CN113683710B

CN113683710B - 一种易于定向偶联的nkg2d受体蛋白及其免疫吸附剂

Info

Publication number: CN113683710B
Application number: CN202111094063.4A
Authority: CN
Inventors: 张海珍; 杨睿祯; 李家萍; 杨正根; 陈宇; 陈思锐; 陈校园
Original assignee: Guangzhou Kangsheng Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Kangsheng Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-09-17
Filing date: 2021-09-17
Publication date: 2023-09-12
Anticipated expiration: 2041-09-17
Also published as: CN113683710A

Abstract

本发明公开了一种易于定向偶联的NKG2D受体蛋白及其免疫吸附剂。NKG2D受体蛋白的结构为Km‑Fc‑NKG2D或Km‑NKG2D‑his。本发明以NKG2D受体蛋白为配基合成了免疫吸附剂，用免疫吸附的方式***相关的疾病。免疫吸附能够在短时间内大幅度地降低可溶性MIC分子及ULBP分子的含量，清除效率可达到70%‑97%，且免疫吸附是通过物理方式去除血液（浆）中过高的致病成分，对机体正常成分干扰较小，合成的吸附剂具有广谱性；通过控制多孔载体上的孔径尺寸，有效地吸附以外泌体形式存在的NKG2D配体形式。通过对载体的筛选，选择Sephacryl S‑1000 SF葡聚糖载体，其孔径较大，分离范围5*10⁵‑1*10⁸D，可以分离分子量小于300‑400nm的小颗粒分子，可以更有效地吸附以外泌体形式存在的MIC分子，如MICA*008配体分子。

Description

一种易于定向偶联的NKG2D受体蛋白及其免疫吸附剂

技术领域

本发明属于血液净化领域，主要涉及清除血液中游离NKG2D配体的免疫吸附剂，具体涉及一种易于定向偶联的NKG2D受体蛋白及其免疫吸附剂。

背景技术

NKG2D是NK(natural killer)细胞活化性受体。NKG2D表达于几乎所有的NK细胞及CD8⁺T细胞，也表达于自然杀伤T细胞(natural killer T cell，NKT)、αβT细胞、γδT细胞、CD4⁺T细胞的一部分亚群。NKG2D是目前为止在体内发现的唯一可以与MICA/B识别的受体，通过使效应细胞活化引起靶细胞分解(李锋,MICA/B分子与疾病的相关性及其临床应用的研究进展,2016)。NKG2D配体包括6个巨细胞病毒糖蛋白UL16(ULBP 1-6)结合蛋白及MICA/B及视黄酸早期转录家族(RAET1E,RAET1G,and RAET1L)。NKG2D在识别不同配体时使用一种诱导-适应机制(induced-fit-mechanism)，可以容忍配体的高度变异性。NKG2D具有一弹性结合“口袋”，使其具备结合多种配体的能力。从功能上看，这确保了NKG2D能够识别所有应激或变异条件下靶细胞上表达的不同配体，从而不放过任何危险因素的刺激。因NKG2D与其配体属于中等结合力，NKG2D必须形成聚体才能更好地结合配体，所以目前已发表专利都对NKG2D做了修饰，以增强其活性。CN108367071A提供了一种NKG2D1-NKG2D2-Fc嵌合体，用于癌症的免疫疗法，能够提高ADCC作用。该专利指出，相比于现有技术单体NKG2D-Fc嵌合体，二聚NKG2D-Fc嵌合体展现高达100倍提高的结合亲合力。WO2017083545A1通过C4b多聚化结构域构建了由2-10个NKG2D胞外区构建的多聚体用于***或研发疫苗。AU2003296553A1利用应激诱导的内源性危险信号HSP70和MICA/B能够协同激活NK细胞对抗肿瘤的特性，开发相应的药物组合预防和治疗转移性肿瘤。CN110636851A设计了NKG2D胞外区-DAP10-CD3ζ嵌合受体蛋白，开发治疗或预防哺乳动物中的癌症或传染病的药物。

MICA分子可分为膜型MICA和可溶性MICA(soluble MICA,sMICA)两种。膜型的MICA/B高度多态性，MICA有超过100种多态性，而MICB也超过33种可识别等位基因(http:// hla.alleles.org/alleles/text_index.html)。其中MICA*008位点在人群中占比是最高的，占比10.1％-34.0％；MICA*002在人群中占比为12.0％-21.7％。另外，MICA*010、MICA*019占比也是比较高的。MICB各等位基因分布中，MICB*005位点在人群中出现的频率最高，在人群中占比最高达57.4％。分泌型的sMICA来源主要是两个，一是膜型的MICA被金属蛋白酶酶切后脱落；二是MICA*5.1基因上调表达外泌体分泌(VALLIAN S,RAD M J,etal.,Correlation of major histocompatibility complex class I related A(MICA)polymorphism with the risk of developing breast cancer,2012)。细胞膜上的酶切反应是NKG2DL产生的主要机制，如sMICA、sMICB、sULBP2的产生；sULBP3是通过外泌体的形式分泌，恶性间皮瘤的胸腔积液分离的外泌体表面有表达TGFB和NKG2DL(MICA/B,ULBPs1-3)，导致免疫细胞的NKG2D受体下调。另有研究者培养了Hela细胞，发现MICA*008主要以全长的外泌体的形式存在。虽然在CHO细胞中MICA*019和MICA*008都可以下调NKG2D的表达并降低其细胞毒性，但是以外泌体形式存在的MICA*008影响更大(ASHIRU O B P,FERN NDEZ-MESSINA L，Natural killer cell cytotoxicity is suppressed by exposure to thehuman NKG2D ligand MICA*008that is shed by tumor cells in exosomes,2010)。基因表型方面，MICA*010与MICA*A5紧密连锁，MICA*008与MICA*A5.1紧密连锁。编码MICA分子的跨膜蛋白区域的5外显子等位基因MICA*A5.1在5个GCT中***了一个G，导致移码突变，使蛋白质提前终止，形成缺乏包膜内的截断型MICA分子。在目前发现的所有MICA等位基因中，仅MICA*008，MICA*023，MICA*028，MICA*054与MICA*A5.1紧密连锁(李沛,MICA、MICB基因多态性与急性髓细胞白血病M2型相关性研究,2015)。综上所述，人群中可溶性的sMIC蛋白中占比最高的依然是sMICA*008、sMICA*002及sMICB*005。其中sMICA*008以外泌体的形式存在，sMICA*002及sMICB*005被酶切后可溶性存在于血液中。sMICA主要作用是降低了CD8⁺T细胞和NK细胞的NKG2D的表达，从而抑制杀伤活性(Veronika Groh，Tumour-derived solubleMIC ligands impair expression of NKG2D and T-cell activation,2002)。因此，将血液中的sMICA清除后，能够提高NKG2D的靶向杀伤作用，增强对肿瘤的治疗效果。

免疫吸附(immunoadsorption，IA)疗法是近15年发展而来的一种血液净化技术，是将高度特异性的抗原、抗体或有特定物理化学亲和力的物质(配体)与吸附材料(载体)结合制成吸附剂(柱)，选择性或特异地清除血液中的致病因子，从而达到净化血液，缓解病情的目的。近年来，免疫吸附技术如蛋白A免疫吸附、IgE免疫吸附技术在自身免疫性疾病的治疗方面取得了良好的疗效。CN102988959A提供了通过调节NKG2D减弱自身反应性T细胞或NK细胞的扩增，治疗和预防自身免疫性疾病。将NKG2D固定于固相载体上制成免疫吸附剂，通过血液净化的方式能够高效地去除可溶性的NKG2D配体分子，包括MICA、MICB、ULBP分子等，达到通过免疫吸附***的目的。

NKG2D受体蛋白一般通过共价偶联的方式偶联于固相载体，主要利用NKG2D受体蛋白的N或S原子进行，偶联效率较低，导致受体蛋白易于脱落。同时，这种偶联方式难以控制偶联的方向，偶联方向不当对NKG2D受体蛋白也有一定的影响。开发一种更佳的NKG2D免疫吸附剂制备方法，对于提高NKG2D免疫吸附剂的性能具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种易于定向偶联的NKG2D受体蛋白及其免疫吸附剂。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供：

一种易于定向偶联的NKG2D受体蛋白，结构为Km-Fc-NKG2D或Km-NKG2D-his，其中：m＝3～5的整数(例如3、4或5)。

在一些NKG2D受体蛋白的实例中，所述Fc-NKG2D的氨基酸序列如SEQ ID NO.：1所示；所述NKG2D-his中的NKG2D氨基酸序列如SEQ ID NO.：3所示。

在一些NKG2D受体蛋白的实例中，所述Fc-NKG2D的核苷酸序列如SEQ ID NO.：2所示；所述NKG2D-his的核苷酸序列如SEQ ID NO.：4所示。

本发明的第二个方面，提供：

一种表达载体，其可以表达本发明第一个方面所述的NKG2D受体蛋白。

在一些表达载体的实例中，其宿主细胞为真核细胞或昆虫细胞。

在一些表达载体的实例中，其宿主细胞为CHO细胞或293ft细胞。

本发明的第三个方面，提供：

一种NKG2D免疫吸附剂，由本发明第一个方面所述的NKG2D受体蛋白通过氨基与固相载体共价偶联得到。

固相载体可以是本领域常用的固相载体，无特殊要求。在一些NKG2D免疫吸附剂的实例中，所述固相载体选自壳聚糖、琼脂糖、纤维素、葡聚糖、树脂中的至少一种。

在一些NKG2D免疫吸附剂的实例中，所述固相载体微球的孔径范围为100-1200nm(例如200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1000nm、1100nm等)，对球蛋白分离范围为10⁵-10⁸Da(例如10⁶Da级、10⁷Da级等)。这样可以更有针对性地去除目的蛋白。

在一些NKG2D免疫吸附剂的实例中，所述固相载体微球的孔径范围200-800nm，对球蛋白分离范围为10⁷-10⁸Da。

在一些NKG2D免疫吸附剂的实例中，所述固相载体为Sephacryl S-1000SF葡聚糖。

在一些NKG2D免疫吸附剂的实例中，共价偶联的方法为环氧氯丙烷法或甘油醚法。

在一些NKG2D免疫吸附剂的实例中，NKG2D免疫吸附剂合成包括如下操作：

S1)取固相载体填料，加入3倍体积的0.01M NaOH，按照载体：环氧氯丙烷体积比为1:(0.3～0.9)加入环氧氯丙烷溶液，35～42℃，100～150rpm，反应1～4h后清洗填料，抽干；

S2)往步骤S1)抽干后的填料中加入等体积的PBS溶液，按照载体：乙二胺溶液体积比为1:(0.3～0.9)加入乙二胺溶液，35～42℃，100～150rpm，反应1～5h后清洗填料，抽干；

S3)往步骤S2)抽干后的填料中加入等体积的PBS溶液，按照体积比1:(1～2)加入戊二醛溶液，35～42℃，100～150rpm，反应1～5h后用反渗水清洗填料，抽滤；

S4)往步骤S3)抽滤后的填料中，加入所述Fc-NKG2D蛋白或NKG2D-his蛋白溶液，缓冲液为与填料等体积的碳酸盐缓冲液，pH8.3，25～35℃，100～150rpm，反应1～5h后清洗填料，抽干，得到NKG2D免疫吸附剂。

在一些NKG2D免疫吸附剂的实例中，所述免疫吸附剂通过孔吸附的方式吸附以外泌体形式存在的MIC分子。

在一些NKG2D免疫吸附剂的实例中，所述以外泌体形式存在的MIC分子为MICA*008。

在一些NKG2D免疫吸附剂的实例中，所述免疫吸附剂可吸附血液中游离的可溶性NKG2D配体分子。

在一些实NKG2D免疫吸附剂的例中，所述可溶性NKG2D配体分子包括MICA*002、MICA*004、MICA*007、MICA*009、MICA*010、MICA*012、MICA*019、MICA*027、MICA*045、MICB*002、MICB*003、MICB*004、MICB*005、MICB*008、MICB*014、MICB*024和MICB*026分子中的至少一种。

本发明的第四个方面，提供：

本发明第三个方面所述的NKG2D免疫吸附剂在制备血液净化剂中的应用。

在一些应用的实例中，所述血液净化剂包括吸附人血液或血浆中的NKG2D配体的血液净化剂。

在一些应用的实例中，所述NKG2D配体包括可溶性的MICA、MICB分子、ULBP分子及MICA/B与抗MIC单抗药物组成的免疫复合物；从而解除NKG2D配体分子异常升高引起的肿瘤免疫抑制作用。

在一些应用的实例中，所述NKG2D免疫吸附剂通过孔吸附的方式吸附以外泌体形式存在的MIC分子。

在一些应用的实例中，所述以外泌体形式存在的MIC分子为MICA*008。

在一些应用的实例中，所述NKG2D免疫吸附剂吸附血液中游离的可溶性NKG2D配体分子。

在一些应用的实例中，所述可溶性NKG2D配体分子包括MICA*002、MICA*004、MICA*007、MICA*009、MICA*010、MICA*012、MICA*019、MICA*027、MICA*045、MICB*002、MICB*003、MICB*004、MICB*005、MICB*008、MICB*014、MICB*024和MICB*026分子中的至少一种。

本发明的第五个方面，提供：

一种包含本发明第三个方面所述NKG2D免疫吸附剂的吸附柱。

本发明的第六个方面，提供：

一种包含本发明第五个方面所述吸附柱的血液吸附装置。

本发明的有益效果是：

一方面，本发明以NKG2D受体蛋白为配基合成了免疫吸附剂，用免疫吸附的方式***相关的疾病。免疫吸附能够在短时间内大幅度地降低可溶性MIC分子及ULBP分子的含量，清除效率可达到70％-97％，且免疫吸附是通过物理方式去除血液(浆)中过高的致病成分，对机体正常成分干扰较小。理论上NKG2D能够结合所有的MIC分子及ULBP分子，合成的吸附剂具有广谱性。

另一方面，合成吸附剂时，通过控制多孔载体上的孔径尺寸，有效地吸附以外泌体形式存在的NKG2D配体形式。通过对载体的筛选，选择Sephacryl S-1000SF葡聚糖载体，其孔径较大，分离范围5*10⁵-1*10⁸，可以分离分子量小于300-400nm的小颗粒分子。用其作为载体，可以更有效地吸附以外泌体形式存在的MIC分子，如MICA*008配体分子。

同时通过序列设计，在N端引入赖氨酸，赖氨酸含有2个以上的氨基酸，且为伯胺，更容易反应，赖氨酸结构比精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺更简单，添加后对目的蛋白的活性影响是最小的。通过引入赖氨酸使受体蛋白Fc-NKG2D的Fc端偶联至琼脂糖载体上，最大限度地将NKG2D活性部位暴露在外部，从而使合成的吸附剂对MIC蛋白的吸附性能得到提高。

本发明一些实例的NKG2D受体蛋白，因为末端具有特定种类、数量的氨基酸序列，更易于固相载体发生偶联反应，与未联接有该氨基酸序列相比，可以更好地实现NKG2D受体蛋白定向偶联，从而将NKG2D与MICA结合位点暴露在外侧，因此偶联得到的NKG2D免疫吸附剂可以更好地吸附血液中游离的可溶性NKG2D配体分子，如MICA*002、MICA*004、MICA*007、MICA*009、MICA*010、MICA*012、MICA*019、MICA*027、MICA*045、MICB*002、MICB*003、MICB*004、MICB*005、MICB*008、MICB*014、MICB*024、MICB*026分子。

本发明一些实例的NKG2D受体蛋白，通过在N端引入3～5个赖氨酸，可以使更多受体蛋白Fc-NKG2D的Fc端偶联至固相载体上，最大限度将NKG2D活性部位暴露在外部，从而使合成的吸附剂对MIC蛋白的吸附性能得到提高。

本发明一些实例的NKG2D免疫吸附剂，通过控制多孔载体上的孔径尺寸，有效地吸附以外泌体形式存在的NKG2D配体形式。

本发明一些实例的NKG2D免疫吸附剂，使用Sephacryl S-1000SF葡聚糖作为固相载体，其孔径较大，分离范围5*10⁵～1*10⁸，可以分离300～400nm的小颗粒分子，可以更有效地吸附MICA*008配体分子。

附图说明

图1是Fc-NKG2D蛋白及NKG2D-his蛋白WB鉴定图；M：Marker(KD)：由上到下依次为180、130、100、70、55、40、35、25、15、10；泳道1：FC-NKG2D蛋白；泳道2：NKG2D-his蛋白；

图2是Fc-NKG2D蛋白及NKG2D-his蛋白对各种MICA的吸附率；

图3是Fc-NKG2D蛋白及NKG2D-his蛋白对各种MICB的吸附率。

具体实施方式

发明人在先的研究表明NKG2D的胞外区可能会不稳定，所以本发明中研究了单独的胞外区(NKG2D-his)及添加Fc端增加稳定性(Fc-NKG2D)两种形式的受体蛋白表达及偶联合成吸附剂的性能。将配基固定至载体时，如果Fc-NKG2D分子的Fc端暴露在外侧，因空间位阻的作用，受体蛋白NKG2D连接至载体就会导致无法有效地结合配体，对MICA蛋白的吸附性能就会下降。本发明中尝试通过基因序列的设计，在Fc-NKG2D序列N端或NKG2D-his序列N端加入3-5个赖氨酸，出人意料地可以促进Fc-NKG2D蛋白在固相载体的定向偶联，同时偶联效率显著提升。

部分sMICA分子以外泌体形式存在，直径50-200nm，本发明一些实例通过严格筛选固相载体的孔径，将孔径控制在100-1200nm，优选为200～800nm，可以高效地去除这一部分外泌体。

下面结合实例，进一步说明本发明的技术方案。

实施例1 NKG2D载体构建及瞬时转染

选择pcDNA3.1为真核细胞表达载体，K5-Fc-NKG2D蛋白的氨基酸序列见SEQ IDNO.：1，DNA序列见SEQ ID NO.：2，设计EcoRI及XbaI 2个酶切位点，N端加入5个赖氨酸，记为K₅-Fc-NKG2D。然后通过引物设计，以K₅-Fc-NKG2D为模板合成K3-Fc-NKG2D及K1-Fc-NKG2D的基因序列。

NKG2D-his蛋白的氨基酸序列见SEQ ID NO.：3，DNA序列见SEQ ID NO.：4，设计EcoRI及XbaI 2个酶切位点，C端带6个his标签，K₅-NKG2D-his蛋白即NKG2D-his蛋白的N端偶联5个连续的赖氨酸。委外进行全基因合成，然后用Lipofectamine 2000作转染试剂，DNA用量为200ng/well，转染时用Opti-MEM培养基配制转染复合物和孵育细胞，转染30h后离心，收集细胞培养上清。

实施例2 蛋白的纯化及WB鉴定

Fc-NKG2D蛋白的纯化：取1mL的protein A亲和层析填料，用PBS平衡5倍柱体积，将收集的细胞培养液过滤后上样至吸附柱，再用PBS平衡5倍柱体积，最后用pH＝2.8，100mM甘氨酸-HCl缓冲液进行洗脱，用pH＝8.8的Tris-HCl缓冲液进行中和。

NKG2D-his蛋白的纯化：取1mL的镍亲和层析填料，用PBS平衡5倍柱体积，将收集的细胞培养液过滤后上样至吸附柱，再用PBS(含20mM咪唑)平衡5倍柱体积，最后用含有300mM咪唑的PBS溶液洗脱收集蛋白。

蛋白的鉴定：用12％分离胶电泳，转膜后用1％BSA封闭，然后加入抗NKG2D一抗(abcam)，加入羊抗鼠二抗，用DAB显色液显色。见图1。Fc-NKG2D分子量约55KD；NKG2D-His分子量约35KD。

Fc-NKG2D、K₁-Fc-NKG2D、K₃-Fc-NKG2D、K6-Fc-NKG2D、K7-Fc-NKG2D及NKG2D-his、K1-NKG2D-his、K3-NKG2D-his、K5-NKG2D-his、K7-NKG2D-his蛋白参照实施例1和2的方法制备得到。

实施例3 不同的载体及不同的蛋白设计对免疫吸附填料的性能影响

NKG2D免疫吸附剂的制备：

1)按照实施例1和2表达纯化收集蛋白；

2)取5mL的Sephacryl S-1000SF微球和Sepharose 6FF微球，加入15mL 0.01M的氢氧化钠，加入3.0mL的环氧氯丙烷溶液，38℃，120rpm，反应2h后清洗填料，抽干；

3)然后加入5mL的PBS溶液，加入3.0mL的乙二胺溶液，38℃，120rpm，反应3h后清洗填料，抽干；

4)再加入5mL的PBS溶液，加入7.5mL的戊二醛溶液，38℃，120rpm，反应3h后清洗填料，抽干；

5)按照投料量15mg/ml加入K₅-Fc-NKG2D、K₃-Fc-NKG2D、K₁-Fc-NKG2D蛋白溶液，缓冲液为pH＝8.3的碳酸缓冲液，30℃，120rpm，反应3h后清洗填料，抽干，得到NKG2D免疫吸附剂；

6)最后用20％乙醇保存。

MIC蛋白吸附实验

用10mL EP管分别装入0.5mL的上述合成填料及2mL浓度为45μg/mL的重组MICA蛋白溶液或2mL浓度为25μg/mL的MICB蛋白溶液(自制)，置于脱色摇床上，室温，100rpm接触1～2h后，将填料置于一次性亲和层析柱中，抽干填料。

分别用微量BCA的方法检测吸附前后上清液中MICA、MICB含量，计算清除率。以未加蛋白的固相载体作为空白对照。实验结果如表1所示。

表1 不同的固相载体对MICA*008的清除率比较

固相载体类型	配基	对MICA*008清除率(％)
			Sepharose 6FF	Fc-NKG2D	50.5
Sephacryl S-1000SF	Fc-NKG2D	65.7
			Sepharose 6FF	NKG2D-his	49.5
Sephacryl S-1000SF	NKG2D-his	66.0

因所有的MICA种类中，对MICA*008的吸附作用是最关键的。由上表可以看出，Sephacryl S-1000SF因为孔径较大，所以对MICA*008的吸附效果明显高于Sepharose 6FF。所以初步选择Sephacryl S-1000SF作为合成免疫吸附剂的载体。

表2 赖氨酸长度对吸附性能的影响

MICA*002和MICB*005也是所有MIC蛋白中含量最高的亚型之一。由上表可以看出，当在N端加入赖氨酸时，随着赖氨酸长度的增加，合成的吸附剂填料对MICA*002和MICB*005的吸附性能都大大增加。当氨基酸个数增加至5-7个时，清除率不再有增加，呈稳定状态。考虑到对蛋白质结构的影响及信号肽酶切的影响，最终选择5个赖氨酸，即K5-Fc-NKG2D或K5-NKG2D-his结构。

与Fc-NKG2D作为配基相比，N端偶联有5个赖氨酸的Fc-NKG2D吸附活性大大增加，对MICA*002的吸附性能提高了27.4％，对MICB*005的吸附性能提高了28.2％；与NKG2D-his作为配基相比，N端偶联有5个赖氨酸的NKG2D-his吸附活性也有一定的增加，对MICA*002的吸附性能提高了15.8％，对MICB*005的吸附性能提高了10.6％。总之，N端偶联有赖氨酸可以提高Fc-NKG2D偶联在固相载体中的方向，易于实现定向偶联。

实施例4：合成吸附剂对各MIC蛋白的吸附性能测定

按照实施例1和2表达纯化K₅-Fc-NKG2D及K₅-NKG2D-his蛋白。用Sephacryl S-1000SF微球按照实施3合成填料并测定吸附性能。结果见图2和图3。Fc-NKG2D吸附剂对多种MICA蛋白的清除率范围是70％-97％，NKG2D-his对多种MICA蛋白的清除率范围是59％-73％。Fc-NKG2D对几种MICB蛋白的清除率均在70％-86％。NKG2D-his对几种MICB蛋白的清除率约60％-73％。Fc-NKG2D的吸附效果明显高于NKG2D-his，可能是带Fc更接近其天然构象，活性更高。

Fc-NKG2D氨基酸序列

上述氨基酸序列中，下划线标记部分为信号肽，粗体为K5序列，斜体标记部分为Fc序列，后面为linker序列(斜体+加粗标记)，最后一部分是NKG2D序列。

Fc-NKG2D基因序列

上述核苷酸序列中，斜体加粗标记部分为酶切位点，下划线虚线标记部分为信号肽序列及赖氨酸序列，下划线实线标记部分为Fc片段的基因序列，后面加粗部分为linker序列，最后一部分小写字母部分为NKG2D基因序列及终止子。

NKG2D-his氨基酸序列

IWSAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSK EDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV-HHHHHH(SEQ ID NO.：3)

上述氨基酸序列中，下划线虚线标记部分为信号肽及K5序列，下划线实线标记部分为NKG2D序列，末尾是his标签序列。

NKG2D-his基因序列

上述核苷酸序列中，斜体加粗标记部分为酶切位点，下划线虚线标记部分为信号肽序列及K5序列，下划线实线标记部分为NKG2D序列，后面为his标签序列及终止子。

以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。

<110> 广州康盛生物科技股份有限公司

<120> 一种易于定向偶联的NKG2D受体蛋白及其免疫吸附剂

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 401

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Lys Lys Lys Lys Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

20 25 30

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

35 40 45

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

50 55 60

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

65 70 75 80

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

85 90 95

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

100 105 110

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

115 120 125

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

130 135 140

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

145 150 155 160

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

165 170 175

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

180 185 190

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

195 200 205

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

210 215 220

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

225 230 235 240

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

245 250 255

Ser Ile Trp Ser Ala Val Phe Leu Asn Ser Leu Phe Asn Gln Glu Val

260 265 270

Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp

275 280 285

Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn

290 295 300

Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu

305 310 315 320

Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser

325 330 335

Tyr His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln

340 345 350

Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu

355 360 365

Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr

370 375 380

Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr

385 390 395 400

Val

<210> 2

<211> 1218

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gaattcatgg agacagacac actcctgcta tgggtactgc tgctctgggt tccaggttcc 60

actggcaaaa aaaaaaaaaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 120

gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 180

acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 240

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 300

tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 360

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 420

atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 480

gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 540

gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 600

cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 660

aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 720

tacacgcaga agagcctctc cctgtctccc ggcggcggcg gcagcggcgg cggcagcata 780

tggagtgctg tattcctaaa ctcattattc aaccaagaag ttcaaattcc cttgaccgaa 840

agttactgtg gcccatgtcc taaaaactgg atatgttaca aaaataactg ctaccaattt 900

tttgatgaga gtaaaaactg gtatgagagc caggcttctt gtatgtctca aaatgccagc 960

cttctgaaag tatacagcaa agaggaccag gatttactta aactggtgaa gtcatatcat 1020

tggatgggac tagtacacat tccaacaaat ggatcttggc agtgggaaga tggctccatt 1080

ctctcaccca acctactaac aataattgaa atgcagaagg gagactgtgc actctatgcc 1140

tcgagcttta aaggctatat agaaaactgt tcaactccaa atacgtacat ctgcatgcaa 1200

aggactgtgt gatctaga 1218

<210> 3

<211> 175

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Lys Lys Lys Lys Lys Ile Trp Ser Ala Val Phe Leu

20 25 30

Asn Ser Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr

35 40 45

Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr

50 55 60

Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys

65 70 75 80

Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln

85 90 95

Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val His

100 105 110

Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser

115 120 125

Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu

130 135 140

Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn

145 150 155 160

Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val His His His His His His

165 170 175

<210> 4

<211> 540

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gaattcatgg agacagacac actcctgcta tgggtactgc tgctctgggt tccaggttcc 60

actggcaaaa aaaaaaaaaa aatatggagt gctgtattcc taaactcatt attcaaccaa 120

gaagttcaaa ttcccttgac cgaaagttac tgtggcccat gtcctaaaaa ctggatatgt 180

tacaaaaata actgctacca attttttgat gagagtaaaa actggtatga gagccaggct 240

tcttgtatgt ctcaaaatgc cagccttctg aaagtataca gcaaagagga ccaggattta 300

cttaaactgg tgaagtcata tcattggatg ggactagtac acattccaac aaatggatct 360

tggcagtggg aagatggctc cattctctca cccaacctac taacaataat tgaaatgcag 420

aagggagact gtgcactcta tgcctcgagc tttaaaggct atatagaaaa ctgttcaact 480

ccaaatacgt acatctgcat gcaaaggact gtgcatcatc atcatcatca ttgatctaga 540

Claims

1.一种易于定向偶联的NKG2D受体蛋白，其特征在于：结构为Km-Fc-NKG2D或Km-NKG2D-his，其中：K为赖氨酸残基，m为残基个数，m=3～5的整数，Fc的氨基酸序列为THTCPPCPAPEL LGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP，NKG2D的氨基酸序列为IWSAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLL KLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV。

2.根据权利要求1所述的NKG2D受体蛋白，其特征在于：所述Fc-NKG2D的氨基酸序列如SEQ ID NO.：1所示；所述NKG2D-his中的NKG2D氨基酸序列如SEQ ID NO.：3所示；

所述Fc-NKG2D的核苷酸序列如SEQ ID NO.：2所示；所述NKG2D-his的核苷酸序列如SEQID NO.：4所示。

3.一种表达载体，其表达权利要求1或2所述的NKG2D受体蛋白。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于：其宿主细胞为真核细胞或昆虫细胞。

5.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于：其宿主细胞为CHO细胞或293ft细胞。

6.一种NKG2D免疫吸附剂，由权利要求1或2所述的NKG2D受体蛋白通过氨基与固相载体共价偶联得到。

7.根据权利要求6所述的NKG2D免疫吸附剂，其特征在于：所述固相载体选自壳聚糖、琼脂糖、纤维素、葡聚糖、树脂中的至少一种。

8.根据权利要求7所述的NKG2D免疫吸附剂，其特征在于：所述固相载体为微球，微球的孔径范围为100-1200nm，对球蛋白分离范围为10⁵-10⁸Da。

9.根据权利要求8所述的NKG2D免疫吸附剂，其特征在于：所述微球的孔径范围为200-800nm，对球蛋白分离范围为10⁷-10⁸Da。

10.根据权利要求7所述的NKG2D免疫吸附剂，其特征在于：所述固相载体为SephacrylS-1000 SF葡聚糖。

11.根据权利要求6～10任一项所述的NKG2D免疫吸附剂，其特征在于：共价偶联的方法为环氧氯丙烷法或甘油醚法。

12.根据权利要求11所述的NKG2D免疫吸附剂，其特征在于：NKG2D免疫吸附剂合成包括如下操作：

S2) 往步骤S1）抽干后的填料中加入等体积的PBS溶液，按照载体：乙二胺溶液体积比为1:( 0.3～0.9) 加入乙二胺溶液，35～42℃，100～150rpm，反应1～5h后清洗填料，抽干；

S3) 往步骤S2）抽干后的填料中加入等体积的PBS溶液，按照体积比1:(1～2) 加入戊二醛溶液，35～42℃，100～150rpm，反应1～5h后用反渗水清洗填料，抽滤；

S4) 往步骤S3）抽滤后的填料中，加入所述Km-Fc-NKG2D蛋白或Km-NKG2D-his蛋白溶液，缓冲液为与填料等体积的碳酸盐缓冲液，pH8.3，25～35℃，100～150rpm，反应1～5h后清洗填料，抽干，得到NKG2D免疫吸附剂。

13.权利要求6～12任一项所述的免疫吸附剂在制备血液净化剂中的应用。

14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于：所述血液净化剂包括吸附人血液或血浆中的NKG2D配体的血液净化剂。

15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于：所述NKG2D配体包括可溶性的MICA、MICB分子、ULBP分子及MICA/B与抗MIC单抗药物组成的免疫复合物。

16.根据权利要求14所述的应用，其特征在于：所述免疫吸附剂通过孔吸附的方式吸附以外泌体形式存在的MIC分子。

17.根据权利要求16所述的应用，其特征在于：所述以外泌体形式存在的MIC分子为MICA*008。

18.根据权利要求14所述的应用，其特征在于：所述免疫吸附剂可吸附血液中游离的可溶性NKG2D配体分子。

19.根据权利要求18所述的应用，其特征在于：所述可溶性NKG2D配体分子包括MICA*002、MICA*004、MICA*007、MICA*009、MICA*010、MICA*012、MICA*019、MICA*027、MICA*045、MICB*002、MICB*003、MICB*004、MICB*005、MICB*008、MICB*014、MICB*024和MICB*026分子中的至少一种。

20.一种包含权利要求6～12任一项所述的NKG2D免疫吸附剂的吸附柱。

21.一种包含权利要求20所述吸附柱的血液吸附装置。