CN111560070B - 针对新型冠状病毒np蛋白的抗体及其检测应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了针对新型冠状病毒NP蛋白的抗体及其检测应用，所述抗体包含抗体轻链可变区的抗原互补决定区CDR1，CDR2和CDR3分别为SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：7的氨基酸序列；抗体重链可变区的抗原互补决定区CDR1，CDR2和CDR3分别为SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：3的氨基酸序列。本发明还公开了该抗体的制备过程及该抗体重链可变区与轻链可变区氨基酸序列。

Description

针对新型冠状病毒NP蛋白的抗体及其检测应用
技术领域
本发明属于细胞免疫学、分子生物学领域，涉及针对新型冠状病毒NP蛋白的抗体及其检测应用。
背景技术
国际病毒分类委员会将新型冠状病毒命名为SARS-CoV-2，世界卫生组织将感染此病毒引起的肺炎称为COVID-19。此病毒传染性强，传播途径广。该病毒能迅速适应人体环境，感染后在潜伏期即具有传播能力，同时还有一些无症状感染者报道，甚至在多种动物体内也检测到病毒核酸。这些因素使得对该病毒的防控变的非常复杂，而且目前没有有效治疗药物及疫苗上市。
SARS-CoV-2属于冠状病毒属，为单股正链RNA病毒，大小约30kb，与SARS-CoV相似性为79％，与蝙蝠体内分离的冠状病毒(Coronavirus，CoV)相似性最高约88％。SARS-CoV-2具有典型的冠状病毒特征，病毒包膜上有典型的棘突，形似日冕。核衣壳为螺旋对称型，主要结构蛋白是核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein,NP)，NP全长420个氨基酸。NP在病毒结构蛋白中含量最多，在宿主感染早期大量表达，且免疫原性较强，能引起宿主强烈的免疫应答。因此，NP可作为SARS-CoV-2感染血清学诊断的主要靶标抗原。
由于特异性治疗药物及有效疫苗尚未研发成功，早期诊断成为防控疫情重要的措施，早期核酸诊断及临床诊断为确诊重要依据。虽然核酸诊断速度快，受采样的质量的影响大，存在假阳性和假阴性，影响防控措施的落实。部分无症状感染者在病程晚期核酸检测也呈阴性，单凭核酸检测很容易出现漏诊。血清学诊断是检测病原感染后机体的免疫反应，持续时间长，免疫反应稳定，且免疫反应随着病程进展呈动态变化趋势。因此，血清学诊断同样也是早期诊断和感染现状评价的的重要手段。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一是提供一种抗新型冠状病毒的单克隆抗体或其衍生体如抗体Fab片段、单链抗体等。
本发明要解决的技术问题之二是提供编码上述抗体的DNA分子或基因。
本发明要解决的技术问题之三是提供制备上述抗体的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
在本发明第一方面，提供了一种抗新型冠状病毒的单克隆抗体或其衍生体，其包含第一可变区和第二可变区，其中所述第一可变区是抗体轻链可变区，其抗原互补决定区CDR1，CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；其中所述第二可变区是抗体重链可变区，其抗原互补决定区CDR1，CDR2和CDR3分别为SEQIDNO：1，SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；
所述单克隆抗体的衍生体包括抗体Fab片段、单链抗体、双特异抗体(bi-specific)等。
作为本发明的优选的技术方案，所述第一可变区是抗体轻链可变区，为SEQ IDNO：8所示的氨基酸序列；其所述第二可变区是抗体重链可变区，为SEQ IDNO：4所示的氨基酸序列。
作为本发明的优选的技术方案，其包含所述抗体轻链可变区和人抗体轻链恒定区，以及所述抗体重链可变区和人抗体重链恒定区的铰链区，CH1区，CH 2区和CH3区。
作为本发明的优选的技术方案，所述人抗体轻链恒定区来自人抗体kappa链或抗体lamda链，所述人抗体重链恒定区来自人IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型。
在本发明第二方面，提供了一种编码前面所述的单克隆抗体抗体或其衍生体的DNA分子或基因核苷酸序列。
作为本发明的优选的技术方案，抗体轻链可变区为SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列，抗体重链可变区为SEQ ID NO：17的核苷酸序列。
此外，本发明包括与本文提供的任何核苷酸序列特异性杂交的序列。术语“特异性杂交”指核苷酸序列与本文提供的序列或针对其的序列互补体的至少12、15、20、25、30、35、40、45、50或100个连接核苷酸杂交的能力，从而使得它具有与对照核酸(例如，非特异性DNA或除本文提供的具体抗体序列外的DNA)小于15％、优选小于10％、和更优选小于5％的背景杂交。各种杂交条件可用于检测特异性杂交，并且严格性主要由杂交测定法的洗涤步骤决定。一般而言，高温和低盐浓度产生高严格性，而低温和高盐浓度产生低严格性。通过在例如约2.0×SSC中在50℃下洗涤达到低严格性杂交，并且用约0.2×SSC在50℃下达到高严格性。
编码本发明的抗体或其衍生体的核苷酸可含前导或信号序列。前导和信号序列可改变，并且可用备选前导序列取代，并且应当理解，在某些实施方案中，本发明的抗体含无前导序列的序列。可使用任何合适的备选前导或信号序列。
在本发明第三方面，提供了一种表达载体，它含有前面所述的DNA分子/基因核苷酸序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列。
在本发明第四方面，提供了一种重组宿主细胞，它由前面所述的表达载体转化而成。
所述重组宿主细胞或其子代细胞表达前面所述的单克隆抗体或其衍生体。
在本发明第五方面，提供了一种制备前面所述的单克隆抗体或其衍生体的方法，该方法包括如下步骤：
a)提供一表达载体，该表达载体含有前面所述的DNA分子序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列；
b)用步骤a)所述的表达载体转化宿主细胞；
c)在适合条件下培养步骤b)所得的宿主细胞：和
d)从宿主细胞培养液中分离纯化获得所述单克隆抗体或其衍生体。
在本发明第六方面，提供了一种组合物，其含有前面所述的单克隆抗体或其衍生体。
在本发明第七方面，提供了含有前面所述的单克隆抗体或其衍生体的试剂盒。所述试剂盒还包括诊断剂。
所述诊断剂包括可检测物质，可检测物质的例子包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性核素、正电子发射金属(用于在正电子发射断层摄影术中使用)、和非放射性顺磁金属离子。关于可与抗体缀合用于用作诊断剂的金属离子，一般参见US4,741,900。合适的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基包括链霉亲和素、抗生物素蛋白和生物素；合适的荧光材料包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹酰氯和藻红蛋白；合适的发光材料包括鲁米诺；合适的生物发光材料包括萤光素酶、萤光素和水母素；放射性同位素，例如125I、131I、111In和90Y、Lu177、铋213、锎252、铱192和钨188/铼188、211砹、99Tc。
本发明的试剂盒还包括标签和施用说明书。
本发明前面所述的组合物或试剂盒还可包括还包含第二种单克隆抗体或其衍生体，所述第二种单克隆抗体或其衍生体包含重链可变区CDR1、重链可变区CDR2、重链可变区CDR3、轻链可变区CDR1、轻链可变区CDR2、轻链可变区CDR3；其中，
重链可变区CDR1含有SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列；
重链可变区CDR2含有SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列；
重链可变区CDR3含有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列；
轻链可变区CDR1含有SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列；
轻链可变区CDR2含有SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列；
轻链可变区CDR3含有SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列；
优选地，所述第二种单克隆抗体或其衍生体包含重链可变区、轻链可变区；其中，重链可变区含有SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列，轻链可变区含有SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列。
在本发明第八方面，提供了前面所述的的单克隆抗体或其衍生体在制备新型冠状病毒检测产品中的应用。
在本发明第九方面，提供了前面所述的单克隆抗体或其衍生体在制备新型冠状病毒感染诊断产品中的应用。
在本发明第十方面，提供了前面所述的组合物在制备检测新型冠状病毒的产品中的应用。
本文所采用的术语“单克隆抗体(单抗)”指从一纯系细胞得到的免疫球蛋白，具有相同的结构和化学特性，对单一抗原决定簇有特异性。单克隆抗体与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤或重组工程细胞培养获得，不会混杂有其它免疫球蛋白。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。
本文所用的术语“抗体”和“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)。其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
本文所用的术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中成为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。
可变区中较保守的部分称为构架区(Framework regions，FR)。抗体重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Ka ba t等，NIH Pu bl.No.91-3242，卷1，647-669页(1991))。抗体恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性(antibody-dependent cellularcytotoxicity，ADCC)或补体介导毒性(complemnt-dependent cytotoxicity，CDC)。
本文所用的术语“表达调控序列”通常指参与控制基因表达的序列。表达调控序列包括与目标基因操作性相连的启动子和终止信号。编码本发明抗体的基因(DNA)序列可用本领域技术人员熟知的常规手段，如根据本发明公开的蛋白质序列人工合成或用PCR法扩增得到。其后可用本领域熟知的各种方法将合成或PCR扩增得到的DNA片段***到合适的表达载体中。本发明中所用的表达载体可以是本领域技术人员已知的市售表达载体，如Invitrogen公司的pCDNA3.1表达载体。
用于接纳表达载体转化的合适宿主细胞一般包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。
表达载体转化的宿主细胞在合适的条件下(如以无血清培养基在细胞培养瓶或生物反应器中贴壁或悬浮培养)培养后，收获培养上清液，然后用包括protein-A亲和层析、离子交换层析、过滤除菌等本领域技术人员熟知的常规分离步骤或手段纯化得到本发明的抗体。
纯化得到的本发明抗体可以溶于适当的溶剂如无菌生理盐水液体中，溶度可以制备成0.01至100mg/ml之间，理想的最终溶度可以制备成1至20mg/ml之间。
附图说明
图1显示本发明的重组SARS-CoV2 NP蛋白的SDS-PAGE图；
图2显示利用间接ELISA检测抗体滴度的结果图；
图3显示利用WB检测抗体与抗原结合的结果图；
图4显示利用SPR检测JS01的亲和活性结果图；
图5显示利用SPR检测JS02的亲和活性结果图；
图6显示利用SPR检测JS03的亲和活性结果图；
图7显示利用SPR检测JS04的亲和活性结果图；
图8显示利用SPR检测JS05的亲和活性结果图；
图9显示利用SPR检测JS06的亲和活性结果图；
图10显示利用SPR检测JS07的亲和活性结果图；
图11显示利用SPR检测JS08的亲和活性结果图；
图12显示利用SPR检测JS09的亲和活性结果图；
图13显示利用SPR检测JS10的亲和活性结果图；
图14显示利用SPR检测JS11的亲和活性结果图；
图15显示利用SPR检测JS12的亲和活性结果图；
图16显示利用SPR检测JS13的亲和活性结果图；
图17显示利用SPR检测JS14的亲和活性结果图；
图18显示利用SPR检测JS15的亲和活性结果图；
图19显示利用SPR检测JS16的亲和活性结果图；
图20显示利用双抗体夹心法检测抗体包被浓度的结果图；
图21显示利用双抗体夹心法检测抗体检测灵敏度的结果图；
图22显示本发明的抗原检测层析条的检测效果图。
具体实施方式
下面通过附图和实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1抗体筛选
一、重组SARS-CoV2核蛋白(NP)表达
1.1主要试剂
SARS-CoV2 NP基因序列(GenBank序列号:MT066176.1)以及相关引物合成和测序均由通用生物***(安徽)有限公司完成；E.coli DH5α，BL21(DE3)感受态细胞购自通用生物***(安徽)有限公司；BamHⅠ和NotⅠ核酸内切酶购自New England Biolabs(NEB)公司；EXTaq酶购自TaKaRa公司；HRP标记抗人Fc抗体购自Sigma公司；其他化学试剂均为国产分析纯试剂；感染2019-nCoV患者血清由本中心收集及保存。
1.2原核表达质粒构建
设计NP基因原核表达引物，上游引物带BamHⅠ酶切位点，下游引物带NotⅠ酶切位点。引物序列为：Cov2-NP-F:CGGGATCCTCTGATAATGGACCCCAAAATC；Cov2-NP-R:ATAAGAATGCGGCCGCAGGCCTGAGTTGAGTCAGCAC。使用EX Taq酶扩增NP基因，PCR反应程序为：94℃3min；94℃30s,58℃30s,72℃80s，共30个循环；72℃10min。PCR产物经胶回收约1 300bp目的片段，然后经BamHⅠ和NotⅠ双酶切后连接pET28a载体，转化E.coli DH5α感受态细胞。次日挑选单菌落测序正确后，提质粒转化原核表达菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞。
1.3 NP表达及纯化
将NP表达菌培养至OD600＝0.6后，加入终浓度0.5mmol/L的IPTG，16℃诱导6h，收集菌体，超声破碎后离心收集包涵体。将包涵体溶于8mol/L尿素中，然后用镍柱亲和层析纯化包涵体蛋白。纯化后梯度减少尿素含量，使蛋白透析复性至PBS中，最后经SDS-PAGE检测蛋白表达及纯化效果。小量表达成功以后即上100L发酵罐进行大量发酵，发酵培养基为TB培养基(1％甘油)，发酵参数为280rpm，通气比为0.5vvm(15L/min)，pH控制在6.8～7.2，罐压0.06MPa～0.1MPa，发酵温度为16℃，培养24h。
SDS-PAGE结果显示：NP全长加上载体中的His tag及其他附带氨基酸，预计蛋白相对分子质量约50×103。表达菌经IPTG诱导后，发现在50×103左右出现明显的条带，与预计分子量大小一致(图1A)。包涵体溶解后，过镍柱纯化，在150mmol/L咪唑时有明显的洗脱峰。蛋白经透析复性后，经SDS-PAGE发现在同样的位置出现单一蛋白条带(图1B)。此说明NP被成功诱导表达并且纯化后纯度较高。注：图中M：蛋白Makers；1：未诱导的pET28a-NP表达菌；2：IPTG诱导后pET28a-NP重组表达菌；3：纯化后重组核衣壳蛋白。
二、噬菌体文库构建
1、采集COVID-19患者恢复期外周血，从外周血中分离单个核细胞(PBMC)
本项目于2020年2月14日，经过知情同意，采集5位COVID-19确诊患者出院前外周血各20ml。使用GE的Ficoll-Paque PLUS，经密度梯度离心法，分离20ml肝素抗凝血中的单个核细胞(PBMC)。
2、PBMC中RNA的提取和cDNA的合成
使用QIAGEN的RNeasy Mini Kit提取PBMC细胞RNA，然后使用罗氏公司的第一链合成试剂盒(Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit，Roche，Cat No.：04896866001)将RNA反转录成cDNA。
3、PCR扩增VK，VL和VH(EX Taq，Takara,Cat No.:DRR001A)
(1)扩增VK&VL体系如表1所示。
表1扩增VK&VL体系
溶液或组分 体积(μL)
cDNA 1
EX Buffer(10x) 5
dNTPs(10mM each) 4
P1(10μM) 2
P2(10μM) 2
EX Taq 1U/μl 0.3
dH<sub>2</sub>O 35.7
(2)扩增重链Fd段体系如表2所示。
表2扩增重链Fd段体系
溶液或组分 体积(μL)
cDNA 2
EX Buffer(10x) 10
dNTPs(10mM each) 8
P1(10μM) 2
P2(10μM) 2
EX Taq 1U/μl 0.6
dH<sub>2</sub>O 75.4
(3)反应程序如表3所示。
表3反应程序
Figure GDA0003234424470000091
Figure GDA0003234424470000101
PCR产物过2％琼脂糖凝胶电泳，回收750bp左右的片段。
4、轻链克隆(将VK和VL克隆入pComb3H载体)
VK和VL经XbaⅠ和SacⅠ酶切后与同样经XbaⅠ和SacⅠ酶切的pComb3H载体连接后，回收连接产物，然后电转XL1-Blue感受态细胞。
电击菌液涂15cm大平皿，次日刮菌，提质粒即为轻链库。此时重组质粒为pComb3H-VK和pComb3H-VL。
5、重链克隆(将VH基因克隆入pComb3H-VK和pComb3H-VL轻链库中)
将轻链库pComb3-L和Fd片段分别经XhoI和SpeI双酶切，与同样经XhoI和SpeI双酶切的pComb3H-VK和pComb3H-VL连接，然后电转即得到抗体文库。
6、抗体库的包装
(1)从-80℃冰箱取出抗体库，冰上融化后取1ml加入10ml A+(20μg/ml)2YT培养基中，37℃200rpm摇1小时；
(2)加100ml A+(100μg/ml)，T+(20μg/ml)2YT培养基，200rpm摇1小时；
(3)加1012pfu的VCSM13辅助噬菌体，37℃静置20min，200rpm摇2小时；
(4)加终浓度70μg/ml卡那30℃200rpm摇过夜；
(5)次日6000rpm离心20min，倒出上清，加入4％PEG8000(4g)和3％NaCl(3g)，混匀，置于冰上30min以上；
(6)分装于50ml离心管中9000rpm离心25min，弃去上清，控干，沉淀用1ml PBS重悬即为包装文库。
三、噬菌体文库筛选
1、将重组SARS-CoV2核蛋白(NP)包被于免疫管中，按50μg/管包被3管，于4℃放置过夜，次日用2％脱脂牛奶封闭免疫管1h。
2、向免疫管中加1.75ml含2％脱脂牛奶的PBS和250μl噬菌体文库，37℃摇1h，再37℃静置1h。
3、倒去噬菌体文库，用PBST洗20次，每次摇5min。
4、用1ml pH＝2.2的Gly-HCl洗脱免疫管，室温静置5min，再37℃摇5min，然后吸至1.5ml EP管中，加入57μl 2M Tris中和至pH＝7。
5、将洗脱液转移至一个新的50ml离心管中，立即加入10ml OD＝1的新鲜XL1-Blue，混匀后37℃孵育30min，加入10ml 2YT(Amp 100μg/ml，Tet 20μg/ml)。
6、取10μl菌液用来测洗脱库容量，剩下20ml培养基倒入500ml三角瓶，230rpm摇1h。
7、加入130ml 2YT(Amp 100ug/ml，Tet 20μg/ml)，230rpm摇1h。
8、加入MOI＝20的辅助噬菌体，37℃静置孵育30min。
9、3000g 10min离心，重悬沉淀至150ml 2YT(Amp 100μg/ml，Tet 20μg/ml)中，37℃，230rpm摇2h。
10、加入110μl 70mg/ml卡那霉素，30℃230rpm过夜。次日再加1/5体积的PEG-NaCl(40ml)，混匀后冰浴至少1h，然后10000g 4℃离心20min，沉淀重悬于2-3ml PBS中，瞬时离心去除杂菌，过0.45μm滤器后用于下一轮筛选。
11、重复上述筛选步骤3次，以达到对噬菌体文库富集筛选的目的。
12、第三轮富集完以后，挑选2*96个克隆。经IPTG诱导后，次日进行ELSA检测。
四、ELISA检测2*96个克隆的结合特异性
1、分别包被2块抗人Fab抗体(1:3000)和2块NP蛋白(2μg/ml)，于4℃包被过夜。
2、次日用3％脱脂牛奶封闭1h，然后加入50μl诱导上清和50μl脱脂牛奶，37℃孵育1h，PBST洗涤。
3、4块板均加入HRP标记的抗人Fab抗体(1:3000)，37℃孵育1h，PBST洗涤后，TMB显色。
经筛选共获得178株能与NP特异性结合的噬菌体抗体片段，该片段为人源的Fab段，包括轻链全长及重链的Fd段。将178个单菌落扩增后送测序，共获得159株轻重链齐全的合格序列。
实施例2全抗体的表达及相关功能验证
从获得的159株抗体中最终选定16株抗体用于全抗体的表达及相关功能验证，将此16株抗体命名为JS01～JS16。
其中，JS13抗体序列如下所示：
重链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
重链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
重链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；
轻链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；
轻链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；
轻链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，核酸序列如SEQ ID NO:17所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，核酸序列如SEQ ID NO:18所示。
JS08抗体序列如下所示：
重链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；
重链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；
重链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；
轻链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示；
轻链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示；
轻链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示。
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:16所示。
1、全抗体表达
将上述16株人源抗体，构建成IgG形式人源全分子抗体，并在293F细胞中表达，用Protein A纯化后备用。
2、ELISA检测16株抗体与重组NP结合特异性
将重组NP用PBS按1μg/ml浓度包被ELISA板，将所有抗体浓度稀释到1mg/ml，然后从1:10000开始倍比稀释，37℃孵育30min。然后PBST洗3次，加入HRP标记的抗人IgG(1:5000)，37℃孵育30min后PBST洗3次，然后TMB显色，终止后读取OD450吸光度值。
采用间接ELISA检测16株NP抗体的稀释滴度，阴性对照的平均OD值为0.119，标准差为0.132，因此将cutoff值定义为
Figure GDA0003234424470000131
由此判断16株抗体的检测滴度为1:80000～1:1280000之间(图2)。
3、16株抗体与纯化NP的Western Blot结果
将1μg重组NP经SDS-PAGE电泳后，转印至PVDF膜中，用上述16种抗体(0.5μg/ml)37℃孵育1h，用PBST洗涤3次，然后用HRP标记的抗人IgG(1:5000)孵育30min，PBST洗涤3次，然后用DAB之间在膜上显色。
WB实验结果显示16株抗体均能特异性结合重组表达的核蛋白(NP)，并在50kDa处出现明显的显色带，此提示该组抗体全部为线性表位的抗体(图3)。
4、抗体亲和活性检测
抗体亲和力测定由Biacore T200工作站完成，具体按以下步骤进行：首先使用氨基偶联活化剂NHS和EDC以10μl/min 300s活化CM5芯片，然后用10mM醋酸钠缓冲液(pH5.5)将重组表达的SARS-CoV-2NP稀释到1ug/mL，以10μl/min流经芯片30s使响应值(Responseunits,RUs)达到600左右，最后设置10μl/min、420s，进样乙醇胺对芯片表面剩余活化位点进行封闭。系列稀释的抗体，在25℃时以30μl/min流速依次进样，每测定一次浓度以后用pH2.0的甘氨酸-盐酸再生CM5芯片，然后进行下个浓度检测。实验结束后，利用Biacore T200Evaluation Software软件全局拟合曲线来获得结合亲和力。
实验结果如图4-19所示，JS01-JS16可高效结合SARS-CoV-2NP蛋白，亲和活性相关参数见表4。
表4抗体亲和力参数
抗体名称 配体偶联量 ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M)
JS01 102RU 2.18E+06 4.79E-04 2.20E-10
JS02 162RU 9.12E+05 5.83E-05 6.39E-11
JS03 102RU 8.97E+05 2.12E-04 2.36E-10
JS04 162RU 7.15E+04 1.91E-04 2.67E-09
JS05 162RU 5.94E+05 2.43E-04 4.09E-10
JS06 136RU 1.61E+05 0.002576 1.61E-08
JS07 110RU 1.44E+06 1.78E-04 1.24E-10
JS08 162RU 3.03E+04 5.77E-06 1.90E-10
JS09 129RU 6.89E+05 4.79E-05 6.94E-11
JS10 136RU 1.47E+06 2.99E-04 2.04E-10
JS11 110RU 1.93E+05 5.62E-05 2.92E-10
JS12 110RU 4.88E+05 7.33E-05 1.50E-10
JS13 110RU 8.05E+05 9.66E-05 1.20E-10
JS14 136RU 1.24E+06 2.21E-04 1.78E-10
JS15 110RU 7.72E+04 1.22E-04 1.58E-09
JS16 136RU 2.68E+05 4.01E-05 1.50E-10
5、抗体配对实验
5.1抗体包被浓度的确定
(1)将100μl JS12抗体从5μg/ml开始倍比稀释到0.0024μg/ml共稀释12个稀释度，然后包被于ELISA板中。4℃包被过夜，次日用1％BSA封闭2h，PBST洗3次。
(2)向每个包被浓度的第一孔加入50ng的重组NP，然后倍比稀释到0.39ng/孔，共8个稀释度，37℃孵育1h，PBST洗3次。
(3)加入1:1000稀释HRP标记的JS08，37℃孵育1h，PBST洗3次，TMB显色后读取OD450nm吸光度值。
由图20的曲线可以看出，包被抗体的量对检测灵敏性有影响，从5μg/ml到0.00245μg/ml的包被量看来，影响不大，检测NP抗原的灵敏性看小于3.9ng/ml。因此，后续配对实验，我们均选择2μg/ml浓度作为抗体包被量，用1:4000作为酶标抗体的稀释度。
5.2双抗夹心法检测NP
(1)将16株NP抗体JS01～JS16按2μg/ml浓度包被ELISA板，于4℃包被过夜，次日用1％BSA封闭2h，PBST洗3次。
(2)加入0.1μg/ml重组NP蛋白，然后倍比稀释至0.78ng/ml，共8个稀释度，37℃孵育1h，PBST洗3次。
(3)加入HRP标记的JS08(1:1000)，37℃孵育1h，PBST洗3次，TMB显色，读取OD450nm吸光度值。
由图21可见，酶标的JS08不能与JS06，JS11和JS08自身配对，而与其他13株NP抗体均可配对用于双抗夹心法检测NP。其中JS08与JS16配对效果最好，其检测限可达0.78ng/ml以下，其他配对抗体检测限在12.5-1.56ng/ml之间。
6、双抗体夹心免疫层析法检测重组NP的灵敏度
将抗JS08单抗包被在硝酸纤维素膜上形成T线，抗人IgG抗体标记至C线处。NP蛋白系列稀释后加50μL于样本孔中，样本孔下的结合垫上的标有色微球的JS01～JS16抗体与NP形成免疫复合物，然后通过层析作用迁移至T线处，与此处标记抗体结合固定，形成有色T线。多余的人源单抗再继续迁移至C线处，与抗人抗体结合，形成C线。以此来测定对NP的结合灵敏度。
采用有色微球标记JS08抗体与13株抗体分别配对，制成抗原检测层析条。用2ng/ml的重组NP验证试纸条，从结果可见全部层析条均可见明显的检测T线，而质控C线也非常明显(图22)。这说明13对抗体组合均可用于检测新冠状病毒的核蛋白，且检测限小于2ng/ml。
虽然以上仅描述了本发明的具体实施方式范例，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改，但这些变更或修改均落入本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏省疾病预防控制中心（江苏省公共卫生研究院）
<120> 针对新型冠状病毒NP蛋白的抗体及其检测应用
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala
1 5
<210> 3
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ala Arg Gly Gly Trp Val Ile Cys Ser Ser Thr Ser Cys Tyr Thr Lys
1 5 10 15
Tyr Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Val
20
<210> 4
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Trp Val Ile Cys Ser Ser Thr Ser Cys Tyr Thr Lys
100 105 110
Tyr Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
115 120 125
Val Ser Ser
130
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr
1 5
<210> 6
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Asp Asn Asn
1
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ile Ala Arg Leu
1 5 10
<210> 8
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
20 25 30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80
Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu
85 90 95
Ile Ala Arg Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr
1 5
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr
1 5
<210> 11
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Ala Arg Glu Gln Phe Ser Gly Gly Asp Tyr Glu Gly Phe Asp Phe
1 5 10 15
<210> 12
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Glu Gln Phe Ser Gly Gly Asp Tyr Glu Gly Phe Asp Phe Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp
1 5
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Gly Asn Ser
1
<210> 15
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Trp Val
1 5 10
<210> 16
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Gln Ser Val Leu Thr Gln Glu Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 17
<211> 393
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaggaggt 300
tgggtgattt gtagtagtac cagctgctac actaagtact cctactacgg tatggacgtc 360
tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc tca 393
<210> 18
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cagagcgtgc tcacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc 60
tcctgctctg gaagcagctc caacattggg aataattatg tatcctggta ccagcagctc 120
ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataata agcgaccctc agggattcct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tgggcatcac cggactccag 240
actggggacg aggccgatta ttactgcgga acgtgggata gcagcctgat tgcccggttg 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330

Claims (15)

1.一种抗新型冠状病毒NP蛋白的单克隆抗体，其特征在于，其包含第一可变区和第二可变区，其中所述第一可变区是抗体轻链可变区，其抗原互补决定区CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：7所示；其中所述第二可变区是抗体重链可变区，其抗原互补决定区CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1，SEQID NO：2及SEQ ID NO：3所示。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述第一可变区是抗体轻链可变区，为SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列；所述第二可变区是抗体重链可变区，为SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包含所述抗体轻链可变区和人抗体轻链恒定区，以及所述抗体重链可变区和人抗体重链恒定区的铰链区，CH1区，CH2区和CH3区。
4.根据权利要求3所述的单克隆抗体，其特征在于，所述人抗体轻链恒定区来自人抗体kappa链或抗体lamda链，所述人抗体重链恒定区来自人IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型。
5.一种编码权利要求1-4中任一项所述的单克隆抗体的DNA分子。
6.根据权利要求5所述的DNA分子，其特征在于，抗体轻链可变区的核苷酸序列为SEQID NO：18所示，抗体重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：17所示。
7.一种表达载体，所述表达载体含有权利要求5或6所述的DNA分子序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列。
8.一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞由权利要求7所述的表达载体转化而成。
9.根据权利要求8所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述重组宿主细胞或其子代细胞表达权利要求1-4中任一项所述的单克隆抗体。
10.一种制备权利要求1-4中任一项所述的单克隆抗体的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
a)提供一表达载体，该表达载体含有权利要求5或6所述的DNA分子序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列；
b)用步骤a)所述的表达载体转化宿主细胞；
c)在适合条件下培养步骤b)所得的宿主细胞：和
d)从宿主细胞培养液中分离纯化获得所述单克隆抗体。
11.一种组合物或试剂盒，其含有权利要求1-4中任一项所述的单克隆抗体；所述组合物或试剂盒还包含第二种单克隆抗体，所述第二种单克隆抗体包含重链可变区CDR1、重链可变区CDR2、重链可变区CDR3、轻链可变区CDR1、轻链可变区CDR2、轻链可变区CDR3；其中，
重链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示；
重链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示；
重链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示；
轻链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示；
轻链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示；
轻链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示。
12.根据权利要求11所述的组合物或试剂盒，其特征在于，所述第二种单克隆抗体包含重链可变区、轻链可变区；其中，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示。
13.权利要求1-4中任一项所述的单克隆抗体在制备新型冠状病毒检测产品中的应用。
14.权利要求1-4中任一项所述的单克隆抗体在制备新型冠状病毒感染诊断产品中的应用。
15.权利要求11或12所述的组合物在制备检测新型冠状病毒的产品中的应用。
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