CN114292315A

CN114292315A - ppc突变体及其在制备L-缬氨酸中的应用

Info

Publication number: CN114292315A
Application number: CN202111676686.2A
Authority: CN
Inventors: 孟刚; 赵春光; 魏爱英; 杨立鹏; 贾慧萍; 毕国东
Original assignee: Ningxia Eppen Biotech Co ltd
Current assignee: Ningxia Eppen Biotech Co ltd
Priority date: 2021-12-31
Filing date: 2021-12-31
Publication date: 2022-04-08

Abstract

本发明公开了ppc突变体及其在制备L‑缬氨酸中的应用。本发明公开的ppc突变体是将ppc蛋白质第186位氨基酸残基由甘氨酸突变为精氨酸得到的蛋白质。本发明首先通过对ppc基因进行单点突变得到ppc^G556C基因，然后构建过表达ppc基因或ppc^G556C基因的重组菌以及ppc基因敲除的重组菌，最后通过对构建的重组菌进行发酵培养发现，ppc基因或ppc^G556C基因可以调控细菌L‑缬氨酸产量。本发明首次发现ppc基因参与L‑缬氨酸的生物合成，对于培育符合工业化生产的高产、高质量菌种，以及缬氨酸工业化生产具有重大的应用价值。

Description

ppc突变体及其在制备L-缬氨酸中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及ppc突变体及其在制备L-缬氨酸中的应用。

背景技术

L-缬氨酸(L-valine)，化学名称为α-氨基异戊酸，是支链氨基酸之一，人和动物自身不能合成。L-缬氨酸是人体八种必需氨基酸之一，具有促进蛋白合成、抑制蛋白分解的作用，增强机体的免疫防护作用，有助于纠正因手术、创伤、感染等引起的负氮平衡。另外，L-缬氨酸还具有抗中枢疲劳、抗外周疲劳、延缓运动性疲劳和加快运动后机体修复的作用，因此在食品和医药行业具有广泛的应用及商业价值。由L-缬氨酸配制的复合支链氨基酸输液在血脑屏障、肝昏迷、慢性肝硬化以及肾功能衰竭的治疗，先天性代谢缺陷病的膳食治疗，败血症及术后糖尿病患者的治疗，加快外科创伤愈合的治疗和肿瘤患者的营养支持治疗中应用广泛。L-缬氨酸在食品工业上主要用作食品添加剂、营养增补液及风味剂等。L-缬氨酸凝胶具有带正电的端基，是新型低分子量凝胶，不仅可以使纯化和含有无机酸和盐的水溶液成凝胶而且可以使有机溶剂和油成胶状，可以制备形成水凝胶，其在生物医药、组织工程、光化学、电化学、食品工业、化妆品等领域已被广泛应用。L-缬氨酸因其含有特殊的生理功能，市场需求量大，使得L-缬氨酸的生产备受关注。

目前，L-缬氨酸大都采用直接发酵法生产，工业发酵中获得高产的菌种，对于L-缬氨酸的发酵生产来说是至关重要的，是整个L-缬氨酸发酵工业的核心，是决定发酵产品工业价值的重要因素。随着L-缬氨酸的市场需求不断增加，选育高产、稳定的生产菌种，促进L-缬氨酸在微生物体内的积累，进一步提高L-缬氨酸的产量一直是L-缬氨酸发酵工业技术开发和发酵工程化研究的热点，并且也将一直伴随L-缬氨酸发酵工业的发展，对于促进L-缬氨酸产业化的进程具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是如何利用ppc基因构建产缬氨酸工程菌，以进一步提高缬氨酸产量。

为了实现上述目的，本发明首先提供了一种ppc突变体。

本发明提供的ppc突变体是将ppc蛋白质第186位氨基酸残基由甘氨酸突变为其他氨基酸残基得到的蛋白质；

所述ppc蛋白质为如下A1)-A3)中的任一种：

A1)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

A2)将A1)所示的氨基酸序列经过除第186位氨基酸残基以外的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与细菌产缬氨酸相关的蛋白质；

A3)来源于细菌且与A1)或A2)具有95％以上同一性且与细菌产缬氨酸相关的蛋白质。

上述A2)所述的蛋白质中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述A3)所述的蛋白质中，这里使用的术语“同一性”指与天然氨基酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有95％或更高，或96％或更高，或97％或更高，或98％或更高，或99％或更高同一性的氨基酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述A1)或A2)或A3)所述的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

进一步的，所述ppc突变体是将ppc蛋白质第186位氨基酸残基由甘氨酸突变为精氨酸得到的蛋白质(对应本发明实施例中的ppc^G556C蛋白质)。

更进一步的，所述ppc突变体(ppc^G556C蛋白质)是SEQ ID No.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

为了实现上述目的，本发明又提供了与ppc突变体相关的生物材料。

本发明提供的与ppc突变体相关的生物材料为如下B1)至B4)中的任一种：

B1)编码上述ppc突变体的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物。

为了实现上述目的，本发明还提供了上述ppc蛋白质或与上述ppc蛋白质相关的生物材料或上述ppc突变体或与上述ppc突变体相关的生物材料的新用途。

本发明提供了上述ppc蛋白质或与上述ppc蛋白质相关的生物材料或上述ppc突变体或与上述ppc突变体相关的生物材料在如下X1)至X4)中任一种中的应用：

X1)调控细菌缬氨酸产量；

X2)构建产缬氨酸工程菌；

X3)制备缬氨酸；

与ppc蛋白质相关的生物材料为如下D1)至D4)中的任一种：

D1)编码所述ppc蛋白质的核酸分子；

D2)含有D1)所述核酸分子的表达盒；

D3)含有D1)所述核酸分子的重组载体、或含有D2)所述表达盒的重组载体；

D4)含有D1)所述核酸分子的重组微生物、或含有D2)所述表达盒的重组微生物、或含有D3)所述重组载体的重组微生物。

上述生物材料或应用中，B1)所述编码ppc突变体的核酸分子为如下C1)或C2)中的任一种：

C1)核苷酸序列为SEQ ID No.3的DNA分子；

C2)将SEQ ID No.3所示的核苷酸序列经过修饰和/或一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加得到的与C1)所示的DNA分子具有90％以上的同一性，且具有相同功能的DNA分子。

D1)所述编码ppc蛋白质的核酸分子为如下E1)或E2)中的任一种：

E1)核苷酸序列为SEQ ID No.1的DNA分子；

E2)将SEQ ID No.1所示的核苷酸序列经过修饰和/或一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加得到的与E1)所示的DNA分子具有90％以上的同一性，且具有相同功能的DNA分子。

其中，SEQ ID No.1所示的DNA分子为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)CGMCC No.21260中的ppc基因，其编码的ppc蛋白质的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。在本发明中通过引入点突变，得到SEQ ID No.3所示的ppc^G556C基因，其编码的ppc^G556C蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码ppc蛋白质或ppc突变体的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码ppc蛋白质或ppc突变体的核苷酸序列90％或者更高同一性的核苷酸，只要编码ppc蛋白质或ppc突变体且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID No.2或SEQ ID No.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有90％或更高，或91％或更高，或92％或更高，或93％或更高，或94％或更高，或95％或更高，或96％或更高，或97％或更高，或98％或更高，或99％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min；或，0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述生物材料或应用中，B2)所述含有编码ppc突变体的核酸分子的表达盒是指能够在宿主细胞中表达ppc突变体的DNA，该DNA不但可包括启动ppc突变体基因转录的启动子，还可包括终止ppc突变体基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。D2)所述含有编码ppc蛋白质的核酸分子的表达盒是指能够在宿主细胞中表达ppc蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动ppc基因转录的启动子，还可包括终止ppc基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

上述生物材料或应用中，B3)或D3)所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pK18mobsacB质粒或pXMJ19质粒。

在本发明的一个具体实施例中，所述重组载体为重组载体pK18-ppc^G556C。

在本发明的另一个具体实施例中，所述重组载体为重组载体pK18-ppcOE或重组载体pK18-ppc^G556COE。

在本发明的又一个具体实施例中，所述重组载体为重组载体pXMJ19-ppc或重组载体pXMJ19-ppc^G556C。

上述生物材料中，B4)或D4)所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。

进一步的，细菌可为任一具有产缬氨酸能力的细菌，如来自短杆菌属(Brevibacterium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、埃希氏菌属(Escherichia)、气杆菌属(Aerobacter)、微球菌属(Micrococcus)、黄杆菌属(Flavobacterium)或芽胞杆菌属(Bacillus)的细菌等。

更进一步的，所述细菌包括但不限于谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳酸发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)、产谷氨酸微球菌(Micrococcus glutamicus)、产氨短杆菌(Brevibacterum ammoniagenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、产气气杆菌(Aerobacteraerogenes)。

在本发明的一个具体实施例中，所述微生物为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)CGMCC No.21260，该菌株名称为YPFV1，已于2020年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No.21260。

上述应用中，调控为正调控。具体体现为当细菌中ppc蛋白质或ppc突变体含量或活性提高时，所述细菌缬氨酸产量提高；当细菌中ppc蛋白质含量或活性降低时，所述细菌缬氨酸产量降低。

为了实现上述目的，本发明还提供了提高ppc蛋白质或ppc突变体含量和/或活性的物质或提高ppc基因或ppc突变体基因表达量的物质的新用途。

本发明提供了提高ppc蛋白质或ppc突变体含量和/或活性的物质或提高ppc基因或ppc突变体基因表达量的物质在如下Y1)至Y4)中任一种中的应用：

Y1)提高细菌缬氨酸产量；

Y2)构建产缬氨酸工程菌；

Y3)制备缬氨酸。

进一步的，所述提高ppc基因表达量的物质可为ppc基因或含有所述ppc基因的重组载体。

所述提高ppc突变体基因表达量的物质可为ppc突变体基因或含有所述ppc突变体基因的重组载体。

更进一步的，含有所述ppc基因的重组载体具体可为重组载体pK18-ppcOE或重组载体pXMJ19-ppc。

含有所述ppc突变体基因的重组载体具体可为重组载体pK18-ppc^G556COE或重组载体pXMJ19-ppc^G556C。

为了实现上述目的，本发明还提供了一种提高细菌缬氨酸产量的方法。

本发明提供的提高细菌缬氨酸产量的方法为如下M1)或M2)：

所述M1)包括如下步骤：将细菌基因组中的ppc基因替换为ppc突变体基因，实现细菌缬氨酸产量的提高；

所述M2)包括如下步骤：提高细菌中ppc蛋白质或ppc突变体含量和/或活性，或提高细菌中ppc基因或ppc突变体基因表达量，实现细菌缬氨酸产量的提高。

为了实现上述目的，本发明还提供了一种产缬氨酸工程菌的构建方法。

本发明提供的产缬氨酸工程菌的构建方法为如下N1)或N2)：

所述N1)包括如下步骤：将细菌基因组中的ppc基因替换为ppc突变体基因，得到所述产缬氨酸工程菌；

所述N2)包括如下步骤：提高细菌中ppc蛋白质或ppc突变体含量和/或活性，或提高细菌中ppc基因或ppc突变体基因表达量，得到所述产缬氨酸工程菌；

上述任一所述应用或方法中，所述ppc突变体具体为ppc^G556C蛋白质，具体为SEQ IDNo.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

所述ppc突变体基因具体为ppc^G556C基因，具体为SEQ ID No.3所示的DNA分子。

按照上述产缬氨酸工程菌的构建方法构建得到的产缬氨酸工程菌在制备缬氨酸中的应用也属于本发明的保护范围。

为了实现上述目的，本发明最后提供了一种制备缬氨酸的方法。

本发明提供的制备缬氨酸的方法包括如下步骤：发酵培养按照上述产缬氨酸工程菌的构建方法构建得到的产缬氨酸工程菌，得到所述缬氨酸。

所述发酵培养方法可按照现有技术中的常规试验方法进行。也可采用优化和改进后的常规试验方法进行。

所述发酵培养采用的培养基如实施例中的表3所示。

所述发酵培养条件如实施例中的表4所示。

上述任一所述应用或方法中，所述缬氨酸具体为L-缬氨酸。

本发明首先通过对ppc基因进行单点突变得到ppc^G556C基因，然后构建过表达ppc基因或ppc^G556C基因的重组菌以及ppc基因敲除的重组菌，最后通过对构建的重组菌进行发酵培养发现，ppc基因或ppc^G556C基因可以调控细菌L-缬氨酸产量。本发明首次发现ppc基因参与L-缬氨酸的生物合成，对于培育符合工业化生产的高产、高质量菌种，以及缬氨酸工业化生产具有重大的应用价值。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、构建包含点突变的ppc基因编码区片段的重组载体

依据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC14067基因组序列，设计并合成两对扩增ppc基因编码区的引物，以等位基因置换的方式在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCC No.21260(经测序确认该菌株染色体上保留有野生型的ppc基因)的ppc基因编码区(SEQ ID No.1)中引入点突变，所述点突变为将ppc基因的核苷酸序列(SEQ ID No.1)中的第556位鸟嘌呤(G)突变为胞嘧啶(C)得到SEQ ID No.3所示的DNA分子(突变的ppc基因，名称为ppc^G556C)。

其中，SEQ ID No.1所示的DNA分子编码氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质(所述蛋白质名称为蛋白质ppc)。

SEQ ID No.3所示的DNA分子编码氨基酸序列为SEQ ID No.4的突变蛋白质(所述突变蛋白质名称为ppc^G556C)。所述突变蛋白质ppc^G556C氨基酸序列(SEQ ID No.4)中的第186位精氨酸(R)由甘氨酸(G)突变而来。

采用重叠PCR(Overlap PCR)技术进行基因定点突变，引物设计如下(上海invitrogen公司合成)，加粗字体的碱基为突变位置：

P1：5'-CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGGAGAATGATCAATGGTCAAC-3'；

P2：

P3：

P4：5'-CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGCCCAGCTAAACACCTGTTT-3'。

构建方法：以谷氨酸棒杆菌ATCC14067为模板，分别采用引物P1/P2和P3/P4进行PCR扩增，获得两条分别带有突变碱基，大小分别为636bp和692bp的ppc基因编码区的DNA片段(ppc Up和ppc Down)。

PCR扩增体系为：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg²⁺(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL。

PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min，(94℃变性30s；52℃退火30s；72℃延伸40s；30个循环)，72℃过度延伸10min。

将上述两条DNA片段(ppc Up和ppc Down)经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，对目的条带进行回收，再以上述两条DNA片段为模板，采用引物P1/P4通过Overlap PCR扩增，得到大小为1294bp的DNA片段(名称为ppc Up-Down，序列如SEQ ID No.5所示)。SEQ ID No.5所示的DNA片段中，第37-1171位(1135bp)为含有突变位点的ppc^G556C基因片段(即SEQ ID No.3的1-1135位)。

Overlap PCR扩增反应体系为：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg²⁺(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL。

Overlap PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min，(94℃变性30s；52℃退火30s；72℃延伸60s；30个循环)，72℃过度延伸10min。

SEQ ID No.5所示的DNA片段(ppc Up-Down)含有突变位点，导致菌株谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260中ppc基因编码区的第556位鸟嘌呤(G)变为胞嘧啶(C)，最终导致编码蛋白的第186位甘氨酸(G)变为精氨酸(R)。将此DNA片段(ppc Up-Down)经琼脂糖凝胶电泳分离后进行纯化，与经过酶切(Xbal I/BamH I)后纯化的pK18mobsacB质粒(购自Addgene公司，用Xbal I/BamH I酶切)用NEBuilder酶(购自NEB公司)50℃连接30min，连接产物转化后长出的单克隆经PCR鉴定获得阳性重组载体pK18-ppc^G556C，该重组载体上含有卡那霉素抗性标记。将酶切正确的重组载体pK18-ppc^G556C送测序公司测序鉴定，并将含有正确点突变(G-C)的重组载体pK18-ppc^G556C保存备用。

所述重组载体pK18-ppc^G556C是将pK18mobsacB载体的Xbal I和/BamH I识别位点间的片段(小片段)替换为序列表中SEQ ID No.5的第37-1171位所示的DNA片段，且保持pK18mobsacB载体的其他序列不变得到的重组载体。

所述重组载体pK18-ppc^G556C含有SEQ ID No.3所示的突变的基因ppc^G556C的第1-1135位所示的DNA分子。

实施例2、构建包含基因ppc^G556C的工程菌株YPV-049

构建方法：将实施例1中的等位替换质粒(pK18-ppc^G556C)通过电击转化入谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCC No.21260后，在培养基中进行培养，培养基成分和培养条件参见表1，对培养产生的单菌落分别通过实施例1中的引物P1和通用引物M13R进行鉴定，能扩增出1301bp大小条带的菌株为阳性菌株。将阳性菌株在含15％蔗糖的培养基上培养，对培养产生的单菌落分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，选择在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用引物P5/P6(上海invitrogen公司合成)进行PCR鉴定。引物序列如下：

P5：5'-CACGGTTGATACGTGGAATC-3'；

P6：5'-GTTTTTGATGCGCAAAAGTG-3'。

将得到的PCR扩增产物(247bp)通过95℃高温变性10min、冰浴5min后进行SSCP(Single-Strand Conformation Polymorphis)电泳(以质粒pK18-ppc^G556C扩增片段为阳性对照，谷氨酸棒杆菌ATCC14067扩增片段为阴性对照，水作为空白对照)，SSCP电泳的PAGE的制备及电泳条件参见表2，由于片段结构不同，电泳位置不同，因此片段电泳位置与阴性对照片段位置不一致且与阳性对照片段位置一致的菌株为等位替换成功的菌株。再次通过引物P5和P6 PCR扩增阳性菌株ppc基因片段，并连接到PMD19-T载体进行测序，通过序列比对，碱基序列发生突变(G-C)的菌株为等位替换成功的阳性菌株，并将其命名为YPV-049。

重组菌YPV-049是将谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCCNo.21260基因组中的ppc基因进行单点突变(对应于SEQ ID No.1所示ppc基因的第556位的碱基G突变为碱基C)，且保持谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260的基因组中的其它序列不变得到的重组菌。

表1、培养基的组成和培养条件

成分	配方
		蔗糖	10g/L
多聚蛋白胨	10g/L
		牛肉膏	10g/L
酵母粉	5g/L
		尿素	2g/L
氯化钠	2.5g/L
		琼脂粉	20g/L
水
		pH	7.0
培养条件	32℃

表2、SSCP电泳的PAGE的制备及电泳条件

成分	用量(丙烯酰胺终浓度为8％)
		40％丙烯酰胺	8mL
ddH<sub>2</sub>O	26mL
		甘油	4mL
10×TBE	2mL
		TEMED	40μL
10％APS	600μL
		电泳条件	将电泳槽置入冰中，使用1×TBE缓冲液电压120V，电泳时间10h

实施例3、构建基因组上过表达ppc基因或ppc^G556C基因的工程菌株YPV-050和YPV-051

依据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC14067基因组序列，设计并合成三对扩增上下游同源臂片段及ppc或ppc^G556C基因编码区及启动子区的引物，以同源重组的方式在谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260中引入ppc或ppc^G556C基因。

引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：

P7：5'-CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGGTAGTGCCGTGCGTACCCCA-3'；

P8：5'-CACTGCGCAACTCTGGCTAGCCCAACCCCAATCGCAATGT-3'；

P9：5'-ACATTGCGATTGGGGTTGGGCTAGCCAGAGTTGCGCAGTG-3'；

P10：5'-GTGCGGGTTGGGGTTTTTGAAGTACAGAGCTTTAAAGCAC-3'；

P11：5'-GTGCTTTAAAGCTCTGTACTTCAAAAACCCCAACCCGCAC-3'；

P12：5'-CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGTTGGTTTAGCGGAGCTGCA-3'。

构建方法：分别以谷氨酸棒杆菌ATCC14067或YPV-049为模板，分别采用引物P7/P8、P9/P10、P11/P12进行PCR扩增，获得上游同源臂片段795bp(对应于谷氨酸棒杆菌CGMCCNo.21260 CEY17_RS02570基因及其CEY17_RS02575的间隔区，序列如SEQ ID No.6所示)，ppc基因及其启动子片段2985bp(序列如SEQ ID No.7所示)或ppc^G556C基因及其启动子片段2985bp(序列如SEQ ID No.8所示)及下游同源臂片段769bp(对应于谷氨酸棒杆菌CGMCCNo.21260 CEY17_RS02575基因及其与CEY17_RS02570的间隔区，序列如SEQ ID No.9所示)。PCR反应结束后，对每个模板扩增得到的3个片段采用柱式DNA凝胶回收试剂盒分别进行电泳回收。回收后的3个片段与经过Xbal I/BamH I酶切后纯化的pK18mobsacB质粒(购自Addgene公司)用NEBuilder酶(购自NEB公司)50℃连接30min，连接产物转化后长出的单克隆用M13引物经PCR鉴定获得阳性整合质粒(重组载体)，分别为pK18-ppcOE、pK18-ppc^G556COE，该阳性整合质粒上含有卡那霉素抗性标记，可以通过卡那霉素筛选获得质粒整合到基因组上的重组子。

PCR反应体系为：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg²⁺(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL。

PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s；52℃退火30s；72℃延伸60s(30个循环)，72℃过度延伸10min。

将测序正确的整合质粒(pK18-ppcOE、pK18-ppc^G556COE)分别电转化入谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260，在培养基中进行培养，培养基成分和培养条件参见表1，对培养产生的单菌落采用P13/P14引物进行PCR鉴定，PCR扩增出大小为3123bp的片段的菌株为阳性菌株，扩增不到片段的菌株为原菌。将阳性菌株在含15％蔗糖的培养基上培养，对培养产生的单菌落进一步采用P15/P16引物进行PCR鉴定，PCR扩增出大小为1668bp的片段的菌株为ppc或ppc^G556C基因整合到谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260基因组上同源臂CEY17_02570和下同源臂CEY17_02575的间隔区上的阳性菌株，分别命名为YPV-050(不含突变点)和YPV-051(含突变点)。

PCR鉴定引物序列如下：

P13：5'-CGGTTAGATTTTTTGGCCCC-3'(对应上同源臂CEY17_RS02570的外侧)；

P14：5'-TCGCCGCCGCACTGTTTTTG-3'(对应ppc基因内部)；

P15：5'-CACGGTTGATACGTGGAATC-3'(对应ppc基因内部)；

P16：5'-TCTGGACTGGGTGTTGCGCT-3'(对应下同源臂CEY17_RS02575的外侧)。

重组菌YPV-050含有双拷贝的SEQ ID No.1所示的ppc基因；具体地，重组菌YPV-050是将谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260基因组中上同源臂CEY17_02570和下同源臂CEY17_02575的间隔区替换为ppc基因，且保持谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260的基因组中的其它序列不变得到的重组菌。含有双拷贝ppc基因的重组菌可以显著和稳定地提高ppc基因的表达量。

重组菌YPV-051含有SEQ ID No.3所示的突变的ppc^G556C基因；具体地，重组菌YPV-051是将谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260基因组中上同源臂CEY17_02570和下同源臂CEY17_02575的间隔区替换为ppc^G556C基因，且保持谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260的基因组中的其它序列不变得到的重组菌。

实施例4、构建质粒上过表达ppc基因或ppc^G556C基因的工程菌株YPV-052和YPV-053

依据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC14067基因组序列，设计并合成一对扩增ppc或ppc^G556C基因编码区及启动子区的引物，引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：

P17：5'-GCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCCTAGCCAGAGTTGCGCAGTG-3'(带下划线的核苷酸序列为pXMJ19上的序列)，

P18：5'-ATCAGGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCCAAAACAGTACAGAGCTTTAAAGCAC-3'(带下划线的核苷酸序列为pXMJ19上的序列)。

构建方法：分别以谷氨酸棒杆菌ATCC14067和YPV-049为模板，采用引物P17/P18进行PCR扩增，获得ppc基因及其启动子片段3015bp和ppc^G556C基因及其启动子片段3015bp。然后将扩增产物进行电泳并采用柱式DNA凝胶回收试剂盒进行纯化回收，回收的DNA片段与经EcoR I酶切回收的穿梭质粒pXMJ19用NEBuilder酶(购自NEB公司)50℃连接30min，连接产物转化后长出的单克隆用M13引物经PCR鉴定获得阳性过表达质粒pXMJ19-ppc(含有ppc基因)和pXMJ19-ppc^G556C(含有ppc^G556C基因)，再将该质粒送测序。因质粒上含有氯霉素抗性标记，可以通过氯霉素来筛选质粒是否转化到菌株中。

将测序正确的pXMJ19-ppc和pXMJ19-ppc^G556C质粒分别电转化入谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260中，在培养基中进行培养，培养基成分和培养条件参见表1，对培养产生的单菌落通过引物M13R(-48)/P18进行PCR鉴定，PCR扩增出大小为3054bp片段的菌株为阳性菌株，其被命名为YPV-052(不含突变点)和YPV-053(含突变点)。

重组菌YPV-052含有SEQ ID No.1所示的ppc基因，是通过质粒过表达ppc基因的重组菌。

重组菌YPV-053含有SEQ ID No.3所示的突变的ppc^G556C基因，是通过质粒过表达ppc^G556C基因的重组菌。

实施例5、构建基因组上缺失ppc基因的工程菌株YPV-054

根据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC14067的基因组序列，合成两对扩增ppc基因编码区两端片段的引物，作为上下游同源臂片段。引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：

P19：5'-CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGGGCTTACCAACGCAAAAGCT-3'；

P20：5'-AAAGAGTGTTTAAAGTAGTTTCCTGCTGGGTAGGTAGTAC-3'；

P21：5'-GTACTACCTACCCAGCAGGAAACTACTTTAAACACTCTTT-3'；

P22：5'-CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCCCGTTCCTTTCACTGACATC-3'。

构建方法：以谷氨酸棒杆菌ATCC14067为模板，分别采用引物P19/P20和P21/P22进行PCR扩增，获得ppc的上游同源臂片段849bp及ppc的下游同源臂片段873bp。再采用引物P19/P22进行Overlap PCR得到整个同源臂片段1722bp(序列如SEQ ID No.10所示)。对扩增的产物进行电泳并采用柱式DNA凝胶回收试剂盒进行纯化，回收的DNA片段与经过Xbal I/BamH I酶切后纯化的pK18mobsacB质粒(购自Addgene公司)用NEBuilder酶(购自NEB公司)50℃连接30min，连接产物转化后长出的单克隆用M13引物经PCR鉴定获得阳性敲除载体pK18-Δppc，将该质粒送测序。该质粒上含有卡那霉素抗性作为筛选标记。

Overlap PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s；52℃退火30s；72℃延伸90s(30个循环)，72℃过度延伸10min。

将测序正确的敲除质粒pK18-Δppc电转化入谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260，在培养基中进行培养，培养基成分和培养条件参见表1，对培养产生的单菌落通过如下引物(上海invitrogen公司合成)进行PCR鉴定：

P23：5'-GGCTTACCAACGCAAAAGCT-3'(对应于谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260ppc基因内部)；

P24：5'-CCGTTCCTTTCACTGACATC-3'(对应于谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260ppc基因内部)。

上述PCR同时扩增出大小1722bp及4408bp的条带的菌株为阳性菌株，只扩增出1722bp条带的菌株为原菌。阳性菌株在15％蔗糖培养基上筛选后分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，选择在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用P23/P24引物进行PCR鉴定，扩增出大小为1722bp条带的菌株为ppc基因编码区被敲除的阳性菌株ppc。再次采用P23/P24引物PCR扩增阳性菌株ppc片段，并连接到pMD19-T载体进行测序，将测序正确的菌株命名为YPV-054。

重组菌YPV-054是将谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260基因组序列上的ppc基因敲除，且保持谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260基因组中的其它序列不变得到的重组菌。

实施例6、L-缬氨酸发酵实验

将上述实施例构建的菌株(重组菌YPV-049、YPV-050、YPV-051、YPV-052、YPV-053和YPV-054)和原始菌株谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260在BLBIO-5GC-4-H型号的发酵罐(购自上海百仑生物科技有限公司)中以表3所示的培养基和表4所示的控制工艺进行发酵实验。每个菌株重复三次。完成发酵后，收集上清，采用HPLC检测上清中的L-缬氨酸产量。

结果如表5所示，在谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260中对ppc基因编码区进行点突变及过表达ppc^G556C，有助于L-缬氨酸产量及转化率的提高，而对基因进行敲除或弱化，不利于L-缬氨酸的积累。

表3、发酵培养基配方(其余为水)

表4、发酵控制工艺

表5、L-缬氨酸发酵实验结果

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 宁夏伊品生物科技股份有限公司

<120> ppc突变体及其在制备L-缬氨酸中的应用

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2760

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

atgactgatt ttttacgcga tgacatcagg ttcctcggtc aaatcctcgg tgaggtaatt 60

gcggaacaag aaggccagga ggtttatgaa ctggtcgaac aagcgcgcct gacttctttt 120

gatatcgcca agggcaacgc cgaaatggat agcctggttc aggttttcga cggcattact 180

ccagccaagg caacaccgat tgctcgcgca ttttcccact tcgctctgct ggctaacctg 240

gcggaagacc tctacgatga agagcttcgt gaacaggctc tcgatgcagg cgacacccct 300

ccggacagca ctcttgatgc cacctggctg aaactcaatg agggcaatgt tggcgcagaa 360

gctgtggccg atgtgctgcg caatgctgag gtggcgccgg ttctgactgc gcacccaact 420

gagactcgcc gccgcactgt ttttgatgcg caaaagtgga tcaccaccca catgcgtgaa 480

cgccacgctt tgcagtctgc ggagcctacc gctcgtacgc aaagcaagtt ggatgagatc 540

gagaagaaca tccgcggtcg catcaccatt ttgtggcaga ccgcgttgat tcgtgtggcc 600

cgcccacgta tcgaggacga gatcgaagta gggctgcgct actacaagct gagccttttg 660

gaagagattc cacgtatcaa ccgtgatgtg gctgttgagc ttcgtgagcg tttcggcgag 720

gatgttcctt tgaagcccgt ggtcaagcca ggttcctgga ttggtggaga ccacgacggt 780

aacccttatg tcaccgcgga aacagttgag tattccactc accgcgctgc ggaaaccgtg 840

ctcaagtact atgcacgcca gctgcattcc ctcgagcatg agctcagcct gtcggaccgc 900

atgaataagg tcaccccgca gctgcttgcg ctggcagatg ccgggcacaa cgacgtgcca 960

agccgcgtgg atgagcctta tcgacgcgcc gtccatggcg ttcgcggacg tatcctcgcg 1020

acgacggccg agctgatcgg cgaggacgcc gttgagggcg tgtggttcaa ggtctttact 1080

ccatacgcat ctccggaaga attcttaaac gatgcgttga ccattgatca ttctctgcgt 1140

gaatccaatg acgttctcat tgccgatgat cgtttgtctg tgctgatttc tgccatcgag 1200

agctttggat tcaaccttta cgcactggat ctgcgccaaa actccgaaag ctacgaggac 1260

gtcctcaccg agcttttcga acgcgcccaa gtcaccgcaa actaccgcga gctgtctgaa 1320

gcagagaagc ttgaggtgct gctgaaggaa ctgcgcagcc ctcgtccgct gatcccgcac 1380

ggttcagatg aatacagcga ggtcaccgac cgcgagctcg gcatcttccg caccgcgtcg 1440

gaggctgtta agaaattcgg gccacggatg gtgcctcact gcatcatctc catggcatca 1500

tcggtcaccg atgtgctcga gccgatggta ttgctcaagg aattcggcct cattgcagcc 1560

aacggcgaca acccacgcgg caccgtcgat gtcatcccac tgttcgaaac catcgaagat 1620

ctccaggccg gcgccggaat cctcgacgaa ctgtggaaaa ttgatcttta ccgcaactac 1680

ctcctgcagc gcgacaacgt ccaggaagtc atgctcggtt actccgattc caacaaggat 1740

ggcggatatt tctccgcaaa ctgggcgctt tacgacgcgg aactgcagct cgtcgaacta 1800

tgccgatcag ccggggtcaa gcttcgcctg ttccacggcc gtggtggcac cgtcggccgc 1860

ggtggcggac cttcctacga cgcgattctt gcccagccca ggggggctgt ccaaggttcc 1920

gtgcgcatca ccgagcaggg cgagatcatc tccgctaagt acggcaaccc cgaaaccgcg 1980

cgccgaaacc tcgaagctct ggtctcagca acgcttgagg catcgcttct cgacgtctcc 2040

gaactcaccg atcaccaacg cgcgtacgac atcatgagtg agatctctga gctcagcttg 2100

aagaagtacg cctccttggt gcacgaggat caaggcttca tcgattactt cacccagtcc 2160

acgccgctgc aggagattgg atccctcaac atcggatcca ggccttcctc acgcaagcag 2220

acctcctcgg tggaagattt gcgagcaatc ccgtgggtgc tcagttggtc ccagtctcgt 2280

gtcatgctgc cgggctggtt tggtgtcggc accgcacttg agcaatggat tggcgaaggg 2340

gagcaggcca cccagcgcat tgccgagcta caaacactca acgagtcctg gccatttttc 2400

acctcagtgt tggataacat ggctcaggtg atgtccaagg cagagctgcg tttggcaaag 2460

ctctacgcag acctgatccc agatagggaa gtagctgagc gcgtttatgc cgtcatccgc 2520

gaggaatact tcctgaccaa gaagatgttc tgcgtaatca ccggttctga tgatctgctt 2580

gatgacaacc cgcttctcgc acgatccgtc cagcgccgat acccctacct gcttccactc 2640

aacgtgatcc aggtagagat gatgcgacgc taccgaaaag gcgaccaaag cgagcaagta 2700

tcccgcaaca tccagctgac catgaacggt ctttccactg cactgcgcaa ctctggctag 2760

<210> 2

<211> 919

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Met Thr Asp Phe Leu Arg Asp Asp Ile Arg Phe Leu Gly Gln Ile Leu

1 5 10 15

Gly Glu Val Ile Ala Glu Gln Glu Gly Gln Glu Val Tyr Glu Leu Val

20 25 30

Glu Gln Ala Arg Leu Thr Ser Phe Asp Ile Ala Lys Gly Asn Ala Glu

35 40 45

Met Asp Ser Leu Val Gln Val Phe Asp Gly Ile Thr Pro Ala Lys Ala

50 55 60

Thr Pro Ile Ala Arg Ala Phe Ser His Phe Ala Leu Leu Ala Asn Leu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Leu Tyr Asp Glu Glu Leu Arg Glu Gln Ala Leu Asp Ala

85 90 95

Gly Asp Thr Pro Pro Asp Ser Thr Leu Asp Ala Thr Trp Leu Lys Leu

100 105 110

Asn Glu Gly Asn Val Gly Ala Glu Ala Val Ala Asp Val Leu Arg Asn

115 120 125

Ala Glu Val Ala Pro Val Leu Thr Ala His Pro Thr Glu Thr Arg Arg

130 135 140

Arg Thr Val Phe Asp Ala Gln Lys Trp Ile Thr Thr His Met Arg Glu

145 150 155 160

Arg His Ala Leu Gln Ser Ala Glu Pro Thr Ala Arg Thr Gln Ser Lys

165 170 175

Leu Asp Glu Ile Glu Lys Asn Ile Arg Gly Arg Ile Thr Ile Leu Trp

180 185 190

Gln Thr Ala Leu Ile Arg Val Ala Arg Pro Arg Ile Glu Asp Glu Ile

195 200 205

Glu Val Gly Leu Arg Tyr Tyr Lys Leu Ser Leu Leu Glu Glu Ile Pro

210 215 220

Arg Ile Asn Arg Asp Val Ala Val Glu Leu Arg Glu Arg Phe Gly Glu

225 230 235 240

Asp Val Pro Leu Lys Pro Val Val Lys Pro Gly Ser Trp Ile Gly Gly

245 250 255

Asp His Asp Gly Asn Pro Tyr Val Thr Ala Glu Thr Val Glu Tyr Ser

260 265 270

Thr His Arg Ala Ala Glu Thr Val Leu Lys Tyr Tyr Ala Arg Gln Leu

275 280 285

His Ser Leu Glu His Glu Leu Ser Leu Ser Asp Arg Met Asn Lys Val

290 295 300

Thr Pro Gln Leu Leu Ala Leu Ala Asp Ala Gly His Asn Asp Val Pro

305 310 315 320

Ser Arg Val Asp Glu Pro Tyr Arg Arg Ala Val His Gly Val Arg Gly

325 330 335

Arg Ile Leu Ala Thr Thr Ala Glu Leu Ile Gly Glu Asp Ala Val Glu

340 345 350

Gly Val Trp Phe Lys Val Phe Thr Pro Tyr Ala Ser Pro Glu Glu Phe

355 360 365

Leu Asn Asp Ala Leu Thr Ile Asp His Ser Leu Arg Glu Ser Asn Asp

370 375 380

Val Leu Ile Ala Asp Asp Arg Leu Ser Val Leu Ile Ser Ala Ile Glu

385 390 395 400

Ser Phe Gly Phe Asn Leu Tyr Ala Leu Asp Leu Arg Gln Asn Ser Glu

405 410 415

Ser Tyr Glu Asp Val Leu Thr Glu Leu Phe Glu Arg Ala Gln Val Thr

420 425 430

Ala Asn Tyr Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Lys Leu Glu Val Leu Leu

435 440 445

Lys Glu Leu Arg Ser Pro Arg Pro Leu Ile Pro His Gly Ser Asp Glu

450 455 460

Tyr Ser Glu Val Thr Asp Arg Glu Leu Gly Ile Phe Arg Thr Ala Ser

465 470 475 480

Glu Ala Val Lys Lys Phe Gly Pro Arg Met Val Pro His Cys Ile Ile

485 490 495

Ser Met Ala Ser Ser Val Thr Asp Val Leu Glu Pro Met Val Leu Leu

500 505 510

Lys Glu Phe Gly Leu Ile Ala Ala Asn Gly Asp Asn Pro Arg Gly Thr

515 520 525

Val Asp Val Ile Pro Leu Phe Glu Thr Ile Glu Asp Leu Gln Ala Gly

530 535 540

Ala Gly Ile Leu Asp Glu Leu Trp Lys Ile Asp Leu Tyr Arg Asn Tyr

545 550 555 560

Leu Leu Gln Arg Asp Asn Val Gln Glu Val Met Leu Gly Tyr Ser Asp

565 570 575

Ser Asn Lys Asp Gly Gly Tyr Phe Ser Ala Asn Trp Ala Leu Tyr Asp

580 585 590

Ala Glu Leu Gln Leu Val Glu Leu Cys Arg Ser Ala Gly Val Lys Leu

595 600 605

Arg Leu Phe His Gly Arg Gly Gly Thr Val Gly Arg Gly Gly Gly Pro

610 615 620

Ser Tyr Asp Ala Ile Leu Ala Gln Pro Arg Gly Ala Val Gln Gly Ser

625 630 635 640

Val Arg Ile Thr Glu Gln Gly Glu Ile Ile Ser Ala Lys Tyr Gly Asn

645 650 655

Pro Glu Thr Ala Arg Arg Asn Leu Glu Ala Leu Val Ser Ala Thr Leu

660 665 670

Glu Ala Ser Leu Leu Asp Val Ser Glu Leu Thr Asp His Gln Arg Ala

675 680 685

Tyr Asp Ile Met Ser Glu Ile Ser Glu Leu Ser Leu Lys Lys Tyr Ala

690 695 700

Ser Leu Val His Glu Asp Gln Gly Phe Ile Asp Tyr Phe Thr Gln Ser

705 710 715 720

Thr Pro Leu Gln Glu Ile Gly Ser Leu Asn Ile Gly Ser Arg Pro Ser

725 730 735

Ser Arg Lys Gln Thr Ser Ser Val Glu Asp Leu Arg Ala Ile Pro Trp

740 745 750

Val Leu Ser Trp Ser Gln Ser Arg Val Met Leu Pro Gly Trp Phe Gly

755 760 765

Val Gly Thr Ala Leu Glu Gln Trp Ile Gly Glu Gly Glu Gln Ala Thr

770 775 780

Gln Arg Ile Ala Glu Leu Gln Thr Leu Asn Glu Ser Trp Pro Phe Phe

785 790 795 800

Thr Ser Val Leu Asp Asn Met Ala Gln Val Met Ser Lys Ala Glu Leu

805 810 815

Arg Leu Ala Lys Leu Tyr Ala Asp Leu Ile Pro Asp Arg Glu Val Ala

820 825 830

Glu Arg Val Tyr Ala Val Ile Arg Glu Glu Tyr Phe Leu Thr Lys Lys

835 840 845

Met Phe Cys Val Ile Thr Gly Ser Asp Asp Leu Leu Asp Asp Asn Pro

850 855 860

Leu Leu Ala Arg Ser Val Gln Arg Arg Tyr Pro Tyr Leu Leu Pro Leu

865 870 875 880

Asn Val Ile Gln Val Glu Met Met Arg Arg Tyr Arg Lys Gly Asp Gln

885 890 895

Ser Glu Gln Val Ser Arg Asn Ile Gln Leu Thr Met Asn Gly Leu Ser

900 905 910

Thr Ala Leu Arg Asn Ser Gly

915

<210> 3

<211> 2760

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

atgactgatt ttttacgcga tgacatcagg ttcctcggtc aaatcctcgg tgaggtaatt 60

gcggaacaag aaggccagga ggtttatgaa ctggtcgaac aagcgcgcct gacttctttt 120

gatatcgcca agggcaacgc cgaaatggat agcctggttc aggttttcga cggcattact 180

ccagccaagg caacaccgat tgctcgcgca ttttcccact tcgctctgct ggctaacctg 240

gcggaagacc tctacgatga agagcttcgt gaacaggctc tcgatgcagg cgacacccct 300

ccggacagca ctcttgatgc cacctggctg aaactcaatg agggcaatgt tggcgcagaa 360

gctgtggccg atgtgctgcg caatgctgag gtggcgccgg ttctgactgc gcacccaact 420

gagactcgcc gccgcactgt ttttgatgcg caaaagtgga tcaccaccca catgcgtgaa 480

cgccacgctt tgcagtctgc ggagcctacc gctcgtacgc aaagcaagtt ggatgagatc 540

gagaagaaca tccgccgtcg catcaccatt ttgtggcaga ccgcgttgat tcgtgtggcc 600

cgcccacgta tcgaggacga gatcgaagta gggctgcgct actacaagct gagccttttg 660

gaagagattc cacgtatcaa ccgtgatgtg gctgttgagc ttcgtgagcg tttcggcgag 720

gatgttcctt tgaagcccgt ggtcaagcca ggttcctgga ttggtggaga ccacgacggt 780

aacccttatg tcaccgcgga aacagttgag tattccactc accgcgctgc ggaaaccgtg 840

ctcaagtact atgcacgcca gctgcattcc ctcgagcatg agctcagcct gtcggaccgc 900

atgaataagg tcaccccgca gctgcttgcg ctggcagatg ccgggcacaa cgacgtgcca 960

agccgcgtgg atgagcctta tcgacgcgcc gtccatggcg ttcgcggacg tatcctcgcg 1020

acgacggccg agctgatcgg cgaggacgcc gttgagggcg tgtggttcaa ggtctttact 1080

ccatacgcat ctccggaaga attcttaaac gatgcgttga ccattgatca ttctctgcgt 1140

gaatccaatg acgttctcat tgccgatgat cgtttgtctg tgctgatttc tgccatcgag 1200

agctttggat tcaaccttta cgcactggat ctgcgccaaa actccgaaag ctacgaggac 1260

gtcctcaccg agcttttcga acgcgcccaa gtcaccgcaa actaccgcga gctgtctgaa 1320

gcagagaagc ttgaggtgct gctgaaggaa ctgcgcagcc ctcgtccgct gatcccgcac 1380

ggttcagatg aatacagcga ggtcaccgac cgcgagctcg gcatcttccg caccgcgtcg 1440

gaggctgtta agaaattcgg gccacggatg gtgcctcact gcatcatctc catggcatca 1500

tcggtcaccg atgtgctcga gccgatggta ttgctcaagg aattcggcct cattgcagcc 1560

aacggcgaca acccacgcgg caccgtcgat gtcatcccac tgttcgaaac catcgaagat 1620

ctccaggccg gcgccggaat cctcgacgaa ctgtggaaaa ttgatcttta ccgcaactac 1680

ctcctgcagc gcgacaacgt ccaggaagtc atgctcggtt actccgattc caacaaggat 1740

ggcggatatt tctccgcaaa ctgggcgctt tacgacgcgg aactgcagct cgtcgaacta 1800

tgccgatcag ccggggtcaa gcttcgcctg ttccacggcc gtggtggcac cgtcggccgc 1860

ggtggcggac cttcctacga cgcgattctt gcccagccca ggggggctgt ccaaggttcc 1920

gtgcgcatca ccgagcaggg cgagatcatc tccgctaagt acggcaaccc cgaaaccgcg 1980

cgccgaaacc tcgaagctct ggtctcagca acgcttgagg catcgcttct cgacgtctcc 2040

gaactcaccg atcaccaacg cgcgtacgac atcatgagtg agatctctga gctcagcttg 2100

aagaagtacg cctccttggt gcacgaggat caaggcttca tcgattactt cacccagtcc 2160

acgccgctgc aggagattgg atccctcaac atcggatcca ggccttcctc acgcaagcag 2220

acctcctcgg tggaagattt gcgagcaatc ccgtgggtgc tcagttggtc ccagtctcgt 2280

gtcatgctgc cgggctggtt tggtgtcggc accgcacttg agcaatggat tggcgaaggg 2340

gagcaggcca cccagcgcat tgccgagcta caaacactca acgagtcctg gccatttttc 2400

acctcagtgt tggataacat ggctcaggtg atgtccaagg cagagctgcg tttggcaaag 2460

ctctacgcag acctgatccc agatagggaa gtagctgagc gcgtttatgc cgtcatccgc 2520

gaggaatact tcctgaccaa gaagatgttc tgcgtaatca ccggttctga tgatctgctt 2580

gatgacaacc cgcttctcgc acgatccgtc cagcgccgat acccctacct gcttccactc 2640

aacgtgatcc aggtagagat gatgcgacgc taccgaaaag gcgaccaaag cgagcaagta 2700

tcccgcaaca tccagctgac catgaacggt ctttccactg cactgcgcaa ctctggctag 2760

<210> 4

<211> 919

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 4

Met Thr Asp Phe Leu Arg Asp Asp Ile Arg Phe Leu Gly Gln Ile Leu

1 5 10 15

Gly Glu Val Ile Ala Glu Gln Glu Gly Gln Glu Val Tyr Glu Leu Val

20 25 30

Glu Gln Ala Arg Leu Thr Ser Phe Asp Ile Ala Lys Gly Asn Ala Glu

35 40 45

Met Asp Ser Leu Val Gln Val Phe Asp Gly Ile Thr Pro Ala Lys Ala

50 55 60

Thr Pro Ile Ala Arg Ala Phe Ser His Phe Ala Leu Leu Ala Asn Leu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Leu Tyr Asp Glu Glu Leu Arg Glu Gln Ala Leu Asp Ala

85 90 95

Gly Asp Thr Pro Pro Asp Ser Thr Leu Asp Ala Thr Trp Leu Lys Leu

100 105 110

Asn Glu Gly Asn Val Gly Ala Glu Ala Val Ala Asp Val Leu Arg Asn

115 120 125

Ala Glu Val Ala Pro Val Leu Thr Ala His Pro Thr Glu Thr Arg Arg

130 135 140

Arg Thr Val Phe Asp Ala Gln Lys Trp Ile Thr Thr His Met Arg Glu

145 150 155 160

Arg His Ala Leu Gln Ser Ala Glu Pro Thr Ala Arg Thr Gln Ser Lys

165 170 175

Leu Asp Glu Ile Glu Lys Asn Ile Arg Arg Arg Ile Thr Ile Leu Trp

180 185 190

Gln Thr Ala Leu Ile Arg Val Ala Arg Pro Arg Ile Glu Asp Glu Ile

195 200 205

Glu Val Gly Leu Arg Tyr Tyr Lys Leu Ser Leu Leu Glu Glu Ile Pro

210 215 220

Arg Ile Asn Arg Asp Val Ala Val Glu Leu Arg Glu Arg Phe Gly Glu

225 230 235 240

Asp Val Pro Leu Lys Pro Val Val Lys Pro Gly Ser Trp Ile Gly Gly

245 250 255

Asp His Asp Gly Asn Pro Tyr Val Thr Ala Glu Thr Val Glu Tyr Ser

260 265 270

Thr His Arg Ala Ala Glu Thr Val Leu Lys Tyr Tyr Ala Arg Gln Leu

275 280 285

His Ser Leu Glu His Glu Leu Ser Leu Ser Asp Arg Met Asn Lys Val

290 295 300

Thr Pro Gln Leu Leu Ala Leu Ala Asp Ala Gly His Asn Asp Val Pro

305 310 315 320

Ser Arg Val Asp Glu Pro Tyr Arg Arg Ala Val His Gly Val Arg Gly

325 330 335

Arg Ile Leu Ala Thr Thr Ala Glu Leu Ile Gly Glu Asp Ala Val Glu

340 345 350

Gly Val Trp Phe Lys Val Phe Thr Pro Tyr Ala Ser Pro Glu Glu Phe

355 360 365

Leu Asn Asp Ala Leu Thr Ile Asp His Ser Leu Arg Glu Ser Asn Asp

370 375 380

Val Leu Ile Ala Asp Asp Arg Leu Ser Val Leu Ile Ser Ala Ile Glu

385 390 395 400

Ser Phe Gly Phe Asn Leu Tyr Ala Leu Asp Leu Arg Gln Asn Ser Glu

405 410 415

Ser Tyr Glu Asp Val Leu Thr Glu Leu Phe Glu Arg Ala Gln Val Thr

420 425 430

Ala Asn Tyr Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Lys Leu Glu Val Leu Leu

435 440 445

Lys Glu Leu Arg Ser Pro Arg Pro Leu Ile Pro His Gly Ser Asp Glu

450 455 460

Tyr Ser Glu Val Thr Asp Arg Glu Leu Gly Ile Phe Arg Thr Ala Ser

465 470 475 480

Glu Ala Val Lys Lys Phe Gly Pro Arg Met Val Pro His Cys Ile Ile

485 490 495

Ser Met Ala Ser Ser Val Thr Asp Val Leu Glu Pro Met Val Leu Leu

500 505 510

Lys Glu Phe Gly Leu Ile Ala Ala Asn Gly Asp Asn Pro Arg Gly Thr

515 520 525

Val Asp Val Ile Pro Leu Phe Glu Thr Ile Glu Asp Leu Gln Ala Gly

530 535 540

Ala Gly Ile Leu Asp Glu Leu Trp Lys Ile Asp Leu Tyr Arg Asn Tyr

545 550 555 560

Leu Leu Gln Arg Asp Asn Val Gln Glu Val Met Leu Gly Tyr Ser Asp

565 570 575

Ser Asn Lys Asp Gly Gly Tyr Phe Ser Ala Asn Trp Ala Leu Tyr Asp

580 585 590

Ala Glu Leu Gln Leu Val Glu Leu Cys Arg Ser Ala Gly Val Lys Leu

595 600 605

Arg Leu Phe His Gly Arg Gly Gly Thr Val Gly Arg Gly Gly Gly Pro

610 615 620

Ser Tyr Asp Ala Ile Leu Ala Gln Pro Arg Gly Ala Val Gln Gly Ser

625 630 635 640

Val Arg Ile Thr Glu Gln Gly Glu Ile Ile Ser Ala Lys Tyr Gly Asn

645 650 655

Pro Glu Thr Ala Arg Arg Asn Leu Glu Ala Leu Val Ser Ala Thr Leu

660 665 670

Glu Ala Ser Leu Leu Asp Val Ser Glu Leu Thr Asp His Gln Arg Ala

675 680 685

Tyr Asp Ile Met Ser Glu Ile Ser Glu Leu Ser Leu Lys Lys Tyr Ala

690 695 700

Ser Leu Val His Glu Asp Gln Gly Phe Ile Asp Tyr Phe Thr Gln Ser

705 710 715 720

Thr Pro Leu Gln Glu Ile Gly Ser Leu Asn Ile Gly Ser Arg Pro Ser

725 730 735

Ser Arg Lys Gln Thr Ser Ser Val Glu Asp Leu Arg Ala Ile Pro Trp

740 745 750

Val Leu Ser Trp Ser Gln Ser Arg Val Met Leu Pro Gly Trp Phe Gly

755 760 765

Val Gly Thr Ala Leu Glu Gln Trp Ile Gly Glu Gly Glu Gln Ala Thr

770 775 780

Gln Arg Ile Ala Glu Leu Gln Thr Leu Asn Glu Ser Trp Pro Phe Phe

785 790 795 800

Thr Ser Val Leu Asp Asn Met Ala Gln Val Met Ser Lys Ala Glu Leu

805 810 815

Arg Leu Ala Lys Leu Tyr Ala Asp Leu Ile Pro Asp Arg Glu Val Ala

820 825 830

Glu Arg Val Tyr Ala Val Ile Arg Glu Glu Tyr Phe Leu Thr Lys Lys

835 840 845

Met Phe Cys Val Ile Thr Gly Ser Asp Asp Leu Leu Asp Asp Asn Pro

850 855 860

Leu Leu Ala Arg Ser Val Gln Arg Arg Tyr Pro Tyr Leu Leu Pro Leu

865 870 875 880

Asn Val Ile Gln Val Glu Met Met Arg Arg Tyr Arg Lys Gly Asp Gln

885 890 895

Ser Glu Gln Val Ser Arg Asn Ile Gln Leu Thr Met Asn Gly Leu Ser

900 905 910

Thr Ala Leu Arg Asn Ser Gly

915

<210> 5

<211> 1294

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctaggaga atgatcaatg gtcaacgcat 60

cgtttaagaa ttcttccgga gatgcgtatg gagtaaagac cttgaaccac acgccctcaa 120

cggcgtcctc gccgatcagc tcggccgtcg tcgcgaggat acgtccgcga acgccatgga 180

cggcgcgtcg ataaggctca tccacgcggc ttggcacgtc gttgtgcccg gcatctgcca 240

gcgcaagcag ctgcggggtg accttattca tgcggtccga caggctgagc tcatgctcga 300

gggaatgcag ctggcgtgca tagtacttga gcacggtttc cgcagcgcgg tgagtggaat 360

actcaactgt ttccgcggtg acataagggt taccgtcgtg gtctccacca atccaggaac 420

ctggcttgac cacgggcttc aaaggaacat cctcgccgaa acgctcacga agctcaacag 480

ccacatcacg gttgatacgt ggaatctctt ccaaaaggct cagcttgtag tagcgcagcc 540

ctacttcgat ctcgtcctcg atacgtgggc gggccacacg aatcaacgcg gtctgccaca 600

aaatggtgat gcgacggcgg atgttcttct cgatctcatc caacttgctt tgcgtacgag 660

cggtaggctc cgcagactgc aaagcgtggc gttcacgcat gtgggtggtg atccactttt 720

gcgcatcaaa aacagtgcgg cggcgagtct cagttgggtg cgcagtcaga accggcgcca 780

cctcagcatt gcgcagcaca tcggccacag cttctgcgcc aacattgccc tcattgagtt 840

tcagccaggt ggcatcaaga gtgctgtccg gaggggtgtc gcctgcatcg agagcctgtt 900

cacgaagctc ttcatcgtag aggtcttccg ccaggttagc cagcagagcg aagtgggaaa 960

atgcgcgagc aatcggtgtt gccttggctg gagtaatgcc gtcgaaaacc tgaaccaggc 1020

tatccatttc ggcgttgccc ttggcgatat caaaagaagt caggcgcgct tgttcgacca 1080

gttcataaac ctcctggcct tcttgttccg caattacctc accgaggatt tgaccgagga 1140

acctgatgtc atcgcgtaaa aaatcagtca taactacttt aaacactctt tcacattgag 1200

ggtgttggcg tgcatgagat aaaaaatcac ccagcaaaac aggtgtttag ctgggcgggt 1260

accgagctcg aattcgtaat catggtcata gctg 1294

<210> 6

<211> 795

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctaggtag tgccgtgcgt accccattag 60

aaagtgaaaa ttcactgatt ctagccagtc acgctgggaa tcattacatg ggccttcttc 120

gatcattcca tgatcgacaa gaaaagcctc acgttcatca ggttgtaaat aggggacagt 180

agacattaat tacacctaaa aagaaaaggg cccccatgag gcgcatcgtt gagaggcgtt 240

gggggtgctg ttggcttcta cgatatatct aattttgcct gatgtgtcag tagctcgaac 300

gtcactttca cttgtcgtct gaagtttcga tgtttctgca ccataaacgg tgtttatgaa 360

ttatcccccc ctctaccccc cgggggtgag gttttcgctg agaaggctgg cttcaaacgg 420

gggctggaca cgtacgcgga gatggcgacg cgttctgtca cgaatcgtgc gttgcgtgct 480

ggccattccg ccacccaagc cagatccagg tcatgagggc taccaggcca cacagaagca 540

gcgctaccta gaacgccaga tcagggcgtc gaaacggatg gaagctgcag ccatcgaccc 600

tagagacatt gacaccgcaa aacagcgcat acgggcatac caggcaaaac tacgcgacca 660

catcaaacag cacgacctgc caaggcgcag acaccgagaa cagattaaaa tgcgctaaag 720

aagttaacat catgctgcca ccgcccaagc gggaaacatt gcgattgggg ttgggctagc 780

cagagttgcg cagtg 795

<210> 7

<211> 2985

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

acattgcgat tggggttggg ctagccagag ttgcgcagtg cagtggaaag accgttcatg 60

gtcagctgga tgttgcggga tacttgctcg ctttggtcgc cttttcggta gcgtcgcatc 120

atctctacct ggatcacgtt gagtggaagc aggtaggggt atcggcgctg gacggatcgt 180

gcgagaagcg ggttgtcatc aagcagatca tcagaaccgg tgattacgca gaacatcttc 240

ttggtcagga agtattcctc gcggatgacg gcataaacgc gctcagctac ttccctatct 300

gggatcaggt ctgcgtagag ctttgccaaa cgcagctctg ccttggacat cacctgagcc 360

atgttatcca acactgaggt gaaaaatggc caggactcgt tgagtgtttg tagctcggca 420

atgcgctggg tggcctgctc cccttcgcca atccattgct caagtgcggt gccgacacca 480

aaccagcccg gcagcatgac acgagactgg gaccaactga gcacccacgg gattgctcgc 540

aaatcttcca ccgaggaggt ctgcttgcgt gaggaaggcc tggatccgat gttgagggat 600

ccaatctcct gcagcggcgt ggactgggtg aagtaatcga tgaagccttg atcctcgtgc 660

accaaggagg cgtacttctt caagctgagc tcagagatct cactcatgat gtcgtacgcg 720

cgttggtgat cggtgagttc ggagacgtcg agaagcgatg cctcaagcgt tgctgagacc 780

agagcttcga ggtttcggcg cgcggtttcg gggttgccgt acttagcgga gatgatctcg 840

ccctgctcgg tgatgcgcac ggaaccttgg acagcccccc tgggctgggc aagaatcgcg 900

tcgtaggaag gtccgccacc gcggccgacg gtgccaccac ggccgtggaa caggcgaagc 960

ttgaccccgg ctgatcggca tagttcgacg agctgcagtt ccgcgtcgta aagcgcccag 1020

tttgcggaga aatatccgcc atccttgttg gaatcggagt aaccgagcat gacttcctgg 1080

acgttgtcgc gctgcaggag gtagttgcgg taaagatcaa ttttccacag ttcgtcgagg 1140

attccggcgc cggcctggag atcttcgatg gtttcgaaca gtgggatgac atcgacggtg 1200

ccgcgtgggt tgtcgccgtt ggctgcaatg aggccgaatt ccttgagcaa taccatcggc 1260

tcgagcacat cggtgaccga tgatgccatg gagatgatgc agtgaggcac catccgtggc 1320

ccgaatttct taacagcctc cgacgcggtg cggaagatgc cgagctcgcg gtcggtgacc 1380

tcgctgtatt catctgaacc gtgcgggatc agcggacgag ggctgcgcag ttccttcagc 1440

agcacctcaa gcttctctgc ttcagacagc tcgcggtagt ttgcggtgac ttgggcgcgt 1500

tcgaaaagct cggtgaggac gtcctcgtag ctttcggagt tttggcgcag atccagtgcg 1560

taaaggttga atccaaagct ctcgatggca gaaatcagca cagacaaacg atcatcggca 1620

atgagaacgt cattggattc acgcagagaa tgatcaatgg tcaacgcatc gtttaagaat 1680

tcttccggag atgcgtatgg agtaaagacc ttgaaccaca cgccctcaac ggcgtcctcg 1740

ccgatcagct cggccgtcgt cgcgaggata cgtccgcgaa cgccatggac ggcgcgtcga 1800

taaggctcat ccacgcggct tggcacgtcg ttgtgcccgg catctgccag cgcaagcagc 1860

tgcggggtga ccttattcat gcggtccgac aggctgagct catgctcgag ggaatgcagc 1920

tggcgtgcat agtacttgag cacggtttcc gcagcgcggt gagtggaata ctcaactgtt 1980

tccgcggtga cataagggtt accgtcgtgg tctccaccaa tccaggaacc tggcttgacc 2040

acgggcttca aaggaacatc ctcgccgaaa cgctcacgaa gctcaacagc cacatcacgg 2100

ttgatacgtg gaatctcttc caaaaggctc agcttgtagt agcgcagccc tacttcgatc 2160

tcgtcctcga tacgtgggcg ggccacacga atcaacgcgg tctgccacaa aatggtgatg 2220

cgaccgcgga tgttcttctc gatctcatcc aacttgcttt gcgtacgagc ggtaggctcc 2280

gcagactgca aagcgtggcg ttcacgcatg tgggtggtga tccacttttg cgcatcaaaa 2340

acagtgcggc ggcgagtctc agttgggtgc gcagtcagaa ccggcgccac ctcagcattg 2400

cgcagcacat cggccacagc ttctgcgcca acattgccct cattgagttt cagccaggtg 2460

gcatcaagag tgctgtccgg aggggtgtcg cctgcatcga gagcctgttc acgaagctct 2520

tcatcgtaga ggtcttccgc caggttagcc agcagagcga agtgggaaaa tgcgcgagca 2580

atcggtgttg ccttggctgg agtaatgccg tcgaaaacct gaaccaggct atccatttcg 2640

gcgttgccct tggcgatatc aaaagaagtc aggcgcgctt gttcgaccag ttcataaacc 2700

tcctggcctt cttgttccgc aattacctca ccgaggattt gaccgaggaa cctgatgtca 2760

tcgcgtaaaa aatcagtcat aactacttta aacactcttt cacattgagg gtgttggcgt 2820

gcatgagata aaaaatcacc cagcaaaaca ggtgtttagc tgggcgattg atttcgatgg 2880

ctttcatggg ctcatcaaaa ccgcacttct acagtgcttg tgctttaagg ctgtgcttta 2940

aggctgtgct ttaaagctct gtacttcaaa aaccccaacc cgcac 2985

<210> 8

<211> 2985

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

acattgcgat tggggttggg ctagccagag ttgcgcagtg cagtggaaag accgttcatg 60

gtcagctgga tgttgcggga tacttgctcg ctttggtcgc cttttcggta gcgtcgcatc 120

atctctacct ggatcacgtt gagtggaagc aggtaggggt atcggcgctg gacggatcgt 180

gcgagaagcg ggttgtcatc aagcagatca tcagaaccgg tgattacgca gaacatcttc 240

ttggtcagga agtattcctc gcggatgacg gcataaacgc gctcagctac ttccctatct 300

gggatcaggt ctgcgtagag ctttgccaaa cgcagctctg ccttggacat cacctgagcc 360

atgttatcca acactgaggt gaaaaatggc caggactcgt tgagtgtttg tagctcggca 420

atgcgctggg tggcctgctc cccttcgcca atccattgct caagtgcggt gccgacacca 480

aaccagcccg gcagcatgac acgagactgg gaccaactga gcacccacgg gattgctcgc 540

aaatcttcca ccgaggaggt ctgcttgcgt gaggaaggcc tggatccgat gttgagggat 600

ccaatctcct gcagcggcgt ggactgggtg aagtaatcga tgaagccttg atcctcgtgc 660

accaaggagg cgtacttctt caagctgagc tcagagatct cactcatgat gtcgtacgcg 720

cgttggtgat cggtgagttc ggagacgtcg agaagcgatg cctcaagcgt tgctgagacc 780

agagcttcga ggtttcggcg cgcggtttcg gggttgccgt acttagcgga gatgatctcg 840

ccctgctcgg tgatgcgcac ggaaccttgg acagcccccc tgggctgggc aagaatcgcg 900

tcgtaggaag gtccgccacc gcggccgacg gtgccaccac ggccgtggaa caggcgaagc 960

ttgaccccgg ctgatcggca tagttcgacg agctgcagtt ccgcgtcgta aagcgcccag 1020

tttgcggaga aatatccgcc atccttgttg gaatcggagt aaccgagcat gacttcctgg 1080

acgttgtcgc gctgcaggag gtagttgcgg taaagatcaa ttttccacag ttcgtcgagg 1140

attccggcgc cggcctggag atcttcgatg gtttcgaaca gtgggatgac atcgacggtg 1200

ccgcgtgggt tgtcgccgtt ggctgcaatg aggccgaatt ccttgagcaa taccatcggc 1260

tcgagcacat cggtgaccga tgatgccatg gagatgatgc agtgaggcac catccgtggc 1320

ccgaatttct taacagcctc cgacgcggtg cggaagatgc cgagctcgcg gtcggtgacc 1380

tcgctgtatt catctgaacc gtgcgggatc agcggacgag ggctgcgcag ttccttcagc 1440

agcacctcaa gcttctctgc ttcagacagc tcgcggtagt ttgcggtgac ttgggcgcgt 1500

tcgaaaagct cggtgaggac gtcctcgtag ctttcggagt tttggcgcag atccagtgcg 1560

taaaggttga atccaaagct ctcgatggca gaaatcagca cagacaaacg atcatcggca 1620

atgagaacgt cattggattc acgcagagaa tgatcaatgg tcaacgcatc gtttaagaat 1680

tcttccggag atgcgtatgg agtaaagacc ttgaaccaca cgccctcaac ggcgtcctcg 1740

ccgatcagct cggccgtcgt cgcgaggata cgtccgcgaa cgccatggac ggcgcgtcga 1800

taaggctcat ccacgcggct tggcacgtcg ttgtgcccgg catctgccag cgcaagcagc 1860

tgcggggtga ccttattcat gcggtccgac aggctgagct catgctcgag ggaatgcagc 1920

tggcgtgcat agtacttgag cacggtttcc gcagcgcggt gagtggaata ctcaactgtt 1980

tccgcggtga cataagggtt accgtcgtgg tctccaccaa tccaggaacc tggcttgacc 2040

acgggcttca aaggaacatc ctcgccgaaa cgctcacgaa gctcaacagc cacatcacgg 2100

ttgatacgtg gaatctcttc caaaaggctc agcttgtagt agcgcagccc tacttcgatc 2160

tcgtcctcga tacgtgggcg ggccacacga atcaacgcgg tctgccacaa aatggtgatg 2220

cgacggcgga tgttcttctc gatctcatcc aacttgcttt gcgtacgagc ggtaggctcc 2280

gcagactgca aagcgtggcg ttcacgcatg tgggtggtga tccacttttg cgcatcaaaa 2340

acagtgcggc ggcgagtctc agttgggtgc gcagtcagaa ccggcgccac ctcagcattg 2400

cgcagcacat cggccacagc ttctgcgcca acattgccct cattgagttt cagccaggtg 2460

gcatcaagag tgctgtccgg aggggtgtcg cctgcatcga gagcctgttc acgaagctct 2520

tcatcgtaga ggtcttccgc caggttagcc agcagagcga agtgggaaaa tgcgcgagca 2580

atcggtgttg ccttggctgg agtaatgccg tcgaaaacct gaaccaggct atccatttcg 2640

gcgttgccct tggcgatatc aaaagaagtc aggcgcgctt gttcgaccag ttcataaacc 2700

tcctggcctt cttgttccgc aattacctca ccgaggattt gaccgaggaa cctgatgtca 2760

tcgcgtaaaa aatcagtcat aactacttta aacactcttt cacattgagg gtgttggcgt 2820

gcatgagata aaaaatcacc cagcaaaaca ggtgtttagc tgggcgattg atttcgatgg 2880

ctttcatggg ctcatcaaaa ccgcacttct acagtgcttg tgctttaagg ctgtgcttta 2940

aggctgtgct ttaaagctct gtacttcaaa aaccccaacc cgcac 2985

<210> 9

<211> 769

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

gtgctttaaa gctctgtact tcaaaaaccc caacccgcac atttttagat ttctattttg 60

tgtacatagg gttcggaaca aagcttaaac catccccaat tgaaatgtcg ttacacaccc 120

acatgtttga agtggagcaa accgaaaacc agttttcccc aacggcagcc gccccccacg 180

ttgaaccttc gaaatagtag gcaacaccat caagcggatc ttcatcaagc gaaatagtga 240

ttgactcttc accgttccgc ttacaaactg cgttagtgtc gctattttcc acccacttgt 300

cacactcgta cccgttttca tttagccatt tttcggcatg tcctattttc tcgaaccggg 360

caggagcgtc agggcttccg cagcccgcta gtagtagtcc ggctgcaatg atgcttaatg 420

tttttttcat gaattaaaca tagtactttg ctggtaaaaa tattggagaa ccccactggc 480

ctacatggtc agtgggggca tttttgcgtt tcacccctca aaaatcatca ccacacttgc 540

gggatttccc cctgatttcc cccactccca caccattccc agtggacagt gtggacgtat 600

tggacacatt aaacacattg cgaccaggta aaacgtcatg accaggtatc gtcaatgttc 660

ttgatgaatt tccgcaccgc aggattatca ttcgaggtgg aataaatagc ctgcagctcc 720

gctaaaccaa cgggtaccga gctcgaattc gtaatcatgg tcatagctg 769

<210> 10

<211> 1722

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagggct taccaacgca aaagctgcga 60

gaatccaggc tagatctgag gggtccatgt taaaggcctt tcagctaagt gatgctgtcg 120

agcggagtat tttctattcc gctatagata aacctagtcc agtttctacc tatcattcta 180

tagatttctg tttttataac gaaggtcacg tttttagccc gcacttacac cacgtctccc 240

ctgctgaaaa atcccccatg gcagcgtttt aacctgcggt tttatagact ccacgttccg 300

tcgggaaaca gttccccttt aaagatgtcc ttagggaaaa ttggaatgta tgtgaattag 360

gcatcaagat tttccaattt tgaccaccac tttgccgaaa tcttggtgtc gaaagtacac 420

accgagcaac agtggggaga cagcaggtcg acaaaaccca aaaaaagcgg ctcccctatg 480

aaaagggaac cgctcttttt aagctcgtgt cttatgaata agcctggatg aggttgagtg 540

cgacaatgca cacaatccag ataacggcaa ccaaaatggt gacgcgatcc aggttctttt 600

caacaacagt ggagcccgaa agattggact gcacaccgcc accgaagagg ctggagagtc 660

cgccgccttt gcccttgtgc agcaagacga aaaccgtcat gagcaggctg gcgacgacga 720

ggatgatttg aagcgtcaat gccatgtgga aaatgttcct ttgccgtttg agaacccagg 780

tgaaccttat tcccacctga tttcgaataa ctttagacag tatacacgag tactacctac 840

ccagcaggaa actactttaa acactctttc acattgaggg tgttggcgtg catgagataa 900

aaaatcaccc agcaaaacag gtgtttagct gggcgattga tttcgatggc tttcatgggc 960

tcatcaaaac cgcacttcta cagtgcttgt gctttaaggc tgtgctttaa ggctgtgctt 1020

taaagctctg tactttaagc aacgctcgca gcgttggcag ccagcttggc gaatgcttca 1080

ccgtcgaggg aagcgccacc gacaagtccg ccgtcgacgt caggctgacc gacgatctca 1140

gcgacggttt ctgccttaac agaaccaccg tagagaatac gcaggccctc agcgacctcg 1200

tcgcctgcaa gctccacgat cagaccgcgg atagccttgc acacttcctg agcgtcagct 1260

gcggaagcaa ccttaccggt gccgatagcc cacactggct catacgcgat aacggtgttg 1320

gccagttcag cagcgtccag gccagcaagg gacttgcggg tctgctcgac gacatactca 1380

acgtgggtgc cagcttcacg gatttccagt ggctcaccaa cgcagacgat cgggctgatg 1440

ccgttggaca gagctgcctt tgccttcgca gcaaccaact catcagactc gttgtggtac 1500

tcgcggcgct cggagtgtcc aacgacaacc caagagcagt tcaactttgc cagcatgctt 1560

gcagaaactt caccggtgta cgcaccggac tcgtgcgggg agacgtcctg agcaccgaaa 1620

gtgacctcaa gcttgtcgcc ctcaacgaga gtctggacgg agcggatgtc agtgaaagga 1680

acgggggtac cgagctcgaa ttcgtaatca tggtcatagc tg 1722

Claims

1.一种ppc突变体，是将ppc蛋白质第186位氨基酸残基由甘氨酸突变为其他氨基酸残基得到的蛋白质；

所述ppc蛋白质为如下A1)-A3)中的任一种：

A1)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2.根据权利要求1所述的ppc突变体，其特征在于：所述ppc突变体是将ppc蛋白质第186位氨基酸残基由甘氨酸突变为精氨酸得到的蛋白质。

3.与权利要求1所述ppc突变体相关的生物材料，所述生物材料为如下B1)至B4)中的任一种：

B1)编码权利要求1或2所述ppc突变体的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

4.根据权利要求3所述的生物材料，其特征在于：所述核酸分子为如下C1)或C2)中的任一种：

C1)核苷酸序列为SEQ ID No.3的DNA分子；

5.ppc蛋白质或与ppc蛋白质相关的生物材料或权利要求1所述的ppc突变体或权利要求2所述的生物材料在如下X1)至X4)中任一种中的应用：

X1)调控细菌缬氨酸产量；

X2)构建产缬氨酸工程菌；

X3)制备缬氨酸；

所述ppc蛋白质为权利要求1中所述ppc蛋白质；

与ppc蛋白质相关的生物材料为如下D1)至D4)中的任一种：

D1)编码所述ppc蛋白质的核酸分子；

D2)含有D1)所述核酸分子的表达盒；

6.提高ppc蛋白质或ppc突变体含量和/或活性的物质或提高ppc基因或ppc突变体基因表达量的物质在如下Y1)至Y4)中任一种中的应用：

Y1)提高细菌缬氨酸产量；

Y2)构建产缬氨酸工程菌；

Y3)制备缬氨酸；

所述ppc蛋白质为权利要求1中所述ppc蛋白质；

所述ppc突变体为权利要求1所述ppc突变体；

所述ppc基因为编码权利要求1中所述ppc蛋白质的基因；

所述ppc突变体基因为编码权利要求1所述ppc突变体的基因。

7.一种提高细菌缬氨酸产量的方法，为如下M1)或M2)：

所述M2)包括如下步骤：提高细菌中ppc蛋白质或ppc突变体含量和/或活性，或提高细菌中ppc基因或ppc突变体基因表达量，实现细菌缬氨酸产量的提高；

所述ppc蛋白质为权利要求1中所述ppc蛋白质；

所述ppc突变体为权利要求1所述ppc突变体；

所述ppc基因为编码权利要求1中所述ppc蛋白质的基因；

所述ppc突变体基因为编码权利要求1所述ppc突变体的基因。

8.一种产缬氨酸工程菌的构建方法，为如下N1)或N2)：

所述ppc蛋白质为权利要求1中所述ppc蛋白质；

所述ppc突变体为权利要求1所述ppc突变体；

所述ppc基因为编码权利要求1中所述ppc蛋白质的基因；

所述ppc突变体基因为编码权利要求1所述ppc突变体的基因。

9.按照权利要求8所述方法构建得到的产缬氨酸工程菌在制备缬氨酸中的应用。

10.一种制备缬氨酸的方法，包括如下步骤：发酵培养按照权利要求8所述方法构建得到的产缬氨酸工程菌，得到所述缬氨酸。