CN112661858A

CN112661858A - 重组人生长激素Fc融合蛋白和用途及其工程细胞株

Info

Publication number: CN112661858A
Application number: CN202011394304.2A
Authority: CN
Inventors: 徐婷; 杨文静; 许文娟; 黄伟; 叶洪涛; 崔智强; 范清林; 宋礼华
Original assignee: Anhui Anke Biotechnology Group Co ltd
Current assignee: Anhui Anke Biotechnology Group Co ltd
Priority date: 2020-12-03
Filing date: 2020-12-03
Publication date: 2021-04-16

Abstract

本发明涉及生物医药工程技术领域，特别是基因重组长效人生长激素技术领域，具体涉及一种重组人生长激素Fc融合蛋白研制。本发明的人生长激素Fc融合蛋白所述融合蛋白含有人生长激素(hGH)、柔性肽接头(L))和人免疫球蛋白Fc片段。本发明还公开了该融合蛋白的活性测定方法以及能够表达该融合蛋白的宿主细胞。本发明构建的重组人生长激素Fc融合蛋白比重组hGH具有更长的血清半衰期，大大降低了治疗时间内所需的注射给药频率，从而提高患者的依从性、增加医患双方的便利性，同时其生产过程也更简单、高效，特别适用于工业化大规模制备基因重组长效人生长激素。

Description

重组人生长激素Fc融合蛋白和用途及其工程细胞株

技术领域

本发明涉及生物医药工程技术领域，特别是基因重组长效人生长激素技术领域，具体涉及一种重组人生长激素Fc融合蛋白研制和用途及其工程细胞株。

背景技术

生长激素(HGH)是一种肽类激素，它是由垂体中的生长激素细胞合成、存储和分泌。成熟野生型人GH(由SEQ ID NO:2鉴别的hGH)是由191个氨基酸残基构成，其中大部分是以分子量22KDa形式存在，少量生长激素以20KDa形式存在，等电点为4.9，在53、165、182和189位置含有4个半胱氨酸残基，其通过形成分别连接C53与C165和C182与C189的两个分子内二硫键，稳定蛋白的三维结构。生长激素与其特异生长激素受体(hGHR)在靶点细胞表面相互结合，介导出生化串联反应，活化细胞内的JAK2-STATs、MAPK和PI3K-GSK3等多条明确的信号通路，从而维持细胞的增殖和分化。胰岛素样生长因-1(IGF-1)与生长激素受体组合表达，参与细胞的生长和再生。众所周知，生长激素是在正常人体的脑垂体中产生的，并逐渐增加到***，并随着年龄逐渐减少。

生长激素最主要的生理作用是通过促进身体各组织、器官以及骨骼中受体细胞的蛋白质合成和脂肪的分解，进而促进人的代谢和生长发育。如果人体的生长激素分泌不足，通俗的说就是会导致“发育不良”。因此，目前临床上，生长激素主要被用于治疗儿童生长迟缓和成人的生长激素不足。此外，近年来在美容和抗衰老以及重度烧伤等方面也有了应用，经实验证实生长激素确实能够使体内脂肪重新分泌，会让皮下弹性组织中的粘多糖增加，使皮肤变得坚实有弹性。

2019年国内生长激素存量市场约55亿元，处于快速增长期。根据出厂口径计算，生长激素市场规模逐年升高，从2014年11.90亿元逐渐增长到2019年55.19亿，复合增长率35.91％。目前国内外重组人生长激素已有多个产品上市，例如辉瑞的健豪宁(注射用重组人生长激素)其适应症为：由内源性生长激素分泌不足所致或由Turner's综合征或慢性肾功能不全引起的生长障碍；Genentech的NUTROPIN；诺和诺德的

(somatropin，生长激素)，金赛药业的赛增(重组人生长激素注射液)以及安科生物的安苏萌(注射用重组人生长激素)等。

然而，这些用药多为短效产品，在临床应用时，由于生长激素在人体内半衰期很短，半衰期大约2小时，所以治疗用药需要皮下注射每天一针，而且给药周期长(例如可高达约6个月以上)。频繁的注射生长激素会给患者带来不便，用药成本也比较昂贵。而市场开发的长效的PEG(聚乙二醇)化生长激素通过聚乙二醇修饰后虽然能够明显提高药物半衰期使其长效化，但由于PEG作为人体内异物有潜在风险，在注射的过程中可能引起疼痛感，安全性收到限制，而且PEG化生长激素的代谢途经肾小球滤过清除，有研究表明PEG成分与肾小管上皮细胞空心化有关，存在潜在隐患。

目前研究最热，发展最迅速的长效蛋白药物技术为Fc融合蛋白技术，Fc片段是IgG保持体内较长半衰期的主要因素，同时可以稳定蛋白，现已用于多种融合蛋白的开发。Fc片段通过两种机制发挥功能，第一种是与细胞表面的Fc受体结合，通过吞噬或裂解作用杀伤细胞并通过抗体依赖性细胞毒(ADCC)途径消化病原体。在四种人IgG亚型中IgG1与IgG3能有效的结合细胞表面的Fc受体，而IgG2和IgG4与受体结合的亲和力较低。第二种是与第一补体成分C1的C1q结合，通过补体依赖的细胞毒(CDC)途径裂解病原体。人IgG1和IgG3能有效的结合C1q从而介导补体级联反应，人IgG2与C1q的结合能力较弱，而人IgG4不与C1q结合。Fc融合蛋白主要是为了增加蛋白药物在体内的半衰期和简化生产工艺降低成本，Fc介导的IgG效应和裂解细胞的功能并不是必要的，甚至会产生副作用。Fc融合蛋白技术不仅如PEG化般增大蛋白药物分子质量降低清除率，更加也能通过FcRn结合域，通过pH敏感性结合力以缓释的方式延长半衰期。这种从基因水平将融合伴侣与效应分子连接在一起，不需要额外的化学修饰，纯化、制备过程简单，质量控制也相对容易，综合来看是非常有前景的一种长效化手段。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一种重组人生长激素Fc融合蛋白，编码该融合蛋白的核苷酸的载体、宿主细胞及其用途。由本发明涉及的融合蛋白，作为药物用于治疗儿童生长迟缓和成人的生长激素不足以及重度烧伤等方面，能延长血清半衰期，降低治疗时间内所需的注射给药频率，提高患者的依从性和医患双方的便利性。

本发明提供了一种长效重组人生长激素Fc融合蛋白，所述融合蛋白优选由N端至C端依次为：人生长激素、连接肽、Fc片段(简称rGH-Fc)，次优选为Fc片段、连接肽、人生长激素(简称Fc-rGH)。

其中生长激素的氨基酸序列同GenBank:M13438.1中的氨基酸序列，共191个氨基酸。

进一步地，优选的柔性肽接头氨基酸组成的结构通式为(GGGGS)nA，其中n是大于或等于2的整数，在一些实施例，n＝3，在另一些实施例中，n＝2或4。

n在保护范围内的取值并不影响具体实施例的构建，进行和试验结果。

在一些实施例中，所述人IgG的Fc变体(残基的编号是依据Kabat Eu Index编号)选自下组：

1)至少含有以下两个突变的IgG1 Fc：Leu234Ala，Leu235Ala，Asn297Ala，Val308Pro以及删除C末端Lys，所述IgG1 Fc的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；

2)至少含有以下两个突变的IgG2 Fc：Asn297Ala，Val308Pro，Pro331Ser以及删除C末端Lys，所述IgG2 Fc的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；

3)至少含有以下两个突变的IgG4 Fc：至少含有Ser228Pro，Glu233Pro，Leu234Ala或者Leu234Val，Leu235Ala，Asn297Ala，Val308Pro和Arg409Lys以及删除C末端Lys的人IgG4绞链区、CH2和CH3区域，所述IgG4 Fc的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示；

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

首先确定重组人生长激素Fc融合蛋白的氨基酸序列，在两端加入合适的酶切位点、Koaza序列和引导分泌的信号肽，参考了如中国仓鼠蛋白翻译各密码子利用率的网站或数据库，也参考了一些文献资料在不改变氨基酸序列前提下进行基因编码区密码子优化后，采用大鼠种属偏好密码子，同时去除可能影响抗体表达的序列(如TATA box,AATAATranscription termination site,Cryptic splice sites等)，最终反向转换为对应的基因序列，送至基因合成。

将编码融合蛋白的DNA构建入pCDNA3.1载体(来自Invitrogen)中，瞬时转染入Expi293真核细胞，转染5天后收取细胞培养上清液，经Protein A纯化后得到目的融合蛋白。分析目的融合蛋白的纯度，等电点、稳定性、大鼠体内的血浆半衰期、对大鼠血清IGF-1的反应以及其与生长激素受体(GHR)结合后对STAT5信号通路的影响。

在确认目的融合蛋白能刺激大鼠IGF-1反应，在大鼠体内的血浆半衰期明显延长且与生长激素受体(GHR)结合后能有效活化STAT5信号通路后，将编码该融合蛋白的DNA构建入D2M载体，转染CHO-S细胞，利用MTX加压筛选得到高表达rGH-Fc/Fc-rGH的稳定细胞株。

上述技术方案产生的有益效果在于：本发明提供的重组人生长激素融合蛋白，具有特异性结合生长激素受体(GHR)，激活下游STAT5信号通路，维持细胞的增殖和分化，且半衰期更长的特点，用于治疗儿童生长迟缓和成人的生长激素不足以及重度烧伤等方面。

附图说明

图1为SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)检测proteinA一步亲和层析纯化后的rGH-Fc/Fc-rGH蛋白，其中左起第一条泳道为Fc-rGH蛋白，第二条泳道为rGH-Fc蛋白，第三条泳道为蛋白Ladder；

图2为SEC检测rGH-Fc蛋白的纯度；

图3为SEC检测Fc-rGH蛋白的纯度；

图4为ELISA检测rGH-Fc/Fc-rGH蛋白与生长激素受体GHR的结合；

图5为ELISA检测rGH-Fc/Fc-rGH蛋白与补体C1q的结合；

图6为荧光素酶报告基因法检测rGH-Fc的生物学活性；

图7为静脉注射等摩尔量rGH-Fc和GH后大鼠血清中IGF-1水平的变化；

图8为静脉注射等摩尔量rGH-Fc和GH后大鼠血清中GH含量的变化；

图9为rGH-Fc工程细胞株的生长曲线，纵坐标分别为细胞数(LCC)和细胞活率(VIA)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作详细的说明。

实施例1:rGH-Fc/Fc-rGH的表达载体的构建

1.1合成GH基因

NCBI数据库检索GH的氨基酸序列(GenBank Accession:M13438.1)，分析其核苷酸序列，针对核苷酸序列进行去相关酶切位点或减少茎环结构等改造，委托全基因合成rGH-Fc全长基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

1.2PCR扩增XbaI-rGH-Fc-HindIII和XbaI-Fc-rGH-XhoI

设计如下引物：

GH-Fc扩增：以合成的含有GH基因的质粒(pUC57-GH)为模板，以P1和P2为引物，使用Prime STAR HS聚合酶，PCR扩增得到XbaI-GH片段。以已有的IgG-Fc基因的质粒为模板，以P3和P4为引物，使用Prime STARHS聚合酶，PCR扩增得到Fc-HindIII片段。再以上述PCR扩增得到的XbaI-GH和Fc-HindIII为模板，P1和P4为引物，经SOE-PCR扩增得到XbaI-GH-Fc-HindIII。

Fc-GH扩增：以已有的IgG-Fc基因的质粒为模板，以P6和P7为引物，使用PrimeSTARHS聚合酶，PCR扩增得到Fc-pre片段，再以Fc-pre为模板，以P5和P8为引物，扩增得到XbaI-Fc。以合成的含有GH基因的质粒(pUC57-GH)为模板，以P9和P10为引物，使用Prime STAR HS聚合酶，PCR扩增得到GH-XhoI片段。再以上述PCR扩增得到的XbaI-Fc和GH-XhoI为模板，P5和P10为引物，经SOE-PCR扩增得到XbaI-Fc-GH-XhoI。

其扩增体系具体如下：

PCR反应程序，具体如下：

1.3双酶切

XbaI/HindIII酶切载体pCD-cFc(改造自pCDNA3.1+)与目的片段XbaI-GH-Fc-HindIII，XbaI/XhoI双酶切目的片段XbaI-Fc-GH-XhoI和pCD-cFc载体，载体和酶切产物经DNA胶回收后用于连接转化，其中酶切体系如下：

1.4连接转化与测序

取3μl酶连产物，转化入DH-5a感受态细胞，涂布氨苄板后挑克隆送测序，即获得真核表达质粒pCD-rGH-Fc和pCD-Fc-rGH，测序鉴定载体序列正确。

实施例2:rGH-Fc/Fc-rGH蛋白表达与纯化

2.1 rGH-Fc/Fc-rGH的表达与鉴定

向24孔培养板中接种Expi293细胞，接种密度2.5～3×10⁶cells/ml，接种量1ml/孔，转染时细胞活率大于90％。将1μgDNA(pCD-rGH-Fc/Fc-rGH)稀释于50μl OptiMEM，轻轻混匀，再将2.7μl稀释于50μl OptiMEM中，轻轻浑匀，室温孵育5分钟后将所得DNA稀释液和所得ExpiFectamine稀释液混合，轻轻浑匀，室温孵育20分钟，将所得DNA--ExpiFectamine复合物(总体积约100μl)加入培养孔板中，前后摇动培养板使其分布均匀。将细胞放入培养箱继续培养16h，按照5μl/ml的添加比例加入转染Enhancer1，50μl/ml的添加比例加入转染Enhancer2，1μl/ml的添加比例加入抗生素，轻轻混匀，继续培养4天，细胞活率低于50％时，收集全部细胞离心。经ELISA鉴定确认rGH-Fc/Fc-rGH融合蛋白表达后，扩大转染体系至30ml(操作同上)，转染5天后收取上清液纯化蛋白用。

2.2rGH-Fc/Fc-rGH蛋白的纯化与纯度鉴定

收集培养基上清液，用proteinA树脂纯化rGH-Fc/Fc-rGH，随后用截留分子量为30kDa的超滤离心管超滤浓缩rGH-Fc/Fc-rGH，经SDS-PAGE鉴定结果如附图1所示，其中泳道1为Fc-rGH，泳道2为rGH-Fc，泳道3为蛋白Ladder，表明rGH-Fc/Fc-rGH的分子量大小与理论(97KD)一致且纯度较高。附图2和图3分别为rGH-Fc和Fc-rGH蛋白的SEC鉴定图，积分结果显示主峰的纯度均大于95％。

实施例3:rGH-Fc/Fc-rGH蛋白与GHR的结合

用PBS稀释生长激素受体蛋白(GHR)至1μg/ml，4℃铺板过夜。TPBS洗涤3次，37℃烘箱封闭1h，TPBS洗3次后加入梯度稀释的rGH-Fc/Fc-rGH融合蛋白(50，25，12.5，6.25，3.12，1.56，0.78，0.39，0.19nM)，每孔100μl，室温震荡孵育1小时。TPBS洗涤3次后加入绵羊抗人Fc-HRP(1:4000稀释)，每孔100μl，室温震荡孵育1小时，TPBS洗3次，加入OPD显色，室温反应10min后加入1MH2SO4以终止反应，每孔100μl，在490nm处测量吸光度。检测结果如图4所示，结果表明rGH-Fc和Fc-rGH均能与GHR结合，且呈现浓度梯度依赖趋势。

实施例4:rGH-Fc/Fc-rGH蛋白与C1q的结合

用PBS稀释rGH-Fc/Fc-rGH蛋白和Herceptin抗体抗原稀释至8，4，2.000，1，0.5，0.25，0.125，0μg/mL，加入96孔板中，每孔100μl，4℃铺板过夜。TPBS洗涤3次，37℃烘箱封闭1h，TPBS洗3次后加入2μg/mL人C1q蛋白，每孔50μl，室温震荡孵育1小时。TPBS洗涤3次后加入绵羊抗人C1q-HRP(1:500稀释)，每孔100μl，室温震荡孵育1小时，TPBS洗3次，加入OPD显色，室温反应10min后加入1MH2SO4以终止反应，每孔100μl，在490nm处测量吸光度。检测结果如图5所示，结果表明IgG1亚型的Herceptin与C1q蛋白的结合呈浓度梯度依赖趋势，而rGH-Fc/Fc-rGH蛋白不与C1q结合。

实施例5:rGH-Fc蛋白的生物学活性测定

在HEK293细胞中转入含有STAT5启动子的荧光素酶报告基因和GHR受体质粒，获得HEK293-GHR-Luc细胞株。取对数生长期的HEK293-GHR-Luc细胞，胰酶消化后用DMEM+10％FBS+1％PS+2μg/ml of Puromycin培养基重悬细胞使细胞浓度达到6ⅹ105cells/ml。在96孔板中加入50μl细胞混悬液，即30000cells/well，并在96孔板四周加入100μl PBS缓冲液，CO2培养箱培养16-24h。用不含酚红的DMEM+10％FBS培养基稀释rGH-Fc蛋白至200μg/ml，再做8倍梯度稀释，共8个梯度，取50μl的稀释的蛋白加入96孔板中(即使其终浓度为100，14.2857，2.0408，0.2915，0.0416，0.0059，0.0008，0.0001μg/ml)，随后放入CO2培养箱中培养5h后每孔加入100μl已经达到室温的Promega Bio-GloTM luciferase Assary System，并放置在室温用振荡器震荡10min后上机检测。测试结果如附图5所示。附图5表明：HEK293-GHR-Luc经GH-Fc刺激后，GH-Fc与受体GHR结合后激活JAK2-STATs信号通路，从而激活STAT5反应元件下游的荧光素酶基因的转录，荧光素酶基因表达量的强弱与结合至靶细胞膜上GHR的GH-Fc含量呈正相关。

实施例6:rGH-Fc蛋白与对大鼠IGF-1水平的影响

将雄性成熟Sprague Dawley大鼠(约7周龄，体重130-180g)分成3组，每组5只，分别静脉注射等体积的生理盐水、15nmol生长激素水针和15nmol重组人生长激素蛋白(rGH-Fc)，单次给药给药0，1，4，12，24，48，96h后取血样，用Rat IGF-1 ELISAKit(厂商：Elabscience，货号：E-EL-R0010c)检测大鼠血清中的IGF-1含量。具体操作如下：首先取出包被有抗IGF-1抗体的酶标板上平衡至室温，加入100μL梯度稀释的rat IGF-1标准品蛋白(100，50，25，12.5，6.25，3.13，1.56，0ng/mL)和待测样品，37℃孵育90分钟后弃去液体，甩干后加入生物素化抗体工作液100μL，37℃温育1小时。洗板3次后每孔加酶结合物工作液100μL，37℃温育30分钟。洗板5次再每孔加90μL底物溶液TMB，37℃避光孵育15分钟左右每孔加终止液50μL，立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(OD值)，根据标准GH蛋白的吸光值计算样品的IGF-1浓度。检测结果如附图6所示，结果表明，静脉注射GH和rGH-Fc后均能引起大鼠血清中IGF-1水平的短暂上升。

实施例7:rGH-Fc蛋白在大鼠体内的血浆半衰期

将雄性成熟Sprague Dawley大鼠(约7周龄，体重130-180g)分成3组，每组5只，分别静脉注射等体积的生理盐水、15nmol生长激素水针和15nmol重组人生长激素蛋白(rGH-Fc)，单次给药给药0、0.25、1、2、4、8、12、24、32、48、72、96、144、192h后取血样，用ELISA检测大鼠血清中的GH含量，具体操作如下：首先用PBS稀释抗GH抗体4D9(1:1000)，加入96孔板中，每孔100μl，4℃铺板过夜。TPBS洗涤3次，37℃烘箱封闭1h，TPBS洗3次后加入梯度稀释的标准GH蛋白和待测样品(2000，1000，500，250，125，62.5，31.25，15.625ng/mL)，每孔100μl，室温震荡孵育1小时。TPBS洗涤3次后加入6A4-HRP(1:1000)，每孔100μl，室温震荡孵育1小时，TPBS洗3次，加入OPD显色，室温反应10min后加入1MH2SO4以终止反应，每孔100μl，在490nm处测量吸光度，根据标准GH蛋白的吸光值计算样品的GH和rGH-Fc浓度。检测结果如附图7所示，结果表明，rGH-Fc在大鼠体内的额血浆半衰期较GH更长。

实施例8:高表达rGH-Fc蛋白的工程细胞株的构建与筛选

将核苷酸优化后的rGH-Fc构建入DN2载体，经PvuI酶切线性化后转染入CHO细胞，用50～100～200～500～1000nM MTX加压后以0.5cell/well铺板，使用ELISA法检测培养上清液中融合蛋白的含量进行筛选，得到表达量相对较高且细胞生长状态较好的5个优选一级亚克隆，将一级亚克隆以以0.3cell/wel铺板筛选二级亚克隆，筛选后最终得到1个优选克隆和2个次优克隆。优选克隆培养14天的细胞生长曲线如图7所示，上清液中rGH-Fc的含量＞2g/L。

本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，由于文字表达的有限性，而客观上存在无限的具体结构，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进、润饰或变化，也可以将上述技术特征以适当的方式进行组合；这些改进润饰、变化或组合，或未经改进将发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 安徽安科生物工程（集团）股份有限公司

<120> 重组人生长激素Fc融合蛋白研制和用途及其工程细胞株

<130> 2020

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 651

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 生长激素核苷酸序列

<400> 1

atggccaccg gcagccggac ctctctgctc ctggccttcg gactgctctg cctgccttgg 60

ctgcaggaag gcagcgcttt ccctacaatc cctctgagcc ggctgttcga taacgccatg 120

ctgagagccc acaggctgca ccagctggcc ttcgacacct accaggagtt cgaggaagcc 180

tacatcccta aggagcagaa gtacagcttc ctgcagaacc ctcagaccag cctgtgtttc 240

tctgagtcca tccctacccc aagcaaccgg gaggaaaccc agcagaagag caacctggag 300

ctgctcagaa tctccctgct cctgatccag agctggctgg agcctgtgca gttcctgcgg 360

agcgtgttcg ccaacagcct ggtgtacgga gccagcgaca gtaacgtgta cgacctgctc 420

aaggacctgg aggaaggcat ccagaccctg atgggcagac tggaggacgg cagccctcgg 480

acaggccaga tcttcaagca gacctacagc aagttcgaca caaacagcca caacgatgac 540

gccctgctca agaactacgg cctgctctac tgcttcagaa aggacatgga taaggtggaa 600

acattcctga gaatcgtgca gtgcaggtcc gtggaaggca gctgcggctt c 651

<210> 2

<211> 217

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 生长激素氨基酸序列

<400> 2

Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu

1 5 10 15

Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Phe Pro Thr Ile Pro Leu

20 25 30

Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln

35 40 45

Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys

50 55 60

Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe

65 70 75 80

Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys

85 90 95

Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp

100 105 110

Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val

115 120 125

Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu

130 135 140

Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg

145 150 155 160

Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser

165 170 175

His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe

180 185 190

Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys

195 200 205

Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe

210 215

<210> 3

<211> 699

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IgG1 Fc核苷酸序列

<400> 3

gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 60

gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 120

acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 180

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 240

tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 300

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 360

atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 420

gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 480

gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 540

cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctatagca agctcaccgt ggacaagagc 600

aggtggcagc aggggaacgt ctcctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 660

tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatga 699

<210> 4

<211> 232

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IgG1 Fc氨基酸序列

<400> 4

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

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Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

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Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Ser

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Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

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Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

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<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IgG2 Fc氨基酸序列

<400> 6

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165 170 175

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<223> IgG4 Fc核苷酸序列

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50 55 60

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65 70 75 80

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Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

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Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

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<110> 安徽安科生物工程（集团）股份有限公司

<120> 重组人生长激素Fc融合蛋白研制和用途及其工程细胞株

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<170> PatentIn version 3.5

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<212> DNA

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gttccagttc caaagattaa aggaatcgat ccagatctcc tcaaggaagg aaaattagag 960

gaggtgaaca caatcttagc cattcatgat agctataaac ccgaattcca cagtgatgac 1020

tcttgggttg aatttattga gctagatatt gatgagccag atgaaaagac tgaggaatca 1080

gacacagaca gacttctaag cagtgaccat gagaaatcac atagtaacct aggggtgaag 1140

gatggcgact ctggacgtac cagctgttgt gaacctgaca ttctggagac tgatttcaat 1200

gccaatgaca tacatgaggg tacctcagag gttgctcagc cacagaggtt aaaaggggaa 1260

gcagatctct tatgccttga ccagaagaat caaaataact caccttatca tgatgcttgc 1320

cctgctactc agcagcccag tgttatccaa gcagagaaaa acaaaccaca accacttcct 1380

actgaaggag ctgagtcaac tcaccaagct gcccatattc agctaagcaa tccaagttca 1440

ctgtcaaaca tcgactttta tgcccaggtg agcgacatta caccagcagg tagtgtggtc 1500

ctttccccgg gccaaaagaa taaggcaggg atgtcccaat gtgacatgca cccggaaatg 1560

gtctcactct gccaagaaaa cttccttatg gacaatgcct acttctgtga ggcagatgcc 1620

aaaaagtgca tccctgtggc tcctcacatc aaggttgaat cacacataca gccaagctta 1680

aaccaagagg acatttacat caccacagaa agccttacca ctgctgctgg gaggcctggg 1740

acaggagaac atgttccagg ttctgagatg cctgtcccag actatacctc cattcatata 1800

gtacagtccc cacagggcct catactcaat gcgactgcct tgcccttgcc tgacaaagag 1860

tttctctcat catgtggcta tgtgagcaca gaccaactga acaaaatcat gccttag 1917

<210> 8

<211> 638

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 生长激素受体氨基酸序列

<400> 8

Met Asp Leu Trp Gln Leu Leu Leu Thr Leu Ala Leu Ala Gly Ser Ser

1 5 10 15

Asp Ala Phe Ser Gly Ser Glu Ala Thr Ala Ala Ile Leu Ser Arg Ala

20 25 30

Pro Trp Ser Leu Gln Ser Val Asn Pro Gly Leu Lys Thr Asn Ser Ser

35 40 45

Lys Glu Pro Lys Phe Thr Lys Cys Arg Ser Pro Glu Arg Glu Thr Phe

50 55 60

Ser Cys His Trp Thr Asp Glu Val His His Gly Thr Lys Asn Leu Gly

65 70 75 80

Pro Ile Gln Leu Phe Tyr Thr Arg Arg Asn Thr Gln Glu Trp Thr Gln

85 90 95

Glu Trp Lys Glu Cys Pro Asp Tyr Val Ser Ala Gly Glu Asn Ser Cys

100 105 110

Tyr Phe Asn Ser Ser Phe Thr Ser Ile Trp Ile Pro Tyr Cys Ile Lys

115 120 125

Leu Thr Ser Asn Gly Gly Thr Val Asp Glu Lys Cys Phe Ser Val Asp

130 135 140

Glu Ile Val Gln Pro Asp Pro Pro Ile Ala Leu Asn Trp Thr Leu Leu

145 150 155 160

Asn Val Ser Leu Thr Gly Ile His Ala Asp Ile Gln Val Arg Trp Glu

165 170 175

Ala Pro Arg Asn Ala Asp Ile Gln Lys Gly Trp Met Val Leu Glu Tyr

180 185 190

Glu Leu Gln Tyr Lys Glu Val Asn Glu Thr Lys Trp Lys Met Met Asp

195 200 205

Pro Ile Leu Thr Thr Ser Val Pro Val Tyr Ser Leu Lys Val Asp Lys

210 215 220

Glu Tyr Glu Val Arg Val Arg Ser Lys Gln Arg Asn Ser Gly Asn Tyr

225 230 235 240

Gly Glu Phe Ser Glu Val Leu Tyr Val Thr Leu Pro Gln Met Ser Gln

245 250 255

Phe Thr Cys Glu Glu Asp Phe Tyr Phe Pro Trp Leu Leu Ile Ile Ile

260 265 270

Phe Gly Ile Phe Gly Leu Thr Val Met Leu Phe Val Phe Leu Phe Ser

275 280 285

Lys Gln Gln Arg Ile Lys Met Leu Ile Leu Pro Pro Val Pro Val Pro

290 295 300

Lys Ile Lys Gly Ile Asp Pro Asp Leu Leu Lys Glu Gly Lys Leu Glu

305 310 315 320

Glu Val Asn Thr Ile Leu Ala Ile His Asp Ser Tyr Lys Pro Glu Phe

325 330 335

His Ser Asp Asp Ser Trp Val Glu Phe Ile Glu Leu Asp Ile Asp Glu

340 345 350

Pro Asp Glu Lys Thr Glu Glu Ser Asp Thr Asp Arg Leu Leu Ser Ser

355 360 365

Asp His Glu Lys Ser His Ser Asn Leu Gly Val Lys Asp Gly Asp Ser

370 375 380

Gly Arg Thr Ser Cys Cys Glu Pro Asp Ile Leu Glu Thr Asp Phe Asn

385 390 395 400

Ala Asn Asp Ile His Glu Gly Thr Ser Glu Val Ala Gln Pro Gln Arg

405 410 415

Leu Lys Gly Glu Ala Asp Leu Leu Cys Leu Asp Gln Lys Asn Gln Asn

420 425 430

Asn Ser Pro Tyr His Asp Ala Cys Pro Ala Thr Gln Gln Pro Ser Val

435 440 445

Ile Gln Ala Glu Lys Asn Lys Pro Gln Pro Leu Pro Thr Glu Gly Ala

450 455 460

Glu Ser Thr His Gln Ala Ala His Ile Gln Leu Ser Asn Pro Ser Ser

465 470 475 480

Leu Ser Asn Ile Asp Phe Tyr Ala Gln Val Ser Asp Ile Thr Pro Ala

485 490 495

Gly Ser Val Val Leu Ser Pro Gly Gln Lys Asn Lys Ala Gly Met Ser

500 505 510

Gln Cys Asp Met His Pro Glu Met Val Ser Leu Cys Gln Glu Asn Phe

515 520 525

Leu Met Asp Asn Ala Tyr Phe Cys Glu Ala Asp Ala Lys Lys Cys Ile

530 535 540

Pro Val Ala Pro His Ile Lys Val Glu Ser His Ile Gln Pro Ser Leu

545 550 555 560

Asn Gln Glu Asp Ile Tyr Ile Thr Thr Glu Ser Leu Thr Thr Ala Ala

565 570 575

Gly Arg Pro Gly Thr Gly Glu His Val Pro Gly Ser Glu Met Pro Val

580 585 590

Pro Asp Tyr Thr Ser Ile His Ile Val Gln Ser Pro Gln Gly Leu Ile

595 600 605

Leu Asn Ala Thr Ala Leu Pro Leu Pro Asp Lys Glu Phe Leu Ser Ser

610 615 620

Cys Gly Tyr Val Ser Thr Asp Gln Leu Asn Lys Ile Met Pro

Claims

1.一种重组人生长激素Fc融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由人生长激素、连接肽和Fc片段组成，所述融合蛋白由N端至C端依次为：人生长激素、连接肽、Fc片段，或者所述融合蛋白由N端至C端依次为Fc片段、连接肽、人生长激素。

2.一种根据权利要求1所述的重组人生长激素Fc融合蛋白，其特征在于，所述编码人生长激素基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种根据权利要求1所述的重组人生长激素Fc融合蛋白，其特征在于，所述连接肽为柔性连接肽，所述柔性肽接头氨基酸组成的结构通式为(GGGGS)nA，其中n是大于或等于2的整数。

4.一种根据权利要求1所述的重组人生长激素Fc融合蛋白，其特征在于，所述Fc片段为人IgG Fc变体。

5.一种根据权利要求4所述的重组人生长激素Fc融合蛋白，其特征在于，所述的人IgGFc变体选自以下一组或多组：

1)至少含有以下两个突变的IgG1 Fc：Leu234Ala，Leu235Ala，Asn297Ala，Val308Pro以及删除C末端Lys，所述IgG1 Fc的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，氨基酸序列如SEQ IDNO：4所示；

3)至少含有以下两个突变的IgG4 Fc：至少含有Ser228Pro，Glu233Pro，Leu234Ala或者Leu234Val，Leu235Ala，Asn297Ala，Val308Pro和Arg409Lys以及删除C末端Lys的人IgG4绞链区、CH2和CH3区域，所述IgG4 Fc的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，氨基酸序列如SEQ IDNO：8所示。

6.一种多核苷酸，其特征在于，编码权利要求1-5任一权利要求所述的重组人生长激素Fc融合蛋白的氨基酸。

7.一种载体或载体组，其特征在于，包含权利要求6所述的多核苷酸。

8.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求7所述的载体或载体组，所述宿主细胞是原核的或真核的，为酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞中的一种或多种。

9.一种表达权利要求1至5任一项所述融合蛋白的阳性克隆及亚克隆的筛选方法，其特征在于，通过逐渐提高氨甲喋呤(amethopterin,MTX)浓度，从96板→24孔板→6孔板→25cm²培养瓶→125ml摇瓶，采用ELISA法逐步筛选出细胞株，将最终筛选细胞株命名为rhGH-Fc/Fc-rGH细胞株，表达的目的蛋白为rhGH-Fc/Fc-rGH重组蛋白。

10.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1-5任意一项所述的重组人生长激素Fc融合蛋白，或包含权利要求7所述的载体或载体组，以及药学上可接受的载体。

11.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求1-5中任意一项所述的重组人生长激素Fc融合蛋白或如权利要求10所述的药物组合物。

12.一种生产重组人生长激素Fc融合蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括在表达所述多核苷酸的条件下培养如权利要求8所述的宿主细胞。

13.一种根据权利要求1-5任一项所述的重组人生长激素Fc融合蛋白的用途，其特征在于，所述融合蛋白诱导延长的IGF-1反应。

14.一种生长激素受体，其特征在于，所述生长激素受体能与权利要求1-5任一项所述的重组人生长激素Fc融合蛋白结合，并激活JAK2-STATs信号通路，所述编码生长激素受体的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。

15.一种根据权利要求1-5任一项所述的重组人生长激素Fc融合蛋白或根据权利要求8所述的宿主细胞或包含权利要求8所述的宿主细胞的菌株群的用途，其特征在于，所述融合蛋白或所述宿主细胞或所述菌株群用于延长血清半衰期，降低治疗时间内所需的注射给药频率，提高患者的依从性和医患双方的便利性。