证正确的菌株即为重组菌1。
SC选择培养基配方：6.7g/LYeast Nitrogen Base(YNB)，20g/L葡萄糖或半乳糖，2g/L相应缺省氨基酸混合物。混合物成分包括：
Figure BDA0002381569880000061
本发明在配制SC选择培养基时，根据菌种需要补齐相应成分，终浓度为：
亮氨酸Leu 0.1g/L
尿嘧啶Ura 0.02g/L
实施例2、基因元件克隆和含有对应基因元件的质粒构建
一、PCR扩增基因元件以解脂耶氏酵母ATCC201249基因组为模板，用表2中的引物，分别扩增TEF1p-opAtLUP1-XPR2t、hp4d-erg9-XPR2t、tHMG1和erg9。扩增后所得基因表达盒纯化回收备用。
表2 PCR扩增基因引物表
Figure BDA0002381569880000071
本发明所用PCR酶为南京诺唯赞生物科技有限公司的
Figure BDA0002381569880000072
Max Super-Fidelity聚合酶。50μL的PCR扩增体系如下：DNA模板，1μL；前引(10μM)和后引(10μM)各2μL；dNTP(10mM)，1μL；2×Phanta Max Buffer，25μL；
Figure BDA0002381569880000073
Max Super-Fidelity聚合酶，1μL；最后用双蒸水补齐50μL。在PCR仪上设置扩增程序。扩增条件为95℃预变性4min(1个循环)；95℃变性15sec、退火60℃15sec、7℃延伸1min(34个循环)；72℃延伸5min(1个循环)。
二、pLEU-opAtLUP1质粒构建
SalI酶切质粒pINA1269(Catherine Madzak et al.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.2000,2(2):207-216)，纯化回收片段约7259bp。所述Leu2的核苷酸序列如SEQ ID NO11所示。
该质粒构建使用南京诺唯赞生物科技有限公司的一步克隆试剂盒，在冰水浴中配制如下表所示反应体系。
表3 pLEU-opAtLUP1质粒构建反应体系
Figure BDA0002381569880000074
体系配制完成后，使用微量移液枪温和吹打混匀。置于37℃反应30min。之后立即将反应体系放置在冰水浴中冷却5min。
大肠杆菌感受态细胞的化学转化法(热激法)
1.从-80℃冰箱中取出Trans5α化学感受态细胞成品，在冰盒中放置10min解冻，无菌环境下吸取50μL菌液至灭菌的1.5mLPE离心管中；
2.向离心管中加入5μL重组体系溶液，温和混匀，在冰盒中放置30min；
3.从冰盒中取出离心管，在42℃恒温水浴中热激30sec，取出并立刻在冰盒中放置2min；
4.向离心管中加入500μL灭菌的LB液体培养基，放入设定条件为37℃，200rpm的摇床中复苏1h；
5.在4000rmp条件下离心3min，吸去上清液350μL，收集菌体并重悬；
6.在无菌条件下，将菌液涂布在含有抗生素Amp的LB平板培养基上，在37℃培养箱中倒置过夜培养。
挑取转化子菌落PCR验证，得到正确目的片段的为正确转化子，提取质粒SalI单酶切验证正确的质粒为正确质粒，命名为pLEU-opAtLUP1。
三、pLEU-tHMG1-erg9的质粒构建
利用上述“二、pLEU-opAtLUP1质粒构建”的相同方法，将扩增获得的erg9，利用一步克隆试剂盒，分别与ClaI线性化的pLEU-tHMG1质粒重组，经过大肠杆菌转化，转化子验证，提取质粒酶切验证，得到正确重组质粒，命名为pLEU-tHMG1-erg9。
实施例3、解脂耶氏酵母重组菌2的构建
向重组菌1中导入截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因tHMG1、鲨烯合酶编码基因Erg9、优化的羽扇豆醇合酶的编码基因opAtLUP1得到重组菌2。
所述截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因tHMG1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因tHMG1是编码3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因HMG1 5'端截了1500个核苷酸得到；所述编码3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因HMG1的核苷酸序列如SEQ ID NO.54所示；
所述鲨烯合酶编码基因Erg9的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述优化的羽扇豆醇合酶的编码基因opAtLUP1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
一、模块构建
以解脂耶氏酵母ATCC 201249基因组为模板，以zetaup-F(SEQ ID NO.44)，SalIQ-zetaup-R(SEQ ID NO.45)为引物，扩增得到zetaup(SEQ ID NO.14)；以线性化的pLEU-tHMG1-erg9(实施例2所得)为模板，以zetaup-SalIQ-F(SEQ ID NO.46)和LEU2Q-R(SEQ IDNO.47)为引物，扩增得到tHMG1-erg9表达盒；以质粒pINA1269(Catherine Madzak et al.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.2000,2(2):207-216)为模版，Leu2Q-F(SEQ ID NO.48)和TEF1-leu2-R(SEQ ID NO.50)为引物，PCR扩增得到LEU2；以pLEU-opAtLUP1(实施例2所得)为模板，leu2-TEF1-F(SEQ ID NO.51)和zetad-XPR2t-R(SEQ ID NO.52)为引物PCR扩增得到PTEF1-AtLUP1-TXPR2；以Yl201249基因组为模版，XPR2t-zetad-F(SEQ ID NO53)和zetad-R(SEQ ID NO49)为引物，PCR扩增得到zetadown(SEQ ID NO.15)。
本发明所用PCR酶为南京诺唯赞生物科技有限公司的
Figure BDA0002381569880000091
Max Super-Fidelity聚合酶。50μL的PCR扩增体系如下：DNA模板，1μL；前引(10μM)和后引(10μM)各2μL；dNTP(10mM)，1μL；2×Phanta Max Buffer，25μL；
Figure BDA0002381569880000092
Max Super-Fidelity聚合酶，1μL；最后用双蒸水补齐50μL。在PCR仪上设置扩增程序。扩增条件为95℃预变性4min(1个循环)；95℃变性15sec、退火60℃15sec、72℃延伸1min(34个循环)；72℃延伸5min(1个循环)。
本发明所用融合PCR体系如下：DNA片段总量800ng，摩尔比1:1；dNTP(10mM)，1μL；2×Phanta Max Buffer，25μL；
Figure BDA0002381569880000093
Max Super-Fidelity聚合酶，1μL；最后用双蒸水补齐至50μL。在PCR仪上设置扩增程序。扩增条件为95℃预变性4min(1个循环)；95℃变性15sec、退火60℃30sec、72℃延伸1min(11个循环)，72℃延伸5min(1个循环)。
最后得到转化解脂耶氏酵母所用的DNA片段，分别连有上游同源臂zetaup的表达盒zetaup-tHMG1-erg9，含有筛选标记基因LEU2和PTEF1-opAtLUP1-TXPR2的zeta位点下游同源臂LEU2-PTEF1-opAtLUP1-TXPR2-zetadown；
二、解脂耶氏酵母转化
1.出发菌株解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica,美国ATCC 201249)接种于试管YPD液体培养基中，30℃摇床过夜培养；
2.将过夜培养的酵母菌以1/10的体积比，转接到新的试管YPD液体培养基中，30℃摇床培养4h，使其达到对数生长期；
3.取1mL菌液于无菌的离心管中，5000rpm离心3min，除去上清液，收集底部菌液，并用1mL无菌水将菌体洗一次；
4.将洗涤过的酵母菌用1mL 100mM LiAc重悬，并静置5min；
5. 5000rpm离心3min，除去LiAc溶液，保留底部酵母菌；
6.在含有酵母菌的离心管中配制转化体系，具体加入试剂及顺序如下表：
表4转化体系
Figure BDA0002381569880000101
转化的DNA片段包括zetaup-tHMG1-erg9、LEU2-PTEF1-opAtLUP1-TXPR2-zetadown，每种片段大于300ng；
7.其中鲑鱼精DNA需要在沸水中煮沸5min，使其解链，然后迅速转移到冰上冰浴，用以酵母转化；
8.将配好的转化体系，用移液器吹吸，或者放在漩涡振荡器上震荡1min，使体系充分混匀，放入42℃水浴锅中，热激30min；
9.将热激后的酵母菌离心，用移液器移去上清液，加入1mLYPD培养基，在30℃摇床中复苏2h；
10. 5000rpm离心3min，移去YPD液体培养基，并用无菌水洗涤2次；
11.加入100μL无菌水，将酵母细胞重悬，并涂布在缺失尿嘧啶Ura3和LEU2的SC选择培养基上，30℃培养箱培养2d。
12.待长出单菌落后，进行菌落PCR，需要对基因组进行粗提。本发明采用冻融法粗提解脂耶氏酵母基因组，首先将单菌落挑取到10μL浓度为10mM的NaOH溶液中，在沸水中煮沸10min，再放入-20℃冰箱中冷冻10min，反复冻融三次，即将基因组粗提，可直接当做模板，进行菌落验证。验证正确的菌株即为重组菌2。
实施例4、重组菌生产白桦脂酸
1、重组菌培养和产物提取
将实施例1、3中得到的解脂耶氏酵母菌株重组菌1，重组菌2，连同ATCC 201249，在固体筛选培养基上活化；于YPD液体培养基中制备发酵种子液(30℃,220rmp，24h)，离心收集菌体，转移至含30mL YPD发酵培养基的250mL三角瓶中，调节OD至1进行培养(30℃，220rmp)。3d后离心收集细胞，加入乙酸乙酯，旋涡振荡10min，在12000rpm常温条件下离心2min，将上层有机相吹干后加入衍生化试剂BSTFA，80℃衍生化30min备用。
2、GC-MS鉴定白桦脂酸
白桦脂酸的定性用GC-MS进行。GC-MS检测条件：色谱柱HP-5ms，氦气流速1mL/min；进样口温度280℃，不分流，进样量1μL；炉温：80℃保持1min，20℃/min升高至300℃保持18min；离子扫描范围50-600m/z。
白桦脂酸的定量用GC进行。GC检测条件：色谱柱tg-5；氮气流速1mL/min；进样口温度320℃，不分流，进样量1μL；炉温：80℃保持1min，20℃/min升高至310℃保持18min；FID检测器：280℃。
白桦脂酸购自天津市百倍生物科技有限公司。
3、检测结果
A.解脂耶氏酵母ATCC 201249没有合成白桦脂酸；
B.重组菌1：提取重组菌1的发酵产物，可以检测到白桦脂酸的产量达1.53mg/L；
C.重组菌2：提取重组菌2的发酵产物，可以检测到白桦脂酸的产量达9.41mg/L。
将上述重组菌的结果统计见表5。
表5重组菌株生产白桦脂酸能力
菌名 白桦脂酸(mg/L)
解脂耶氏酵母ATCC201249 0
重组菌1 1.53
重组菌2 9.41
实施例5、重组菌2的5L罐发酵
首先将重组菌2的单菌落接种到5mLYPD培养基中，30℃的摇床，220rpm转速下培养24h，转接至含100mlYPD的500ml摇瓶中，30℃的摇床，220rpm转速下培养24h制备种子液。发酵罐初始装入体积为2L的培养基，补充碳源、氮源、无机盐、生物素、微量元素等生长要素，溶氧量保持在10％以上，控制发酵pH在5，发酵6d，收集发酵后的菌液，提取发酵产物，进行气相色谱检测，得到白桦脂酸的产量为30.96mg/L。
补充的碳源为600g/L甘油溶液；
微量元素母液的配方为：ZnSO4·7H2O 10.2g/L，EDTANa2·2H2O 15g/L，FeSO4·7H2O 5.12g/L，无水CuSO40.5 g/L，MnCl2·4H2O 0.5g/L，CoCl2·6H2O 0.86g/L，CaCl2·2H2O 3.84g/L，Na2MoO4·2H2O 0.56g/L。
维生素母液的配方为：肌醇25g/L，生物素0.05g/L，烟碱酸1g/L，泛酸钙1g/L，thiamine HCl 1g/L，pyridoxol HCl 1g/L，对氨基苯甲酸0.2g/L。
无机盐配方：KH2PO49 g/L，K2SO43.5 g/L，Na2SO40.28 g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L。
在灭菌的无机盐溶液中，每1L加入10mL的微量元素母液，及12mL的维生素溶液母液，配制成无机盐/微量元素/维生素混合溶液。流加补料过程中补充500mL的无机盐/微量元素/维生素混合溶液。
上述5L罐发酵采用的培养基：20g/L蛋白胨，10g/L酵母浸粉，200g/L甘油。
YPD培养基：20g/L蛋白胨，10g/L酵母浸粉，20g/L葡糖糖，固体培养基需另外添加2％琼脂粉。
序列表
<110> 天津大学
<120> 异源合成白桦脂酸的重组解脂耶氏酵母及其构建方法
<160> 54
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2274
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgtggaagc tgaagatcgg caagggcaac ggcgaggacc ctcacctgtt ttcttccaac 60
aacttcgtcg gccgacagac ctggaagttc gaccataagg ccggctcccc tgaggagcga 120
gccgccgtcg aggaggcccg acgaggcttc ctggacaacc gatttcgagt caagggctgc 180
tccgacctgc tgtggcgaat gcagttcctg cgagagaaga agttcgagca gggcatcccc 240
cagctgaagg ccaccaacat tgaggagatc acctacgaga ccaccaccaa cgccctgcga 300
cgaggcgtcc gatactttac tgccctgcag gcttccgacg gccattggcc cggcgagatc 360
accggccccc tgttcttcct gccccctctg atcttctgcc tgtatattac cggccacctg 420
gaggaggtct tcgacgccga gcaccgaaag gagatgctgc gacatatcta ctgccaccag 480
aacgaggacg gcggttgggg cctgcacatc gagtccaagt ctgtcatgtt ctgcaccgtc 540
ctgaactaca tctgcctgcg aatgctgggc gagaaccctg agcaggatgc ttgtaagcga 600
gcccgacagt ggatcttgga ccgaggcggc gtcattttca tcccctcttg gggtaagttc 660
tggctgtcca tcctgggcgt ctacgactgg tctggtacta accccacccc ccctgagctg 720
ctgatgctgc cttcctttct gcccatccac cccggtaaga tcctgtgtta ctcccgaatg 780
gtctccatcc ccatgtccta cctgtacggc aagcgattcg tcggccctat cacccctctg 840
atcctgctgc tgcgagagga gctgtacctg gagccttacg aggagatcaa ctggaagaag 900
tcccgacgac tgtacgccaa ggaggacatg tactacgccc accctctggt ccaggacctg 960
ctgtccgaca ccctgcagaa cttcgtcgag cctctgctga cccgatggcc tctgaacaag 1020
ctggtccgag agaaggccct gcagctgacc atgaagcaca tccactacga ggacgagaac 1080
tcccactaca tcaccatcgg ctgcgtcgag aaggtcctgt gtatgctggc ctgctgggtc 1140
gagaacccta acggtgatta cttcaagaag cacctggccc gaatccccga ctacatgtgg 1200
gttgctgagg acggtatgaa gatgcagtcc ttcggctgcc agctgtggga tactggtttc 1260
gctatccagg ccctgctggc ttctaacctg cctgatgaga ccgacgacgc cctgaagcga 1320
ggtcacaact acatcaaggc ctcccaggtc cgagagaacc cttctggtga cttccgatcc 1380
atgtaccgac acatctccaa gggcgcctgg actttctccg accgagatca tggctggcag 1440
gtctctgact gcaccgctga ggctctgaag tgctgtctgc tgctgtccat gatgtccgcc 1500
gacatcgtcg gtcagaagat cgacgacgag cagctgtacg actccgtcaa cctgctgctg 1560
tccctgcagt ctggtaacgg tggtgtcaac gcctgggagc cttctcgagc ttacaagtgg 1620
ctggagctgc tgaaccccac cgagtttatg gccaacacca tggtcgagcg agagttcgtc 1680
gagtgcacct cttccgtcat ccaggctctg gacctgttcc gaaagctgta ccccgaccac 1740
cgaaagaagg agatcaaccg atccatcgag aaggccgtcc agttcatcca ggacaaccag 1800
acccccgacg gttcttggta cggtaactgg ggtgtctgct tcatctacgc cacctggttc 1860
gccctgggtg gtctggctgc tgctggtgag acctacaacg actgcctggc tatgcgaaac 1920
ggcgtccatt tcctgctgac cacccagcga gacgacggtg gttggggtga gtcctacctg 1980
tcttgctccg agcagcgata catcccctcc gagggtgagc gatctaacct ggttcagacc 2040
tcctgggcca tgatggctct gatccacacc ggtcaggccg agcgagacct gatccctctg 2100
caccgagctg ctaagctgat catcaactcc cagctggaga acggcgactt ccctcagcag 2160
gagatcgtcg gtgctttcat gaacacctgc atgctgcact acgccaccta ccgaaacacc 2220
ttccccctgt gggctctggc tgagtaccga aaggtcgtct tcatcgtcaa ctaa 2274
<210> 2
<211> 1440
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggagccta acttctacct gtccctgctg ctgctgttcg tctccttcat ctccctgtcc 60
ctgttcttca tcttctacaa gcagaagtcc cccctgaacc tgccccctgg taagatgggt 120
taccccatca tcggcgagtc cctggagttc ctgtccactg gttggaaggg ccaccctgag 180
aagttcatct tcgaccgaat gcgaaagtac tcctccgagc tgttcaagac ctccatcgtc 240
ggcgagtcca ccgttgtttg ctgcggtgct gcttccaaca agttcctgtt ctccaacgag 300
aacaagctgg tcaccgcctg gtggcctgat tctgttaaca agatcttccc caccacctcc 360
ctggactcca acctgaagga ggagtccatc aagatgcgaa agctgctgcc ccagttcttc 420
aagcccgagg ctctgcagcg atacgtcggt gtcatggacg tcatcgccca gcgacatttc 480
gtcacccact gggataacaa gaacgagatc accgtctacc ccctggccaa gcgatacact 540
ttcctgctgg cctgccgact gttcatgtcc gttgaggacg agaaccacgt cgccaagttc 600
tccgaccctt tccagctgat cgccgctggt atcatctccc tgcctatcga cctgcccggt 660
actcctttca acaaggccat caaggcctcc aacttcatcc gaaaggagct gatcaagatc 720
atcaagcagc gacgaatcga cctggccgag ggtactgctt ctcctactca ggacatcctg 780
tcccacatgc tgctgacctc cgacgagaac ggtaagtcca tgaacgagct gaacatcgcc 840
gacaagatcc tgggcctgct gatcggtggt cacgatactg cttccgtcgc ctgtaccttc 900
ctggtcaagt acctgggcga gctgcctcat atctacgaca aggtctacca ggagcagatg 960
gagatcgcca agtccaagcc cgctggtgag ctgctgaact gggatgatct gaagaagatg 1020
aagtactcct ggaacgtcgc ctgcgaggtc atgcgactgt ctcctcctct gcagggtggt 1080
ttccgagagg ctatcaccga cttcatgttc aacggcttct ccatccccaa gggctggaag 1140
ctgtactggt ccgctaactc cacccacaag aacgccgagt gcttccctat gcccgagaag 1200
ttcgacccca cccgattcga gggtaacggt cctgctcctt acaccttcgt ccccttcggt 1260
ggtggtcctc gaatgtgtcc tggcaaggag tacgcccgac tggagattct ggtcttcatg 1320
cacaacctgg tcaagcgatt caagtgggag aaggtcatcc ccgacgagaa gatcatcgtc 1380
gatcccttcc ccatccccgc taaggatctg cctatccgac tgtaccccca caaggcttaa 1440
<210> 3
<211> 2079
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgacctccg ctctgtacgc ttccgacctg ttcaagcagc tgaagtccat catgggcacc 60
gactccctgt ccgatgacgt tgttctggtc atcgccacca cctccctggc cctggtcgcc 120
ggcttcgtcg tcctgctgtg gaagaagacc accgctgacc gatccggtga gctgaagccc 180
ctgatgatcc ctaagtccct gatggccaag gacgaggacg acgatctgga cctgggttct 240
ggtaagaccc gagtctccat cttcttcggc acccagaccg gtactgccga gggcttcgcc 300
aaggccctgt ccgaggagat caaggcccga tacgagaagg ccgctgtcaa ggttatcgac 360
ctggacgact acgccgccga tgatgatcag tacgaggaga agctgaagaa ggagaccctg 420
gccttcttct gcgtcgctac ttacggcgac ggcgagccca ccgacaacgc cgcccgattc 480
tacaagtggt tcaccgagga gaacgagcga gacatcaagc tgcagcagct ggcttacggc 540
gtcttcgccc tgggcaaccg acagtacgag catttcaaca agatcggcat cgtcctggac 600
gaggagctgt gtaagaaggg cgctaagcga ctgatcgagg tcggtctggg tgacgatgac 660
cagtctatcg aggacgactt caacgcctgg aaggagtccc tgtggtccga gctggataag 720
ctgctgaagg acgaggacga caagtccgtc gctaccccct acactgctgt catccctgag 780
taccgagtcg tcacccacga cccccgattt actacccaga agtccatgga gtccaacgtc 840
gccaacggca acaccactat cgacatccac cacccctgcc gagtcgatgt tgctgttcag 900
aaggagctgc acacccacga gtccgatcga agctgtatcc acctggagtt cgacatctcc 960
cgaaccggta tcacctacga gaccggtgac cacgtcggtg tttacgctga gaaccacgtc 1020
gagatcgtcg aggaggctgg taagctgctg ggtcattccc tggacctggt cttctccatc 1080
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ccttgtaccc tgggcaccgg cctggcccga tacgccgacc tgctgaaccc ccctcgaaag 1200
tccgctctgg ttgctctggc tgcttacgct accgagcctt ctgaggctga gaagctgaag 1260
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gctccttccc gagtccacgt cacctccgct ctggtctacg gtcctactcc taccggtcga 1500
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gagtgctctg gtgcccctat cttcatccga gcctccaact tcaagctgcc ctccaaccct 1620
tccaccccta tcgttatggt cggccctggt actggcctgg ctcctttccg aggtttcctg 1680
caggagcgaa tggccctgaa ggaggatggt gaggagctgg gttcctccct gctgtttttc 1740
ggctgccgaa accgacagat ggacttcatc tacgaggacg agctgaacaa cttcgtcgat 1800
cagggcgtca tctccgagct gatcatggct ttctcccgag agggcgctca gaaggagtac 1860
gttcagcaca agatgatgga gaaggccgcc caggtctggg atctgattaa ggaggagggc 1920
tacctgtacg tctgcggtga tgctaagggc atggcccgag atgtccaccg aactctgcac 1980
actatcgtcc aggagcagga gggtgtctcc tcttctgagg ctgaggctat cgtcaagaag 2040
ctgcagaccg agggccgata cctgcgagac gtctggtaa 2079
<210> 4
<211> 1503
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)
<400> 4
atgacccagt ctgtgaaggt ggttgagaag cacgttccta tcgtcattga gaagcccagc 60
gagaaggagg aggacacctc ttctgaagac tccattgagc tgactgtcgg aaagcagccc 120
aagcccgtga ccgagacccg ttctctggac gacctagagg ctatcatgaa ggcaggtaag 180
accaagcttc tggaggacca cgaggttgtc aagctctctc tcgagggcaa gcttcctttg 240
tatgctcttg agaagcagct tggtgacaac acccgagctg ttggcatccg acgatctatc 300
atctcccagc agtctaatac caagacttta gagacctcaa agcttcctta cctgcactac 360
gactacgacc gtgtttttgg agcctgttgc gagaacgtta ttggttacat gcctctcccc 420
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actgagggtt gtcttgttgc ctcaaccatg cgaggttgca aggccatcaa cgccggtggc 540
ggtgttacca ctgtgcttac tcaggacggt atgacacgag gtccttgtgt ttccttcccc 600
tctctcaagc gggctggagc cgctaagatc tggcttgatt ccgaggaggg tctcaagtcc 660
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aatctgatcg gtagtgccat ggctggctct gtgggaggtt tcaatgcaca cgccgcaaac 1080
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tag 1503
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<211> 1338
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<400> 5
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cgatgctatg agcttctaga cgtgtgctca cgatcatttg cagccgttat tcgagaactg 180
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attgaagacg atatgactct gtcgcgtgac atcaagatcc caattcttcg agacttcacg 300
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gtggtgctac aggagtttcc tgtggttatg actgagttca acaagctcaa gcccaagtac 420
caggaagtaa tctacgacat taccgacaga atgggaaacg gaatggccga ttacgtcatt 480
gatgacgact tcaacaacaa cggcgtggac accattgccg cttatgatct gtactgtcat 540
catgttgccg gcatcgtggg tgagggcctt acccgaatta cgattctcgc tggttttgga 600
accgacgtgt tgcacgaaaa cccccgactt caggagtcta tgggcttgtt cttgcaaaag 660
gtcaacatca tccgagacta cagagaagac attgacgtga acagagcttt ctggcctcga 720
gaaatctggc acaagtacgc cgaagaaatg cgagatttca aggacccgaa gtattccaag 780
aaggccttgc attgcacctc cgatctggtt gcaaatgccc tcggacatgc cacagactgc 840
ctcgattacc tcgacaacgt caccgatcct tcaaccttca ctttctgcgc cattccccag 900
gtcatggcca ttgctaccct ggacttggtc taccgaaacc ccgacgtttt ccagaagaac 960
gtcaagttgc gcaagggaac tactgtcagc ctgattcttg aggccagcaa cgtttctgga 1020
gtatgtgaca ttttcactcg atacgcccgg aaggtgtaca agaagtccga ccccaatgac 1080
cccaactact tccgagtgtc tgtgctctgc ggtaagatcg agcagcatgc ggctctgatc 1140
aagagacagc gaggaccccc cgctaaaacc attgcacaac tggaaggtga acgaaaagag 1200
atggccctgt cgctaattgt ctgtttagca gttatcttct cgatgtctgg actgatggct 1260
tatatcgcct acgtgtctgg attcagatgg tcaccccgag agattttcga ctctaagatg 1320
tttcctctga gagattag 1338
<210> 6
<211> 406
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)
<400> 6
agagaccggg ttggcggcgt atttgtgtcc caaaaaacag ccccaattgc cccaattgac 60
cccaaattga cccagtagcg ggcccaaccc cggcgagagc ccccttcacc ccacatatca 120
aacctccccc ggttcccaca cttgccgtta agggcgtagg gtactgcagt ctggaatcta 180
cgcttgttca gactttgtac tagtttcttt gtctggccat ccgggtaacc catgccggac 240
gcaaaataga ctactgaaaa tttttttgct ttgtggttgg gactttagcc aagggtataa 300
aagaccaccg tccccgaatt acctttcctc ttcttttctc tctctccttg tcaactcaca 360
cccgaaatcg ttaagcattt ccttctgagt ataagaatca ttcaaa 406
<210> 7
<211> 411
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)
<400> 7
cctgtcccca cgttgccggt cttgcctcct actacctgtc catcaatgac gaggttctca 60
cccctgccca ggtcgaggct cttattactg agtccaacac cggtgttctt cccaccacca 120
acctcaaggg ctctcccaac gctgttgcct acaacggtgt tggcatttag gcaattaaca 180
gatagtttgc cggtgataat tctcttaacc tcccacactc ctttgacata acgatttatg 240
taacgaaact gaaatttgac cagatattgt tgtaaataga aaatctggct tgtaggtggc 300
aaaatcccgt ctttgttcat caattccctc tgtgactact cgtcatccct ttatgttcga 360
ctgtcgtatt tttattttcc atacatacgc aagtgagatg cccgtgtccg a 411
<210> 8
<211> 999
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)
<400> 8
gagtttggcg cccgtttttt cgagccccac acgtttcggt gagtatgagc ggcggcagat 60
tcgagcgttt ccggtttccg cggctggacg agagcccatg atgggggctc ccaccaccag 120
caatcagggc cctgattaca cacccacctg taatgtcatg ctgttcatcg tggttaatgc 180
tgctgtgtgc tgtgtgtgtg tgttgtttgg cgctcattgt tgcgttatgc agcgtacacc 240
acaatattgg aagcttatta gcctttctat tttttcgttt gcaaggctta acaacattgc 300
tgtggagagg gatggggata tggaggccgc tggagggagt cggagaggcg ttttggagcg 360
gcttggcctg gcgcccagct cgcgaaacgc acctaggacc ctttggcacg ccgaaatgtg 420
ccacttttca gtctagtaac gccttaccta cgtcattcca tgcatgcatg tttgcgcctt 480
ttttcccttg cccttgatcg ccacacagta cagtgcactg tacagtggag gttttggggg 540
ggtcttagat gggagctaaa agcggcctag cggtacacta gtgggattgt atggagtggc 600
atggagccta ggtggagcct gacaggacgc acgaccggct agcccgtgac agacgatggg 660
tggctcctgt tgtccaccgc gtacaaatgt ttgggccaaa gtcttgtcag ccttgcttgc 720
gaacctaatt cccaattttg tcacttcgca cccccattga tcgagcccta acccctgccc 780
atcaggcaat ccaattaagc tcgcattgtc tgccttgttt agtttggctc ctgcccgttt 840
cggcgtccac ttgcacaaac acaaacaagc attatatata aggctcgtct ctccctccca 900
accacactca cttttttgcc cgtcttccct tgctaacaca aaagtcaaga acacaaacaa 960
ccaccccaac ccccttacac acaagacata tctacagca 999
<210> 9
<211> 200
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)
<400> 9
gctatttatc actctttaca acttctacct caactatcta ctttaataaa tgaatatcgt 60
ttattctcta tgattactgt atatgcgttc ctctaagaca aatcgaaacc agcatgcgat 120
cgaatggcat acaaaagttt cttccgaagt tgatcaatgt cctgatagtc aggcagcttg 180
agaagattga cacaggtgga 200
<210> 10
<211> 1907
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggtgtgttct gtggagcatt ctcacttttg gtaaacgaca ttgcttcaag tgcagcggaa 60
tcaaaaagta taaagtgggc agcgagtata cctgtacaga ctgtaggcga taactcaatc 120
caattacccc ccacaacatg actggccaaa ctgatctcaa gactttattg aaatcagcaa 180
caccgattct caatgaaggc acatacttct tctgcaacat tcacttgacg cctaaagttg 240
gtgagaaatg gaccgacaag acatattctg ctatccacgg actgttgcct gtgtcggtgg 300
ctacaatacg tgagtcagaa gggctgacgg tggtggttcc caaggaaaag gtcgacgagt 360
atctgtctga ctcgtcattg ccgcctttgg agtacgactc caactatgag tgtgcttgga 420
tcactttgac gatacattct tcgttggagg ctgtgggtct gacagctgcg ttttcggcgc 480
ggttggccga caacaatatc agctgcaacg tcattgctgg ctttcatcat gatcacattt 540
ttgtcggcaa aggcgacgcc cagagagcca ttgacgttct ttctaatttg gaccgatagc 600
cgtatagtcc agtctatcta taagttcaac taactcgtaa ctattaccat aacatatact 660
tcactgcccc agataaggtt ccgataaaaa gttctgcaga ctaaatttat ttcagtctcc 720
tcttcaccac caaaatgccc tcctacgaag ctcgagctaa cgtccacaag tccgcctttg 780
ccgctcgagt gctcaagctc gtggcagcca agaaaaccaa cctgtgtgct tctctggatg 840
ttaccaccac caaggagctc attgagcttg ccgataaggt cggaccttat gtgtgcatga 900
tcaagaccca tatcgacatc attgacgact tcacctacgc cggcactgtg ctccccctca 960
aggaacttgc tcttaagcac ggtttcttcc tgttcgagga cagaaagttc gcagatattg 1020
gcaacactgt caagcaccag tacaagaacg gtgtctaccg aatcgccgag tggtccgata 1080
tcaccaacgc ccacggtgta cccggaaccg gaatcattgc tggcctgcga gctggtgccg 1140
aggaaactgt ctctgaacag aagaaggagg acgtctctga ctacgagaac tcccagtaca 1200
aggagttcct ggtcccctct cccaacgaga agctggccag aggtctgctc atgctggccg 1260
agctgtcttg caagggctct ctggccactg gcgagtactc caagcagacc attgagcttg 1320
cccgatccga ccccgagttt gtggttggct tcattgccca gaaccgacct aagggcgact 1380
ctgaggactg gcttattctg acccccgggg tgggtcttga cgacaaggga gacgctctcg 1440
gacagcagta ccgaactgtt gaggatgtca tgtctaccgg aacggatatc ataattgtcg 1500
gccgaggtct gtacggccag aaccgagatc ctattgagga ggccaagcga taccagaagg 1560
ctggctggga ggcttaccag aagattaact gttagaggtt agactatgga tatgtaattt 1620
aactgtgtat atagagagcg tgcaagtatg gagcgcttgt tcagcttgta tgatggtcag 1680
acgacctgtc tgatcgagta tgtatgatac tgcacaacct gtgtatccgc atgatctgtc 1740
caatggggca tgttgttgtg tttctcgata cggagatgct gggtacaagt agctaatacg 1800
attgaactac ttatacttat atgaggcttg aagaaagctg acttgtgtat gacttattct 1860
caactacatc cccagtcaca ataccaccac tgcactacca ctacacc 1907
<210> 11
<211> 2347
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gaattccgtc gtcgcctgag tcatcattta tttaccagtt ggccacaaac ccttgacgat 60
ctcgtatgtc ccctccgaca tactcccggc cggctggggt acgttcgata gcgctatcgg 120
catcgacaag gtttgggtcc ctagccgata ccgcactacc tgagtcacaa tcttcggagg 180
tttagtcttc cacatagcac gggcaaaagt gcgtatatat acaagagcgt ttgccagcca 240
cagattttca ctccacacac cacatcacac atacaaccac acacatccac aatggaaccc 300
gaaactaaga agaccaagac tgactccaag aagattgttc ttctcggcgg cgacttctgt 360
ggccccgagg tgattgccga ggccgtcaag gtgctcaagt ctgttgctga ggcctccggc 420
accgagtttg tgtttgagga ccgactcatt ggaggagctg ccattgagaa ggagggcgag 480
cccatcaccg acgctactct cgacatctgc cgaaaggctg actctattat gctcggtgct 540
gtcggaggcg ctgccaacac cgtatggacc actcccgacg gacgaaccga cgtgcgaccc 600
gagcagggtc tcctcaagct gcgaaaggac ctgaacctgt acgccaacct gcgaccctgc 660
cagctgctgt cgcccaagct cgccgatctc tcccccatcc gaaacgttga gggcaccgac 720
ttcatcattg tccgagagct cgtcggaggt atctactttg gagagcgaaa ggaggatgac 780
ggatctggcg tcgcttccga caccgagacc tactccgttc ctgaggttga gcgaattgcc 840
cgaatggccg ccttcctggc ccttcagcac aacccccctc ttcccgtgtg gtctcttgac 900
aaggccaacg tgctggcctc ctctcgactt tggcgaaaga ctgtcactcg agtcctcaag 960
gacgaattcc cccagctcga gctcaaccac cagctgatcg actcggccgc catgatcctc 1020
atcaagcagc cctccaagat gaatggtatc atcatcacca ccaacatgtt tggcgatatc 1080
atctccgacg aggcctccgt catccccggt tctctgggtc tgctgccctc cgcctctctg 1140
gcttctctgc ccgacaccaa cgaggcgttc ggtctgtacg agccctgtca cggatctgcc 1200
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ctcaagttct ctcttaacat gaagcccgcc ggtgacgctg ttgaggctgc cgtcaaggag 1320
tccgtcgagg ctggtatcac taccgccgat atcggaggct cttcctccac ctccgaggtc 1380
ggagactttg ttgccaacaa ggtcaaggag ctgctcaaga aggagtaagt cgtttctacg 1440
acgcattgat ggaaggagca aactgacgcg cctgcgggtt ggtctaccgg cagggtccgc 1500
tagtgtataa gactctataa aaagggccca gccctgctaa tgaaatgatg atttataatt 1560
taccggtgta gcaaccttga ctagaagaag cagattgggt gtgtttgtag tggaggacag 1620
tggtacgttt tggaaacagt cttcttgaaa gtgtcttgtc tacagtatat tcactcataa 1680
cctcaatagc caagggtgta gtcggtttat taaaggaagg gagttgtggc tgatgtggat 1740
agatatcttt aaagctggcg actgcaccca acgagtgtgg tggtagcttg ttactgtata 1800
ttcggtaaga tatattttgt ggggttttta gtggtgtttg gtaggttagt gtctggtata 1860
tgagttgtag gcatgacaat ttggaaaggg gtggactttg ggaatattgt gggatttcaa 1920
taccttagtt tgtacagggt aattgttaca aatgatacaa agaactgtat ttcttttcat 1980
ttgttttaat tggttgtata tcaagtccgt tagacgagct cagtgccatg gcttttggca 2040
ctgtatttca tttttagagg tacactacat ccagtgaggt atggtaaggt tgagggcata 2100
atgaaggcac cttgtactga cagtcacaga cctctcaccg agaattttat gagatatact 2160
cgggttcatt ttaggctccg attcgattca aattattact gtcgaaatcg gttgagcatc 2220
cgttgatttc cgaacagatc tcggcagtct ctcggatgta gaattaggtt tccttgaggc 2280
gagatgagac ggtaagttgg aggggtttga gaagagatag agatcggttt gtgtgacatg 2340
aattctt 2347
<210> 12
<211> 700
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)
<400> 12
tcgatcctaa ggggtggcat aactgtcgcg tacggcccga taagggcctt ctccaaaagg 60
gaagccggtt gaaattccgg cacttggatg tggattctcc acggcaacgt aactgaatgt 120
ggggacggtg gcacaagtct tggaaggagt tatcttttct ttttaacgga gtcaacaccc 180
tggaattagt ttgtctagag atagggtatc gttccggaag aggggggcag ctttgtcccc 240
tccgatgcac ttgtgacgcc ccttgaaaac ccgcaggaag gaatagtttt cacgccaagt 300
cgtactgata accgcagcag gtctccaagg tgaacagcct ctagttgata gaataatgta 360
gataagggaa gtcggcaaaa tagatccgta acttcgggat aaggattggc tctgggggtt 420
ggtggatgga agcgtgggag accccaaggg actggcggct gggcaactgg cagccggacc 480
cgcggcagac actgcgtcgc tccgtccaca tcatcaaccg ccccagaact ggtacggaca 540
aggggaatct gactgtctaa ttaaaacata gctttgcgat ggttgtaaaa caatgttgac 600
gcaaagtgat ttctgcccag tgctctgaat gtcaaagtga agaaattcaa ccaagcgcgg 660
gtaaacggcg ggagtaacta tgactctctt aaggtagcca 700
<210> 13
<211> 599
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)
<400> 13
aatgcctcgt catctaatta gtgacgcgca tgaatggatt aacgagattc ccactgtccc 60
tatctactat ctagcgaaac cacagccaag ggaacgggct tggcagaatc agcggggaaa 120
gaagaccctg ttgagcttga ctctagtttg acattgtgaa gagacatagg gggtgtagaa 180
taagtgggag cttcggcgcc ggtgaaatac cactaccctt atcgtttctt tacttattta 240
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caggtgggga gtttggctgg ggcggcacat ctgttaaaag ataacgcaga tgtcctaagg 360
gggactcaat gagaacagaa atctcatgta gaacaaaagg gtaaaagtcc ccttgatttt 420
gattttcagt gtgaatacaa accatgaaag tgtggcctat cgatccttta gttgttcgga 480
gtttgaacct agaggtgcca gaaaagttac cacagggata actggcttgt ggcagtcaag 540
cgttcatagc gacattgctt tttgatcctt cgatgtcggc tcttcctatc ataccgaag 599
<210> 14
<211> 348
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)
<400> 14
agagaatcgg cgttacctct ctcacaaagc ccttcagtac cgccgcctgt cgggaatcgc 60
gttcaggtgg aacaggacca cctcccttgc acttcttggt atatcagtat aggctgatgt 120
attcatagtg gggtttttca taataaattt actaacggca ggcaacattc actcggctta 180
aacgcaaaac ggaccgtctt gatatcttct gacgcattga ccaccgagaa atagtgttag 240
ttaccgggtg agttattgtt cttctacaca ggcgacgccc atcgtctaga gttgatgtac 300
taactcagat ttcactacct accctatccc tggtacgcac aaagcact 348
<210> 15
<211> 353
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)
<400> 15
tgtaacactc gctctggaga gttagtcatc cgacagggta actctaatct cccaacacct 60
tattaactct gcgtaactgt aactcttctt gccacgtcga tcttactcaa ttttcctgct 120
catcatctgc tggattgttg tctatcgtct ggctctaata catttattgt ttattgccca 180
aacaactttc attgcacgta agtgaattgt tttataacag cgttcgccaa ttgctgcgcc 240
atcgtcgtcc ggctgtccta ccgttagggg tagtgtgtct cacactaccg aggttactag 300
agttgggaaa gcgatactgc ctcggacaca ccacctgggt cttacgactg cag 353
<210> 16
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tcgatcctaa ggggtggcat aactgtcgc 29
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<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
acgccgccaa cccggtctct tggctacctt aagagagtca t 41
<210> 18
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
atgactctct taaggtagcc aagagaccgg gttggcggcg ta 42
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<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ccgatcttca gcttccacat tttgaatgat tcttatactc 40
<210> 20
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gagtataaga atcattcaaa atgtggaagc tgaagatcgg 40
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<211> 40
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
accggcaacg tggggacagg ttagttgacg atgaagacga 40
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<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tcgtcttcat cgtcaactaa cctgtcccca cgttgccggt 40
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gtcactaatt agatgacgag gcattggtgt agtggtagtg cagtgg 46
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<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ccactgcact accactacac caatgcctcg tcatctaatt agtgac 46
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
cttcggtatg ataggaagag ccgacatcga 30
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tcaccgaaac gtgtggggct cgaaaaaacg ggcgccaaac tctcggacac gggcatctca 60
cttgc 65
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tatttttatt ttccatacat acgcaagtga gatgcccgtg tccgagagtt tggcgcccgt 60
tttttc 66
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<211> 40
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
aggtagaagt taggctccat tgctgtagat atgtcttgtg 40
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
cacaagacat atctacagca atggagccta acttctacct 40
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcagcggtgg tcttcttcca ttaagccttg tgggggtaca 40
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgtaccccca caaggcttaa tggaagaaga ccaccgctga 40
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgtaaagagt gataaatagc ttaccagacg tctcgcaggt a 41
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
tacctgcgag acgtctggta agctatttat cactctttac aa 42
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
aatgtcgttt accaaaagtg agaatgctcc acagaacaca cctccacctg tgtcaatctt 60
ctc 63
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gtcctgatag tcaggcagct tgagaagatt gacacaggtg gaggtgtgtt ctgtggagca 60
ttc 63
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ctctcaaggg catcggtcga cagagaccgg gttggcggc 39
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
cgcataaggg agagcgtcga ctcggacacg ggcatctca 39
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gtttgacagc ttatcatcga tcggaaggag ctgactgggt t 41
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
gtttgacagc ttatcatcga ttcggacacg ggcatctca 39
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
acaaccacac acatccacgt gatgatcgtc attgagaagc ccagc 45
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
ttagtttcgg gttcccacgt gctatgaccg tatgcaaata ttcgaa 46
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
acaaccacac acatccacgt gatgggaaaa ctcatcgaac tgc 43
<210> 43
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
ttagtttcgg gttcccacgt gctaatctct cagaggaaac atcttagagt c 51
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
agagaatcgg cgttacctct ctcacaaagc 30
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
acgatgatcg gcctgtcgct tgcggagtgc tttgtgcgta 40
<210> 46
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
tacgcacaaa gcactccgca agcgacaggc cgatcatcgt cgcgctccag 50
<210> 47
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
aactggtaaa taaatgatga ctcaggcgac gacggaattc 40
<210> 48
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
gaattccgtc gtcgcctgag tcatcattta tttaccagtt 40
<210> 49
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
ctgcagtcgt aagacccagg tggtgtgt 28
<210> 50
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
acgccgccaa cccggtctct aagaattcat gtcacacaaa 40
<210> 51
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
tttgtgtgac atgaattctt agagaccggg ttggcggcgt 40
<210> 52
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
tctccagagc gagtgttaca tcggacacgg gcatctcact 40
<210> 53
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
agtgagatgc ccgtgtccga tgtaacactc gctctggaga 40
<210> 54
<211> 3000
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)
<400> 54
atgctacaag cagctattgg aaagattgtg ggatttgcgg tcaaccgacc catccacaca 60
gttgtcctga cgtccatcgt ggcgtcaacc gcatacctcg ccatcctcga cattgccatc 120
ccgggtttcg agggcacaca acccatctca tactaccacc ctgcagcaaa atcttacgac 180
aaccctgctg attggaccca cattgcagag gccgacatcc cttcagacgc ctaccgactt 240
gcatttgccc agatccgtgt cagtgatgtt cagggcggag aggcccccac catccctggc 300
gccgtggccg tgtctgatct cgaccacaga atcgtcatgg actacaaaca gtgggccccc 360
tggaccgcca gcaacgagca gatcgcctcg gagaaccaca tctggaagca ctccttcaag 420
gaccacgtgg ccttcagctg gatcaagtgg ttccgatggg cctacctgcg tttgtccact 480
ctcatccagg gggcagacaa cttcgacatt gccgtggtcg cccttggcta tcttgccatg 540
cactacacct tcttcagtct cttccgatcc atgcgaaagg ttggctcgca cttttggctt 600
gcctccatgg ctctggtctc ttccaccttc gctttcctgc ttgcggtggt ggcttcctct 660
agcctgggtt accgacctag catgatcacc atgtccgagg gcctgccctt cctcgtggtc 720
gccattggct ttgaccgaaa ggtcaacctg gctagcgagg tgctcacatc caagagcagc 780
cagctcgctc ccatggtgca ggtgatcaca aagatcgcct ccaaggcgct gtttgagtac 840
agccttgagg tggccgccct gtttgctggc gcctataccg gagttcctcg actgtcccag 900
ttttgcttct tatctgcttg gatcctcatc ttcgactaca tgtttttgct gaccttctac 960
tctgctgtcc ttgctatcaa gtttgagatc aatcacatta agcgaaaccg aatgatccag 1020
gatgctctca aggaggatgg tgtatctgct gctgttgccg agaaggtagc cgactcttct 1080
cccgacgcca agctcgaccg aaagtccgac gtttctcttt ttggagcctc tggcgccatt 1140
gcggtgttca agatcttcat ggtccttggg ttccttggtc tcaacctcat caacctgact 1200
gccatccctc accttggcaa ggcggccgcc gctgcccagt ctgtgactcc catcaccctc 1260
tcccccgagc ttctccatgc catccccgcc tctgtgcccg ttgttgtcac ctttgtgccc 1320
agcgttgtgt acgagcactc ccagctcatt ctgcagctgg aggacgccct cactaccttc 1380
ctggctgcct gctccaaaac tattggtgac cccgtcatct ccaagtacat cttcctgtgc 1440
ctgatggtct ccaccgccct gaacgtctac ctgtttggag ccacccgaga agttgtgcga 1500
acccagtctg tgaaggtggt tgagaagcac gttcctatcg tcattgagaa gcccagcgag 1560
aaggaggagg acacctcttc tgaagactcc attgagctga ctgtcggaaa gcagcccaag 1620
cccgtgaccg agacccgttc tctggacgac ctagaggcta tcatgaaggc aggtaagacc 1680
aagcttctgg aggaccacga ggttgtcaag ctctctctcg agggcaagct tcctttgtat 1740
gctcttgaga agcagcttgg tgacaacacc cgagctgttg gcatccgacg atctatcatc 1800
tcccagcagt ctaataccaa gactttagag acctcaaagc ttccttacct gcactacgac 1860
tacgaccgtg tttttggagc ctgttgcgag aacgttattg gttacatgcc tctccccgtt 1920
ggtgttgctg gccccatgaa cattgatggc aagaactacc acattcctat ggccaccact 1980
gagggttgtc ttgttgcctc aaccatgcga ggttgcaagg ccatcaacgc cggtggcggt 2040
gttaccactg tgcttactca ggacggtatg acacgaggtc cttgtgtttc cttcccctct 2100
ctcaagcggg ctggagccgc taagatctgg cttgattccg aggagggtct caagtccatg 2160
cgaaaggcct tcaactccac ctctcgattt gctcgtctcc agtctcttca ctctaccctt 2220
gctggtaacc tgctgtttat tcgattccga accaccactg gtgatgccat gggcatgaac 2280
atgatctcca agggcgtcga acactctctg gccgtcatgg tcaaggagta cggcttccct 2340
gatatggaca ttgtgtctgt ctcgggtaac tactgcactg acaagaagcc cgcagcgatc 2400
aactggatcg aaggccgagg caagagtgtt gttgccgaag ccaccatccc tgctcacatt 2460
gtcaagtctg ttctcaaaag tgaggttgac gctcttgttg agctcaacat cagcaagaat 2520
ctgatcggta gtgccatggc tggctctgtg ggaggtttca atgcacacgc cgcaaacctg 2580
gtgaccgcca tctaccttgc cactggccag gatcctgctc agaatgtcga gtcttccaac 2640
tgcatcacgc tgatgagcaa cgtcgacggt aacctgctca tctccgtttc catgccttct 2700
atcgaggtcg gtaccattgg tggaggtact attttggagc cccagggggc tatgctggag 2760
atgcttggcg tgcgaggtcc tcacatcgag acccccggtg ccaacgccca acagcttgct 2820
cgcatcattg cttctggagt tcttgcagcg gagctttcgc tgtgttctgc tcttgctgcc 2880
ggccatcttg tgcaaagtca tatgacccac aaccggtccc aggctcctac tccggccaag 2940
cagtctcagg ccgatctgca gcgtctacaa aacggttcga atatttgcat acggtcatag 3000

Claims (2)

1.异源合成白桦脂酸的重组解脂耶氏酵母的构建方法，其特征是包括如下步骤：
(1)利用同源重组方法，向解脂耶氏酵母中导入优化的羽扇豆醇合酶编码基因opAtLUP1、优化的细胞色素P450酶编码基因opCYP716A12和优化的细胞色素P450还原酶1的编码基因opAtCPR1，得到重组菌1；
所述优化的羽扇豆醇合酶编码基因opAtLUP1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述优化的细胞色素P450酶编码基因opCYP716A12的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述优化的细胞色素P450还原酶1的编码基因opAtCPR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
(2)向重组菌1中导入截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因tHMG1、鲨烯合酶编码基因Erg9和优化的羽扇豆醇合酶的编码基因opAtLUP1得到重组菌2；
所述截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因tHMG1是编码3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因HMG1 5'端截了1500个核苷酸得到；所述编码3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因HMG1的核苷酸序列如SEQ ID NO.54所示；
所述截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因tHMG1的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；
所述鲨烯合酶编码基因Erg9的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
2.权利要求1的方法制备的异源合成白桦脂酸的重组解脂耶氏酵母。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111440733A (zh) * 2020-02-07 2020-07-24 天津大学 产松油醇的重组酿酒酵母及构建方法及应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105385614A (zh) * 2015-12-17 2016-03-09 浙江大学 一种重组酿酒酵母及其构建方法与应用
CN105886415A (zh) * 2016-05-13 2016-08-24 湖北仁悦药业股份有限公司 一种生产白桦脂酸的酿酒酵母工程菌及其构建方法
WO2018096150A1 (en) * 2016-11-28 2018-05-31 Vib Vzw Enhancing production of terpenoids using eukaryotic cells with increased intracellular membrane proliferation
WO2019014310A1 (en) * 2017-07-13 2019-01-17 Verdezyne (Abc), Llc BIOLOGICAL METHODS FOR THE PREPARATION OF TERPENES
US20190270971A1 (en) * 2018-03-01 2019-09-05 Jason Donald Increasing productivity of microbial host cells that functionally express p450 enzymes
CN110511879A (zh) * 2018-05-22 2019-11-29 暨南大学 酿酒酵母工程菌的构建及桦木酸的制备方法
CN110628805A (zh) * 2019-09-19 2019-12-31 天津大学 精细调控酿酒酵母erg7表达的重组菌及构建方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105385614A (zh) * 2015-12-17 2016-03-09 浙江大学 一种重组酿酒酵母及其构建方法与应用
CN105886415A (zh) * 2016-05-13 2016-08-24 湖北仁悦药业股份有限公司 一种生产白桦脂酸的酿酒酵母工程菌及其构建方法
WO2018096150A1 (en) * 2016-11-28 2018-05-31 Vib Vzw Enhancing production of terpenoids using eukaryotic cells with increased intracellular membrane proliferation
WO2019014310A1 (en) * 2017-07-13 2019-01-17 Verdezyne (Abc), Llc BIOLOGICAL METHODS FOR THE PREPARATION OF TERPENES
US20190270971A1 (en) * 2018-03-01 2019-09-05 Jason Donald Increasing productivity of microbial host cells that functionally express p450 enzymes
CN110511879A (zh) * 2018-05-22 2019-11-29 暨南大学 酿酒酵母工程菌的构建及桦木酸的制备方法
CN110628805A (zh) * 2019-09-19 2019-12-31 天津大学 精细调控酿酒酵母erg7表达的重组菌及构建方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CONG-CONG JIN等: "Boosting the biosynthesis of betulinic acid and related triterpenoids in Yarrowia lipolytica via multimodular metabolic engineering", 《BIOMED CENTRAL》 *
JIE SUN等: "Glycerol improves heterologous biosynthesis of betulinic acid in engineered Yarrowia lipolytica", 《CHEMICAL ENGINEERING SCIENCE》 *
孔婧等: "代谢工程改造解脂耶氏酵母合成植物萜类化合物的研究进展", 《微生物学通报》 *
孙杰: "解脂耶氏酵母异源合成白桦脂酸", 《中国学位论文全文数据库》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111440733A (zh) * 2020-02-07 2020-07-24 天津大学 产松油醇的重组酿酒酵母及构建方法及应用

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