CN116209473A - 用于癌症疾病免疫治疗的cxcl9及其变体 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种包含另外的氨基酸在对应野生型CXCL9的N‑末端的***的修饰的CXCL9多肽、包含该多肽的药物组合物，以及其产生方法和使用该多肽用于治疗癌症的方法。还提供了编码本发明的修饰的CXCL9多肽的核酸、包含其的载体和宿主细胞。

Description

用于癌症疾病免疫治疗的CXCL9及其变体

发明背景

虽然许多由还具有趋化因子受体的癌细胞产生的趋化因子(也具有它们的受体)明显地支持肿瘤生长并抑制抗癌免疫反应性，但CXCR3配体CXCL10被认为通过引发抗癌免疫应答来减弱肿瘤生长。CXCL10也可以直接抑制肿瘤生长。CXCR3是具有三个配体的趋化因子受体：CXCL9、CXCL10和CXCL11。不同的CXCR3配体的生物学功能可能不同。

若干研究示出，CXCL9和CXCL10，特别是由肿瘤或宿主细胞产生的CXCL10可以募集与肿瘤抑制相关的CXCR3+肿瘤浸润CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞。已经示出，CXCR3KO小鼠中抗PD-1效力降低，并表明主要由肿瘤部位的CD103+树突状细胞(DC)产生的CXCL9与CD8+T细胞上的CXCR3之间的相互作用增强了抗PD-1效力(Chow等人，Immunity 2019,50 1498-1512e5)。

CXCL9在癌症疗法中的作用没有被研究。趋化因子，特别是CXCL9的体内稳定性非常有限。已经示出，稳定化的趋化因子(作为与Ig FC融合的融合蛋白)的产生导致体内半衰期延长(Barsheshet等人PNAS 2017)。

CXCL10和CXCL9的体内活性，特别是在肿瘤部位，受二肽基肽酶4(DPP4，也称为CD26)调节，其作用于位置2处的脯氨酸并诱导两个N-末端氨基酸的裂解，产生也可以分别充当CXCL9和CXCL10的拮抗趋化因子的无功能的CXCL9或CXCL10，因为截短的蛋白可以抑制完整的趋化因子。

因此，DPP4的全身靶向可能有利于抑制癌症发展，但由于这种酶在调节不同生物功能(其中包括葡萄糖代谢)中的关键作用，可能会有严重的副作用。

存在开发作为抗癌药物的稳定和有效的修饰的CXCL9多肽的需要。此外，存在开发对DPP4裂解具有抗性的稳定化的和修饰的CXCL9的需要。

发明概述

根据一些实施方案，提供了有利的修饰的CXCL9多肽，与野生型(未修饰的)CXCL9相比，其包含一个或更多个点突变和/或***。根据一些实施方案，本文公开的新的、非天然存在的、修饰的CXCL9是有利的，因为它稳定、易于产生，并表现出期望的生物活性，如本文进一步详述的。还提供了编码修饰的CXCL9多肽的核酸、制备修饰的CXCL9的方法、包含其的组合物及其在治疗各种医学状况，特别是癌症中的用途。

在一些实施方案中，提供了修饰的CXCL9多肽，其包含一个或更多个另外的氨基酸在如SEQ ID NO:1所表示的对应野生型CXCL9的N-末端的***。

在一些实施方案中，提供了修饰的CXCL9多肽，其包含另外的氨基酸在对应野生型CXCL9的N-末端的***。在一些实施方案中，另外的氨基酸是任何氨基酸。在一些实施方案中，另外的氨基酸是谷氨酰胺、天冬酰胺、焦谷氨酸、谷氨酸或脯氨酸。在一些实施方案中，野生型CXCL9是人类来源的。在一些实施方案中，修饰的CXCL9多肽包含如由SEQ ID NO:2-4中的任何一种所表示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本文描述的修饰的CXCL9多肽与免疫球蛋白(Ig)分子或Ig分子的片段连接。在一些实施方案中，免疫球蛋白是由SEQ ID No:5所表示的IgG-Fc:铰链-ch2-ch3。在一些实施方案中，本文描述的修饰的CXCL9多肽与免疫球蛋白(Ig)分子或Ig分子的片段连接，还包含在修饰的CXCL9与免疫球蛋白分子或其片段之间的接头。在一些实施方案中，免疫球蛋白或其片段是人类来源的。在一些实施方案中，接头包含一个或更多个甘氨酸氨基酸的链段(多G)或甘氨酸和丝氨酸氨基酸的链段(多GS)。在一些实施方案中，多GS是GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID No:6)。

在一些实施方案中，修饰的CXCL9多肽能够与CXCR3受体结合。在一些实施方案中，修饰的CXCL9多肽能够诱导CD8+T细胞。

在一些实施方案中，提供了包含与免疫球蛋白分子或Ig分子的片段缀合的CXCL9多肽(可以是野生型或修饰的)的融合蛋白。在一些实施方案中，免疫球蛋白或其片段是IgG-Fc:铰链-ch2-ch3。在一些实施方案中，CXCL9、免疫球蛋白分子或其片段是人类来源的。在一些实施方案中，融合蛋白还包含在CXCL9与免疫球蛋白或其片段之间的接头。接头可以是一个或更多个甘氨酸氨基酸的链段(多G)或甘氨酸和丝氨酸氨基酸的链段(多GS)。在一些实施方案中，多GS是GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID No:6)。

在一些实施方案中，融合蛋白能够与CXCR3受体结合。在一些实施方案中，融合蛋白能够诱导CD8+T细胞。CXCL9可通过引发干扰素γ(IFN-g)、肿瘤坏死因子α(TNFa)、颗粒酶-B、穿孔素和白细胞介素2(IL-2)的水平来诱导(增强)CD8+T细胞的活性。

在一些实施方案中，提供了一种治疗有相应需要的受试者的癌症的方法，该方法包括向有相应需要的受试者施用治疗量的本发明的修饰的CXCL9多肽或融合蛋白或包含其的药物组合物。在一些实施方案中，提供了包含本发明的修饰的CXCL9多肽或融合蛋白和药学上可接受的运载体的药物组合物。在一些实施方案中，该药物组合物适用于在治疗癌症中使用。

在一些实施方案中，提供了编码本发明的修饰的CXCL9多肽或融合蛋白的核酸分子。在一些实施方案中，提供了包含本文描述的核酸分子的载体。在一些实施方案中，载体是表达载体，还包含一种或更多种调节序列。

在一些实施方案中，载体或核酸可用于治疗有相应需要的受试者的癌症。在一些实施方案中，载体或核酸可用于治疗有相应需要的受试者的癌症。在一些实施方案中，提供了一种治疗有相应需要的受试者的癌症的方法，该方法包括向有相应需要的受试者施用治疗量的本发明的核酸分子或载体。在一些实施方案中，提供了包含本发明核酸分子的宿主细胞。在一些实施方案中，提供了用本发明的载体转化或转染的宿主细胞。在一些实施方案中，提供了包含本发明的修饰的CXCL9多肽或融合蛋白的宿主细胞。在一些实施方案中，提供了产生修饰的CXCL9多肽的方法，该方法包括：(i)在表达包含修饰的CXCL9的多肽的条件下培养包含本发明的核酸分子的宿主细胞；和(ii)从宿主细胞或从培养基中回收修饰的CXCL9多肽。

在本发明的一些实施方案中，以上描述的修饰的CXCL9多肽与免疫球蛋白或其片段连接。在本发明的一些实施方案中，提供了与免疫球蛋白或其片段连接的WT CXCL9多肽。

在本发明的一些实施方案中，提供了稳定化的CXCL9趋化因子，其是任选地包含多GS接头的CXCL9-Ig融合多肽。

在本发明的一些实施方案中，提供了一种修饰的CXCL9多肽，其包含在对应的WTCXCL9多肽的C末端***肽“GGGGS”SEQ ID No:7(四个甘氨酸和一个丝氨酸)的一个或更多个串联重复。一个或更多个GGGGS单元的***在这里被称为多GS。

在本发明的实施方案中，提供了一种修饰的CXCL9多肽，其包含在对应WT CXCL9多肽的C-末端***甘氨酸和丝氨酸氨基酸的一个或更多个单元的链段(多GS)。

在本发明的一些实施方案中，以上描述的修饰的CXCL9多肽与免疫球蛋白或其片段连接。在本发明的一些实施方案中，提供了与免疫球蛋白或其片段连接的WT CXCL9多肽。在本发明的一些实施方案中，提供了与非蛋白质部分连接的WT CXCL9多肽。在本发明的一些实施方案中，提供了与非蛋白质部分连接的修饰的CXCL9多肽。

附图简述

本文通过参考随附附图，仅通过示例性方式描述了本发明。现详细具体参考附图，应强调的是，所示的细节仅以示例的方式并且仅用于本发明的优选实施方案的说明性讨论的目的，并且为了提供被认为是本发明的原理和概念方面的最有用和容易理解的描述是什么而呈现。在这一点上，除了试图示出对本发明的基本理解所需的内容之外，不试图更详细地示出本发明的结构细节，结合附图的描述，使得本发明的若干种形式如何可以在实践中实施对于本领域技术人员来说是明显的。

在附图中：

图1示出，CXCL9抑制Hela(人类宫颈细胞癌)的增殖。将Hela细胞接种在96孔板中的补充有10％FCS、青霉素、链霉素和谷氨酸的RPMI培养基中(每孔2x10⁴个细胞)。接种后24h，用补充有不同浓度小鼠CXCL9(Peprotech Cat#250-18)的新鲜培养基替换培养基，如图所指示的或不处理(WO)。24小时后，根据制造厂说明(Biological Industries，cat#20-300-1000)进行XTT测定。在与XTT底物孵育2小时后进行OD测量。每个处理用六个孔进行测定。

图2A-图2C示出了用CXCL9-Ig处理的C57Bl/6小鼠与对照组相比的肿瘤进展和死亡率分析。

小鼠(14只8周龄雌性)在后背皮下注射3.5x10⁵个Ret细胞。在第3天，将小鼠分为5个组，每组7只雌性。每组用CXCL9-Ig或用同种型匹配的对照IgG处理(每周3次，40μg/小鼠)(根据摩尔调整校准)。在第9天，从每组中减去一只没有肿瘤发展的小鼠。在第23天，疗法被终止，并继续追踪小鼠的死亡率。图2A示出肿瘤尺寸为平均尺寸±SD(长x宽x高)x0.52。图2B示出了第17天的分散分析(scattered analyses)。图2C示出了死亡率曲线。*P≤0.05被认为是显著的。

详细实施方案的描述

本文教导的原理、用途和实现可以参照所附描述和图被更好地理解。在仔细阅读本文中的描述和图后，本领域的技术人员能够不用过多努力或实验就实现本文的教导。在附图中，相同的附图标记自始至终指代相同的部分。

定义

为了便于理解本发明，一些术语和措辞定义如下。应当理解，这些术语和短语是为了描述而不是限制的目的，使得本说明书的术语或短语将由本领域技术人员根据本文呈现的教导和指导，结合本领域普通技术人员的知识来解释。

如本文提及的，术语“多核苷酸分子”、“寡核苷酸”、“多核苷酸”、“核酸”和“核苷酸”序列可以互换使用。这些术语涉及脱氧核糖核苷酸(DNA)、核糖核苷酸(RNA)及其修饰形式的聚合物，所述聚合物呈单独的片段或作为更大的构建体的组分、线性或支链、单链(ss)、双链(ds)、三链(ts)或其杂合体的形式。多核苷酸可以是例如DNA或RNA的多核苷酸序列。DNA或RNA分子可以是，例如，但不限于：互补的DNA(cDNA)、基因组DNA、合成的DNA、重组DNA、或其杂合体，或者RNA分子，诸如，例如，mRNA。因此，如本文使用的，术语“多核苷酸分子”、“寡核苷酸”、“多核苷酸”、“核酸”和“核苷酸”序列意在指DNA和RNA分子两者。这些术语还包括由天然存在的碱基、糖和共价的核苷间键组成的寡核苷酸，以及具有非天然存在的部分的寡核苷酸，所述非天然存在的部分发挥类似于相应的天然存在的部分的功能。如本文使用的，核苷酸(A、G、C或T)和核苷酸序列以小写字母(a、g、c或t)标记。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，以指氨基酸残基的聚合物。这些术语还适用于其中一个或更多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。在一些实施方案中，多肽中的一个或更多个氨基酸残基可以包含修饰，诸如但不仅限于糖基化、磷酸化或二硫键形状。还提供了本文公开的肽和蛋白质分子的保守氨基酸变体。也可以制备根据本发明的变体，其保留编码的蛋白质或肽的整体分子结构。考虑到组成所公开的蛋白产物的单个氨基酸的特性，技术人员将认识到一些合理的取代。氨基酸取代，即“保守取代”，可以例如基于所涉及残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性来进行。如本文使用的，氨基酸和肽序列使用常规氨基酸命名法(单字母或三字母代码)进行标记。例如，氨基酸“丝氨酸”可以标记为“Ser”或“S”，并且氨基酸“半胱氨酸”可以标记为“Cys”或“C”。

如本文提及的，术语“互补性”是指核酸链之间的碱基配对。如本领域已知的，核酸的每一条链可以与另一条链互补，因为链之间的碱基对经由两个或三个氢键非共价连接。在相对的互补的核酸链上通过氢键连接的两个核苷酸被称为碱基对。根据Watson-CrickDNA碱基配对，腺嘌呤(A或a)与胸腺嘧啶(T或t)形成碱基对，并且鸟嘌呤(G或g)与胞嘧啶(C或c)形成碱基对。在RNA中，胸腺嘧啶被尿嘧啶(U或u)替换。两条核酸链之间的互补性程度可以根据在链之间形成碱基对的核苷酸的数目(或百分比)而变化。例如，“100％互补性”指示，每条链中的所有核苷酸都与互补链形成碱基对。例如，“95％互补性”指示，每条链中95％的核苷酸与互补链形成碱基对。术语充分互补性可包括约30％至约100％的任何百分比的互补性。

如本文使用的，术语“构建体”是指人工组装或分离的核酸分子，其可包含一个或更多个核酸序列，其中核酸序列可以是编码序列(即，编码终产物的序列)、调节序列、非编码序列或其任何组合。术语构建体包括，例如，载体、质粒，但不应被视为限于此。在一些实施方案中，术语“调节序列”指的是DNA序列，其对于实现与其可操作地连接(link)(连接(connect)/连接(ligate))的编码序列的表达是必需的。调节序列的性质取决于宿主细胞而不同。例如，在原核生物中，调节/控制序列可以包括启动子、核糖体结合位点和/或终止子。例如，在真核生物中，调节/控制序列可以包括启动子、终止子、增强子、反式激活子和/或转录因子。与编码序列“可操作地连接”的调节序列以使得在合适的条件下实现编码序列的表达的方式连接。在一些实施方案中，“构建体”或“DNA构建体”是指人工组装或分离的核酸分子，其包含感兴趣的编码区和任选的另外的调节或非编码序列。

如本文使用的，术语“载体”是指可用于转化(即将异源DNA引入宿主细胞)目的的任何重组多核苷酸构建体(诸如DNA构建体)。一种示例性类型的载体是“质粒”，其是指可以将另外的DNA区段连接到其中的环状双链DNA环。另一示例性类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们被引入的宿主细胞中自主复制。术语“表达载体”是指具有将异源核酸片段(诸如DNA)整合到外来细胞中并使其在外来细胞中表达的能力的载体。换句话说，表达载体包括能够在靶细胞中转录或表达的核酸序列/片段(诸如DNA、mRNA)。许多病毒、原核和真核表达载体是已知的和/或商购可得的。选择适当的表达载体在本领域技术人员的知识范围内。表达载体可以包含一个或更多个调节序列。

如本文使用的，“引物”定义了能够与靶核苷酸序列退火(杂交)，从而产生可在适合的条件下作为DNA合成的起始点的双链区的寡核苷酸。

如本文使用的，术语“转化”是指将外源DNA引入细胞。术语“转化体”或“转化细胞”包括原代转化细胞和来源于该细胞的培养物，而无论转移的次数。由于有意或无意的突变，所有后代的DNA内容可能不完全相同。具有与在最初转化细胞中筛选的功能相同的突变后代被包括在转化体的定义中。

如本文使用的，术语“引入”和“转染”可以互换使用，并且指将分子，诸如，例如核酸、多核苷酸分子、载体等转移到靶细胞中，并且更具体地转移到靶细胞的膜封闭空间的内部。分子可以通过本领域技术人员已知的任何手段“引入”到靶细胞中，例如如Sambrook等人Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(2001)所教导的，其内容通过引用并入本文。将分子“引入”细胞的方法包括，例如，但不限于：热激、磷酸钙转染、PEI转染、电穿孔、脂质体转染、转染试剂、病毒介导的转移、注射等或其组合。细胞的转染可以对任何来源的任何细胞类型进行，诸如，例如人类细胞、动物细胞、植物细胞等。细胞可以是分离的细胞、组织培养的细胞、细胞系、存在于生物体中的细胞等。

如本文使用的，术语“上游”和“下游”是指在核苷酸序列，诸如，例如，DNA序列或RNA序列中的相对位置。如众所周知的，核苷酸序列具有5’末端和3’末端，这样的命名是针对核苷酸主链的糖(脱氧核糖或核糖)环上的碳原子。因此，关于核苷酸序列上的位置，术语下游是指朝向序列的3’末端的区域。术语上游是指朝向链的5’末端的区域。

如本文使用的，术语“治疗”包括但不限于以下一种或更多种：消除、改善、抑制、减弱、阻断、阻抑、减少、延迟、停止、减轻或阻止与状况相关的症状。每一种可能性代表本发明的单独的实施方案。在一些实施方案中，状况是癌症。在一些示例性实施方案中，状况可以选自黑素瘤或转移性黑素瘤等。

术语“CXCL9”可与本领域已知的该蛋白的任何替代名称或同义词互换。该术语指蛋白或多肽，主要指人类蛋白。这些术语还指编码对应多肽的核酸。CXCL9的氨基酸序列和编码核苷酸序列在本领域是熟知的。核酸序列可以在像NCBI这样的公共数据库中检索。在一些实施方案中，智人(Homo sapiens)野生型(WT)CXCL9对应于SEQ ID NO:8。

术语“野生型CXCL9”、“WT CXCL9”、“天然存在的CXCL9”和“未修饰的CXCL9”可以互换使用。这些术语指的是天然存在的CXCL9形式(即内源性、未突变的CXCL9或全长CXCL9)。在一些实施方案中，WT-CXCL9是哺乳动物来源的。在一些实施方案中，WT-CXCL9是人类来源的。在一些实施方案中，人类来源的WT-CXCL9具有SEQ ID NO:8所表示的氨基酸序列。SEQID NO:9中列出的多核苷酸序列对应于编码SEQ ID NO:8中列出的人类WT CXCL9的cDNA。

如本文使用的，术语“修饰的CXCL9”、“突变的CXCL9”、“非天然存在的CXCL9”可以互换使用。这些术语涉及CXCL9的对应野生型(WT)或天然形式的突变/修饰形式。在一些实施方案中，CXCL9是人类来源的，并且其被称为“修饰的hCXCL9”、“突变的hCXCL9”、“非天然存在的hCXCL9”或“修饰的CXCL9”、“突变的CXCL9”、“非天然存在的CXCL9”。在一些实施方案中，CXCL9是哺乳动物来源的。在一些实施方案中，修饰的CXCL9通过选自一个或更多个氨基酸取代、***和/或缺失的至少一个突变不同于对应的野生型CXCL9。在本发明的一些实施方案中，修饰的CXCL9多肽可以与免疫球蛋白(Ig)或其片段缀合。在本发明的一些实施方案中，Ig可以是IgG或其片段，但不限于IgG-Fc:铰链-ch2-ch3。这样的缀合修饰的CXCL9多肽在此也被定义为修饰的CXCL9多肽，并且可以互换地定义为修饰的CXCL9-Ig多肽。在本发明的一些实施方案中，术语“修饰的CXCL9-Ig多肽”或“修饰的CXCL9多肽”也指具有多G或多GS接头的CXCL9多肽或CXCL9-Ig多肽。在一些实施方案中，术语“修饰的CXCL9-Ig多肽”或“修饰的CXCL9多肽”还包括与Ig或与非蛋白质部分(例如，PEG)缀合，用或不用接头的WT CXCL9多肽或突变体CXCL9多肽的嵌合体或缀合物。在一些实施方案中，修饰的CXCL9是在CXCL9的N-末端***了另外的氨基酸的人类WT CXCL9。在一些实施方案中，***的氨基酸可以是任何氨基酸。在一些实施方案中，***的氨基酸是谷氨酰胺、天冬酰胺、焦谷氨酸、谷氨酸或脯氨酸。在一些实施方案中，另外的氨基酸是苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸或甘氨酸。

本发明的实例示出，趋化因子CXCL9可用于治疗或抑制癌症疾病。在本发明的一些实施方案中，CXCL9、CXCL9-Ig和修饰的CXCL9多肽诱导抗肿瘤CD8+T细胞，并通过这样做抑制癌症疾病，例如但不限于***、黑素瘤和结肠直肠癌。在本发明的一些实施方案中，CXCL9、CXCL9-Ig和修饰的CXCL9多肽限制或预防癌症。在本发明的一些实施方案中，CXCL9、CXCL9-Ig和修饰的CXCL9多肽限制、抑制或预防癌症疾病，诸如结肠直肠癌、卵巢癌、骨肉瘤(OS)、***、黑素瘤、肺癌、头颈癌和肝细胞癌(HCC)。

在本发明的一些实施方案中，提供了基于CXCL9-Ig的融合蛋白。在本发明的一些实施方案中，提供了基于CXCL9-Ig的融合蛋白，其中CXCL9是修饰的人类CXCL9多肽。

在一些实施方案中，本发明的修饰的CXCL9多肽或修饰的CXCL9-Ig多肽能够与CXCR3受体结合。

在一些实施方案中，修饰的CXCL9多肽或修饰的CXCL9-Ig多肽能够诱导CD8+T细胞。“诱导”意指细胞活性的增强或放大，包括但不限于细胞毒性。

在一些实施方案中，人类CXCL9野生型(WT)的序列如下在SEQ ID No.8列出：

hCXCL9-WT

蛋白序列

在本发明的一些实施方案中，编码hCXCL9 WT的cDNA序列如在SEQ ID No:9中列出：

在本发明的一些实施方案中，提供了包含多G或多GS链的修饰的hCXCL9多肽。在一些实施方案中，提供了一种修饰的CXCL9多肽，其包含在对应WT CXCL9多肽的C-末端***甘氨酸和丝氨酸氨基酸的链段，其可以是4个甘氨酸和1个丝氨酸的单元链(多GS)。

如本文使用的，“氨基酸”的“链段”意指排列成链的多于一个氨基酸，每个氨基酸通过肽键连接到前面的氨基酸。链的氨基酸可以是天然或非天然存在的，或者可以包含它们的混合物。在一些实施方案中，每个“链段”包含两个或更多个彼此相邻或彼此接近的氨基酸残基(即，在氨基酸序列的一级或三级结构中)。

在本发明的一些实施方案中，具有多G的修饰的hCXCL9多肽包含如在SEQ ID No:10中列出的序列：

突变体1-hCXCL9-多GS-在hCXCL9 C-末端***多GS序列。

hCXCL9-多GS突变体的蛋白序列

在本发明的一些实施方案中，编码如在SEQ ID No:10中列出的修饰的CXCL9多肽的cDNA序列在SEQ ID No:11中列出。

hCXCL9-多GS突变体的cDNA序列：

/>

在一些实施方案中，CXCL9或修饰的CXCL9多肽包括IgG-Fc:铰链-ch2-ch3。

在一些实施方案中，IgG-Fc:铰链-ch2-ch3是如在SEQ ID No:5中列出的人类IgG-Fc:铰链-ch2-ch3。

SEQ ID No:5

hIgG-Fc:铰链-ch2-ch3

蛋白：

hIgG-Fc:铰链-ch2-ch3的cDNA

在本发明的一些实施方案中，提供了具有多GS和IgG-Fc的修饰的hCXCL9。在一些实施方案中，Ig是IgG-Fc:铰链-CH2-CH3。在一些实施方案中，可以使用IgG-Fc:铰链-CH1-CH2-CH3。

在一些实施方案中，人类CXCL9或修饰的CXCL9多肽包含人类IgG-Fc序列或其片段，产生基于CXCL9-Ig的融合蛋白或修饰的CXCL9-Ig多肽。

在本发明的一些实施方案中，可以将多G或多GS接头添加到CXCL9或突变的CXCL9。在一些实施方案中，一个或更多个重复GGGGS(SEQ IDNo:7)的序列被添加。接头将***CXCL9的Fc和c末端部分之间。接头可以是如在SEQ ID No:7中列出的GGGGS单元、两个或更多个重复单元，诸如例如如在GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID No:6)中列出的三个单元(如Shen，Z等人Anal Chem 77，6834-6842(2005)和Kim等人PloS one 9，e113442(2014)描述的)。在一些实施方案中，包含至少两个甘氨酸的接头被添加。在一些实施方案中，包含2-20个甘氨酸之间的接头被添加。

在一些实施方案中，本发明涉及在位置2具有脯氨酸的任何趋化因子，诸如hCXCL9或hCXCL10。在一些实施方案中，提供了一种通过在N-末端***一个氨基酸以将位置2的脯氨酸移动到位置3来阻断hCXCL9或任何其他具有在位置2(P2)的脯氨酸的趋化因子(诸如hCXCL10)的N-末端的DPP4蛋白水解性裂解的方法(DPP4是一种在C-末端的位置2特异性裂解脯氨酸的外肽酶)。在一些实施方案中，***的氨基酸是谷氨酰胺、天冬酰胺、焦谷氨酸、谷氨酸或脯氨酸。潜在地，可以使用所有可以***到N-末端而不干扰信号肽酶裂解(去除N-末端)的氨基酸。

在一些实施方案中，提供了修饰的人类CXCL9多肽，其中可以是任何氨基酸的氨基酸被***到位置2的脯氨酸之前。

在一些实施方案中，***的氨基酸是谷氨酰胺、天冬酰胺、焦谷氨酸、谷氨酸或脯氨酸。***导致脯氨酸移动到位置3，从而阻止被DPP4的裂解。在一些实施方案中，谷氨酰胺被***在hCXCL9的N-末端。根据本发明的一些实施方案，这样的修饰的CXCL9多肽的序列如在SEQ ID No:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3或SEQ ID No:4中示出：

突变体-1：hCXCL9在N-末端***X氨基酸(X可以是任何氨基酸)

包含信号肽的蛋白序列：

CXCL9的信号肽用斜体表示。Xaa紧接在被认为是位置0的信号肽裂解位点之后***。

在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID No.2的序列：

突变体2：hGln-CXCL9-在hCXCL9 N-末端的位置0处***Gln

Gln-CXCL9-Ig突变体的蛋白序列：

在一些实施方案中，并且作为实例，编码在N-末端具有GLN***的hCXCLl9的cDNA序列如下在SEQ ID No.12列出：

hGln-CXCL9突变体的cDNA序列：

在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID No.3的序列：

突变体3：Asn-CXCL9-在hCXCL9 N-末端的位置0处***Asn

Asn-CXCL9突变体的蛋白序列：

在一些实施方案中，并且作为实例，编码在N-末端具有Asn***的hCXCL9的cDNA序列如下在SEQ ID No:22列出：

Asn-CXCL9突变体的cDNA序列：

在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID No:4的序列：

突变体4：hPro-CXCL9-在hCXCL9 N-末端的位置0处***Pro

hPro-CXCL9突变体的蛋白序列：

在一些实施方案中，并且作为实例，编码在N-末端具有Pro***的hCXCLl9的cDNA序列如下在SEQ ID No:23列出：

Pro-CXCL9突变体的cDNA序列：

在本发明的一些实施方案中，本发明的任何修饰的人类CXCL9多肽或WT CXCL9可以与Ig(可以是IgG或其片段)缀合。在本发明的一些实施方案中，IgG是但不限于IgG-Fc:铰链-ch2-ch3。

例如，在各种实施方案中，肽与免疫球蛋白的Fc部分连接(例如，以促进抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC))。在一些实施方案中，CXCL9与IgG抗体的Fc区连接。在一些实施方案中，CXCL9与人类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4同种型的Fc区连接。

如本文使用的，“免疫球蛋白Fc区”是指包含免疫球蛋白的重链恒定区2(CH2)和重链恒定区3(CH3)的蛋白，不包括免疫球蛋白的重链和轻链可变区、重链恒定区1(CH1)和轻链恒定区1(CL1)。它还可以包含重链恒定区处的铰链区。此外，除了免疫球蛋白的重链和轻链的可变区之外，本发明的免疫球蛋白Fc区可以包含含有重链恒定区1(CH1)和/或轻链恒定区1(CL1)的Fc区的一部分或全部，只要其具有基本上类似于或优于天然形式的作用。此外，它可以是在CH2和/或CH3的氨基酸序列的相对长的部分中具有缺失的区。即，本发明的免疫球蛋白Fc区可以包含1)CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域，2)CH1结构域和CH2结构域，3)CH1结构域和CH3结构域，4)CH2结构域和CH3结构域，5)一个或更多个结构域和免疫球蛋白铰链区(或铰链区的一部分)的组合，以及6)重链恒定区和轻链恒定区的每个结构域的二聚体。

免疫球蛋白Fc区用作药物运载体是安全的，因为它是一种在体内代谢的可生物降解的多肽。此外，与整个免疫球蛋白分子相比，免疫球蛋白Fc区具有相对低的分子量，并且因此，它在缀合物的制备、纯化和产量方面是有利的。免疫球蛋白Fc区不包含Fab片段，该片段由于不同氨基酸序列(根据抗体亚类)而高度非同质，并且因此可以预期免疫球蛋白Fc区可以大大增加物质的同质性，并且在血液中抗原性较低。

免疫球蛋白Fc区可以来源于人类或其他动物，包括牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠和豚鼠，并且优选地人类。此外，免疫球蛋白Fc区可以是来源于IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的Fc区，或者由其组合物(combinations)或杂合物(hybrids)制成。优选地，它来源于IgG或IgM，IgG或IgM是人类血液中最丰富的蛋白之一，并且最优选地，来源于已知能增强配体结合蛋白半衰期的IgG。

IgG分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚类，并且本发明包括它们的组合物和杂合物。优选的是IgG1和IgG4亚类，并且最优选的是很少具有效应物功能诸如CDC(补体依赖性细胞毒性)的IgG4 Fc区。

同时，免疫球蛋白Fc区可以是具有天然糖链、与天然形式相比增加的糖链或与天然形式相比减少的糖链的形式，或者可以是去糖基化的形式。免疫球蛋白Fc糖链的增加、减少或去除可以通过本领域常见的方法来实现，诸如化学方法、酶促方法和使用微生物的遗传工程方法。这里，从Fc区去除糖链导致与补体(c1q)的结合亲和力急剧降低，以及抗体依赖性细胞介导的细胞毒性或补体依赖性细胞毒性降低或损失，从而不会在体内诱导不必要的免疫应答。在这方面，去糖基化或非糖基化形式的免疫球蛋白Fc区可以更适合作为药物运载体的本发明的目的。

如本文使用的，“去糖基化”意指酶促地从Fc区去除糖部分，并且“非糖基化”意指Fc区是由原核生物，优选地大肠杆菌(E.coli)以未糖基化的形式产生。

此外，本发明的免疫球蛋白Fc区包含其序列衍生物(突变体)以及天然氨基酸序列。氨基酸序列衍生物具有由于一个或更多个氨基酸残基的缺失、***、非保守或保守取代或其组合而不同于天然氨基酸序列的序列。例如，在IgG Fc中，在位置214至238、297至299、318至322或327至331的已知在结合中重要的氨基酸残基可以用作修饰的合适靶。此外，其他各种衍生物是可能的，包括具有能够形成二硫键的区缺失、天然Fc形式的N-末端处的若干氨基酸残基缺失或添加甲硫氨酸残基到天然Fc形式的N-末端的衍生物。此外，为了去除效应物功能，可以在补体结合位点发生缺失，诸如C1q结合位点和ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)位点。制备这样的免疫球蛋白Fc区序列衍生物的技术在WO 97/34631和WO96/32478中公开。

如果期望，Fc区可以通过磷酸化、硫酸化、丙烯酰化、糖基化、甲基化、法尼基化、乙酰化、酰胺化等被修饰。在本发明的一些实施方案中，本发明的CXCL9和IgG和/或可用于延长本发明的变体在血清中半衰期的任何其他蛋白通过接头连接。在本发明的一些实施方案中，接头是在2-30个氨基酸之间的序列。在本发明的一些实施方案中，接头是在2-20个氨基酸之间的序列。在本发明的一些实施方案中，接头是在2-10个氨基酸之间的序列。在一些实施方案中，接头是如本文描述的多G或多GS接头。

可以根据本发明的这一方面使用的异源氨基酸序列的实例是免疫球蛋白氨基酸序列，诸如免疫球蛋白重结构域的铰链和Fc区(参见美国专利第6,777,196号)。本发明这一方面的嵌合体中的免疫球蛋白部分可以从IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型、IgA、IgE、IgD或IgM中获得，如下文进一步讨论的。

通常，在这样的融合物中，嵌合分子将保留至少功能活性铰链以及免疫球蛋白重链恒定区的CH2和CH3结构域。融合物也可以产生到恒定结构域Fc部分的C-末端，或者紧邻重链的CH1或轻链的对应区的N-末端。

尽管将整个重链恒定区与本发明的CXCL9氨基酸序列缀合可以是可能的，但融合较短的序列是优选的。例如，从木瓜蛋白酶裂解位点(其化学上定义IgG Fc)；残基216(将重链恒定区的第一个残基取为114)或其他免疫球蛋白的类似位点上游的铰链区开始的序列可用于融合。在特定实施方案中，CXCL9氨基酸序列融合到铰链区以及CH2和CH3，或融合到IgG2或IgG3重链的CH1、铰链、CH2和CH3结构域(参见美国专利第6,777,196号)。

例如，编码本发明的CXCL9肽的核酸序列在框内(in frame)连接到免疫球蛋白cDNA序列。应当理解，也可以使用基因组免疫球蛋白片段的连接。在这种情况下，融合物需要免疫球蛋白调节序列的存在才能表达。编码IgG重链恒定区的cDNA可以通过杂交或通过聚合酶链式反应(PCR)技术，基于来自脾或外周血淋巴细胞的cDNA文库的公开序列被分离。

在一些实施方案中，本发明进一步构思将修饰的CXCL9或WT CXCL9包含在复合物中，其中修饰的CXCL9或WT CXCL9附接到蛋白质(例如，异源氨基酸序列)，或者其中的每一个都能够延长组合物在循环中的半衰期。这样的分子是高度稳定的，对体内蛋白水解活性具有抗性，并且可以使用常见固相合成来产生。还可以使用另外的重组技术，由此对重组肽产物进行体外修饰(例如，如下文进一步描述的PEG化)。

本文使用的措辞“非蛋白质部分”是指附接到以上描述的CXCL9氨基酸序列的分子。根据一些实施方案，非蛋白质部分可以是聚合物或共聚物(合成的或天然的)。本发明的非蛋白质部分的非限制性实例包括聚乙二醇(PEG)或其衍生物、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、白蛋白、二乙烯基醚和马来酸酐共聚物(DIVEMA)；聚唾液酸(PSA)和/或聚(苯乙烯共马来酸酐)(SMA)。此外，可以使用能够保护CXCL9或修饰的CXCL9免受环境影响并因此保持其稳定性的复合物，包括例如脂质体或胶束也被包括在本发明中。

根据本发明的一些实施方案，本发明的修饰的CXCL9或WT CXCL9附接到非蛋白质部分(其可充当缓释增强剂)。示例性缓释增强剂包括但不限于透明质酸(HA)、海藻酸(AA)、聚甲基丙烯酸羟乙酯(聚-HEMA)、甘醇二甲醚和聚异丙基丙烯酰胺。

将修饰的CXCL9或WT CXCL9附接到其它非氨基酸剂可以通过共价连接或通过非共价络合(complexion)，例如通过络合到可以被降解或裂解产生能够持续释放的化合物的疏水性聚合物。这种缔合可以通过将氨基酸序列包封在其它组分(脂质体、胶束)中或将氨基酸序列浸渍在聚合物中来产生本发明的最终肽。

在一些实施方案中，PEG衍生物是PEG羧酸的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯、羧甲基化PEG的琥珀酰亚胺酯(SCM-PEG)、PEG的苯并***碳酸酯衍生物、PEG的缩水甘油醚、PEG对硝基苯基碳酸酯(PEG-NPC，诸如甲氧基PEG-NPC)、PEG醛、PEG-邻吡啶基-二硫化物、羰基二咪唑活化的PEG、PEG-硫醇、PEG-马来酰亚胺。也可以使用PEG-马来酰亚胺、PEG-乙烯基砜(VS)、PEG-丙烯酸酯(AC)或PEG-邻吡啶基二硫化物。

在本发明的一些实施方案中，提供了包含如本文描述的修饰的CXCL9多肽以及药学上可接受的运载体的药物组合物，该修饰的CXCL9多肽任选地与Ig缀合，用或不用接头，该接头可以是多G或GGGGS(SEQ ID No:7)的一个、两个、三个或更多个重复单元的序列。在一些实施方案中，修饰的CXCL9多肽或WT CXCL9如以上描述与非蛋白质部分或蛋白质部分连接。

在本发明的一些实施方案中，提供了一种治疗癌症的方法，包括向有需要的受试者施用药物组合物的步骤，该药物组合物包含如本文描述的修饰的CXCL9多肽以及药学上可接受的运载体，该修饰的CXCL9多肽任选地与Ig缀合，用或不用接头。

在本发明的一些实施方案中，可将任选地与Ig缀合的突变的人类CXCL9与另一抗癌治疗组合向有需要的受试者施用，另一抗癌治疗诸如但不限于，诸如细胞或非细胞免疫治疗，如免疫检查点抑制剂、癌症疫苗、缀合的抗体、双特异性T细胞衔接物、双特异性NK细胞衔接物、溶瘤病毒、‘吃我(eat me)’信号、‘发现我(find me)’信号或其他，或非免疫治疗抗癌治疗，包括化学疗法、生物疗法如例如酪氨酸激酶抑制剂、抗血管生成疗法、激素疗法、放射疗法或手术。

在本发明的一些实施方案中，提供了编码本发明的修饰的CXCL9多肽的核酸分子。

在本发明的一些实施方案中，提供了包含编码本发明的修饰的CXCL9多肽的核酸分子的载体。载体是表达载体，还包含一种或更多种调控序列。

在本发明的一些实施方案中，本发明的核酸分子或载体可用于治疗有相应需要的受试者的癌症。

在本发明的一些实施方案中，提供了包含本发明核酸分子的宿主细胞。在本发明的一些实施方案中，提供了用本发明的载体转化或转染的宿主细胞。在本发明的一些实施方案中，提供了包含本发明的修饰的CXCL9多肽的宿主细胞。

在本发明的一些实施方案中，提供了产生修饰的CXCL9多肽的方法，该方法包括：(i)在表达包含修饰的CXCL9的多肽的条件下培养包含编码修饰的CXCL9多肽的核酸的宿主细胞；和(ii)任选地从宿主细胞或从培养基中回收修饰的CXCL9。

根据一些实施方案，向受试者的任何合适的施用途径可用于本发明的核酸、多肽或组合物，包括但不限于局部和全身途径。示例性的合适施用途径包括但不限于：口服、鼻内、肠胃外、静脉内、表面(topically)、灌肠或通过吸入。根据另一种实施方案，组合物的全身施用是通过注射。对于通过注射的施用，组合物可以在水性溶液中配制，例如在生理相容的缓冲液中配制，缓冲液包括但不限于Hank氏溶液、林格氏溶液或生理盐缓冲液。用于注射的制剂可以以单位剂型呈现，例如，以安瓿或以任选地添加防腐剂的多剂量容器。

根据另一种实施方案，全身施用是通过肠胃外途径。根据一些实施方案，肠胃外施用是静脉内、动脉内、肌肉内、腹膜内、皮内、玻璃体内或皮下施用。上面提到的施用途径中的每一个都代表本发明的单独实施方案。根据另一种实施方案，通过团注注射进行肠胃外施用。根据另一种实施方案，通过连续输注进行肠胃外施用。根据一些实施方案，用于肠胃外施用的本发明组合物制品包括无菌水性或非水性溶液、悬浮液或乳剂，每种都代表本发明的单独实施方案。非水性溶剂或媒介物的非限制性实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油诸如橄榄油和玉米油、明胶以及可注射有机酯诸如油酸乙酯。

根据另一种实施方案，肠胃外施用是经粘膜施用。根据另一种实施方案，经粘膜施用是经鼻施用。对于经粘膜施用，在制剂中使用适于待渗透的屏障的渗透剂。这样的渗透剂通常是本领域已知的。优选的施用方式将取决于所治疗的具体适应症，并且对于本领域技术人员将是明显的。

水性注射悬浮液可以包含增加悬浮液粘度的物质，诸如羧甲基纤维素钠、山梨醇或右旋糖酐。任选地，悬浮液还可以包含合适的稳定剂或增加活性成分的溶解度以允许制备高度浓缩的溶液的剂。

根据另一种实施方案，配制用于注射的组合物可以是在油性或水性媒介物中的溶液、悬浮液、分散体或乳液的形式，并且可以包含配制剂，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。合适的亲脂性溶剂或媒介物的非限制性实例包括脂肪油诸如芝麻油，或合成的脂肪酸酯诸如油酸乙酯或甘油三酯。

根据另一种实施方案，组合物静脉内施用，并且因此以适于静脉内施用的形式配制。根据另一种实施方案，组合物动脉内施用，并且因此以适于动脉内施用的形式配制。根据另一种实施方案，组合物肌肉内施用，并且因此以适于肌肉内施用的形式配制。

根据另一个实施方案，全身施用是通过肠内途径。根据另一种实施方案，通过肠内途径的施用是含服施用(buccal administration)。根据另一个实施方案，通过肠内途径的施用是口服施用。根据一些实施方案，组合物被配制成用于口服施用。

根据一些实施方案，口服施用呈硬或软明胶胶囊、药丸、胶囊、片剂的形式，包含包衣片剂、锭剂、酏剂、悬浮液、液体、凝胶、浆体、糖浆或吸入和其控释形式。

根据一些实施方案，用于口服施用的合适运载体在本领域是熟知的。用于口服使用的组合物可如下制成：使用固体赋形剂，任选地研磨所得混合物，并且在如需要地添加适合的助剂之后加工颗粒混合物，以获得片剂或锭剂芯。适合的赋形剂的非限制性实例包括填充剂诸如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇，纤维素制品诸如，玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、和羧甲基纤维素钠和/或生理上可接受的聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。

在一些实施方案中，如需要，可添加崩解剂，诸如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐诸如藻酸钠。例如，可配制用于在分配器中使用的明胶的胶囊和药筒(cartridges)，该明胶的胶囊和药筒包含本发明的组合物和合适的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。

根据一些实施方案，用于口服施用的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉末和颗粒。在这样的固体剂型中，使本发明的组合物与至少一种惰性的药学上可接受的运载体诸如蔗糖、乳糖或淀粉混合。如其通常的做法，这样的剂型还可以包括除了惰性稀释剂之外的另外的物质，例如，润滑剂，诸如硬脂酸镁。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型还可以包括缓冲剂。可另外地制备带有肠溶包衣的片剂和药丸。

在一些实施方案中，用于口服施用的液体剂型还可以包含辅料，诸如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、和增甜剂、调味剂和增香剂。根据一些实施方案，组合物的肠包衣还用于口服或含服施用。如本文使用的，术语“肠包衣”指控制组合物在消化***中吸收的位置的包衣。用于肠包衣的材料的非限制性实例是脂肪酸、蜡、植物纤维或塑料。

根据一些实施方案，施用是表面施用。根据一些实施方案，组合物被配制成用于表面施用。如本文使用的术语“表面施用”是指向身体表面施用。用于表面使用的制剂的非限制性实例包括乳膏、软膏、洗剂、凝胶、泡沫、悬浮液、水性或共溶剂溶液、药膏和可喷雾液体形式。本发明组合物的其它合适的表面产品形式包括例如乳液、摩丝、洗剂、溶液和血清。

根据一些实施方案，施用可以包括任何合适的施用方案，尤其取决于医疗状况、患者特征、施用途径等。在一些实施方案中，施用可以包括每天施用两次、每天施用一次、每隔一天施用一次、每三天施用一次、每四天施用一次、每五天施用一次、每周施用一次、每两周施用一次、每三周施用一次、每月施用一次等。

根据一些实施方案，当用于治疗癌症时，修饰的CXCL9多肽、编码该多肽的核酸和/或包含该多肽或核酸分子的组合物可以与其他治疗剂组合使用。这样组合的组分可以通过任何合适的施用途径以单独的或组合的药物制剂顺序地或同时地/伴随地施用。

根据一些实施方案，提供了包含修饰的CXCL9多肽和/或编码该多肽的核酸分子和/或本文公开的组合物的试剂盒。这样的试剂盒可以用于例如癌症的治疗。

在一些实施方案中，本发明的药物组合物可以与其他免疫检查点阻断剂(诸如但不限于抗PD-1)组合施用。在一些实施方案中，组合治疗可用于其中抗PD-1本身没有取得显著成功的肿瘤，诸如神经胶质瘤和三阴性乳腺癌。

在本申请的说明书和权利要求书中，词语“包含”和“具有”及其形式，不限于该词语可关联的列表中的成员。

如本文所使用的，术语“包含”包括术语“由……组成”。

如本文使用的，术语“约”可用于将量或参数(例如要素的长度)的值指定为在给定(陈述)值附近的连续值范围内(并包括给定(陈述)值)。根据一些实施方案，“约”可以将参数的值指定为给定值的80％和120％之间。根据一些实施方案，“约”可以将参数的值指定为给定值的90％和110％之间。根据一些实施方案，“约”可以将参数的值指定为给定值的95％和105％之间。

如本文使用的，根据一些实施方案，术语“基本上(substantially)”和“约”可以互换。

尽管以上已经讨论了许多示例性方面和实施方案，但本领域技术人员将认识到某些修改、排列、添加及其子组合。因此意图的是，以下随附的权利要求和今后引入的权利要求被解释为包括所有这样的在其真实精神和范围内的修改、排列、添加及子组合。

提供以下实施例以更充分地说明本发明的一些实施方案。然而，其绝不应以任何方式被解释为限制本发明的宽泛的范围。本领域技术人员可以容易地设想本文公开的原理的许多变化形式和修改，而不背离本发明的范围。

实施例

实验方法：

pSecTag-Ig载体的构建：

从在存在脂多糖(LPS)和小鼠白细胞介素4(mIL-4)的情况下培养96h的小鼠脾细胞中提取的RNA构建编码小鼠IgG1的Fc恒定区(铰链-CH2-CH3)的cDNA。用于该反应的引物是5‘CTCGAGGTGCCCAGGGATTGTGGTTG-3‘(有义)(SEQ ID No.13)和5‘-GGGCCCTTTACCA GGAGAGTGGGAGA-3‘(反义)(SEQ ID No.14)。然后，PCR产物用XhoI和ApaI消化，并连接到哺乳动物表达/分泌载体pSecTag2/Hygro B(Invitrogen)中。接下来，新构建体用Nhe1和Xho1进行裂解，以去除在原始pSecTag2/Hygro B载体中发现的原始小鼠NF-κ前导序列。这两个步骤揭示了一个命名为pSecTag-Ig的修饰的pSecTag2/Hygro B载体，缺乏信号肽，并包含位于紧邻编码c-myc的序列之前的小鼠IgG1的铰链-CH2-CH3，以及构建在原始pSectag-hygro b载体中的5个组氨酸残基。

将趋化因子克隆到pSecTag-Ig载体中：

趋化因子序列(初始

或突变序列)由Rhenium提供。趋化因子序列包括原始信号肽、趋化因子编码区和对应地在5’和3’处的限制性酶Nhe1(GCTAGC)(SEQ ID No:15)和Xho1(CTCGAG)(SEQ ID No:16)的裂解位点序列。用Nhe1和Xho1消化后，将趋化因子亚克隆到包含小鼠IgG1片段的载体中。融合片段在我们的设施中通过双脱氧核苷酸测序进行测序(Sequenase版本2；Millipore)。

构建体在293T和CH0-DG-44中的表达

将构建体转染到HEK-293T中进行瞬时表达。接下来转染到中国仓鼠卵巢dhfr-/-(DG44)细胞(由L.Chasin,Columbia University,New York,NY提供)中。产生趋化因子的稳定细胞系在DG-44细胞中产生。趋化因子的产生通过逐渐增加甲氨蝶呤浓度的选择而改善。通过镍柱Ni-NTA(Thermo-scientific)从培养基中纯化融合蛋白。

以下序列用于小鼠-CXCL9蛋白序列和mCXCL9-多G蛋白序列的实验。

小鼠CXCL9蛋白序列

mCXCL9-多GS蛋白序列

此外，使用以下核酸序列：

小鼠IgG1-Fc(铰链区-CH2-CH3)

WT-mCXCL9-Ig：小鼠-CXCL9(小写字母)与小鼠IgG1-Fc(大写字母)融合

小鼠突变体1-mCXCL9-多G-Ig：小鼠CXCL9，其C-末端的多GS与小鼠IgG1-Fc融合

小鼠-CXCL9(小写字母)+多G(斜体)+IgG(大写字母)

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实施例1

CXCL9抑制Hela(人类***)的增殖。

首先，进行实验以评估将鼠CXCL9添加到培养的Hela细胞系中是否影响其增殖/存活率(XTT测定)。

将Hela细胞接种在96孔板中的补充有10％FCS、青霉素、链霉素和谷氨酸的RPMI培养基中(每孔2x10⁴个细胞)。接种后24h，用补充有不同浓度小鼠CXCL9(Peprotech Cat#250-18)的新鲜培养基替换培养基，如图所指示的或不处理(WO)。24小时后，根据制造厂说明(Biological Industries，cat#20-300-1000)进行XTT测定。在与XTT底物孵育2小时后进行OD测量。每个处理用六个孔进行测定。

提出了两种稳定CXCL9并有效用于癌症免疫治疗的方法：第一种包括添加多GS作为接头，该接头包含在CXCL9的C-末端位点的三个串联重复的GGGGS作为CXCL9和Fc之间的接头(即CXCL9-多GS)，并且另一种是在CXCL9的N-末端位点处***氨基酸(诸如谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn)、脯氨酸(Pro)，焦谷氨酸或谷氨酸，或任何其它单个或更多个氨基酸)以在不影响趋化因子的开放阅读框的情况下阻止DPP4在位置2的脯氨酸处裂解趋化因子的能力，产生趋化因子变体，该变体对用DPP4蛋白水解性裂解CXCL9稳定，并具有抗癌药物的功能。

结果

图2示出了一项实验的结果，其中评估了CXCL9-Ig(小鼠CXLC9与IgG-Fc:铰链-ch2-ch3连接)在实验性小鼠黑素瘤模型中相对于其同种型匹配的IgG抑制黑素瘤生长的能力。这包括肿瘤生长速率(图A)、单个时间点的分散分析(第17天)(图B)和疗法终止后的死亡率(图C)。如可以看到的，CXCL9-Ig抑制黑素瘤生长的效率比其同种型匹配的IgG大得多。

实施例2

用CXCL9-Ig处理的C57Bl/6小鼠相对于对照组的肿瘤进展和死亡率分析

小鼠(14只8周龄的雌性)在右侧皮下注射3.5x10⁵个Ret黑素瘤前系(pre-line)。在第3天，将小鼠分为2个组，每组7只雌性。每组用CXCL9-Ig(即具有IgG-Fc的mCXCL9)或用同种型匹配的对照IgG处理(每周3次，40μg/小鼠)。每隔一天，肿瘤大小由对实验方案不知情的观察者使用科学卡尺测量。在第9天，从每组中减去一只没有肿瘤发展的小鼠。在第23天，疗法被终止，并继续追踪小鼠的死亡率。

图2A示出肿瘤尺寸为平均尺寸±SD(长x宽x高)x 0.52。图2B示出了第17天的分散分析。图2C示出了死亡率曲线。

该实验示出，用mCXCL9-Ig处理减弱了原发肿瘤发展率，并显著增加了小鼠存活率。

*P≤0.05被认为是显著的。

实施例3

在N-末端添加谷氨酰胺(Gln)或天冬酰胺(Asn)的修饰的CXCL9-Ig克服由DPP4的 蛋白水解性裂解

在人类中，CXCL10(1-77个氨基酸)和CXCL9(1-103个氨基酸)都经受外切蛋白酶二肽基肽酶4(DPP4，也称为CD26)的外切蛋白水解性翻译后修饰(PTM)。

DPP4识别在位置2处的脯氨酸并在其C-末端裂解，产生截短的无功能CXCL10(3-77个氨基酸)或CXCL9(3-103)。这些截短的无功能的CXCL9或CXCL10也可以充当有效的CXCR3拮抗剂。在肿瘤部位，DPP4大量产生，并且因此可能在靶向CXCL9和CXCL10中起主要作用。

外切蛋白酶裂解位点为X₁-P₂(X-N-末端处的任何氨基酸，P-位置2处的脯氨酸)。因此，在这些趋化因子的N-末端***另外的单个氨基酸将脯氨酸移动到位置3，并保护这些趋化因子免受DPP4的蛋白水解性裂解。

Gln-CXCL9-Ig和Asn-CXCL9-Ig的产生

Gln-CXCL9-Ig和Asn-CXCL9-Ig如下产生：

在pcDNA3.1中克隆了“突变的CXCL9”的序列。“突变的序列”包括包含信号肽的CXCL9的完整序列。该序列侧接5’端的NheI(限制性酶)裂解位点和3’端的XhoI(限制性酶)裂解位点序列。Gln、Asn或Pro密码子序列紧接放在位置22处的甘氨酸(信号肽的裂解位点)之后，以确保其被放在N-末端CXCL9的位置0处。用NheI和XhoI裂解突变的序列，以将其从pcDNA 3.1质粒中取出，并重新克隆在pSecTag-Ig载体(先前描述)中，以形成“突变的CXCL9”与小鼠IgG1-Fc的缀合。

Ca++流的检查：

为了评估突变体是否仍然能够结合受体(CXCR3)并激活它，测量了Ca++流：

将人类和小鼠CXCL9(购自Peprotech，USA)、人类CXCL9-Ig、Gln-CXCL9-Ig和Asn-CXCL9添加到过表达人类CXCR3A和脱辅基水母蛋白(脱辅基水母蛋白的氧化释放水母蛋白，一种钙敏感的生物发光蛋白)两者的CHO-K1细胞中。在这些细胞中，当受体与其配体(GPCR)偶联时，钙通道被激活并刺激钙内流。细胞中升高的Ca++激活当与钙离子结合时发出蓝光的水母蛋白，并作为钙内流发生的指标。在该***中测量了CXCL9-Ig、Gln-CXCL9-Ig和Asn-CXCL9-Ig(实施例中使用的所有Ig为IgG-Fc:铰链-ch2-ch3)诱导Ca++流的能力。该方案包括添加0.1ug/ml或0.2ug/ml的每种检测的趋化因子。在添加每种修饰的趋化因子后0秒、5秒、10秒、15秒、20秒、25秒、30秒和35秒确定Ca++流。发光读取器将Ca++流的水平记录为发光单元。

实施例4：

检查小鼠DPP4裂解人类CXCL9-Ig及其突变体的能力

接下来检查小鼠重组DPP4是否裂解人类CXCL9、hCXCL9-Ig和突变的hCXCL9-Ig。将小鼠DPP4添加到重组人类CXCL9中，根据其是否将人类CXCL9限制为非活性化合物进行测试。如果响应为阳性，则在体内实验中使用野生型C57Bl/6小鼠。如果没有，则使用过表达人类DPP4的转基因小鼠(Caygen https://www.cyagen.com/us/en/service/transgenic- mice.html)。无论哪种方式，小鼠都被植入了ret黑素瘤细胞系。

实施例5：

CXCL9-Ig(Gln)和CXCL9-Ig(Asn)在小鼠黑素瘤模型中有效性的体内验证

基本的实验设置和施用方案根据实施例2。它是C57Bl/6小鼠的黑素瘤的免疫活性模型，其中皮下植入Ret前系(每只小鼠350,000个细胞)。在第3天，仅对肿瘤阳性的小鼠进行重新分组，并进行CXCL9-Ig、CXCL9-Ig(Gln)、CXCL9-Ig(Asn)或对照IgG的重复施用(每周3次，40μg/小鼠)，并由对实验方案不知情的观察者监测肿瘤生长，并后面监测死亡率。与WTCXCL9-Ig相比，CXCL9-Ig(Gln)、CXCL9-Ig(Asn)在限制癌症发展方面进行了测试。

特定实施方案的前述描述将如此完全地揭示本发明的一般性质，以致其他人可以通过应用现有知识容易地修改和/或调整这样的特定实施方案用于多种应用，而不进行过度的实验并且不脱离一般概念，并且因此，这样的调整和修改应当且意图被包含在公开的实施方案的等效物的含义和范围内。应当理解，本文中采用的措辞或术语是为了描述的目的而非限制的目的。用于实施多种公开的功能的手段、材料和步骤可以采取多种可选择的形式而不脱离本发明。应当理解，正在进行进一步的试验以确定临床作用。

序列表

<110> 技术研究及发展基金有限公司

<120> 用于癌症疾病免疫治疗的CXCL9及其变体

<130> TECH/018-PCT

<150> 63/041,940

<151> 2020-06-21

<150> 63/150,629

<151> 2021-02-18

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (23)..(23)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 1

Met Lys Lys Ser Gly Val Leu Phe Leu Leu Gly Ile Ile Leu Leu Val

1 5 10 15

Leu Ile Gly Val Gln Gly Xaa Thr Pro Val Val Arg Lys Gly Arg Cys

20 25 30

Ser Cys Ile Ser Thr Asn Gln Gly Thr Ile His Leu Gln Ser Leu Lys

35 40 45

Asp Leu Lys Gln Phe Ala Pro Ser Pro Ser Cys Glu Lys Ile Glu Ile

50 55 60

Ile Ala Thr Leu Lys Asn Gly Val Gln Thr Cys Leu Asn Pro Asp Ser

65 70 75 80

Ala Asp Val Lys Glu Leu Ile Lys Lys Trp Glu Lys Gln Val Ser Gln

85 90 95

Lys Lys Lys Gln Lys Asn Gly Lys Lys His Gln Lys Lys Lys Val Leu

100 105 110

Lys Val Arg Lys Ser Gln Arg Ser Arg Gln Lys Lys Thr Thr

115 120 125

<210> 2

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成序列

<400> 2

Met Lys Lys Ser Gly Val Leu Phe Leu Leu Gly Ile Ile Leu Leu Val

1 5 10 15

Leu Ile Gly Val Gln Gly Gln Thr Pro Val Val Arg Lys Gly Arg Cys

20 25 30

Ser Cys Ile Ser Thr Asn Gln Gly Thr Ile His Leu Gln Ser Leu Lys

35 40 45

Asp Leu Lys Gln Phe Ala Pro Ser Pro Ser Cys Glu Lys Ile Glu Ile

50 55 60

Ile Ala Thr Leu Lys Asn Gly Val Gln Thr Cys Leu Asn Pro Asp Ser

65 70 75 80

Ala Asp Val Lys Glu Leu Ile Lys Lys Trp Glu Lys Gln Val Ser Gln

85 90 95

Lys Lys Lys Gln Lys Asn Gly Lys Lys His Gln Lys Lys Lys Val Leu

100 105 110

Lys Val Arg Lys Ser Gln Arg Ser Arg Gln Lys Lys Thr Thr

115 120 125

<210> 3

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成序列

<400> 3

Met Lys Lys Ser Gly Val Leu Phe Leu Leu Gly Ile Ile Leu Leu Val

1 5 10 15

Leu Ile Gly Val Gln Gly Asn Thr Pro Val Val Arg Lys Gly Arg Cys

20 25 30

Ser Cys Ile Ser Thr Asn Gln Gly Thr Ile His Leu Gln Ser Leu Lys

35 40 45

Asp Leu Lys Gln Phe Ala Pro Ser Pro Ser Cys Glu Lys Ile Glu Ile

50 55 60

Ile Ala Thr Leu Lys Asn Gly Val Gln Thr Cys Leu Asn Pro Asp Ser

65 70 75 80

Ala Asp Val Lys Glu Leu Ile Lys Lys Trp Glu Lys Gln Val Ser Gln

85 90 95

Lys Lys Lys Gln Lys Asn Gly Lys Lys His Gln Lys Lys Lys Val Leu

100 105 110

Lys Val Arg Lys Ser Gln Arg Ser Arg Gln Lys Lys Thr Thr

115 120 125

<210> 4

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成序列

<400> 4

Met Lys Lys Ser Gly Val Leu Phe Leu Leu Gly Ile Ile Leu Leu Val

1 5 10 15

Leu Ile Gly Val Gln Gly Pro Thr Pro Val Val Arg Lys Gly Arg Cys

20 25 30

Ser Cys Ile Ser Thr Asn Gln Gly Thr Ile His Leu Gln Ser Leu Lys

35 40 45

Asp Leu Lys Gln Phe Ala Pro Ser Pro Ser Cys Glu Lys Ile Glu Ile

50 55 60

Ile Ala Thr Leu Lys Asn Gly Val Gln Thr Cys Leu Asn Pro Asp Ser

65 70 75 80

Ala Asp Val Lys Glu Leu Ile Lys Lys Trp Glu Lys Gln Val Ser Gln

85 90 95

Lys Lys Lys Gln Lys Asn Gly Lys Lys His Gln Lys Lys Lys Val Leu

100 105 110

Lys Val Arg Lys Ser Gln Arg Ser Arg Gln Lys Lys Thr Thr

115 120 125

<210> 5

<211> 232

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成序列

<400> 5

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 6

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成序列

<400> 6

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 7

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成序列

<400> 7

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 8

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成序列

<400> 8

Met Lys Lys Ser Gly Val Leu Phe Leu Leu Gly Ile Ile Leu Leu Val

1 5 10 15

Leu Ile Gly Val Gln Gly Thr Pro Val Val Arg Lys Gly Arg Cys Ser

20 25 30

Cys Ile Ser Thr Asn Gln Gly Thr Ile His Leu Gln Ser Leu Lys Asp

35 40 45

Leu Lys Gln Phe Ala Pro Ser Pro Ser Cys Glu Lys Ile Glu Ile Ile

50 55 60

Ala Thr Leu Lys Asn Gly Val Gln Thr Cys Leu Asn Pro Asp Ser Ala

65 70 75 80

Asp Val Lys Glu Leu Ile Lys Lys Trp Glu Lys Gln Val Ser Gln Lys

85 90 95

Lys Lys Gln Lys Asn Gly Lys Lys His Gln Lys Lys Lys Val Leu Lys

100 105 110

Val Arg Lys Ser Gln Arg Ser Arg Gln Lys Lys Thr Thr

115 120 125

<210> 9

<211> 375

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成序列

<400> 9

atgaagaaaa gtggtgttct tttcctcttg ggcatcatct tgctggttct gattggagtg 60

caaggaaccc cagtagtgag aaagggtcgc tgttcctgca tcagcaccaa ccaagggact 120

atccacctac aatccttgaa agaccttaaa caatttgccc caagcccttc ctgcgagaaa 180

attgaaatca ttgctacact gaagaatgga gttcaaacat gtctaaaccc agattcagca 240

gatgtgaagg aactgattaa aaagtgggag aaacaggtca gccaaaagaa aaagcaaaag 300

aatgggaaaa aacatcaaaa aaagaaagtt ctgaaagttc gaaaatctca acgttctcgt 360

caaaagaaga ctaca 375

<210> 10

<211> 140

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成序列

<400> 10

Met Lys Lys Ser Gly Val Leu Phe Leu Leu Gly Ile Ile Leu Leu Val

1 5 10 15

Leu Ile Gly Val Gln Gly Thr Pro Val Val Arg Lys Gly Arg Cys Ser

20 25 30

Cys Ile Ser Thr Asn Gln Gly Thr Ile His Leu Gln Ser Leu Lys Asp

35 40 45

Leu Lys Gln Phe Ala Pro Ser Pro Ser Cys Glu Lys Ile Glu Ile Ile

50 55 60

Ala Thr Leu Lys Asn Gly Val Gln Thr Cys Leu Asn Pro Asp Ser Ala

65 70 75 80

Asp Val Lys Glu Leu Ile Lys Lys Trp Glu Lys Gln Val Ser Gln Lys

85 90 95

Lys Lys Gln Lys Asn Gly Lys Lys His Gln Lys Lys Lys Val Leu Lys

100 105 110

Val Arg Lys Ser Gln Arg Ser Arg Gln Lys Lys Thr Thr Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

<210> 11

<211> 420

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成序列

<400> 11

atgaagaaaa gtggtgttct tttcctcttg ggcatcatct tgctggttct gattggagtg 60

caaggaaccc cagtagtgag aaagggtcgc tgttcctgca tcagcaccaa ccaagggact 120

atccacctac aatccttgaa agaccttaaa caatttgccc caagcccttc ctgcgagaaa 180

attgaaatca ttgctacact gaagaatgga gttcaaacat gtctaaaccc agattcagca 240

gatgtgaagg aactgattaa aaagtgggag aaacaggtca gccaaaagaa aaagcaaaag 300

aatgggaaaa aacatcaaaa aaagaaagtt ctgaaagttc gaaaatctca acgttctcgt 360

caaaagaaga ctacaggcgg aggtggctct ggcggtggcg gatcgggcgg aggtggctct 420

<210> 12

<211> 378

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成序列

<400> 12

atgaagaaaa gtggtgttct tttcctcttg ggcatcatct tgctggttct gattggagtg 60

caaggacaaa ccccagtagt gagaaagggt cgctgttcct gcatcagcac caaccaaggg 120

actatccacc tacaatcctt gaaagacctt aaacaatttg ccccaagccc ttcctgcgag 180

aaaattgaaa tcattgctac actgaagaat ggagttcaaa catgtctaaa cccagattca 240

gcagatgtga aggaactgat taaaaagtgg gagaaacagg tcagccaaaa gaaaaagcaa 300

aagaatggga aaaaacatca aaaaaagaaa gttctgaaag ttcgaaaatc tcaacgttct 360

cgtcaaaaga agactaca 378

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成序列

<400> 13

ctcgaggtgc ccagggattg tggttg 26

<210> 14

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成序列

<400> 14

gggcccttta ccaggagagt gggaga 26

<210> 15

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成序列

<400> 15

gctagc 6

<210> 16

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成序列

<400> 16

ctcgag 6

<210> 17

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成序列

<400> 17

Met Lys Ser Ala Val Leu Phe Leu Leu Gly Ile Ile Phe Leu Glu Gln

1 5 10 15

Cys Gly Val Arg Gly Thr Leu Val Ile Arg Asn Ala Arg Cys Ser Cys

20 25 30

Ile Ser Thr Ser Arg Gly Thr Ile His Tyr Lys Ser Leu Lys Asp Leu

35 40 45

Lys Gln Phe Ala Pro Ser Pro Asn Cys Asn Lys Thr Glu Ile Ile Ala

50 55 60

Thr Leu Lys Asn Gly Asp Gln Thr Cys Leu Asp Pro Asp Ser Ala Asn

65 70 75 80

Val Lys Lys Leu Met Lys Glu Trp Glu Lys Lys Ile Ser Gln Lys Lys

85 90 95

Lys Gln Lys Arg Gly Lys Lys His Gln Lys Asn Met Lys Asn Arg Lys

100 105 110

Pro Lys Thr Pro Gln Ser Arg Arg Arg Ser Arg Lys Thr Thr

115 120 125

<210> 18

<211> 141

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成序列

<400> 18

Met Lys Ser Ala Val Leu Phe Leu Leu Gly Ile Ile Phe Leu Glu Gln

1 5 10 15

Cys Gly Val Arg Gly Thr Leu Val Ile Arg Asn Ala Arg Cys Ser Cys

20 25 30

Ile Ser Thr Ser Arg Gly Thr Ile His Tyr Lys Ser Leu Lys Asp Leu

35 40 45

Lys Gln Phe Ala Pro Ser Pro Asn Cys Asn Lys Thr Glu Ile Ile Ala

50 55 60

Thr Leu Lys Asn Gly Asp Gln Thr Cys Leu Asp Pro Asp Ser Ala Asn

65 70 75 80

Val Lys Lys Leu Met Lys Glu Trp Glu Lys Lys Ile Ser Gln Lys Lys

85 90 95

Lys Gln Lys Arg Gly Lys Lys His Gln Lys Asn Met Lys Asn Arg Lys

100 105 110

Pro Lys Thr Pro Gln Ser Arg Arg Arg Ser Arg Lys Thr Thr Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

<210> 19

<211> 681

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成序列

<400> 19

gtgcccaggg attgtggttg taagccttgc atatgtacag tcccagaagt atcatctgtc 60

ttcatcttcc ccccaaagcc caaggatgtg ctcaccatta ctctgactcc taaggtcacg 120

tgtgttgtgg tagacatcag caaggatgat cccgaggtcc agttcagctg gtttgtagat 180

gatgtggagg tgcacacagc tcagacgcaa ccccgggagg agcagttcaa cagcactttc 240

cgctcagtca gtgaacttcc catcatgcac caggactggc tcaatggcaa ggagttcaaa 300

tgcagggtca acagtgcagc tttccctgcc cccatcgaga aaaccatctc caaaaccaaa 360

ggcagaccga aggctccaca ggtgtacacc attccacctc ccaaggagca gatggccaag 420

gataaagtca gtctgacctg catgataaca gacttcttcc ctgaagacat tactgtggag 480

tggcagtgga atgggcagcc agcggagaac tacaagaaca ctcagcccat catggacaca 540

gatggctctt acttcgtcta cagcaagctc aatgtgcaga agagcaactg ggaggcagga 600

aatactttca cctgctctgt gttacatgag ggcctgcaca accaccatac tgagaagagc 660

ctctcccact ctcctggtaa a 681

<210> 20

<211> 1059

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成序列

<400> 20

atgaagtccg ctgttctttt ccttttgggc atcatcttcc tggagcagtg tggagttcga 60

ggaaccctag tgataaggaa tgcacgatgc tcctgcatca gcaccagccg aggcacgatc 120

cactacaaat ccctcaaaga cctcaaacag tttgccccaa gccccaattg caacaaaact 180

gaaatcattg ctacactgaa gaacggagat caaacctgcc tagatccgga ctcggcaaat 240

gtgaagaagc tgatgaaaga atgggaaaag aagatcagcc aaaagaaaaa gcaaaagagg 300

gggaaaaaac atcaaaagaa catgaaaaac agaaaaccca aaacacccca aagtcgtcgt 360

cgttcaagga agactacagt gcccagggat tgtggttgta agccttgcat atgtacagtc 420

ccagaagtat catctgtctt catcttcccc ccaaagccca aggatgtgct caccattact 480

ctgactccta aggtcacgtg tgttgtggta gacatcagca aggatgatcc cgaggtccag 540

ttcagctggt ttgtagatga tgtggaggtg cacacagctc agacgcaacc ccgggaggag 600

cagttcaaca gcactttccg ctcagtcagt gaacttccca tcatgcacca ggactggctc 660

aatggcaagg agttcaaatg cagggtcaac agtgcagctt tccctgcccc catcgagaaa 720

accatctcca aaaccaaagg cagaccgaag gctccacagg tgtacaccat tccacctccc 780

aaggagcaga tggccaagga taaagtcagt ctgacctgca tgataacaga cttcttccct 840

gaagacatta ctgtggagtg gcagtggaat gggcagccag cggagaacta caagaacact 900

cagcccatca tggacacaga tggctcttac ttcgtctaca gcaagctcaa tgtgcagaag 960

agcaactggg aggcaggaaa tactttcacc tgctctgtgt tacatgaggg cctgcacaac 1020

caccatactg agaagagcct ctcccactct cctggtaaa 1059

<210> 21

<211> 1104

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成序列

<400> 21

atgaagtccg ctgttctttt ccttttgggc atcatcttcc tggagcagtg tggagttcga 60

ggaaccctag tgataaggaa tgcacgatgc tcctgcatca gcaccagccg aggcacgatc 120

cactacaaat ccctcaaaga cctcaaacag tttgccccaa gccccaattg caacaaaact 180

gaaatcattg ctacactgaa gaacggagat caaacctgcc tagatccgga ctcggcaaat 240

gtgaagaagc tgatgaaaga atgggaaaag aagatcagcc aaaagaaaaa gcaaaagagg 300

gggaaaaaac atcaaaagaa catgaaaaac agaaaaccca aaacacccca aagtcgtcgt 360

cgttcaagga agactacagg cggaggtggc tctggcggtg gcggatcggg cggaggtggc 420

tctgtgccca gggattgtgg ttgtaagcct tgcatatgta cagtcccaga agtatcatct 480

gtcttcatct tccccccaaa gcccaaggat gtgctcacca ttactctgac tcctaaggtc 540

acgtgtgttg tggtagacat cagcaaggat gatcccgagg tccagttcag ctggtttgta 600

gatgatgtgg aggtgcacac agctcagacg caaccccggg aggagcagtt caacagcact 660

ttccgctcag tcagtgaact tcccatcatg caccaggact ggctcaatgg caaggagttc 720

aaatgcaggg tcaacagtgc agctttccct gcccccatcg agaaaaccat ctccaaaacc 780

aaaggcagac cgaaggctcc acaggtgtac accattccac ctcccaagga gcagatggcc 840

aaggataaag tcagtctgac ctgcatgata acagacttct tccctgaaga cattactgtg 900

gagtggcagt ggaatgggca gccagcggag aactacaaga acactcagcc catcatggac 960

acagatggct cttacttcgt ctacagcaag ctcaatgtgc agaagagcaa ctgggaggca 1020

ggaaatactt tcacctgctc tgtgttacat gagggcctgc acaaccacca tactgagaag 1080

agcctctccc actctcctgg taaa 1104

<210> 22

<211> 378

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成序列

<400> 22

atgaagaaaa gtggtgttct tttcctcttg ggcatcatct tgctggttct gattggagtg 60

caaggaaaca ccccagtagt gagaaagggt cgctgttcct gcatcagcac caaccaaggg 120

actatccacc tacaatcctt gaaagacctt aaacaatttg ccccaagccc ttcctgcgag 180

aaaattgaaa tcattgctac actgaagaat ggagttcaaa catgtctaaa cccagattca 240

gcagatgtga aggaactgat taaaaagtgg gagaaacagg tcagccaaaa gaaaaagcaa 300

aagaatggga aaaaacatca aaaaaagaaa gttctgaaag ttcgaaaatc tcaacgttct 360

cgtcaaaaga agactaca 378

<210> 23

<211> 378

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成序列

<400> 23

atgaagaaaa gtggtgttct tttcctcttg ggcatcatct tgctggttct gattggagtg 60

caaggaccca ccccagtagt gagaaagggt cgctgttcct gcatcagcac caaccaaggg 120

actatccacc tacaatcctt gaaagacctt aaacaatttg ccccaagccc ttcctgcgag 180

aaaattgaaa tcattgctac actgaagaat ggagttcaaa catgtctaaa cccagattca 240

gcagatgtga aggaactgat taaaaagtgg gagaaacagg tcagccaaaa gaaaaagcaa 300

aagaatggga aaaaacatca aaaaaagaaa gttctgaaag ttcgaaaatc tcaacgttct 360

cgtcaaaaga agactaca 378

<210> 24

<211> 696

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成序列

<400> 24

gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 60

gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 120

acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 180

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 240

tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 300

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 360

atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 420

gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 480

gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 540

cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctatagca agctcaccgt ggacaagagc 600

aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 660

tacacgcaga agagcctctc cctgtccccg ggtaaa 696

Claims (34)

1.一种修饰的CXCL9多肽，所述修饰的CXCL9多肽包含另外的氨基酸在对应野生型CXCL9的N-末端的***。

2.根据权利要求1所述的修饰的CXCL9多肽，所述修饰的CXCL9多肽具有SEQ ID NO:1所表示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2中任一项所述的修饰的CXCL9多肽，其中所述另外的氨基酸是谷氨酰胺、焦谷氨酸或谷氨酸、天冬酰胺或脯氨酸。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的修饰的CXCL9多肽，其中所述野生型CXCL9是人类来源的。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的修饰的CXCL9多肽，所述修饰的CXCL9多肽具有根据SEQ ID NO:2-4所表示的氨基酸序列。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的修饰的CXCL9多肽，其中所述修饰的CXCL9多肽与免疫球蛋白(Ig)分子或Ig分子的片段连接。

7.根据权利要求6所述的修饰的CXCL9，其中所述免疫球蛋白是由SEQ ID.No.5所表示的IgG-Fc:铰链-ch2-ch3。

8.根据权利要求6或7中任一项所述的修饰的CXCL9，所述修饰的CXCL9还包含在所述修饰的CXCL9与所述免疫球蛋白分子或其片段之间的接头。

9.根据权利要求6-8中任一项所述的修饰的CXCL9多肽，其中所述免疫球蛋白或其片段是人类来源的。

10.根据权利要求8所述的修饰的CXCL9，其中所述接头包含一个或更多个甘氨酸氨基酸的链段(多G)或甘氨酸和丝氨酸氨基酸的链段(多GS)。

11.根据权利要求9所述的修饰的CXCL9，其中所述多GS是GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ IDNo:6)。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的修饰的CXCL9多肽，所述修饰的CXCL9多肽能够与CXCR3受体结合。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的修饰的CXCL9多肽，所述修饰的CXCL9多肽能够诱导CD8+T细胞。

14.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含与免疫球蛋白分子或Ig分子的片段缀合的CXCL9多肽。

15.根据权利要求14所述的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白或其片段是IgG-Fc:铰链-ch2-ch3。

16.根据权利要求14-15中任一项所述的融合蛋白，其中所述CXCL9、所述免疫球蛋白分子或其片段是人类来源的。

17.根据权利要求14-16中任一项所述的融合蛋白，所述融合蛋白还包含在所述CXCL9与所述免疫球蛋白或其片段之间的接头。

18.根据权利要求17所述的融合蛋白，其中所述接头包含一个或更多个甘氨酸氨基酸的链段(多G)或甘氨酸和丝氨酸氨基酸的链段(多GS)。

19.根据权利要求18所述的融合蛋白，其中所述多GS是GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID No:6)。

20.根据权利要求14-19中任一项所述的融合蛋白，所述融合蛋白能够与CXCR3受体结合。

21.根据权利要求14-20中任一项所述的融合蛋白，所述融合蛋白能够诱导CD8+T细胞。

22.一种治疗有相应需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向有相应需要的受试者施用治疗量的根据权利要求1-13中任一项所述的修饰的CXCL9多肽或根据权利要求14-21所述的融合蛋白。

23.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-13中任一项所述的修饰的CXCL9多肽或根据权利要求14-19所述的融合蛋白和药学上可接受的运载体。

24.根据权利要求23所述的药物组合物、根据权利要求1-13中任一项所述的修饰的CXCL9多肽或根据权利要求14-19所述的融合蛋白，用于在治疗癌症中使用。

25.一种治疗有相应需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向有相应需要的受试者施用治疗量的根据权利要求23所述的药物组合物、根据权利要求1-13中任一项所述的修饰的CXCL9多肽或根据权利要求14-19中任一项所述的融合蛋白。

26.一种核酸分子，所述核酸分子编码根据权利要求1-13中任一项所述的修饰的CXCL9多肽或根据权利要求14-19中任一项所述的融合蛋白。

27.一种载体，所述载体包含权利要求26所述的核酸分子。

28.根据权利要求27所述的载体，所述载体为表达载体，还包含一种或更多种调节序列。

29.根据权利要求26所述的核酸分子，或根据权利要求27-28中任一项所述的载体，用于在治疗有相应需要的受试者的癌症中使用。

30.一种治疗有相应需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向有相应需要的受试者施用治疗量的根据权利要求26所述的核酸分子或根据权利要求27-28中任一项所述的载体。

31.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求26所述的核酸分子。

32.一种宿主细胞，所述宿主细胞用根据权利要求27-28中任一项所述的载体转化或转染。

33.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求1-13中任一项所述的修饰的CXCL9多肽或根据权利要求14-19中任一项所述的融合蛋白。

34.一种产生修饰的CXCL9多肽的方法，所述方法包括：

(i)在表达包含修饰的CXCL9的多肽的条件下培养权利要求31-33中任一项所述的宿主细胞；和

(ii)任选地从所述宿主细胞或培养基中回收所述修饰的CXCL9。

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