CN113699138A

CN113699138A - 碱性蛋白酶基因、杂合启动子、重组表达载体、重组表达工程菌、碱性蛋白酶及方法和应用

Info

Publication number: CN113699138A
Application number: CN202110952632.8A
Authority: CN
Inventors: 王建荣; 赵良忠; 陈浩; 李明; 周小虎; 周晓洁; 黄展锐
Original assignee: Shaoyang University
Current assignee: Shaoyang University
Priority date: 2021-08-19
Filing date: 2021-08-19
Publication date: 2021-11-26
Anticipated expiration: 2041-08-19
Also published as: CN113699138B

Abstract

本发明公开了一种碱性蛋白酶基因、杂合启动子、重组表达载体、重组表达工程菌、碱性蛋白酶及方法和应用，碱性蛋白酶基因bcp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的碱性蛋白酶基因bcp，其全长为1143bp，在枯草芽孢杆菌表达菌株中进行高效表达，从而降低碱性蛋白酶BCP的生产成本。

Description

碱性蛋白酶基因、杂合启动子、重组表达载体、重组表达工程菌、碱性蛋白酶及方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别地，涉及一种碱性蛋白酶基因。此外，本发明还涉及杂合启动子、重组表达载体、重组表达工程菌及其制备方法和应用。

背景技术

蛋白酶能够分解蛋白质形成多肽以及游离氨基酸，在许多领域具有广泛的应用前景。蛋白酶来源广泛，目前产业化应用的蛋白酶主要来源于微生物，微生物来源蛋白酶具有种类多、酶学特性多样等特点。微生物来源的蛋白酶，根据作用pH可以分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶以及碱性蛋白酶。这三种蛋白酶根据各自不同的酶学性质分别应用于不同的工业领域。其中碱性蛋白酶作为一种丝氨酸蛋白酶，具有良好的活性和稳定性，能够有效分解各种蛋白质，目前主要应用于食品加工、洗涤以及饲料等领域。碱性蛋白酶作为一种常用的工业酶制剂，市场上主流的碱性蛋白酶产品则是来源于嗜碱芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌以及枯草芽孢杆菌。碱性蛋白酶的生产方式则主要分为天然菌发酵培养和异源高效表达两大类。天然菌发酵培养的优点是发酵周期短，缺点则是酶活低、发酵过程不稳定及培养基组成复杂、菌种容易退化等。相对于天然菌，异源重组表达具备发酵酶活高、发酵过程稳定可控等优点，因此其成为主流的生产方式。目前碱性蛋白酶异源表达宿主包括枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，其中枯草芽孢杆菌表达宿主的研究最多。枯草芽孢杆菌作为一种食品级表达宿主具有遗传操作简单、基因背景清晰、胞外分泌蛋白等优点。

发明内容

本发明提供了一种碱性蛋白酶基因、杂合启动子、重组表达载体、重组表达工程菌、碱性蛋白酶及方法和应用，以解决来源于芽孢杆菌的碱性蛋白酶的生产成本高、碱性蛋白酶发酵活力低的技术问题。

本发明采用的技术方案如下：

一种碱性蛋白酶基因bcp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

通过同源克隆获得环状芽孢杆菌碱性蛋白酶基因bcp。参照细菌基因组提取试剂盒提取环状芽孢杆菌基因组sy1(环状芽孢杆菌sy1由实验室前期从豆渣里面筛选获得)，根据NCBI数据库Bacillus circulans strain NCTC2610基因组序列(GenBank:UAPZ01000012.1：120935-122077)设计一对引物，即正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示(bc1-fw，5'–TCACGGCCG ATGAAGAAACTGTTGACGAAA-3'，下划线为Ec52I酶切位点)，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示(bc1-rev：5'-ACGTCTAGAGCGTGTTGCCGCTTCTGC-3'，下划线为XbaI酶切位点)。以提取的基因组为模板，通过PCR扩增获得碱性蛋白酶基因bcp。

上述碱性蛋白酶基因bcp为环状芽孢杆菌碱性蛋白酶基因bcp，其全长为1143bp，编码性蛋白酶BCP的380个氨基酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

根据本发明的另一方面，还提供了一种碱性蛋白酶BCP，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。通过分析，基因bcp编码的碱性蛋白酶BCP可以分成三段，前27个氨基酸为其信号肽序列，28位氨基酸到111位氨基酸为其前导肽，112位氨基酸到269位氨基酸为其成熟肽(请确认，此处是否需要修改)。

通过NCBI蛋白比对分析发现碱性蛋白酶BCP与环状芽孢杆菌NCTC2610碱性蛋白酶(蛋白登录号：No.SPU21234.1)相似性最高，为90％；其次分别为克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(蛋白登录号：WP_094423791)和巴塔哥尼亚芽孢杆菌碱性蛋白酶(蛋白登录号：WP_094190329.1)，相似性分别为89.4％和78.7％。通过同源建模获得碱性蛋白酶BCP蛋白三维结构，由图1可知，BCP催化活性位点由第143位的天冬氨酸(D143)，第173位的组氨酸(H173)和第326位的丝氨酸(S326)催化三联体构成。蛋白表面的两段氨基酸之环(G²⁰⁹到S²¹⁵，L²³³到S²³⁹)负责结合底物进行反应。此外BCP成熟肽还存在两个Ca²⁺结合位点，一个在蛋白表面，一个处于蛋白中间。

根据本发明的另一方面，还提供了一种用于在枯草芽孢杆菌中高效表达碱性蛋白酶的杂合启动子，杂合启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。杂合启动子的构建方法包括以下步骤：(1)PCR扩增获得碱性蛋白酶基因bcp，再通过琼脂糖凝聚纯化后用限制性内切酶XbaI和Eco521进行酶切，将酶切后的产物纯化，连接至表达载体pHY，通过筛选以及测序最终获得表达载体pHY-bcp。(2)以构建好的pHY-bcp为模板，分别构建不同启动子表达载体。筛选的启动子包括：P_cryIIIA(苏云金芽孢杆菌结晶蛋白启动子)、P_Bsamy(枯草芽孢杆菌中温淀粉酶启动子)、P_Baamy(解淀粉芽孢杆菌中温淀粉酶启动子)、P_HpaII(来源于表达载体pMA5q)、P_gsib(来源于枯草芽孢杆菌)、P_Bsapr(枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶启动子)，P_Bsnpr(枯草芽孢杆菌中性蛋白酶启动子)和P_Blapr(地衣芽孢碱性蛋白酶启动子)，启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.10所示。(3)采用电转化法将所有不同启动子表达载体转入枯草芽孢杆菌RIK1285，获得多个转化子。(4)多个转化子培养后进行酶活筛选，以确定单一最优启动子。(5)以单一最优启动子作为模板构建杂合启动子，重复步骤(3)、(4)，获得杂合启动子。杂合启动子为pHYP_{Bsapr-cryIIIA}-bcp，其对应的重组工程菌的酶活为2210U/mL，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

根据本发明的另一方面，还提供了一种重组表达载体，包括上述碱性蛋白酶基因bcp、权利要求3的杂合启动子和信号肽，信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。启动子和信号肽作为枯草芽孢杆菌重组表达的核心元件，在异源蛋白重组表达过程中发挥着重要作用。不同的酶对启动子和信号肽有选择性，因此蛋白酶在枯草芽孢进行异源表达，通过筛选获得最适启动子和信号肽。信号肽对其进行优化能够进一步提升碱性蛋白酶BCP在枯草芽孢杆菌RIK1285的表达量。所选的信号肽包括：SP_Bsamy(枯草芽孢杆菌中温淀粉酶信号肽)、SP_Bsapr(枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶信号肽)、SP_Bsnpr(枯草芽孢杆菌中性蛋白酶信号肽)、SP_Bschi(枯草芽孢杆菌几丁质酶信号肽)、SP_DacB(枯草芽孢杆菌DacB信号肽)、SP_Vpr(枯草芽孢杆菌Vpr信号肽)、SP_YncM(枯草芽孢杆菌YncM信号肽)和SP_Ap(枯草芽孢杆菌氨肽酶信号肽)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12～SEQ ID NO.19所示。分别将不同信号肽表达载体转入枯草芽孢杆菌RIK1285，筛选转化子，确定最佳信号肽，试验结果可知，SP_Bschi(枯草芽孢杆菌几丁质酶信号肽)效果最好，其对应的重组工程菌发酵酶活最高，培养48小时酶活为2650U/mL，其次为SPBsamy和SPBsnpr多对应的重组工程菌，酶活分别为2452U/mL和2345U/mL。重组表达载体为pHYP_{Bsapr-cryIIIA}-SP_Bschi-bcp。

根据本发明的另一方面，还提供了一种重组表达工程菌，包括上述重组表达载体。以游离质粒表达的方式，在经过多次传代后重组工程菌的发酵酶活会显著降低，因此需要把最优重组表达载体pHYP_{Bsapr-cryIIIA}-SP_Bschi-bcp整合到枯草芽孢杆菌RIK1285基因组上。重组表达工程菌种Bs16-5在7升发酵罐培养48小时后发酵活力达到最高为51807U/mL；在50升发酵罐培养48小时后发酵酶活为53708U/mL。

根据本发明的另一方面，还提供了一种上述碱性蛋白酶BCP的制备方法，包括以下步骤：

提供碱性蛋白酶基因bcp、表达载体和表达菌株；

对碱性蛋白酶基因bcp进行扩增，扩增产物与表达载体进行连接，获得重组表达载体；

将重组表达载体基因整合到表达菌株，获得重组表达工程菌；

对重组表达工程菌进行培养，获得碱性蛋白酶BCP；

其中，碱性蛋白酶基因bcp的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明的碱性蛋白酶BCP的制备方法，首先通过同源克隆获得了碱性蛋白酶BCP编码基因bcp，其次通过启动子和信号肽优化以及整合型表达获得高效重组枯草芽孢杆菌工程菌Bs16-5，最后通过高密度发酵实现碱性蛋白酶BCP的高效制备，为碱性蛋白酶BCP的产业化应用奠定基础。

进一步地，表达载体包括载体pHY、杂合启动子和信号肽；和/或，表达菌株为枯草芽孢杆菌RIK1285。

进一步地，重组表达载体基因整合到枯草芽孢杆菌RIK1285的中温淀粉酶基因位点。

进一步地，碱性蛋白酶基因bcp进行扩增的过程中，用于扩增的引物包括正向引物和反向引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示，反向引物的核苷酸序列如SEQID NO：21所示。

根据本发明的另一方面，还提供了一种上述碱性蛋白酶BCP在水解蛋白质中的应用，碱性蛋白酶BCP的反应温度为20℃～70℃；碱性蛋白酶BCP的反应pH值为7～11。

本发明具有以下有益效果：

本发明的碱性蛋白酶基因bcp，其全长为1143bp，在枯草芽孢杆菌表达菌株中进行高效表达，从而降低碱性蛋白酶BCP的生产成本。

除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照附图，对本发明作进一步详细的说明。

附图说明

构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明优选实施例的碱性蛋白酶BCP的三维结构图；

图2是本发明优选实施例的重组表达载体的优化路线图；

图3是本发明优选实施例的枯草芽孢杆菌Bs16-5在7升发酵罐培养产酶曲线图；

图4是本发明优选实施例的枯草芽孢杆菌Bs16-5在50升发酵罐培养产酶曲线图；

图5是本发明优选实施例的碱性蛋白酶BCP的反应温度特性图；以及

图6是本发明优选实施例的碱性蛋白酶BCP的pH特性图。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

图1是本发明优选实施例的碱性蛋白酶BCP的三维结构图；图2是本发明优选实施例的重组表达载体的优化路线图；图3是本发明优选实施例的枯草芽孢杆菌Bs16-5在7升发酵罐培养产酶曲线图；图4是本发明优选实施例的枯草芽孢杆菌Bs16-5在50升发酵罐培养产酶曲线图；图5是本发明优选实施例的碱性蛋白酶BCP的反应温度特性图；以及图6是本发明优选实施例的碱性蛋白酶BCP的pH特性图。

实施例

大肠杆菌菌株Topl0和枯草芽孢杆菌RIK1285均购自宝生物公司。

环状芽孢杆菌sy1由实验室前期从豆渣里面筛选获得。

表达载体pHY由本课题组前期实验构建且常规保存于-80℃冰箱。

高保真Q5酶，购自NEB公司。

质粒提取、胶纯化、限制性内切酶、试剂盒购自上海生工公司。

大肠杆菌和枯草芽孢杆菌RIK1285培养基为LB液体和固体培养基，LB液体培养基组成成分如下：1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，pH7.0；固体培养基则是在液体培养基的基础上添加了2.5％琼脂粉。

大肠杆菌和枯草芽孢杆菌RIK1285筛选培养基为液体LBK和固体LBK培养基，主要用于大肠杆菌重组转化子和枯草芽孢杆菌重组转化子的筛选。液体LBK配置：在灭好菌的LB液体培养基加入30μg/mL卡那霉素，获得液体LBK培养基；固体LBK培养基：将灭好菌的固体LB培养基加热溶解，待培养基温度降至50℃，按照30μg/mL加入卡那霉素，倒板，获得固体LBK培养基。

枯草芽孢发酵培养基为麦芽糖培养基，其组成成分如下：酵母浸膏2.5％、蛋白胨1.5％、麦芽糖4％、柠檬酸钠1％、氯化钙0.3％、磷酸氢二钾1％。

高密度发酵培养基，其组成成分如下：麦芽糖7％、豆粕2.5％、酵母粉1.5％、麸皮2％、磷酸氢二钾1％、柠檬酸三钠0.3％、氯化钙0.3％。

实施例1

碱性蛋白酶基因bcp基因克隆及表达载体构建

参照细菌基因组提取试剂盒提取环状芽孢杆菌基因组sy1，根据NCBI数据库Bacillus circulans strain NCTC2610基因组序列(GenBank:UAPZ01000012.1：120935-122077)设计一对引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示(bc1-fw，5'–TCACGGCCGATGAAGAAACTGTTGACGAAA-3'，下划线为Ec52I酶切位点)，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示(bc1-rev：5'-ACGTCTAGAGCGTGTTGCCGCTTCTGC-3'，下划线为XbaI酶切位点)，用于扩增环状芽孢杆菌碱性蛋白酶基因bcp。以提取的基因组为模板，通过PCR扩增获得碱性蛋白酶基因bcp。

扩增的碱性蛋白酶基因bcp通过琼脂糖凝聚纯化后用限制性内切酶XbaI和Eco521进行酶切，将酶切后的产物纯化，连接至表达载体pHY，将连接产物转化至大肠杆菌Top10，转化产物均匀涂布于LBK固体培养基。转化子的筛选采用菌液PCR法，如下：(1)将转化子以单菌落的形式接入含有300μl LBK液体培养基的2ml灭菌离心管，37℃，200rpm培养5小时；(2)以培养好的菌液为模板，以引物bc1-fw和bc1-rev进行PCR扩增，将扩增结果正确的转化子接入LBK液体培养基进行培养，提取质粒；(3)通过测序验证，最终获得表达载体pHY-bcp。

实施例2

单启动子优化

以构建好的表达载体pHY-bcp为模板，分别构建不同启动子表达载体。筛选的启动子包括：P_cryIIIA(苏云金芽孢杆菌结晶蛋白启动子)、P_Bsamy(枯草芽孢杆菌中温淀粉酶启动子)，P_Baamy(解淀粉芽孢杆菌中温淀粉酶启动子)，P_HpaII(来源于表达载体pMA5q)，P_gsib(来源于枯草芽孢杆菌)、P_Bsapr(枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶启动子)，P_Bsnpr(枯草芽孢杆菌中性蛋白酶启动子)和P_Blapr(地衣芽孢碱性蛋白酶启动子)，启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.10所示，所有启动子序列均由通用生物公司进行合成，基因合成过程中在启动子序列两端均加上了Eco52I和MluI酶切位点。

如图2所示，具体步骤如下(以pHY_PcryIIIA-bcp为例，其它类同)：首先用限制性内切酶Eco52I和MluI分别酶切表达载体pH_Y-bcp和合成的启动子P_cryIIIA质粒；其次通过琼脂糖凝聚分别回收主框架pHY(不含有pHY自带启动子P43)以及P_cryIIIA启动子，并且将P_cryIIIA启动子连接至主框架pHY，转入大肠杆菌Top10；最后通过菌落PCR、测序验证确定获得表达载体pHYP_cryIIIA-bcp。依次方法分别获得pHYP_cryIIIA-bcp、pHYP_Bsamy-bcp、pHYP_Baamy-bcp、pHYP_HpaII-bcp、pHYP_gsib-bcp、pHYP_Bsapr-bcp、pHYP_Bsnpr-bcp、pHYP_Blapr-bcp，共8个表达载体。

采用电转化法将8个表达载体转入枯草芽孢杆菌RIK1285。转化过程如下：(1)从37℃培养16h～20h的平板中挑取一个单菌落(直径2mm～3mm)，转到一个含有5ml LB培养基的50mL EP管中，37℃剧烈振摇过夜；(2)1％接种量接种于50mlGM(LB+0.5M山梨醇)，测量摇管内OD，控制好接种量，使接种完毕后培养基的OD在0.19～0.2之间，37℃，200rpm培养至OD600＝0.8～1.0(大约3～4小时)左右；(3)取全部菌液冰水浴10min，然后5000rpm，8min，4℃离心收集菌体；(4)用30ml预冷的电转缓冲液ETM(0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10％甘油，可以加入0.5M海藻糖提高效率)洗涤菌体，5000rpm，8min，4℃离心去上清，如此漂洗3次；(5)将洗涤后的菌体重悬于等500μl的ETM中，每管分装100μl；(6)将100μl感受态细胞中加入1～6μl质粒，冰浴孵育5min，加入预冷的电转杯(1mm)中，电击一次，电转仪设置：1.5～2.0kv，25μF，200Ω，1mm，电击1次(持续时间4.5ms～5ms之间)；(7)电击完毕立即加入0.5ml复苏培养基RM(LB+0.5M山梨醇+0.38甘露醇)，37℃，120rpm，复苏3h后，涂LBK固体平板，37℃，过夜培养。

转化子筛选，采用摇瓶培养进行筛选，分别将含有不同启动子表达载体的枯草芽孢杆菌RIK1285接入含有5mL枯草芽孢发酵培养基的50ml离心管，37℃，200rpm培养24小时后，按照5％的接种量接入含有50ml枯草芽孢发酵培养基的500ml摇瓶中。37℃，200rpm培养48小时后测定酶活。酶活测定方法参照国标GB/T 23527-2009碱性蛋白酶进行。

实验结果如表1所示，由表1可知，含有启动子P_cryIIIA的枯草芽孢杆菌酶活最高为1852U/mL，其次为启动子P_Bsapr和启动子P_Baamy，酶活分别为1455U/mL和1415U/mL。

表1不同启动子表达的酶活

实施例3

双启动子优化

根据实施列2的结果进行双启动子优化，由于启动子PcryIIIA酶活最高，以表达载体pHYP_cryIIIA-bcp作为模板构建双启动子表达载体，与其他四个启动子P_Bsapr、P_Baamy、P_Bsamy和P_HpaII进行配合。双启动子表达载体构建过程如下(以双启动子表达载体pHYP_{Bsapr-cryIIIA}-bcp为例)：(1)以表达载体pHYP_cryIIIA-bcp为模板，通过引物双-1-fw和双-1-rev，核苷酸序列如SEQ ID NO.22～SEQ ID NO.23所示，进行PCR扩增获得主框架1；(2)以表达载体pHYP_Bsapr-bcp为模板，通过引物P_Bsapr-fw和P_Bsapr-rev进行PCR扩增获得启动子P_Bsapr；(3)通过无缝克隆方法将启动子P_Bsapr和主框架1进行融合，获得双启动子表达载体pHYP_{Bsapr-cryIIIA}-bcp。

此部分所有引物序列下所示(5'-3')：

主框架1引物，双-fw的核苷酸序列(SEQ ID NO.22)：TCGAAACGTAAGATGAAACCT，双-rev的核苷酸序列(SEQ ID NO.23)：ACGCGTTCAGACCAGTTTTTAA。

P_Bsapr引物，P_Bsapr-fw的核苷酸序列(SEQ ID NO.24)：AAAAACTGGTCTGAACGCGTTATTTCTTCCTCCCTCTCAAT，P_Bsapr-rev的核苷酸序列(SEQ ID NO.25)：GGTTTCATCTTACGTTTCGATCTTTACCCTCTCCTTTTAAA。

P_Baamy引物，P_Baamy-fw的核苷酸序列(SEQ ID NO.26)：AAAAACTGGTCTGAACGCGTGCCCCGCACATACGAAAAGAC，P_Baamy-rev的核苷酸序列(SEQ ID NO.27)：GGTTTCATCTTACGTTTCGAGTTTCCTCTCCCTCTCATTTT。

P_Bsamy引物，P_Bsamy-fw的核苷酸序列(SEQ ID NO.28)：AAAAACTGGTCTGAACGCGTCCGAGAATGGACACCAAAGA，P_Bsamy-rev的核苷酸序列(SEQ ID NO.29)：GGTTTCATCTTACGTTTCGATCTTGACACTCCTTATTTGAT。

P_HpaII引物，P_HpaII-fw的核苷酸序列(SEQ ID NO.30)：AAAAACTGGTCTGAACGCGTGGGCGCGATTGCTGAATAAAAG，P_HpaII-rev的核苷酸序列(SEQ ID NO.31)：GGTTTCATCTTACGTTTCGAATGTAAATCGCTCCTTTTTA

分别将双启动子表达载体pHYP_{Bsapr-cryIIIA}-bcp、pHYP_{Baamy-cryIIIA}-bcp、pHYP_{Bsamy-cryIIIA}-bcp和pHYP_{HpaII-cryIIIA}-bcp转入枯草芽孢杆菌RIK1285，转化过程与重组转化子的筛选方法同实施列2相同，测定酶活。

实验结果可知，pHYP_{Bsapr-cryIIIA}-bcp，pHYP_{Baamy-cryIIIA}-bcp，pHYP_{Bsamy-cryIIIA}-bcp和pHYP_{HpaII-cryIIIA}-bcp对应重组工程菌的酶活分别为2210U/mL、1985U/mL、1850U/mL和2042U/mL。

表2不同启动子表达的酶活

实施例4

信号肽优化

信号肽选自包括：SP_Bsamy(枯草芽孢杆菌中温淀粉酶信号肽)、SP_Bsapr(枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶信号肽)、SP_Bsnpr(枯草芽孢杆菌中性蛋白酶信号肽)、SPBschi(枯草芽孢杆菌几丁质酶信号肽)、SP_DacB(枯草芽孢杆菌DacB信号肽)、SP_Vpr(枯草芽孢杆菌Vpr信号肽)、SP_YncM(枯草芽孢杆菌YncM信号肽)和SP_Ap(枯草芽孢杆菌氨肽酶信号肽)，核苷酸序列如SEQID NO.12～SEQ ID NO.19所示。

以双启动子最优载体pHYP_{Bsapr-cryIIIA}-bcp为模板构建不同信号肽表达载体，构建过程如下(以表达载体pHYP_{Bsapr-cryIIIA}-SP_Bschi-bcp为例)：(1)以表达载体pHYP_{Bsapr-cryIIIA}-bcp为模板，通过引物信-fw和信-rev扩增获得主框架2；(2)通过PCR方式将引物SP_Bschi-fw和SP_Bschi-rev合成信号肽SP_Bschi；(3)采用无缝克隆将SP_Bschi和主框架2进行连接获得表达载体pHYP_{Bsapr-cryIIIA}-SP_Bschi-bcp。

此部分所有引物序列下所示：

主框架2引物，信-fw的核苷酸序列(SEQ ID NO.32)：GCTGAGGAAGCAAATGAAAAAT，信-rev的核苷酸序列(SEQ ID NO.33)：CGGCCGCTTTTCATAATACATAA。

SP_Bsamy引物，SP_Bsamy-fw的核苷酸序列(SEQ ID NO.34)：TATTATGAAAAGCGGCCGATGTTTGCAAAACGATTCAAAACCTCTTTACTGCCGTTATTCGCTGGATTTTTAT，SP_Bsamy-rev的核苷酸序列(SEQID NO.35)：TTCATTTGCTTCCTCAGCAGCACTCGCAGCCGCCGGTCCTGCCAGAACCAAATGAAACAGCAATAAAAATCCA。

SP_Bsapr引物，SP_Bsapr-fw的核苷酸序列(SEQ ID NO.36)：TATTATGAAAAGCGGCCGGTGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCAGCTTGTTGTTTGCGTTAACGTTA，SP_Bsapr-rev的核苷酸序列(SEQ IDNO.37)：TTCATTTGCTTCCTCAGCAGCCTGCGCAGACATGTTGCTGAACGCCATCGTAAAGATTAACGTTAA。

SP_Bsnpr引物，SP_Bsnpr-fw的核苷酸序列(SEQ ID NO.38)：TATTATGAAAAGCGGCCGGTGGGTTTAGGTAAGAAATTGTCTGTTGCTGTCGCTGCTTCGTTT，SP_Bsnpr-rev的核苷酸序列(SEQ IDNO.39)：TTCATTTGCTTCCTCAGCAGCCTGAACACCTGGCAGGCTGATTGATAAACTCATAAACGAAGC。

SP_Bschi引物，SP_Bschi-fw的核苷酸序列(SEQ ID NO.40)：TATTATGAAAAGCGGCCGATGAAAAAAGTGTTTTCAAACAAAAAGTTTCTCGTTTTTTCTTTCATTTTTGCGA，SP_Bschi-rev的核苷酸序列(SEQID NO.41)：TTCATTTGCTTCCTCAGCGGCTTTTGCACTTTCCCCATTAAAAAAAGACAGACTTAAAATCATCGCAAAAATG。

SP_DacB引物，SP_DacB-fw的核苷酸序列(SEQ ID NO.42)：TATTATGAAAAGCGGCCGATGCGCATTTTCAAAAAAGCAGTATTCGTGATCATGATTTCTTTT，SP_DacB-rev的核苷酸序列(SEQ ID NO.43)：TTCATTTGCTTCCTCAGCAGCATGTGCTGTATTCACATTTACGGTTGCAATAAGAAAAGAAAT。

SP_Vpr引物，SP_Vpr-fw的核苷酸序列(SEQ ID NO.44)：TATTATGAAAAGCGGCCGATGAAAAAGGGGATCATTCGCTTTCTGCTTGTAAGTTTCGTCTTATTTTTT，SP_Vpr-rev的核苷酸序列(SEQ IDNO.45)：TTCATTTGCTTCCTCAGCAGCCGGAGCTGCCTGAACGCCCGTAATGCCTGTGGATAACGCAAAAAATAAG。

SP_YncM引物，SP_YncM-fw的核苷酸序列(SEQ ID NO.46)：TATTATGAAAAGCGGCCGATGGCGAAACCACTATCAAAAGGGGGAATTTTGGTGAAAAAAGTATTGATTGCAGGTGCAGTAGGAACAG，SP_YncM-rev的核苷酸序列(SEQ ID NO.47)：TTCATTTGCTTCCTCAGCAGCGTCTGCCGCGGGTAAACCTGGTATACCTGATGAAAGGGTTCCGAAAAGAACTGCTGTTCCTACTGCA。

SP_Ap引物，SP_Ap-fw的核苷酸序列(SEQ ID NO.48)：TATTATGAAAAGCGGCCGATGAAAAAGCTTTTGACTGTCATGACGATGGCTGTTTTAACTGCCGGCAC，SP_Ap-rev的核苷酸序列(SEQ ID NO.49)：TTCATTTGCTTCCTCAGCAGCGTGCGCGGCAGGGGTGACACTCTGTGCCGGCAAGAGCAGTGTGCCGGC。

分别将不同信号肽表达载体转入枯草芽孢杆菌RIK1285，转化过程与重组转化子的筛选方法同实施列2相同，测定酶活。

实验结果如表3所示，由表3可知，SP_Bschi(枯草芽孢杆菌几丁质酶信号肽)效果最好，其对应的重组工程菌发酵酶活最高，培养48小时酶活为2650U/mL，其次为SP_Bsamy和SP_Bsnpr多对应的重组工程菌，酶活分别为2452U/mL和2345U/mL。

表3不同信号肽表达的酶活

实施例5

基因整合表达

表达载体pHY能够作为基因整合载体进行整合表达，在pHY载体上存在枯草芽孢杆菌中温淀粉酶5’端和3’同源臂，此外其复制子是温敏复制子。将含有pHYP_{Bsapr-cryIIIA}-SP_Bschi-bcp重组枯草芽孢杆菌进行基因整合实验，整合实验过程大致如下：(1)在45℃下进行高温诱导，使表达载体pHYP_{Bsapr-cryIIIA}-SP_Bschi-bcp的复制子失活，从而促使表达载体pHYP_{Bsapr-cryIIIA}-SP_Bschi-bcp和枯草芽孢杆菌RIK1285进行同源重组；(2)提取同源重组单菌落接入含有400μl LB液体培养基的2ml灭菌离心管，37℃，200rpm培养4小时后，95℃处理菌液作为PCR扩增模板；(3)以热处理后的菌液为模板，用5端鉴定的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：50所示(5端鉴定-fw：5'-TTCAAAACCTCTTTACTGCCG)和5端鉴定的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：51所示(5端鉴定-rev：5'-GGTCTTTCACATCTTCTGGGC-3')进行5’端同源臂扩增，用3端鉴定的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：52所示(3端鉴定-fw：5'-GATGGCTACTCCTCATGTTGC-3')和用3端鉴定的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：53所示(引物3端鉴定-rev：5'-CGCCGTCTCTGGTCCATTATT-3')进行3’端同源臂扩增，确定同源臂单交换所发生的位置；(3)将确定好同源臂单交换所发生位置的转化子，进行无抗传代培养，连续传代10次进行点板实验，将在抗性板上不长，在无抗性板上长的转化子初步确定为基因整合成功；(4)提取初步确定基因整合成功的枯草芽孢杆菌的基因组，用引物5端鉴定-fw和引物3端鉴定-rev进行PCR扩增，对扩增产物进行测序，基因整合成功的枯草芽孢杆菌。最终获得5个基因整合成功的重组表达工程菌(分别命名为枯草芽孢杆菌Bs16-1、枯草芽孢杆菌Bs16-2、枯草芽孢杆菌Bs16-3、枯草芽孢杆菌Bs16-4和枯草芽孢杆菌Bs16-5)。

采用实施列2的培养方法对这5个重组转化子进行培养筛选，培养48小时后，5个重组表达工程菌所对应的酶活为分别为2510U/mL，2515U/mL、2351U/mL、2462U/mL和2615U/mL。由于Bs16-5发酵酶活最高，因此选择重组表达工程菌Bs16-5进行高密度发酵培养。

实施例6

高密度发酵

以重组表达工程菌种枯草芽孢杆菌Bs16-5进行高密度发酵实验，高密度发酵实验在7升和50升发酵罐进行，高密度发酵的培养基为：麦芽糖7％、豆粕2.5％、酵母粉1.5％、麸皮2％、磷酸氢二钾1％、柠檬酸三钠0.3％、氯化钙0.3％，培养温度为37℃，培养pH为6.0。培养过程中每隔一段时间取发酵液进行酶活测定。

实验结果，如图3所示，重组表达工程菌种枯草芽孢杆菌Bs16-5在7升发酵罐培养48小时后发酵酶活力达到最高为51807U/mL。如由图4所示，在50升发酵罐培养48小时后发酵酶活最高为53708U/mL。

实施例7

温度特性测定

将高密度发酵液离心，获得液体碱性蛋白酶BCP酶液，碱性蛋白酶BCP的温度特性测定如下：在pH10.0条件下测定碱性蛋白酶BCP在20℃～70℃不同温度下的酶活，以测定酶活最高温度下的酶活为100％，计算其他温度下的相对酶活；在50℃～70℃不同温度下水浴热处理10min后测定剩余酶活，以未热处理的酶活作为100％，计算其他温度下的相对剩余酶活。

实验结果，碱性蛋白酶BCP的温度特性如图5所示，碱性蛋白酶BCP在20℃和70℃的相对酶活分别为9.7％和31.6％，最适反应温度为60℃，热稳定性方面碱性蛋白酶，BCP在20℃～50℃不同温度下具有良好的稳定性，热处理10min后，剩余酶活均大于90％，当温度提升至50℃以上，BCP热稳定性急剧下降，60℃和70℃热处理10min后剩余酶活仅为21％和3％。

实施例8

pH特性测定

将高密度发酵液离心，获得液体碱性蛋白酶BCP酶液，碱性蛋白酶BCP的pH特性测定如下：在60℃条件下测定碱性蛋白酶BCP在pH6.0～11.0下的酶活，以测定酶活最高pH下的酶活为100％，计算其他pH下的相对酶活；在pH6.0～11.0条件下，室温保存5小时后测定剩余酶活，以未做任何处理的酶活作为100％，计算其他温度下的相对剩余酶活。

实验结果，碱性蛋白酶BCP的pH特性如图6所示，碱性蛋白酶BCP在pH7.0～11.0范围内相对酶活均大于70％，其最适反应pH为10.0；pH稳定性方面，在pH6.0～11.0条件下，室温保存5小时后剩余酶活均大于80％，表明在该pH范围内碱性蛋白酶BCP具有良好的稳定性。

本发明中所使用的方法如无特殊说明均为常规方法，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译。第3版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行。同时，本发明中的氨基酸无特别说明外均用其缩写或代号标明(氨基酸中英文名称及其缩写和代号见表4)。

表4氨基酸中英文名称及其缩写和代号

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 邵阳学院

<120> 碱性蛋白酶基因、杂合启动子、重组表达载体、重组表达工程菌、碱性蛋白酶及方法和应用

<160> 53

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1143

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaagaaac tgttgacgaa aattgtcgca agcgccgcac tactcctttc tgttgctttt 60

acttcatcga tcgtatcggc tgctgaggaa gcaaatgaaa aatatttaat tggccttaat 120

gagcaggaag ctgtcagtga gtttgtagaa tccatagagg caaatgacga ggtcgccatt 180

ctctctgagg atgagtcagt cgaaattgaa ttgcttcatg agtttgaaac gattcctgtt 240

gtatccgttg agttaagccc agaagatgtg aaagaccttg aaaaagatcc agcgatttct 300

tatactgaag aggatattga agtaacgata atggcgcaat cagtgccatg gggaattagc 360

cgtgtgcaag ccccagctgc ccataaccgt ggattgacag gttctggtga aaaagttgct 420

gtcctcgata caggtatttc cactcatcca gacttaaata ttcgtggtgg cgctagcttt 480

gtaccagggg caccatccac tcaagatggg aatgggcatg gcacgcatgt ggccgggacg 540

attgctgctt taaacaattc gattggcgtt cttggcgtag cgccgagtgc ggaactatac 600

gctgttaatg ttttaggagc cgacgggaga ggtgcaatca gctcgattgc ccatgggttg 660

gaatggacag ggaacaataa catgcacgtt gctaatttaa gtttaggaag cccttcgcca 720

agtgccacac ttgagcaagc tgttaatagc gcgacttcta gaggcgttct tgttgtagcg 780

gcatctggga attcaggtgc aagctcaatc agctatccgg cccgttatgc gaacgcaatg 840

gcagtcggag ctactgacca aaacaacaac cgcgccagct tttcacagta tggcgcaggg 900

cttgacattg tcgcaccagg ggtaggcgtg cagagctcat acccaggttc aacgtatgcc 960

agcttaaacg gtacatcgat ggctactcct catgttgcag gtgtcgcagc ccttgttaaa 1020

cacaagaacc catcttggtc caatacacaa atccgcaacc atctagagaa tacggcaacg 1080

agcttaggaa gcacgaactt gtatgtaagc ggacttgtca aagcagaagc ggcaacacgc 1140

taa 1143

<210> 2

<211> 380

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Lys Lys Leu Leu Thr Lys Ile Val Ala Ser Ala Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Val Ala Phe Thr Ser Ser Ile Val Ser Ala Ala Glu Glu Ala Asn

20 25 30

Glu Lys Tyr Leu Ile Gly Leu Asn Glu Gln Glu Ala Val Ser Glu Phe

35 40 45

Val Glu Ser Ile Glu Ala Asn Asp Glu Val Ala Ile Leu Ser Glu Asp

50 55 60

Glu Ser Val Glu Ile Glu Leu Leu His Glu Phe Glu Thr Ile Pro Val

65 70 75 80

Val Ser Val Glu Leu Ser Pro Glu Asp Val Lys Asp Leu Glu Lys Asp

85 90 95

Pro Ala Ile Ser Tyr Thr Glu Glu Asp Ile Glu Val Thr Ile Met Ala

100 105 110

Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala His

115 120 125

Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Glu Lys Val Ala Val Leu Asp Thr

130 135 140

Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser Phe

145 150 155 160

Val Pro Gly Ala Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His

165 170 175

Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly

180 185 190

Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Asn Val Leu Gly Ala Asp

195 200 205

Gly Arg Gly Ala Ile Ser Ser Ile Ala His Gly Leu Glu Trp Thr Gly

210 215 220

Asn Asn Asn Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser Pro

225 230 235 240

Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly Val

245 250 255

Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Ser Ser Ile Ser Tyr

260 265 270

Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln Asn

275 280 285

Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile Val

290 295 300

Ala Pro Gly Val Gly Val Gln Ser Ser Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr Ala

305 310 315 320

Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Val Ala

325 330 335

Ala Leu Val Lys His Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Thr Gln Ile Arg

340 345 350

Asn His Leu Glu Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu Tyr

355 360 365

Val Ser Gly Leu Val Lys Ala Glu Ala Ala Thr Arg

370 375 380

<210> 3

<211> 426

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgtcgacgtg catgcaggcc ggggcatatg ggaaacagcg cggacggagc ggaatttcca 60

atttcatgcc gcagccgcct gcgctgttct catttgcggc ttccttgtag agctcagcat 120

tattgagtgg atgattatat tccttttgat aggtggtatg ttttcgcttg aacttttaaa 180

tacagccatt gaacatacgg ttgatttaat aactgacaaa catcaccctc ttgctaaagc 240

ggccaaggac gctgccgccg gggctgtttg cgtttttacc gtgatttcgt gtatcattgg 300

tttacttatt tttttgccaa agctgtaatg gctgaaaatt cttacattta ttttacattt 360

ttagaaatgg gcgtgaaaaa aagcgcgcga ttatgtaaaa tataaagtga tagcggtacc 420

attata 426

<210> 4

<211> 510

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccgagaatgg acaccaaaga agaactgcaa aaacgggtga agcagcagcg aatagaatca 60

attgcggtcg cctttgcggt agtggtgctt acgatgtacg acagggggat tccccataca 120

ttcttcgctt ggctgaaaat gattcttctt tttatcgtct gcggcggcgt tctgtttctg 180

cttcggtatg taattgtgaa gctggcttac agaagagcgg taaaagaaga aataaaaaag 240

aaatcatctt gaaaaataga tggtttcttt ttttgtttgg aaagcgaggg aagcgttcac 300

agtttcgggc agcttttttt ataggaacat tgatttgtat tcactctgcc aagttgtttt 360

gatagagtga ttgtgataat ttaaaatgta agcgttaaca aaattctcca gtcttcacat 420

cagtttgaaa ggaggaagcg gaagaatgaa gtaagaggga tttttgactc cgaagtaagt 480

cttcaaaaaa tcaaataagg agtgtcaaga 510

<210> 5

<211> 249

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gccccgcaca tacgaaaaga ctggctgaaa acattgagcc tttgatgact gatgatttgg 60

ctgaagaagt ggatcgattg tttgagaaaa gaagaagacc ataaaaatac cttgtctgtc 120

atcagacagg gtatttttta tgctgtccag actgtccgct gtgtaaaaat aaggaataaa 180

ggggggttgt tattatttta ctgatatgta aaatataatt tgtataagaa aatgagaggg 240

agaggaaac 249

<210> 6

<211> 479

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gggcgcgatt gctgaataaa agatacgaga gacctctctt gtatcttttt tattttgagt 60

ggttttgtcc gttacactag aaaaccgaaa gacaataaaa attttattct tgctgagtct 120

ggctttcggt aagctagaca aaacggacaa aataaaaatt ggcaagggtt taaaggtgga 180

gattttttga gtgatcttct caaaaaatac tacctgtccc ttgctgattt ttaaacgagc 240

acgagagcaa aacccccctt tgctgaggtg gcagagggca ggtttttttg tttctttttt 300

ctcgtaaaaa aaagaaaggt cttaaaggtt ttatggtttt ggtcggcact gccgacagcc 360

tcgcagagca cacactttat gaatataaag tatagtgtgt tatactttac ttggaagtgg 420

ttgccggaaa gagcgaaaat gcctcacatt tgtgccacct aaaaaggagc gatttacat 479

<210> 7

<211> 371

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gatcaagacc gtacatataa gaatgtcgct tctcaaatcc aaggctggcg agaagtcgtt 60

ttgggctatc gagacacgtt tggctggaaa aaacttttcc agatagtgcc ggttgccgga 120

atggtttttg gcgccgctgc caatcgctca acattaaacg acattaccga gacaggcatg 180

atgctgtaca aaaagaggcg cattcttgaa cgactgaaag aaacagaacg agagatggaa 240

tagcagaaag cagacggaca ccgcgatccg cctgcttttt ttagtggaaa catacccaat 300

gtgttttgtt tgtttaaaag aattgtgagc gggaatacaa caaccaacac caattaaagg 360

aggaattcaa a 371

<210> 8

<211> 432

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tatttcttcc tccctctcaa taattttttc attctatccc ttttctgtaa agtttatttt 60

tcagaatact tttatcatca tgctttgaaa aaatatcacg ataatatcca ttgttctcac 120

ggaagcacac gcaggtcatt tgaacgaatt ttttcgacag gaatttgccg ggactcagga 180

gcatttaacc taaaaaagca tgacatttca gcataatgaa catttactca tgtctatttt 240

cgttcttttc tgtatgaaaa tagttatttc gagtctctac ggaaatagcg agagatgata 300

tacctaaata gagataaaat catctcaaaa aaatgggtct actaaaatat tattccatct 360

attacaataa attcacagaa tagtctttta agtaagtcta ctctgaattt ttttaaaagg 420

agagggtaaa ga 432

<210> 9

<211> 520

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gattgcacct ggtgaataag ttcaacagac actcccgcca gcagcacaat ccgcaatata 60

acacccgcca agaacattgt gcgctgccgg tttattttgg gatgatgcac caaaagatat 120

aagcccgcca gaacaacaat tgaccattga atcagcaggg tgctttgtct gcttaatata 180

aaataacgtt cgaaatgcaa tacataatga ctgaataact ccaacacgaa caacaatcct 240

ttacttctta ttaaggcctc attcggttag acagcggact tttcaaaaag tttcaagatg 300

aaacaaaaat atctcatctt ccccttgata tgtaaaaaac ataactcttg aatgaaccac 360

cacatgacac ttgactcatc ttgatattat tcaacaaaaa caaacacagg acaatactat 420

caattttgtc tagttatgtt agtttttgtt gagtattcca gaatgctagt ttaatataac 480

aatataaagt tttcagtatt ttcaaaaagg gggatttatt 520

<210> 10

<211> 406

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

acgcctttca catgagctga tttcatatct tacacccgtt tctgtatgcg atatattgca 60

tattttaata gatgatcgac taggccgcaa cctccttcgg caaaaaatga tctcataaaa 120

taaatgaata gtattttcat aaaatgaatc agacgaagca atctcctgtc attcacggac 180

cccgggacct ctttccctgc caggttgaag cggtctattc atactttcga accgaatatt 240

tttctaaaac agttattaat aaccaataaa tttaaattgg ccgttcaaaa aaatgggtct 300

accatataat tcattttttt tctataataa attaacagaa taattggaat agagtatatt 360

attcttctat ttcaattatt ctgaataaaa cggaggagag tgagta 406

<210> 11

<211> 858

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tatttcttcc tccctctcaa taattttttc attctatccc ttttctgtaa agtttatttt 60

tcagaatact tttatcatca tgctttgaaa aaatatcacg ataatatcca ttgttctcac 120

ggaagcacac gcaggtcatt tgaacgaatt ttttcgacag gaatttgccg ggactcagga 180

gcatttaacc taaaaaagca tgacatttca gcataatgaa catttactca tgtctatttt 240

cgttcttttc tgtatgaaaa tagttatttc gagtctctac ggaaatagcg agagatgata 300

tacctaaata gagataaaat catctcaaaa aaatgggtct actaaaatat tattccatct 360

attacaataa attcacagaa tagtctttta agtaagtcta ctctgaattt ttttaaaagg 420

agagggtaaa gatgtcgacg tgcatgcagg ccggggcata tgggaaacag cgcggacgga 480

gcggaatttc caatttcatg ccgcagccgc ctgcgctgtt ctcatttgcg gcttccttgt 540

agagctcagc attattgagt ggatgattat attccttttg ataggtggta tgttttcgct 600

tgaactttta aatacagcca ttgaacatac ggttgattta ataactgaca aacatcaccc 660

tcttgctaaa gcggccaagg acgctgccgc cggggctgtt tgcgttttta ccgtgatttc 720

gtgtatcatt ggtttactta tttttttgcc aaagctgtaa tggctgaaaa ttcttacatt 780

tattttacat ttttagaaat gggcgtgaaa aaaagcgcgc gattatgtaa aatataaagt 840

gatagcggta ccattata 858

<210> 12

<211> 99

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atgtttgcaa aacgattcaa aacctcttta ctgccgttat tcgctggatt tttattgctg 60

tttcatttgg ttctggcagg accggcggct gcgagtgct 99

<210> 13

<211> 87

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atgagaagca aaaaattgtg gatcagcttg ttgtttgcgt taacgttaat ctttacgatg 60

gcgttcagca acatgtctgc gcaggct 87

<210> 14

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atgggtttag gtaagaaatt gtctgttgct gtcgctgctt cgtttatgag tttatcaatc 60

agcctgccag gtgttcaggc t 81

<210> 15

<211> 99

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atgaaaaaag tgttttcaaa caaaaagttt ctcgtttttt ctttcatttt tgcgatgatt 60

ttaagtctgt ctttttttaa tggggaaagt gcaaaagcc 99

<210> 16

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

atgcgcattt tcaaaaaagc agtattcgtg atcatgattt cttttcttat tgcaaccgta 60

aatgtgaata cagcacatgc t 81

<210> 17

<211> 93

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

atgaaaaagg ggatcattcg ctttctgctt gtaagtttcg tcttattttt tgcgttatcc 60

acaggcatta cgggcgttca ggcagctccg gct 93

<210> 18

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

atggcgaaac cactatcaaa agggggaatt ttggtgaaaa aagtattgat tgcaggtgca 60

gtaggaacag cagttctttt cggaaccctt tcatcaggta taccaggttt acccgcggca 120

gacgct 126

<210> 19

<211> 93

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

atgaaaaagc ttttgactgt catgacgatg gctgttttaa ctgccggcac actgctcttg 60

ccggcacaga gtgtcacccc tgccgcgcac gct 93

<210> 20

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tcacggccga tgaagaaact gttgacgaaa 30

<210> 21

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

acgtctagag cgtgttgccg cttctgc 27

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tcgaaacgta agatgaaacc t 21

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

acgcgttcag accagttttt a 21

<210> 24

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

aaaaactggt ctgaacgcgt tatttcttcc tccctctcaa t 41

<210> 25

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ggtttcatct tacgtttcga tctttaccct ctccttttaa a 41

<210> 26

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

aaaaactggt ctgaacgcgt gccccgcaca tacgaaaaga c 41

<210> 27

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ggtttcatct tacgtttcga gtttcctctc cctctcattt t 41

<210> 28

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

aaaaactggt ctgaacgcgt ccgagaatgg acaccaaaga 40

<210> 29

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

ggtttcatct tacgtttcga tcttgacact ccttatttga t 41

<210> 30

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

aaaaactggt ctgaacgcgt gggcgcgatt gctgaataaa ag 42

<210> 31

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

ggtttcatct tacgtttcga atgtaaatcg ctccttttta 40

<210> 32

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

gctgaggaag caaatgaaaa at 22

<210> 33

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

cggccgcttt tcataataca taa 23

<210> 34

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

tattatgaaa agcggccgat gtttgcaaaa cgattcaaaa cctctttact gccgttattc 60

gctggatttt tat 73

<210> 35

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

ttcatttgct tcctcagcag cactcgcagc cgccggtcct gccagaacca aatgaaacag 60

caataaaaat cca 73

<210> 36

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

tattatgaaa agcggccggt gagaagcaaa aaattgtgga tcagcttgtt gtttgcgtta 60

acgtta 66

<210> 37

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

ttcatttgct tcctcagcag cctgcgcaga catgttgctg aacgccatcg taaagattaa 60

cgttaa 66

<210> 38

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

tattatgaaa agcggccggt gggtttaggt aagaaattgt ctgttgctgt cgctgcttcg 60

ttt 63

<210> 39

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

ttcatttgct tcctcagcag cctgaacacc tggcaggctg attgataaac tcataaacga 60

agc 63

<210> 40

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

tattatgaaa agcggccgat gaaaaaagtg ttttcaaaca aaaagtttct cgttttttct 60

ttcatttttg cga 73

<210> 41

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

ttcatttgct tcctcagcgg cttttgcact ttccccatta aaaaaagaca gacttaaaat 60

catcgcaaaa atg 73

<210> 42

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

tattatgaaa agcggccgat gcgcattttc aaaaaagcag tattcgtgat catgatttct 60

ttt 63

<210> 43

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

ttcatttgct tcctcagcag catgtgctgt attcacattt acggttgcaa taagaaaaga 60

aat 63

<210> 44

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

tattatgaaa agcggccgat gaaaaagggg atcattcgct ttctgcttgt aagtttcgtc 60

ttatttttt 69

<210> 45

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

ttcatttgct tcctcagcag ccggagctgc ctgaacgccc gtaatgcctg tggataacgc 60

aaaaaataag 70

<210> 46

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

tattatgaaa agcggccgat ggcgaaacca ctatcaaaag ggggaatttt ggtgaaaaaa 60

gtattgattg caggtgcagt aggaacag 88

<210> 47

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

ttcatttgct tcctcagcag cgtctgccgc gggtaaacct ggtatacctg atgaaagggt 60

tccgaaaaga actgctgttc ctactgca 88

<210> 48

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

tattatgaaa agcggccgat gaaaaagctt ttgactgtca tgacgatggc tgttttaact 60

gccggcac 68

<210> 49

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

ttcatttgct tcctcagcag cgtgcgcggc aggggtgaca ctctgtgccg gcaagagcag 60

tgtgccggc 69

<210> 50

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

ttcaaaacct ctttactgcc g 21

<210> 51

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

ggtctttcac atcttctggg c 21

<210> 52

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

gatggctact cctcatgttg c 21

<210> 53

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

cgccgtctct ggtccattat t 21

Claims

1.一种碱性蛋白酶基因bcp，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种碱性蛋白酶BCP，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种用于在枯草芽孢杆菌中高效表达碱性蛋白酶的杂合启动子，其特征在于，所述杂合启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

4.一种重组表达载体，其特征在于，包括权利要求1所述的碱性蛋白酶基因bcp、权利要求3所述的杂合启动子和信号肽，所述信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。

5.一种重组表达工程菌，其特征在于，包括权利要求4所述的重组表达载体。

6.一种根据权利要求2所述的碱性蛋白酶BCP的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

提供碱性蛋白酶基因bcp、表达载体和表达菌株；

对所述重组表达工程菌进行培养，获得碱性蛋白酶BCP；

其中，所述碱性蛋白酶基因bcp的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

7.根据权利要求6所述的碱性蛋白酶BCP的制备方法，其特征在于，

所述表达载体包括载体pHY、杂合启动子和信号肽；和/或

所述表达菌株为枯草芽孢杆菌RIK1285。

8.根据权利要求6所述的碱性蛋白酶BCP的制备方法，其特征在于，

所述重组表达载体基因整合到枯草芽孢杆菌RIK1285的中温淀粉酶基因位点。

9.根据权利要求6所述的碱性蛋白酶BCP的制备方法，其特征在于，

所述碱性蛋白酶基因bcp进行扩增的过程中，用于扩增的引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQID NO:21所示。

10.一种根据权利要求2所述的碱性蛋白酶BCP在水解蛋白质中的应用，其特征在于，

碱性蛋白酶BCP的反应温度为20℃～70℃；

碱性蛋白酶BCP的反应pH值为7～11。