CN113677804A

CN113677804A - 使用高特异性d-乳酸氧化酶处理有机废物

Info

Publication number: CN113677804A
Application number: CN202080027715.XA
Authority: CN
Inventors: T·沙皮拉; R·蒂德哈尔; O·阿维丹; T·格林纳
Original assignee: Three W Ltd
Current assignee: Three W Ltd
Priority date: 2019-04-10
Filing date: 2020-04-07
Publication date: 2021-11-19
Also published as: CA3134806A1; EP3953488A4; WO2020208635A1; US20220213516A1; KR20220002889A; EP3953488A1; IL286440A

Abstract

本发明提供了使用D‑乳酸氧化酶处理有机废物、特别是混合食品废物的***和方法。所述D‑乳酸氧化酶消除所述有机废物中存在的D‑乳酸。所述处理过的有机废物可以在工业发酵过程例如光学纯L‑乳酸的生产中用作底物。还提供了用于从有机废物生产L‑乳酸的***和方法，其中使用D‑乳酸氧化酶消除在所述有机废物中内源性存在的D‑乳酸。

Description

使用高特异性D-乳酸氧化酶处理有机废物

技术领域

本发明涉及利用D-乳酸氧化酶消除有机废物中存在的D-乳酸的处理有机废物的***和方法。所述处理过的废物可作为底物用于工业发酵过程例如光学纯L-乳酸的生产。

背景技术

乳酸发酵

近年来，由于乳酸在生物塑料的制造中用作构件的能力，乳酸发酵，即通过微生物发酵从碳水化合物源生产乳酸，获得了持续不断的关注。乳酸可以被聚合，以形成生物可降解且可回收利用的聚酯聚乳酸(PLA)，其被认为是从石油制造的塑料的潜在替代品。PLA被用于制造各种不同产品，包括食品包装物、一次性用品、纺织和卫生产品行业中的纤维等。

出于各种不同考量，通过发酵生物过程生产乳酸优于化学合成方法，所述考量包括环境问题、成本和通过化学合成产生大多数工业应用所需的对映异构纯乳酸的困难度。常规发酵过程通常基于产生乳酸作为碳水化合物发酵的主要代谢终产物的产乳酸微生物的厌氧发酵。为了生产PLA，将在所述发酵期间产生的乳酸从发酵液分离并通过各种不同过程纯化，然后对纯化的乳酸进行聚合。

乳酸具有手性碳原子，因此以两种对映异构体形式D-和L-乳酸存在。为了产生适合于工业应用的PLA，聚合过程应该只使用一种对映异构体。杂质或D-和L-乳酸的外消旋混合物的存在产生具有不理想的特征例如低结晶度和低熔点的聚合物。因此，通常使用只产生L-对映异构体或只产生D-对映异构体的乳酸细菌。

在目前可用的商业化过程中，用于乳酸发酵的碳水化合物源通常是含有淀粉的可再生来源，例如玉米和木薯根。也已提出了其他来源，例如富含纤维素的甘蔗渣。通常，乳酸细菌可以利用还原糖如葡萄糖和果糖，但不具有降解多糖如淀粉和纤维素的能力。因此，为了利用此类多糖，所述过程需要添加糖分解酶类，并通常与化学处理相组合，以降解多糖并释放出还原糖。

已提出的用于乳酸发酵的其他碳水化合物源是复杂有机废物，例如混合食品废物。将此类有机废物作为底物用于发酵与利用作为人类食物的高价值源材料的乳酸生产过程相比高度有利。混合食品废物通常包含不同比例的还原糖(葡萄糖、果糖、乳糖等)、淀粉和木质纤维材料。然而，食品废物还含有内源的D,L-乳酸(例如来自于乳制品)，其需要被移除以便利用所述废物作为生产光学纯乳酸(L-或D-乳酸)的底物。

Sakai等(2004)Journal of Industrial Ecology,7(3-4):63-74报告了一种用于城市食品废物的回收利用***，其将发酵和化学过程组合以生产聚L-乳酸(PLLA)。所述Sakai等描述的过程包括在乳酸发酵步骤之前通过消耗乳酸作为碳源的丙酸菌(Propionibacterium)从所述食品废物中除去内源性D,L-乳酸。

被转让给本发明的申请人的WO 2017/122197公开了双重作用乳酸(LA)利用细菌，其被遗传修饰以分泌多糖降解酶例如纤维素酶、半纤维素酶和淀粉酶，可用于处理有机废物，既消除所述废物中存在的乳酸又降解复杂多糖。

D-乳酸氧化酶

D-乳酸氧化酶是一种使用O₂作为电子受体催化D-乳酸根氧化成丙酮酸根和H₂O₂的酶。所述酶使用黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)作为其催化活性的辅因子。

Sheng等(2015)Appl Environ Microbiol.,81(12):4098-110研究了氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)在D-乳酸根上生长的酶学基础。Sheng等人鉴定了GOX2071这种D-乳酸氧化酶。根据Sheng等人的论文，GOX2071可能在生物传感器和生物催化应用中有用。

Sheng等(2016)ChemCatChem,8(16)使用来自于氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)的D-乳酸氧化酶GOX2071进行了2-羟基羧酸向(S)-2-羟基羧酸的酶法拆分。

Li等(2017)ACS Sustainable Chem.Eng.,5(4):3456–3464使用来自于氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)的D-乳酸氧化酶(D-LOX)、来自于片球菌(Pediococcussp.)的L-乳酸氧化酶(L-LOX)、来自于运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的丙酮酸脱羧酶和来自于牛肝的过氧化氢酶合成了一种包括不同酶级联的体外酶***，用于从玉米浸液中分离的外消旋乳酸根生产有价值的平台化学品。

CN 104745544公开了来自于氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)的D-乳酸氧化酶GOX2071及其在D-乳酸的检测中的应用。

CN 106636022、CN 106701701、CN 106701702、CN 106701705和CN 106754793公开了来自于各种不同微生物的D-乳酸氧化酶，其可用于制备光学纯(S)-α-羟基酸酯。

从未公开或建议过使用D-乳酸氧化酶从有机废物例如食品废物中消除D-乳酸。此外，从未公开或建议过将D-乳酸氧化酶合并在有机废物的工业发酵过程中，以消除所述废物中存在的D-乳酸。

对用于处理有机废物的成本效益更高且高效的***和方法存在着需求，以便可以将所述有机废物作为底物用于工业发酵过程例如光学纯乳酸的生产中。

发明内容

本发明提供了使用D-乳酸氧化酶和任选的一种或多种多糖降解酶在商业规模上处理有机废物的***和方法。本发明还提供了用于从有机废物生产L-乳酸的***和方法，其中在所述废物中内源存在的D-乳酸使用D-乳酸氧化酶来消除。

根据本发明所述的有机废物包括各种不同类型和来源的食品废物以及农业废物、工业有机废物等。根据本发明所述的有机废物包含源自于例如天然发酵过程的内源性D,L-乳酸。所述有机废物还包含复杂多糖，包括淀粉、纤维素、半纤维素及其组合。

本发明第一次公开了将D-乳酸氧化酶用于从有机废物例如食品废物中消除D-乳酸。

本发明部分是基于下述发现，即D-乳酸氧化酶可以有效地作用于原始底物例如有机废物，特别是各种不同类型和来源的混合食品废物，所述原始底物是粘稠、高度复杂的物质，其确切组成是未知的且随着批次而变，含有可能的抑制剂和可能对酶产生负面影响的其他因子。迄今为止描述的使用D-乳酸氧化酶的实验仅测试了它在缓冲溶液中的活性。

本发明还基于下述发现，即与缓冲溶液相比，所述酶令人吃惊地在有机废物中显示出改善的活性，其特征在于所述酶具有活性并有效消除D-乳酸根的条件范围更宽。更具体来说，发现所述酶在以前据报道会失去其活性和稳定性的酸性pH值下以及更宽的温度范围下起作用。这些发现对于利用有机废物作为底物的工业发酵过程特别有利，因为有机废物通常是酸性的，并且通常也需要通过典型地在酸性pH下工作的多糖降解酶例如淀粉酶和纤维素酶进行糖化。因此，所述酶可用于不同pH的各种有机废物的工业处理和发酵。此外，所述酶可以潜在地在从有机废物生产乳酸的过程中的不同时间点使用，并与其他步骤例如所述废物的糖化相组合。

本发明还基于下述发现，即所述D-乳酸氧化酶有效地消除D-乳酸根，即使在与D-乳酸根相比存在显著过量的L-乳酸根的情况下。这允许在发酵之前或之后使用所述酶，从而在其工业利用中提供了更大的灵活性。

此外，已发现当将所述D-乳酸氧化酶与多糖降解酶例如葡糖淀粉酶组合时，它的活性甚至被进一步提高，允许使用与未与多糖降解酶组合时所需的量相比更少量的所述D-乳酸氧化酶。此外，当将所述D-乳酸氧化酶与多糖降解酶例如葡糖淀粉酶组合时，所述过程需要底物(有机废物)的更少稀释。不希望受到任何特定理论或作用机制限制，设想了在多糖降解酶存在下所述D-乳酸氧化酶的提高的活性源自于在将所述废物中存在的多糖(例如淀粉)降解成可溶性糖类后所述废物的黏度降低。

有利的是，所述D-乳酸氧化酶对D-乳酸高度特异，而L-乳酸基本上不被所述酶消耗。因此，所述有机废物中存在的内源性L-乳酸在根据本发明所述的过程中得以维持，并在下游过程中与通过发酵产生的L-乳酸一起被纯化，从而提高了L-乳酸发酵的总得率。

此外，所述酶以高度有效的方式催化D-乳酸根向丙酮酸根(和H₂O₂)的转变，能够近乎完全或甚至完全地消除D-乳酸，这对于生产光学纯L-乳酸来说特别重要。

作为另一个优点，使用D-乳酸氧化酶消除所述有机废物中的D-乳酸避免了如以前所述对乳酸利用细菌进行发酵的需要，因此显著降低了所涉及的成本，包括运营支出(OPEX)和资本支出(CAPEX)。

根据一个方面，本发明提供了一种用于处理有机废物的方法，所述方法包括：

(i)提供有机废物；和

(ii)用D-乳酸氧化酶消化所述有机废物，以消除所述有机废物中存在的D-乳酸。

在某些实施方式中，所述有机废物选自食品废物、城市废物、农业废物、植物材料及其组合。每种可能性代表本发明的独立实施方式。

在某些特定实施方式中，所述有机废物是食品废物。根据本发明所述的食品废物涵盖植物起源的食品废物。根据本发明所述的食品废物涵盖家庭食品废物、商业食品废物和工业食品废物。根据本发明所述的植物材料涵盖农业废物和人造产品例如废纸。

在某些实施方式中，所述D-乳酸氧化酶来自于氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacteroxydans)。

当在本文中使用时，所述D-乳酸氧化酶与有机废物的接触在所述D-乳酸氧化酶在其中有活性并高效消除D-乳酸(即将D-乳酸转变成丙酮酸和H₂O₂)的条件下进行足以从所述废物中消除D-乳酸的时间。当在本文中使用时，“酶在其中有活性的条件”是指诸如温度和pH的条件，酶在所述条件下以足以用于给定工业过程的水平有效执行其催化活性。这些条件在本文中也被称为“适合条件”，并且所述术语涵盖了最适条件。正如上文提到的，本发明的发明人令人吃惊地发现，所述D-乳酸氧化酶在有机废物中的活性的特征在于与以前为这种酶所报道的条件相比更宽的温度和pH范围。在某些实施方式中，所述温度范围是25-60℃。在某些实施方式中，所述pH范围是5.5-8。当在本文中使用时，“消除”在指称从有机废物中消除D-乳酸时，是指残留量的降低，以便对生产L-乳酸和随后聚合成适合于工业应用的聚乳酸的下游过程没有干扰。“残留量”是指在发酵结束时的总乳酸根(L+D)中少于1％的乳酸，甚至更优选地少于0.5％的D-乳酸(w/w)。在某些特定实施方式中，D-乳酸的消除是降低到在发酵结束时的总乳酸根中少于0.5％的D-乳酸(w/w)。

在某些实施方式中，所述D-乳酸氧化酶与有机废物的接触在25-60℃范围内的温度下进行。在其他实施方式中，所述接触在37-55℃范围内的温度下进行。在其他实施方式中，所述接触在45-55℃范围内的温度下进行。在某些特定实施方式中，所述接触在55℃下进行。

在某些实施方式中，所述D-乳酸氧化酶与有机废物的接触在5.5-7范围内的pH下进行。在其他实施方式中，所述D-乳酸氧化酶与有机废物的接触在6-7范围内的pH下进行。在某些特定实施方式中，所述接触在pH＝6下进行。

在某些实施方式中，所述D-乳酸氧化酶与有机废物的接触进行6至48小时范围内的时间长度。在其他实施方式中，所述D-乳酸氧化酶与有机废物的接触进行6至12小时范围内的时间长度。在其他实施方式中，所述D-乳酸氧化酶与有机废物的接触进行24-48小时范围内的时间长度。在其他实施方式中，所述D-乳酸氧化酶与有机废物的接触进行24-36小时范围内的时间长度。

在某些实施方式中，所述方法还包括将所述有机废物与一种或多种糖类降解酶接触。在某些实施方式中，所述一种或多种糖类降解酶是多糖降解酶，其与所述有机废物接触以降解所述有机废物中的多糖，释放出还原糖(将所述有机废物糖化)。

在某些实施方式中，所述一种或多种多糖降解酶选自淀粉酶、纤维素酶和半纤维素酶。在某些特定实施方式中，所述一种或多种多糖降解酶包含葡糖淀粉酶。在某些实施方式中，所述方法包括将所述有机废物与D-乳酸氧化酶和葡糖淀粉酶接触。

在某些实施方式中，所述与一种或多种糖类降解酶例如多糖降解酶的接触和所述与D-乳酸氧化酶的接触相伴地(同时)进行。根据这些实施方式，所述D-乳酸的消除和有机废物的糖化相伴地(同时)进行。同时的D-乳酸消除和糖化对于在相同的pH和温度范围内有活性的D-乳酸氧化酶和一种或多种多糖降解酶来说是可能的。因此，在某些实施方式中，所述D-乳酸氧化酶和一种或多种多糖降解酶在相同的pH和温度范围内有活性。在某些实施方式中，所述方法包括将所述有机废物与所述D-乳酸氧化酶和一种或多种多糖降解酶在所述D-乳酸氧化酶和一种或多种多糖降解酶在其中有活性的温度和pH下接触。接触进行足以从所述废物中消除D-乳酸并获得所需水平的可溶性还原糖的时间。

在其他实施方式中，所述与一种或多种糖类降解酶例如多糖降解酶的接触和所述与D-乳酸氧化酶的接触以任何顺序依次进行。在某些特定实施方式中，所述与一种或多种糖类降解酶例如多糖降解酶的接触在所述与D-乳酸氧化酶的接触之前进行。

在其他实施方式中，所述D-乳酸氧化酶和一种或多种多糖降解酶在不同的pH和/或温度范围下有活性。

在某些实施方式中，所述方法包括：(1)将所述有机废物与所述D-乳酸氧化酶第一温度下接触足以从所述废物中消除D-乳酸的时间，所述第一温度适合于所述D-乳酸氧化酶的活性；和(2)将所述温度调整(例如提高)到第二温度，所述第二温度适合于所述一种或多种糖类降解酶例如多糖降解酶的活性，并将所述有机废物与所述一种或多种多糖降解酶接触足以获得所需水平的可溶性还原糖的时间。

在某些实施方式中，所述方法包括：(1)将所述有机废物与所述D-乳酸氧化酶在第一pH下接触足以从所述废物中消除D-乳酸的时间，所述第一pH适合于所述D-乳酸氧化酶的活性；和(2)将所述pH调整(例如降低)到第二pH，所述第二pH适合于所述糖类降解酶例如多糖降解酶的活性，并将所述有机废物与所述一种或多种多糖降解酶接触足以获得所需水平的可溶性还原糖的时间。

在某些实施方式中，所述方法包括：(1)将所述有机废物与所述一种或多种糖类降解酶例如多糖降解酶在第一温度下接触足以获得所需水平的可溶性还原糖的时间，所述第一温度适合于所述一种或多种糖类降解酶的活性；和(2)将所述温度调整(例如提高)到第二温度，所述第二温度适合于所述D-乳酸氧化酶的活性，并将所述有机废物与所述D-乳酸氧化酶接触足以从所述废物中消除D-乳酸的时间。

在某些实施方式中，所述方法包括：(1)将所述有机废物与所述一种或多种糖类降解酶例如多糖降解酶在第一pH下接触足以获得所需水平的可溶性还原糖的时间，所述第一pH适合于所述一种或多种糖类降解酶的活性；和(2)将所述pH调整(例如提高)到第二pH，所述第二pH适合于所述D-乳酸氧化酶的活性，并将所述有机废物与所述D-乳酸氧化酶接触足以从所述废物中消除D-乳酸的时间。

根据另一方面，本发明提供了一种用于处理有机废物的***，所述细***包含：

(a)有机废物源；和

(b)D-乳酸氧化酶，

其中将所述D-乳酸氧化酶与所述有机废物混合并消除所述有机废物中存在的D-乳酸。

在某些实施方式中，将所述D-乳酸氧化酶与所述有机废物在25-60℃范围内的温度下混合。在其他实施方式中，将所述D-乳酸氧化酶与所述有机废物在37-55℃范围内的温度下混合。在其他实施方式中，将所述D-乳酸氧化酶与所述有机废物在45-55℃范围内的温度下混合。在某些特定实施方式中，所述与D-乳酸氧化酶的混合在55℃下进行。

在某些实施方式中，将所述D-乳酸氧化酶与所述有机废物在5.5-7范围内的pH下混合。在其他实施方式中，将所述D-乳酸氧化酶与所述有机废物在6-7范围内的pH下混合。在某些特定实施方式中，所述与D-乳酸氧化酶的混合在pH＝6下进行。

在某些实施方式中，将所述D-乳酸氧化酶与所述有机废物混合6至48小时范围内的时间长度。在其他实施方式中，将所述D-乳酸氧化酶与所述有机废物混合6至12小时范围内的时间长度。在其他实施方式中，将所述D-乳酸氧化酶与所述有机废物混合24-48小时范围内的时间长度。在其他实施方式中，将所述D-乳酸氧化酶与所述有机废物混合24-36小时范围内的时间长度。

在某些实施方式中，所述***还包含一种或多种糖类降解酶例如多糖降解酶，其与所述有机废物混合并降解所述有机废物中的多糖，以释放出还原糖(将所述有机废物糖化)。

在某些特定实施方式中，所述***包含D-乳酸氧化酶和葡糖淀粉酶。

在某些实施方式中，将所述D-乳酸氧化酶和一种或多种糖类降解酶相伴地(同时)与所述有机废物混合。在其他实施方式中，将所述D-乳酸氧化酶和一种或多种糖类降解酶以任何顺序依次与所述有机废物混合。

有利的是，正如在下文中示例的，即使在不向培养基添加任何辅因子的情况下也观察到D-乳酸从所述有机废物中的有效消除。因此，在某些实施方式中，所述有机废物用D-乳酸氧化酶的处理在不向培养基添加任何辅因子的情况下进行。在某些特定实施方式中，所述有机废物用D-乳酸氧化酶的处理在不添加FAD的情况下进行。

根据另一方面，本发明提供了一种从有机废物生产L-乳酸的方法，所述方法包括：(i)使用D-乳酸氧化酶消除源自于所述有机废物的D-乳酸；和(ii)用只产生L-乳酸根的产乳酸微生物发酵所述有机废物。

在某些实施方式中，使用D-乳酸氧化酶消除源自于所述有机废物的D-乳酸在用只产生L-乳酸根的产乳酸微生物发酵所述有机废物之前进行。

在其他实施方式中，使用D-乳酸氧化酶消除源自于所述有机废物的D-乳酸在用只产生L-乳酸根的产乳酸微生物发酵所述有机废物之后进行。

在其他实施方式中，使用D-乳酸氧化酶消除源自于所述有机废物的D-乳酸与用只产生L-乳酸根的产乳酸微生物发酵所述有机废物同时进行。

根据本发明使用的有机废物通常是已经历预处理的有机废物，所述预处理包括减小粒子尺寸和增加表面积，任选地还包括失活所述废物内的内源性细菌。根据某些实施方式，在本发明中使用的有机废物是混合食品废物，其可能含有有机和无机组分例如纸或塑料包装材料。根据这些实施方式，所述预处理可以包括分离所述包装材料，例如通过锤磨机、液压机、旋转螺旋钻或螺旋压机。在某些实施方式中，所述有机废物在与D-乳酸氧化酶接触之前经历澄清以除去不溶性颗粒。

所述预处理在用所述D-乳酸氧化酶(和任选的一种或多种糖类降解酶)处理所述废物之前进行。在某些实施方式中，所述有机废物在用所述D-乳酸氧化酶(和任选的一种或多种糖类降解酶)处理之前经历撕碎、切碎和灭菌。灭菌可以通过本领域中已知的方法进行，包括例如高压蒸汽、UV辐射或超声处理。

在某些实施方式中，所述有机废物在用所述D-乳酸氧化酶(和任选的一种或多种糖类降解酶)处理之前还经历水稀释。因此，在某些实施方式中，所述预处理包括用水稀释所述有机废物。在某些实施方式中，所述有机废物在与D-乳酸氧化酶接触之前用水稀释。所述水稀释通常是1:1稀释。它通常是将35％-40％的溶解固体稀释到20％至25％的固体。

根据另一方面，本发明提供了一种从有机废物生产L-乳酸的方法，所述方法包括：

(i)提供有机废物；

(ii)通过将所述有机废物与D-乳酸氧化酶和一种或多种糖类降解酶接触来处理所述有机废物，以消除所述废物中存在的D-乳酸并降解所述废物中的糖类，释放出可溶性还原糖；

(iii)将所述处理过的有机废物用只产生L-乳酸的产乳酸微生物发胶，以获得L-乳酸；和

(iv)从发酵液回收所述L-乳酸。

从发酵液回收乳酸通常包括从所述发酵液分离乳酸和纯化所述乳酸。在某些实施方式中，所述L-乳酸作为乳酸盐从发酵液回收。当在本文中使用时，“回收乳酸”涵盖了将它作为乳酸和作为乳酸盐回收两者。

在某些实施方式中，所述将有机废物与D-乳酸氧化酶和一种或多种糖类降解酶接触的步骤和所述用只产生L-乳酸的产乳酸微生物发酵处理过的有机废物的步骤同时进行。

在其他实施方式中，所述将有机废物与D-乳酸氧化酶和一种或多种糖类降解酶接触的步骤在所述用只产生L-乳酸的产乳酸微生物发酵处理过的有机废物的步骤之前进行。

根据另一方面，本发明提供了一种用于从有机废物生产L-乳酸的***，所述***包含：

(a)有机废物源；

(b)D-乳酸氧化酶；和

(c)只产生L-乳酸根的产乳酸微生物,

其中所述D-乳酸氧化酶消除源自于所述有机废物的D-乳酸，并且所述产乳酸微生物发酵所述有机废物以产生L-乳酸根。

在某些实施方式中，所述***还包含一种或多种糖类降解酶。

在某些实施方式中，在通过所述D-乳酸氧化酶消除D-乳酸根之后并任选地在降解所述有机废物中的糖类之后，将所述产乳酸微生物与所述有机废物混合。

在其他实施方式中，将所述产乳酸微生物和所述D-乳酸氧化酶和任选的一种或多种糖类降解酶同时与所述有机废物混合，以获得同时的发酵、D-乳酸根消除和任选的糖化。

在其他实施方式中，所述D-乳酸氧化酶在所述产乳酸微生物的发酵完成后添加。

在某些实施方式中，根据本发明所述的用于从有机废物生产L-乳酸的***包含：

(a)有机废物源；

(b)处理罐，其包含用于消除所述有机废物中存在的D-乳酸的D-乳酸氧化酶和任选的用于降解所述有机废物中的糖类的一种或多种糖类降解酶；和

(c)发酵罐，其包含只产生L-乳酸的产乳酸微生物。

其中将所述有机废物在所述处理罐中用所述D-乳酸氧化酶并任选地用所述一种或多种糖类降解酶处理，并将所述处理过的废物转移到所述发酵罐，用于生产L-乳酸。

本文中描述的每个处理和发酵罐能够控制和修改所述罐内部的温度和pH，并且也能够混合/搅拌。

本发明的***通常还包括另外的操作装置，例如：预处理装置，固体/液体分离装置，种子发酵罐和清洗装置，以及连接各种不同操作装置的装置，例如用于将有机废物进料到处理罐和随后进料到发酵罐的装置。所述***还可以包括用于从发酵液回收L-乳酸的操作装置。

根据另一方面，本发明提供了一种用于表达D-乳酸氧化酶的核酸构建物，其包含可操作连接到包含选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的启动子的至少一个调控序列的SEQ ID NO：9中阐述的编码D-乳酸氧化酶的核酸序列。

在某些实施方式中，所述核酸构建物包含可操作连接到SEQ ID NO：3中示出的启动子序列的SEQ ID NO：9中示出的编码D-乳酸氧化酶的核酸序列。

在其他实施方式中，所述核酸构建物包含可操作连接到SEQ ID NO：4中示出的启动子序列的SEQ ID NO：9中示出的编码D-乳酸氧化酶的核酸序列。

在其他实施方式中，所述核酸构建物包含可操作连接到SEQ ID NO：5中示出的启动子序列的SEQ ID NO：9中示出的编码D-乳酸氧化酶的核酸序列。

在某些实施方式中，所述核酸构建物选自SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ IDNO：8。每种可能性代表本发明的独立实施方式。

从下面的描述、实施例和附图，本发明的其他目的、特点和优点将变得清楚。

附图说明

图1.用来自于氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)的重组的D-乳酸氧化酶降解溶解在缓冲液中的纯D-乳酸根(A)和存在于有机废物中的D-乳酸根(B)。

图2.用不同浓度的D-乳酸氧化酶降解有机废物中存在的D-乳酸根。

图3.用水1:1或4:1稀释的有机废物中存在的D-乳酸根的降解。

图4.D-乳酸氧化酶与葡糖淀粉酶的组合。

图5.在不同pH(A)和不同温度(B)下D-乳酸氧化酶对有机废物的活性。

图6.D-乳酸氧化酶对有机废物离心后获得的上清液的活性。(A)pH＝6或pH＝7，30℃；(B)pH＝6或pH＝7，55℃。

图7.乳酸发酵之前和之后有机废物中存在的D-乳酸根的降解。(A)有机废物与不同浓度的D-乳酸氧化酶温育24小时；(B)在将有机废物与0.92mg/ml的D-乳酸氧化酶温育后D-乳酸根随时间的变化；(C)D-乳酸氧化酶与有机废物离心后获得的上清液温育26小时。

图8.D-乳酸氧化酶的表达。

图9.与实施例1中所述生产的纯化的D-乳酸氧化酶相比，用在组成型启动子控制之下表达D-乳酸氧化酶的大肠杆菌的细菌裂解物降解D-乳酸根。

具体实施方式

本发明提供了利用D-乳酸氧化酶消除有机废物中的D-乳酸来处理有机废物的***和方法。然后可以将所述处理过的废物作为底物用于工业发酵过程，例如光学纯L-乳酸的生产。

在某些实施方式中，提供了一种处理有机废物以消除所述有机废物中存在的D-乳酸的方法，所述方法包括：(i)提供有机废物；和将所述有机废物与D-乳酸氧化酶接触，其中所述接触消除了所述有机废物中存在的D-乳酸。

在某些实施方式中，用于本发明的***和方法的有机废物包括食品废物、城市废物、农业废物、植物材料及其组合。根据本发明所述的食品废物涵盖植物来源的食品废物。根据本发明所述的食品废物涵盖家庭食品废物、商业食品废物和工业食品废物。所述有机食品废物可能源自于蔬菜和水果残余物、植物、熟食、蛋白质残余物、屠宰废物及其组合。工业有机食品废物可能包括工厂废物如副产品、工厂废品、商场退货或不可食用的食物部分的下脚料(例如果皮)。商业有机食品废物可能包括来自商场、餐厅、超市等的废物。

根据本发明所述的植物材料涵盖农业废物和人造产品例如废纸。

根据本发明所述的有机废物包含源自于例如天然发酵过程的内源性D,L-乳酸，例如在乳制品中。所述有机废物通常还包含复杂多糖，包括淀粉、纤维素、半纤维素及其组合。

使用混合食品废物作为底物特别适合于大规模工业发酵，因为它是非均质的，因此它将含有大部分发酵所需的矿物质和维生素。此外，本文公开的***和方法优于目前使用的方法，因为它们表现出低化石燃料使用量，不使用宝贵的耕地来种植用于原料的作物，水使用量低，GHG排放也低，此外，得到的产品是可生物降解的。

当在本文中使用时，术语“乳酸”是指具有化学式CH₃CH(OH)CO₂H的羟基羧酸。术语乳酸或乳酸根(失去一个质子的乳酸)可以是指乳酸的立体异构体L-乳酸、D-乳酸或其组合。

根据本发明处理的有机废物包含内源性D,L-乳酸。为了将乳酸聚合成适合于工业应用的聚乳酸，所述乳酸应该是至少约95％光学纯，优选地至少约99％光学纯。因此，为了利用有机废物作为生产光学纯L-乳酸的底物，需要在乳酸发酵之前至少选择性地除去不想要的D-乳酸。从有机废物中至少除去不想要的对映异构体应该以对原料的总糖含量影响极小的方式进行。

本发明致力于通过使用D-乳酸氧化酶处理有机废物来解决这一需求。

“D-乳酸氧化酶”是使用O₂作为电子受体催化D-乳酸根氧化成丙酮酸根和H₂O₂的酶。所述酶使用黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)作为其催化活性的辅因子。根据本发明所述的D-乳酸氧化酶通常是可溶性D-乳酸氧化酶(而不是膜结合的)。有利的是，所述酶在有机废物中直接起作用以消除D-乳酸。在某些实施方式中，所述D-乳酸氧化酶来自于葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter sp.)。在某些实施方式中，所述D-乳酸氧化酶来自于氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)(参见例如GenBank登记号：AAW61807)。在某些实施方式中，所述D-乳酸氧化酶包含与SEQ ID NO：1中示出的序列具有至少75％序列同一性，例如与SEQ IDNO：1中示出的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。每种可能性代表本发明的独立实施方式。在某些实施方式中，所述D-乳酸氧化酶包含在SEQ ID NO：1中示出的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述D-乳酸氧化酶由与SEQ ID NO：1中示出的序列具有至少75％序列同一性，例如与SEQ ID NO：1中示出的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％序列同一性的氨基酸序列构成。每种可能性代表本发明的独立实施方式。在某些实施方式中，所述D-乳酸氧化酶由在SEQ IDNO：1中示出的氨基酸序列构成。

SEQ ID NO：1：

MPEPVMTASSASAPDRLQAVLKALQPVMGERISTAPSVREEHSHGEAMNASNLPEAVVFAESTQDVATVLRHCHEWRVPVVAFGAGTSVEGHVVPPEQAISLDLSRMTGIVDLNAEDLDCRVQAGITRQTLNVEIRDTGLFFPVDPGGEATIGGMCATRASGTAAVRYGTMKENVLGLTVVLATGEIIRTGGRVRKSSTGYDLTSLFVGSEGTLGIITEVQLRLHGRPDSVSAAICQFESLHDAIQTAMEIIQCGIPITRVELMDSVQMAASIQYSGLNEYQPLTTLFFEFTGSPAAVREQVETTEAIASGNNGLGFAWAESPEDRTRLWKARHDAYWAAKAIVPDARVISTDCIVPISRLGELIEGVHRDIEASGLRAPLLGHVGDGNFHTLIITDDTPEGHQQALDLDRKIVARALSLNGSCSGEHGVGMGKLEFLETEHGPGSLSVMRALKNTMDPHHILNPGKLLPPGAVYTG

来自于氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)的编码D-乳酸氧化酶的核酸序列在SEQ ID NO：2中示出。

SEQ ID NO：2：

ATGCCGGAACCAGTCATGACCGCCTCTTCCGCCTCCGCTCCGGACCGCCTTCAGGCCGTTCTCAAAGCCCTCCAGCCCGTCATGGGTGAGCGGATCAGCACGGCACCCTCCGTTCGCGAAGAGCACAGCCACGGCGAGGCCATGAATGCCTCCAACCTGCCCGAGGCGGTGGTGTTTGCTGAAAGTACTCAGGATGTCGCAACCGTCCTGCGGCACTGCCATGAATGGCGCGTTCCGGTCGTGGCGTTCGGCGCTGGCACGTCCGTCGAAGGTCATGTCGTGCCGCCCGAACAGGCCATCAGCCTCGATCTGTCACGCATGACGGGGATCGTGGACCTGAACGCCGAGGATCTGGATTGCCGGGTCCAAGCCGGCATCACGCGCCAGACGCTGAATGTTGAAATCCGCGATACGGGCCTGTTCTTTCCGGTCGATCCGGGTGGGGAAGCTACGATCGGCGGTATGTGCGCCACCCGCGCCTCGGGCACGGCCGCCGTACGCTACGGCACGATGAAAGAAAATGTGCTGGGCCTGACGGTTGTTCTCGCGACCGGCGAAATCATCCGCACAGGTGGCCGCGTCCGCAAATCGTCCACCGGCTATGACCTGACATCGCTGTTCGTCGGCTCGGAAGGTACGCTCGGGATCATCACCGAAGTCCAGCTCCGTCTGCATGGGCGTCCAGACAGTGTTTCGGCCGCGATCTGCCAATTCGAAAGCCTGCATGACGCCATCCAGACTGCCATGGAAATCATCCAGTGCGGCATCCCCATCACCCGCGTGGAACTGATGGACAGCGTGCAGATGGCAGCTTCCATCCAGTATTCCGGCCTGAACGAATATCAGCCGCTGACCACGCTGTTTTTCGAGTTCACAGGCTCGCCCGCAGCGGTACGCGAGCAGGTCGAGACGACCGAAGCCATTGCGTCCGGCAATAACGGGCTTGGCTTTGCCTGGGCCGAAAGTCCCGAAGACCGCACCCGCCTCTGGAAAGCGCGGCATGACGCCTACTGGGCGGCCAAGGCCATCGTTCCGGATGCGCGCGTCATTTCCACAGACTGCATCGTCCCGATTTCCCGTCTGGGCGAACTGATCGAGGGCGTGCATCGCGATATCGAGGCCTCCGGCCTGCGCGCGCCCCTTCTGGGCCATGTGGGGGACGGCAATTTCCATACGCTCATCATCACGGACGACACCCCCGAAGGGCATCAGCAGGCCCTCGATCTGGACCGGAAGATCGTAGCCCGCGCCCTTTCGCTGAACGGGTCGTGCAGCGGGGAACATGGTGTCGGCATGGGCAAGCTGGAGTTTCTGGAAACCGAGCATGGGCCTGGAAGCCTCAGCGTGATGCGCGCCCTGAAGAACACGATGGATCCGCACCATATCCTCAATCCCGGCAAGCTCCTTCCGCCCGGTGCTGTTTACACGGGCTGA

根据本发明所述的D-乳酸氧化酶可以通过在宿主细胞例如在细菌或真菌中重组生产来获得。

D-乳酸氧化酶的示例性生产***：

1)大肠杆菌生产：所述酶作为非分泌蛋白表达。将宿主细胞破碎，并通过例如过滤除去细胞碎片(所述生物质可以在所述过程中作为用于乳酸生产的营养物回收利用)。将所述酶纯化，或将粗酶上清液原样使用。

2)真菌或酵母生产(例如在黑曲霉(Aspergillus niger)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中生产，每种可能性代表独立的实施方式)：所述酶作为分泌蛋白表达。通过例如过滤除去宿主细胞(并任选地如上所述回收利用)。将所述酶纯化，或将粗酶上清液原样使用。

当在本文中使用时，“D-乳酸氧化酶”涵盖了纯化的酶和重组表达D-乳酸氧化酶的微生物的粗酶上清液，例如表达D-乳酸氧化酶的大肠杆菌、黑曲霉、嗜热毁丝霉或巴斯德毕赤酵母的粗酶上清液。将D-乳酸氧化酶作为非分泌蛋白表达的细菌的粗酶上清液在本文中也被称为所述细菌的“裂解液”或“细菌裂解液”。在某些实施方式中，本发明提供了用于表达D-乳酸氧化酶、特别是用于在大肠杆菌中表达D-乳酸氧化酶的核酸构建物，其包含SEQID NO：9中示出的编码D-乳酸氧化酶的核酸序列，所述序列可操作连接到包含选自SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的启动子的至少一个调控序列。

当在本文中使用时，术语“核酸构建物”是指人工组装或分离的核酸分子，其包括编码感兴趣的蛋白质的核酸序列，并被组装成使得所述感兴趣的蛋白质在靶宿主细胞中表达。所述核酸构建物包含可操作连接到所述编码感兴趣的蛋白质的核酸序列的适合的调控序列。所述核酸构建物还可以包含编码纯化标签/肽/蛋白的核酸序列。

术语“核酸序列”和“多核苷酸”在本文中用于指称脱氧核糖核苷酸(DNA)、核糖核苷酸(RNA)及其修饰形式的聚合物，其采取独立片段的形式或作为更大构建物的组分。核酸序列可以是编码序列，即编码细胞中的终产物例如蛋白质的序列。核酸序列也可以是调控序列，例如启动子。

术语“调控序列”是指控制编码序列的表达(转录)的DNA序列，例如启动子。

术语“启动子”是指在体内或体外控制或指导另一个DNA序列的转录的调控DNA序列。通常，启动子位于被转录序列的5’区中(也就是说处于其之前，位于其上游)。启动子可以整体源自于天然来源，或由源自于自然界中发现的不同启动子的不同元件组成，或甚至包含合成的核苷酸区段。启动子可以是组成型(即启动子激活不受诱导剂调控，因此转录速率恒定)或诱导型的(即启动子激活受诱导剂调控)。在大多数情况下，调控序列的确切边界尚未被完全定义，并且在某些情况下不能被完全定义，因此某些变化形式的DNA序列可能具有相同的启动子活性。

术语“可操作连接”意味着所选核酸序列紧邻调控元件(例如启动子)，以允许所述调控元件调控所选核酸序列的表达。

在某些实施方式中，在乳酸发酵之前将所述有机废物与D-乳酸氧化酶在罐(例如反应器)中，在对酶活性最适(或者不然适合)的条件下混合。所述与酶混合的有机废物通常是预处理过的有机废物，其经历过包括减小粒子尺寸和任选的灭菌、稀释和分离包装材料的预处理。在某些实施方式中，在发酵之前将所述D-乳酸氧化酶与所述有机废物温育足够的时间，以从所述废物中消除D-乳酸。在其他实施方式中，在乳酸发酵之前将所述D-乳酸氧化酶与所述有机废物温育足够的时间，以获得所述废物中存在的D-乳酸根的部分降解，并且在发酵期间所述D-乳酸根的降解继续进行，直至D-乳酸根被消除。在某些实施方式中，在乳酸发酵之前将所述有机废物进一步与一种或多种糖类降解酶混合，这与所述D-乳酸氧化酶同时或以任何顺序依次进行。每种可能性代表本发明的独立实施方式。

在其他实施方式中，将所述有机废物(通常为如上所述预处理过的有机废物)与所述D-乳酸氧化酶和L-产乳酸微生物在罐(例如反应器)中混合，以同时获得D-乳酸消除和L-乳酸发酵。

在其他实施方式中，将所述有机废物(通常为如上所述预处理过的有机废物)与所述D-乳酸氧化酶、一种或多种糖类降解酶和L-产乳酸微生物在罐(例如反应器)中混合，以同时获得D-乳酸消除、糖化和L-乳酸发酵。

在其他实施方式中，D-乳酸的消除在发酵完成后进行。在某些实施方式中，在发酵后将发酵液与所述D-乳酸氧化酶接触，以从所述发酵液中消除D-乳酸。在某些实施方式中，在发酵后，将所述发酵液的pH调整到对所述D-乳酸氧化酶最适(或者不然适合)的pH，并将所述D-乳酸氧化酶与发酵液接触，以从所述发酵液中消除D-乳酸根。在某些实施方式中，由所述D-乳酸氧化酶催化的降解反应在5-15小时后，例如在5-10小时(包括所述范围内的任何值)后停止。所述降解反应可以例如通过将pH或温度改变到所述酶在其中无活性的值，例如pH4.5和/或至少65℃的温度来停止。

当在本文中使用时，“糖类降解酶”是指催化包括双糖(二糖)、寡糖、多糖和糖缀合物在内的糖类的分解的水解酶(或其具有酶活性的部分)。糖类降解酶可以选自糖苷水解酶、多糖裂解酶和碳水化合物酯酶。每种可能性代表本发明的独立实施方式。本发明使用的糖类降解酶选自对有机废物例如食品废物中存在的糖类(例如多糖)有活性的糖类降解酶。在某些实施方式中，所述糖类降解酶可以是修饰的酶(即已被修饰并且与它们相应的野生型酶不同的酶)。在某些实施方式中，所述修饰可能包括导致所述酶的性能改善，例如活性和/或稳定性改善的一种或多种突变。在某些实施方式中，所述糖类降解酶是野生型(WT)酶。

糖类降解酶大类根据标准分类***(Cantarel等，2009Nucleic Acids Res 37:D233-238)分为酶类并进一步分为酶家族。此类酶的告知性和更新的分类可以在碳水化合物活性酶(Carbohydrate-Active Enzymes)(CAZy)服务器(www.cazy.org)上获得。

在某些实施方式中，在本发明中使用的糖类降解酶是多糖降解酶。在某些实施方式中，所述一种或多种多糖降解酶是糖苷水解酶。在某些实施方式中，所述一种或多种多糖降解酶是选自淀粉酶、纤维素酶和半纤维素酶的糖苷水解酶。每种可能性代表本发明的独立实施方式。在某些特定实施方式中，所述一种或多种多糖降解酶是葡糖淀粉酶。

在某些实施方式中，在本发明中使用的糖类降解酶是二糖降解酶。在某些实施方式中，用于本发明的二糖降解酶选自乳糖酶和转化酶。每种可能性代表本发明的独立实施方式。

在某些实施方式中，使用单一糖类降解酶。在其他实施方式中，使用多种糖类降解酶。

根据本发明使用的糖类降解酶可以是细菌酶。在某些实施方式中，所述一种或多种糖类降解酶来自于嗜热细菌。当在本文中使用时，术语“嗜热细菌”是指在高于约45℃、优选地高于50℃的温度下茁壮成长的细菌。通常，根据本发明所述的嗜热细菌具有约45℃至约75℃、优选地约50-70℃之间的最适生长温度。在某些实施方式中，所述嗜热细菌选自梭菌(Clostridium sp.)、类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)、Thermobifida fusca、芽孢杆菌(Bacillus sp.)、地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)、色盐杆菌(Chromohalobacter sp.)和Rhodothermus marinus。每种可能性代表本发明的独立实施方式。糖类降解酶的嗜热细菌来源的非限制性实例包括：纤维素酶和半纤维素酶-梭菌(Clostridium sp.)(例如热纤维梭菌(Clostridium thermocellum))、类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)、Thermobifidafusca；淀粉酶-芽孢杆菌(Bacillus sp.)(例如嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus))、地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)(例如高温烷烃地芽孢杆菌(Geobacillus thermoleovorans))、色盐杆菌(Chromohalobacter sp.)、海洋红嗜热盐菌(Rhodothermus marinus)。每种可能性代表独立实施方式。

在其他实施方式中，所述一种或多种糖类降解酶来自于嗜中温细菌。当在本文中使用时，术语“嗜中温细菌”是指在约20℃至45℃之间的温度下茁壮成长的细菌。在某些实施方式中，所述嗜中温细菌选自克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)、Cohnella sp.、链霉菌(Streptomyces sp.)、解纤维素醋弧菌(Acetivibrio cellulolyticus)、白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)和发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)。每种可能性代表本发明的独立实施方式。糖类降解酶的嗜中温细菌来源的非限制性实例包括：纤维素酶和半纤维素酶-克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)(例如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia))、Cohnella sp.、链霉菌(Streptomyces sp.)、解纤维素醋弧菌(Acetivibrio cellulolyticus)、白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)；淀粉酶-芽孢杆菌(Bacillus sp.)(例如解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis))、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)。每种可能性是独立的实施方式。本领域技术人员理解，某些嗜中温细菌例如几种芽孢杆菌(Bacillus sp.))产生热稳定的酶。

在其他实施方式中，所述一种或多种糖类降解酶是真菌酶。在某些实施方式中，所述真菌选自里氏木霉(Trichoderma reesei)、特异腐质霉(Humicola insolens)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、瘿青霉(Penicilliumfellutanum)和疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)。每种可能性代表本发明的独立实施方式。糖类降解酶的真菌来源的非限制性实例包括：纤维素酶和半纤维素酶-里氏木霉(Trichoderma reesei)、特异腐质霉(Humicola insolens)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)；淀粉酶-米曲霉(Aspergillus oryzae)、瘿青霉(Penicillium fellutanum)、疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)。每种可能性是独立的实施方式。

所述一种或多种糖类降解酶通常是外源添加的，并与D-乳酸氧化酶同时或顺序地与所述有机废物混合。或者，一种或多种糖类降解酶可以从用于乳酸发酵步骤的产乳酸微生物表达和分泌。

根据本发明使用的糖类降解酶是可商购的，和/或可以重组生产。

所述D-乳酸氧化酶和任选的一种或多种糖类降解酶可以通过在宿主细胞中，例如在用编码所需蛋白的多核苷酸分子转化的微生物细胞中表达所述多核苷酸分子来产生。编码所述蛋白的DNA序列可以从产生它的微生物中分离。例如，编码所述蛋白的DNA序列可以通过聚合酶链反应(PCR)从所述微生物的基因组DNA扩增。所述基因组DNA可以在扩增之前从所述微生物细胞提取。在扩增后，可以将所述扩增产物分离并克隆到克隆载体中，或直接克隆到适合于在所选宿主细胞中表达它的表达载体中。在编码所述蛋白的多核苷酸的分离和克隆后，可以通过在一个或多个碱基对处修饰来引入突变。

获得编码所需蛋白的多核苷酸的一种可替选方法是使用诸如亚磷酰胺DNA合成的方法化学合成多核苷酸。合成基因的使用允许生产包含为了在所需物种(例如大肠杆菌)中表达而优化的核苷酸序列的人工基因。然后可以对由此产生的多核苷酸进行进一步操作，包括纯化、退火、连接、扩增、限制性核酸内切酶消化和在适合载体中的克隆中的一者或多者。所述多核苷酸可以被首先连接到克隆载体中，或直接连接到适合于在所选宿主细胞中表达它的表达载体中。

正如本领域技术人员显而易见的，在所述多核苷酸中用于编码特定氨基酸的一个或多个密码子，可以根据所选的用于表达所述多核苷酸的宿主细胞的已知且有利的密码子用法进行修改。

根据本发明所述的多核苷酸可以包含非编码序列，包括例如非编码5'和3'序列，例如转录的非翻译序列、终止信号、核糖体结合位点、稳定mRNA的序列、内含子和多腺苷化信号。所述多核苷酸还可以包含编码融合到所述感兴趣的蛋白质、便于纯化的标签或标志物例如His标签的序列。在所述标签部分与所述感兴趣的蛋白质之间包含允许移除所述标签的蛋白水解切割位点例如凝血酶切割位点，也可能是方便的。

根据本发明所述的多核苷酸可以被并入到各种不同的表达载体中，所述表达载体可以被转化到各种不同的宿主细胞中。根据本发明所述的宿主细胞可以是原核(例如细菌大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli))或真核(例如真菌巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris))的。多核苷酸在所述宿主细胞中的引入可以通过公知的方法例如化学转化(例如氯化钙处理)、电穿孔、接合、转导、磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、转染、微注射、阳离子型脂质介导的转染、刮痕荷载、弹道引入和感染来进行。

用所需载体转化的宿主细胞的选择可以使用包括在对未转化的细胞有毒的选择培养基中生长的标准选择方案来实现。例如，可以将大肠杆菌在含有抗生素选择试剂的培养基中生长；被还提供抗生素抗性基因的表达载体转化的细胞将在所述选择培养基中生长。

在转化适合的宿主细胞并在适合于蛋白质表达的条件下繁殖后，可以在被转化细胞的细胞提取物中鉴定所述感兴趣的蛋白质。表达所述感兴趣的蛋白质的被转化细胞可以如下所述鉴定：使用SDS-PAGE分析由所述宿主表达的蛋白质，并将所述凝胶与从用相同但不含所述感兴趣的蛋白质的编码核酸序列的载体转化的宿主获得的SDS-PAGE凝胶进行比较。所述感兴趣的蛋白质也可以通过其他已知方法鉴定，例如使用适合抗体的免疫印迹分析、全细胞提取物的斑点印迹分析、有限蛋白水解、质谱术及其组合。

所述感兴趣的蛋白质可以通过常规方法分离和纯化，包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、盐分级分离、离子交换层析、疏水相互作用层析、凝胶渗透层析、亲和层析及其组合。可以分析所述分离的感兴趣的蛋白质的各种不同性质，例如比活性。

用于执行上述程序以及其他有用方法的条件，由本领域普通技术人员容易地确定。

根据本发明所述的蛋白质可以在没有起始密码子(甲硫氨酸或缬氨酸)和/或没有利于重组蛋白的生产和纯化的前导(信号)肽的情况下产生和/或使用。当在本文中提及时，术语“核酸”、“核酸序列”、“多核苷酸”、“核苷酸”和“核苷酸序列”可互换使用。所述术语是指脱氧核糖核苷酸(DNA)、核糖核苷酸(RNA)及其修饰形式的聚合物，其采取独立片段的形式或作为更大构建物的组分。所述术语还包括由天然存在的碱基、糖和核苷间共价键构成的寡核苷酸，以及具有与相应的天然存在的部分功能相近的非天然存在的部分的寡核苷酸。DNA可以包括例如基因组DNA、质粒DNA、重组DNA或互补DNA(cDNA)。RNA可以包括例如信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)或转移RNA(tRNA)。在某些实施方式中，所述核酸序列可以是编码序列(即可以编码细胞中的终产物例如蛋白质或肽的序列)。在某些实施方式中，所述核酸序列可以是调控序列(例如启动子)。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。所述术语适用于由自然界中存在的氨基酸构成的氨基酸聚合物，并且也适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人造化学类似物的氨基酸聚合物。术语“氨基酸序列”是指由天然存在的氨基酸、已被化学修饰的氨基酸或合成的氨基酸中的任一者构成的序列。所述术语涉及肽和蛋白质，以及肽和蛋白质的片段、类似物、衍生物和组合。

在某些实施方式中，与参比序列“同源”的序列(例如核酸序列和氨基酸序列)在本文中是指所述序列之间的百分同一性。所述百分同一性可以是至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％。所述百分同一性可以分布在所述序列的整个长度内。因此，同源序列可以包括例如与突变相关的变化(例如至少一个氨基酸或至少一个核苷酸的截短、替换、缺失和/或添加)。对于根据本发明所述的酶来说，应当理解，同源物至少在一定程度上保留了野生型酶的特性和活性，使得所述同源物可用于与所述野生型相似的目的。

根据本发明所述的处理通常在容器例如反应器或另一种适合的操作装置中进行，所述装置能够将所述有机废物与酶混合，并控制参数例如温度和pH。

在某些实施方式中，在与D-乳酸氧化酶(和任选的一种或多种糖类降解酶)接触之前，所述有机废物经历预处理，包括粒子尺寸减小和任选的灭菌。所述预处理可以包括例如撕碎、粉碎和例如通过加压蒸汽灭菌。预处理也可以包括使用废物切碎机例如挤出机、超声波处理器、切碎机或搅拌机，用等量的水切碎。

在某些实施方式中，在上述预处理后，确定D-乳酸根和/或可溶性还原糖的量。这种确定可能对利用所述可溶性还原糖的下游发酵过程有用，能够控制进料糖的浓度。

在某些实施方式中，在处理所述有机废物以消除D-乳酸并任选地将糖类降解成可溶性还原糖后，通过产乳酸微生物对所述处理过的有机废物进行发酵。

在某些实施方式中，在根据本发明所述的处理后，将所述处理过的废物泵入到用于乳酸生产的发酵罐中。在其他实施方式中，在根据本发明所述的处理后，在发酵前对所述处理过的废物进行另外的处理，例如固/液分离，以在发酵之前除去不溶性粒子。

有机废物通常包含所述产乳酸微生物所需的氮源和其他营养物，但是如果需要，此类营养物也可以单独供应。

通常，所述发酵步骤在好氧或微好氧条件下进行。所述发酵步骤通常选自分批、分批补料、连续和半连续发酵。每种可能性代表本发明的独立实施方式。

所述有机废物中的还原糖(最初存在于所述废物中的还原糖和通过一种或多种糖类降解酶的作用释放出的还原糖)可以被产乳酸微生物发酵成乳酸。为了只产生L-乳酸，所述使用的产乳酸微生物是仅产生L-乳酸对映异构体的微生物。所述微生物可能天然地只产生L-乳酸，或者可能被遗传修饰成只产生L-乳酸，例如通过敲除参与不想要的D-乳酸对映异构体的合成的一种或多种酶。

在某些实施方式中，在处理后，将所述处理过的有机废物转移到用于所述乳酸发酵的单独的反应器(例如发酵罐)中。

在其他实施方式中，所述乳酸发酵可以在与通过D-乳酸氧化酶和任选的一种或多种糖类降解酶进行所述有机废物处理相同的反应器中进行。

产LA微生物包括各种不同的细菌(包括例如乳杆菌(Lactobacillus)物种和芽孢杆菌(Bacillus)物种)和真菌。通常，所述发酵步骤在厌氧或微好氧条件下，使用分批、补料分批、连续或半连续发酵来进行。

在分批发酵中，将碳底物和其他组分装入反应器中，并在发酵完成时收集产物。除了用于pH控制的中和剂之外，在反应完成前不向所述反应添加其他成分。接种量通常为反应器中液体体积的约5-10％。发酵保持在基本上恒定的温度和pH下，其中pH通过添加适合的中和剂例如碱、碳酸盐或氨来维持。

在补料分批发酵中，将底物连续或顺序地进料到反应器而不移除发酵液(即产物保留在反应器中，直至运行结束)。常用补料方法包括间歇、恒定、脉冲补料和指数补料。

在连续发酵中，将底物以固定速率连续添加到反应器，并将发酵产物连续取出。

在半连续过程中，以一定时间间隔将一部分培养物取出并向***添加新鲜培养基。可以无限期维持的重复补料分批培养是半连续过程的另一个名称。

在发酵期间，可以添加碱例如氢氧化铵、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化镁或氢氧化钙，通过中和乳酸来维持pH，并形成乳酸盐。

乳酸发酵通常进行约1-3天或其间的任何时间量，例如1-2天。

在发酵完成后，可以将含有乳酸(或乳酸盐)的发酵液通过离心澄清或通过压滤机以将固体残留物与发酵液分离。所述滤液可以被浓缩，例如使用旋转真空蒸发器。

乳酸从发酵液的分离和纯化可以通过诸如蒸馏、萃取、电渗析、吸附、离子交换、结晶的方法和这些方法的组合来进行。几种方法被综述在例如Ghaffar等，(2014)，同上；和López-Garzón等，(2014)Biotechnol Adv.,32(5):873-904中。或者，可以使用在单一步骤中进行的乳酸回收和向丙交酯的转化(Dusselier等，(2015)Science,349(6243):78-80)。

在某些实施方式中，所述有机废物在还原糖和糖类方面的组成可以在处理之前使用本领域中已知的方法来确定，包括例如使用葡萄糖氧化酶、己糖激酶或用于果糖测定的磷酸葡萄糖异构酶的酶测定法(比色、荧光)。或者，可以使用HPLC和/或还原糖连续传感器。总糖分析可以例如通过苯酚-硫酸测定法来进行。所述有机废物的组成，例如淀粉、纤维素和半纤维素中的至少一者的百分率，可用于选择将要与所述有机废物接触的一种或多种多糖降解酶。

在用D-乳酸氧化酶处理后D-乳酸的含量，可以例如使用特异性D-乳酸测量试剂盒(Sigma)来测量。

PLA回收利用过程

PLA树脂通常与其他材料复合，以产生所需特性。PLLA和PDLA通常被混合以形成PLLLA/PDLA的共聚物。PDLA被用作成核剂，其提高结晶度、熔化温度并增强其他物理性能。

PDLA的整合对将聚合物(热、化学或酶法)水解成乳酸或丙交酯单体的所有PLA回收利用过程造成问题。出现了对分离所述异构体以便生产纯的L-乳酸根或L-L-丙交酯立体异构体的需求。

在从食品废物到PLA的过程中，PLA废物可以通过化学、热或酶法水解成乳酸单体而与所述食品废物整合，并添加到含有D-乳酸氧化酶的同一个处理罐中。然后所述酶消除在所述废物中天然存在的D-乳酸(源自于垃圾桶、储存和运输中的天然发酵腐败过程)和从PLA废物回收利用的D-乳酸根两者。这种方法可以显著提高来自于设施的乳酸滴度和产量，提高设施的技术经济性，而无需大量投资新设备和运营支出(公共服务、试剂)。

当在本文中使用时，术语“约”在指称可测量的值时，意在涵盖从指定的值变化+/-10％，优选地+/-5％，更优选地+/-1％，更优选地+/-0.1％。

术语“包含”、“包括”、“具有”和它们的同根词意味着“包括但不限于”。术语“包含”在某些实施方式中限于“由……组成”。术语“由……组成”意味着“包括并限于”。术语“基本上由……组成”意味着所述组合物、方法或结构可能包括其他成分、步骤和/或部分，但仅在所述其他的成分、步骤和/或部分不实质性改变所宣称的组合物、方法或结构的基本和新颖特征的情况下。

呈现了下述实施例以便更充分地说明本发明的某些实施方式。然而，它们绝不应该被解释为限制本发明的广阔范围。本领域技术人员可以容易地设计出本文公开的原理的许多变化和修改，而不背离本发明的范围。

实施例

实施例1

从氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)产生重组D-乳酸氧化酶

构建了编码来自于氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)菌株621H的D-乳酸氧化酶(DOX)的pET30质粒。所述编码DOX的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)被修改，以有利于在大肠杆菌中表达。所述为在大肠杆菌中表达而修改的DOX编码序列在SEQ ID NO：9中示出。所述酶作为带有His标签的非分泌蛋白表达。

将大肠埃希氏杆菌BL21(DE3)/pET30-dox细胞的过夜培养物接种在1L含有卡那霉素(50ug/ml)的TB培养基(胰蛋白胨12g/l，酵母提取物24g/l，甘油4ml/l，KH₂PO₄-2.3g/l，K₂HPO₄-16.43g/l)至O.D600为0.1。然后将容器在37℃下搅拌温育，直至O.D600达到1.2。接下来，将所述容器转移到15℃，并以0.5mM的终浓度添加IPTG以诱导酶的表达。在15℃温育16小时后，通过离心收集细菌细胞，悬浮在裂解缓冲液(50mM TRIS-HCl，150mM NaCl，10％甘油，pH＝8)中并超声破碎。

将细菌裂解液离心，将得到的上清液装载到Ni柱上，并用清洗缓冲液(50mM Tris-HCl，10％甘油，pH＝8)清洗。用含有300mM咪唑的清洗缓冲液洗脱蛋白质。将洗脱的蛋白质针对裂解缓冲液透析，并在-80℃下储存直至评估活性。

实施例2

纯的D-乳酸根和有机废物中存在的D-乳酸根被重组D-乳酸氧化酶降解

进行了实验以表征所述酶的活性。以前报道所述酶的最适pH在7-9之间(在pH＝8下观察到最佳活性)，并且最适温度是55℃(Sheng等，2016，同上，支持性信息，图S3)。因此，使用所述酶进行的初始实验在55℃、pH＝8下进行。

首先，使用溶解在缓冲液中的纯D-乳酸根测试活性。将1200mg/LD-乳酸根溶解在含有50mM Tris-HCl、150mM NaCl、10％甘油、pH 8.0的缓冲液中的溶液与所述酶(0.58mg/ml)温育24小时。使用不含所述酶的缓冲液作为对照。如图1A中所示，在温育24小时后，0.58mg/ml的所述酶消耗了基本上全部可用的D-乳酸根。

接下来，在含有D-和L-乳酸两者的有机废物上测试所述酶的活性。所述有机废物是含有烘焙厂废料、水果、蔬菜和屠宰废料(黑肉)和废弃乳制品的混合食品废物。将所述废物研磨，用水1:1稀释，并与所述酶(0.35mg/ml)温育24小时。使用不含所述酶的废物作为对照。所述稀释的废物含有总共1250mg/L乳酸根，其中450mg/L是D-乳酸根。总乳酸根使用

乳酸测试***(Merck)测量。D-乳酸根含量使用特异性D-乳酸比色法试剂盒(Sigma)测量。

如图1B中所示，0.35mg/ml的所述酶消耗了所述废物中大约95％的D-乳酸根：所述废物中D-乳酸根的初始浓度是450mg/L，并且在与酶温育24小时后，所述浓度仅为26mg/L。尽管所述有机废物是确切组成未知的复杂粘稠物质，含有可能的抑制剂和可能不利地影响所述酶的其他因子，并且其活性所需的辅因子的量未知且可能不足，但所述酶仍能有效消除D-乳酸根。

使用不同浓度的酶进一步测试了所述酶对有机废物的活性。将含有450mg/L D-乳酸根的有机废物(在用水1:1稀释后)与如下所述的不同浓度的酶温育24小时：0.35，0.26，0.18，0.09或0.04mg/ml。使用不含所述酶的废物作为对照。如图2中所示，0.35、0.26、0.18、0.09或0.04mg/ml的所述酶分别消耗了大约87％、89％、77％、44％或32％的可用D-乳酸根。在这个实验测试的条件下，为了在24h后实现废物中D-乳酸根的显著减少，需要最低浓度为0.26mg/ml的DOX。

在上述实验中，在添加酶之前将有机废物用水1:1稀释(将400μl废物用400μl水稀释)。在下述实验中，研究了所述酶对用水1:1稀释相比于4:1稀释的废物的活性。4:1稀释通过将400μl废物与100μl水混合来实现。检查了在与浓度逐渐提高的酶温育24小时后所述废物中D-乳酸根的量。结果概述在图3中。如图中所示，浓度为0.27mg/ml的DOX在55℃温育24小时足以消耗1:1稀释的废物中大约90％的D-乳酸根，而对于4:1稀释的废物来说需要0.55mg/ml。这些结果可能表明，所述酶需要更加稀释的环境才能高效消耗D-乳酸根。它还可能表明需要所述废物的更高效的混合(因为所述实验在试管中进行，振摇可能不是最佳)。

实施例3

在葡糖淀粉酶存在下D-乳酸氧化酶的活性

下述实验研究了葡糖淀粉酶(GA)的存在如何影响DOX的活性。所使用的葡糖淀粉酶是可商购的来自于黑曲霉(Aspergillus niger)的葡糖淀粉酶。

在含有或不含100单位/ml GA的情况下，将用水4:1稀释的有机废物与0.18mg/mlDOX在55℃pH＝8下温育24小时。尽管pH＝8对于GA来说不是理想的，但此时不知DOX在酸性pH下是否有活性。所述废物中D-乳酸根的初始浓度是959mg/L。当在含有GA的情况下添加DOX时，试管中剩余154mg/L D-乳酸根，而在不含GA的情况下，剩余274mg/L(图4)。这些结果表明DOX与多糖降解酶例如葡糖淀粉酶的组合是有利的，并引起DOX活性的提高。当将DOX与多糖降解酶例如葡糖淀粉酶组合时，所述过程需要底物(有机废物)的较少稀释，并且可以使用较低量的DOX进行。不受任何特定理论或作用机制限制，设想了在GA存在下DOX活性的提高源自于废物中存在的淀粉被GA降解成可溶性糖之后所述废物的黏度降低。

实施例4

D-乳酸氧化酶在不同pH和温度下的活性

正如上文提到的，以前报道所述酶在pH＝8和55℃下工作最好(Sheng等，2016，支持性信息，图S3)。对于pH来说，已显示在低于7的pH下所述酶的活性和稳定性显著降低。然而，由于垃圾桶、储存和运输中的自然腐败过程，有机废物通常是酸性的(pH在4至5.5之间)。此外，为了从有机废物生产乳酸，将所述有机废物用多糖降解酶例如淀粉酶和纤维素酶糖化，这些酶通常在酸性pH值下有活性。对于温度而言，某些乳酸生产过程通过嗜中温细菌进行。因此，决定检查所述酶在不同pH和温度、甚至是在所述酶据报道失去活性/稳定性的pH和温度下的活性。

首先测试了在不同pH下的活性。为此，将所述废物调节到pH＝5、6、7或8，添加0.27mg/ml酶并在55℃温育24小时。结果概述在图5A中。如图中所示，所述酶甚至在pH＝7和pH＝6时也令人吃惊地显示出D-乳酸根的有效消除。事实上，酶活性与在pH＝8下的活性基本上相同，并且朝向更酸性pH的变化不损害其活性。只有在pH＝5时所述酶的活性才受损而基本上没有从培养基中消除D-乳酸根。

接下来进行了相似的实验，其中将所述酶在不同温度下进行测试。向所述废物添加酶(0.27mg/ml)并在三种不同温度下温育24小时。结果概述在图5B中。如图中所示，对于所有测试温度来说，在实验结束时剩余的D-乳酸根的量基本上相同。

在进一步的实验中，在不同温度和pH下检查了所述酶在有机废物上清液中的活性。在第一个实验中，将废物离心(9000g 10min)，然后将pH调整到pH 7.0或pH 6.0，并与酶(0.27mg/ml)在30℃下温育。如图6A中所示，在30℃下，所述酶在pH 6.0和7.0下的活性趋势非常相似。D-乳酸根分别减少60％或75％(从～1800mg/L分别到700mg/L或470mg/L)，表明在该温度下pH 7.0略微有利。在另一个实验中，将废物离心(9000g 10min)，然后将pH调整到pH 7.0或pH 6.0，并与酶(0.27mg/ml)在55℃下温育。如图6B中所示，所述酶的活性在55℃下比在33℃下更好，并且所述酶在pH 6.0和7.0下的活性趋势非常相似。在两种pH值下，废物中的所有D-乳酸根(～1800mg/L)均被消耗，表明在该温度下两种pH值均可使用。

在缓冲液(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，10％甘油，pH 8.0)中进行Sheng等，同上中所述的测定法。本文中描述的pH和温度结果显示所述酶在有机废物中的活性与它在缓冲液中的活性相比得以改善，特征在于所述酶在其中有活性并有效消除D-乳酸根的条件范围更宽。这些结果表明所述酶可用于不同pH的各种不同有机废物的工业处理和发酵，并且还表明所述酶可以潜在地在用于从有机废物生产乳酸的过程中的不同时间点，并与其他步骤例如废物的糖化相组合使用。

实施例5

在乳酸发酵之前和之后降解有机废物中存在的D-乳酸根

下述实验在从使用有机废物作为发酵底物的15,000升L-乳酸生产线获得的有机废物上测试了D-乳酸氧化酶。所述有机废物是合并了面包店废品和水果、蔬菜和牛奶的市场退货的混合食品废物。将所述废物通过混合、切碎、研磨和蒸汽注入进行预处理。

测试了所述D-乳酸氧化酶对在发酵之前和之后两个时间点从所述有机废物获取的样品的活性。在发酵之前，D-乳酸根浓度约为2200mg/L。在发酵之后，D-乳酸根浓度基本上保持相同(由于细菌接种和发酵期间试剂例如pH控制试剂的添加后废物的稀释而略有降低)。在所述过程中，L-乳酸根浓度被提高到大约80,000mg/L。在这种与D-乳酸相比显著过量的L-乳酸存在下检查D-乳酸氧化酶的活性是令人感兴趣的。

将所述两种样品与不同浓度的D-乳酸氧化酶在55℃温育24小时。也在与有机废物的9小时温育中测试了0.92mg/ml的浓度。将在发酵之前获取的样品与D-乳酸氧化酶在不调整pH(5.5)的情况下温育。在发酵之后获取的样品具有pH＝6.4。使用不含酶的样品作为对照。在与所述酶温育后测量D-乳酸根浓度。与不同浓度的酶24小时温育的结果概述在表1和图7A中。所述图将结果呈现为对照反应(“0”酶)中D-乳酸根浓度的百分数。

表1-与D-乳酸氧化酶24h温育后的D-乳酸根浓度

在发酵之前获取的样品中，浓度为0.92mg/ml的酶在温育24小时后能够有效消耗废物中存在的D-乳酸根——D-乳酸根浓度降低85％。有趣的是，在发酵后获取的样品中，0.55mg/ml的更低浓度的酶足以有效消耗废物中存在的D-乳酸根，并在24小时后将它的浓度降低约85％。所述酶对发酵后获取的样品的活性的提高可能是因为废物在发酵后与它在发酵和用葡糖淀粉酶处理之前的黏度相比黏度更低。此外，发酵后获取的样品具有pH＝6.4，其与发酵前获取的样品的pH＝5.5相比可能更加适合于D-乳酸氧化酶。在与酶温育后D-乳酸根浓度为297mg/ml，而发酵后的L-乳酸根浓度为80,000mg/ml。因此，D-乳酸氧化酶能够减少D-乳酸根的量，使得它在发酵结束时低于总乳酸根的0.5％。重要的是，即使在相比于D-乳酸根显著过量的L-乳酸根存在下，所述酶也能做到这一点。

除了上面讨论的24小时测量之外，也在9小时温育后测量了使用0.92mg/ml D-乳酸氧化酶时废物中D-乳酸根的变化。图7B示出了在与0.92mg/ml D-乳酸氧化酶温育后D-乳酸根随时间的变化。所述图将结果呈现为在时间＝0时D-乳酸根浓度的百分数。与发酵后获取的样品温育的浓度为0.92mg/ml的D-乳酸氧化酶，在9小时后已经能够消耗约80％的D-乳酸根。

在另一个实验中，在用作发酵底物的不同来源的混合食品有机废物上测试了D-乳酸氧化酶的活性，所述废物含有面包店废料、水果、蔬菜、屠宰废料(黑肉)和废乳制品。将所述废物通过混合、研磨和灭菌进行预处理。测试了D-乳酸氧化酶对在乳酸发酵之前和之后两个时间点从所述有机废物获取的样品的活性。在这个实验中，在与D-乳酸氧化酶温育之前将所述样品离心(9000g 10min)。在离心后，向上清液添加0.27mg/ml的酶，并在55℃温育26小时。在温育的0、4、7、14、19和26小时测量D-乳酸根的浓度。

在发酵前获取的样品中的D-乳酸根浓度约为800mg/L。在发酵后，D-乳酸根的浓度基本上保持相同。在所述过程中，L-乳酸根浓度提高到大约87,000mg/L。同样地，在这种与D-乳酸相比显著过量的L-乳酸存在下检查D-乳酸氧化酶的活性是令人感兴趣的。

在与酶温育后测量D-乳酸根浓度。结果概述在表2和图7C中。所述图将结果呈现为在时间＝0时的D-乳酸根浓度的百分数。

表2-在废物上清液与D-乳酸氧化酶温育后D-乳酸根的浓度

在发酵之前获取的样品中，浓度为0.27mg/ml的酶能够在26小时温育后消耗大约70％的废物中存在的D-乳酸根。有趣的是，在发酵后获取的样品中，同样的浓度能够在仅仅14小时后消耗同样量的D-乳酸根。由于在与D-乳酸氧化酶温育之前将所述废物离心，因此似乎除了黏度降低之外，其他因素也导致发酵完成后活性的提高。

在与酶温育后D-乳酸根的浓度为224mg/ml，而发酵后L-乳酸根的浓度为87,000mg/ml。因此，D-乳酸氧化酶能够减少D-乳酸根的量，使得它在发酵结束时低于总乳酸根的0.5％。同样地，即使在相比于D-乳酸根显著过量的L-乳酸根存在下，所述酶也能做到这一点。

实施例6

用于生产重组D-乳酸氧化酶的改进的方案

将实施例1中描述的大肠杆菌BL21(DE3)/pET30-dox细胞的过夜培养物接种在5mL含有卡那霉素(50ug/ml)的LB培养基中并生长过夜。接下来，将1mL培养物接种到50mL含有卡那霉素的TB培养基(胰蛋白胨12g/l，酵母提取物24g/l，甘油4ml/l，KH₂PO₄-2.3g/l，K₂HPO₄-16.43g/l)，并在37℃下搅拌温育，直至O.D600达到1.2。然后将所述培养物转移到15℃并添加终浓度为0.5mM的IPTG，以诱导酶的表达。在15℃下温育20小时后，通过离心收集细菌细胞，悬浮在裂解缓冲液(50mM TRIS-HCl，150mM NaCl，10％甘油，pH＝8)中并超声破碎。

将细菌裂解液以3000rpm离心5min，并将上清液再次以9000rpm离心10min。将得到的沉积物和上清液与样品缓冲液混合，煮沸，并在SDS-PAGE上可视化。在上清液中发现所述蛋白质的可溶性活性形式，而在所述沉积物中发现无活性的蛋白质聚集体。如图8中所示，绝大部分蛋白质存在于上清液中，表明所述蛋白质以有活性的可溶形式成功表达。可溶性(上清液)级分中蛋白质的量显著高于使用实施例1中描述的方案获得的量。

如上所述测试所述粗酶上清液对D-乳酸根的降解。

实施例7

使用组成型启动子生产来自于氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)的重组D-乳酸氧化酶

构建了在组成型启动子下表达来自于氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacteroxydans)菌株621H的D-乳酸氧化酶(DOX)的pET30质粒。对编码DOX的核苷酸序列(SEQ IDNO：2)进行修改，以利于在大肠杆菌中表达。所述修改的序列在SEQ ID NO：9中示出。所述酶被表达成带有His标签的非分泌蛋白。

构建了三种质粒，各自含有被克隆到DOX编码序列上游，代替诱导型T7启动子的下述合成启动子之一：

>SEQ ID NO：3：

AAGCTGTTGTGACCGCTTGCTCTAGCCAGCTATCGAGTTGTGAACCGATCCATCTAGCAATTGGTCTCGATCTAGCGATAGGCTTCGATCTAGCTATGTAGAAACGCCGTGTGCTCGATCGCTTGATAAGGTCCACGTAGCTGCTATAATTGCTTCAACAGAACATATTGACTATCCGGTATTACCCGGC

>SEQ ID NO：4：

CTTGATAAGGTCCACGTAGCTGCTATAGTTGCTTCAACAGAACATATTGACTATCCGGTATTACCCGGC

>SEQ ID NO：5：

CCTGATAAGGTCCACAGTAGCTGCTATAATTGCTTCAACAGAACATATTGACTATCCGGTATTACCCGGC

含有为在大肠杆菌中表达而修改的DOX的编码核酸序列以及上述启动子中的每一者的核酸构建物被阐述为：

-SEQ ID NO：6——包含SEQ ID NO：3中示出的启动子的核酸构建物。所述启动子序列对应于SEQ ID NO：6的第1-190位。所述DOX编码序列对应于SEQ ID NO：6的第256-1,692位。所述核酸构建物还含有在第235-255位处的编码N-端His标签和His标签上游的Met残基的核酸序列。

-SEQ ID NO：7——包含SEQ ID NO：4中示出的启动子的核酸构建物。所述启动子序列对应于SEQ ID NO：7的第1-69位。所述DOX编码序列对应于SEQ ID NO：7的第135-1,571位。所述核酸构建物还含有在第114-134位处的编码N-端His标签和His标签上游的Met残基的核酸序列。

-SEQ ID NO：8——包含SEQ ID NO：5中示出的启动子的核酸构建物。所述启动子序列对应于SEQ ID NO：8的第1-70位。所述DOX编码序列对应于SEQ ID NO：8的第136-1,572位。所述核酸构建物还含有在第115-135位处的编码N-端His标签和His标签上游的Met残基的核酸序列。

每个上述核酸构建物还含有在所述启动子序列与DOX编码序列之间的核糖体结合位点。

对于每种质粒来说，将用所述质粒转化的大肠杆菌BL21(DE3)的过夜培养物接种在1L含有卡那霉素(50ug/ml)的TB培养基(胰蛋白胨12g/l，酵母提取物24g/l，甘油4ml/l，KH₂PO₄-2.3g/l，K₂HPO₄-16.43g/l)中，并在37℃下搅拌16小时。通过离心收集细菌细胞，悬浮在裂解缓冲液(50mM TRIS-HCl，150mM NaCl，10％甘油，pH＝8)中并超声破碎。

测试在组成型启动子之下表达D-乳酸氧化酶的大肠杆菌的细菌裂解液对D-乳酸根的降解。使用在实施例1中产生的D-乳酸氧化酶(0.27mg/ml)作为对照。裂解液以总反应体积的20％(v/v)添加：将20ul含有酶的裂解液添加到80ul含有约3,200mg/L D-乳酸根的缓冲液(pH＝8)，并在55℃下温育。在总共25小时中测量活性。结果示出在图9中。25小时后，来自于实施例1的酶能够将D-乳酸根减少到400mg/L，而所述细菌裂解液在仅仅6小时后就能消除几乎所有的D-乳酸根(170mg/L)。

实施例8

同时的发酵、糖化和D-乳酸根消除

A.同时过程：葡糖淀粉酶+DOX+凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)

将废物料流研磨，添加到发酵罐并灭菌。在50-55℃的温度和pH＝5.5-6.5下添加葡糖淀粉酶(0.1-1gr/L)、DOX(0.25-0.65mg/ml)和凝结芽孢杆菌(B.coagulans)(10⁶–10⁸个活细菌细胞)。在添加到发酵罐之前从所述废物取样，用于评估葡萄糖潜力和测量初始D-乳酸根浓度。也在发酵过程中取样，例如每1-10小时或每1-5小时，以监测葡萄糖和总乳酸根浓度。发酵持续到葡萄糖浓度达到零并且总乳酸根浓度不再增加。在需要花费20-48小时之间才能达到的这个时间点，D-乳酸根浓度降低到低于最终总乳酸根的0.5％的水平。

B.同时过程：葡糖淀粉酶+凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)+“脉冲”添加的 DOX

将废物料流研磨，添加到发酵罐并灭菌。在50-55℃的温度和pH＝5.5-6.5下添加葡糖淀粉酶(0.1-1gr/L)、DOX(0.1-0.3mg/ml)和凝结芽孢杆菌(B.coagulans)(10⁶–10⁸个活细菌细胞)。5小时后添加第二剂DOX(0.1-0.3mg/ml)。5小时后添加第三剂DOX(0.1-0.3mg/ml)。5小时后添加第四剂DOX(0.1-0.3mg/ml)。在添加到发酵罐之前从所述废物取样，用于评估葡萄糖潜力和测量初始D-乳酸根浓度。也在发酵过程中取样，例如每1-10小时或每1-5小时，以监测葡萄糖和乳酸根浓度。发酵持续到葡萄糖浓度达到零并且乳酸根浓度不再增加。在需要花费20-48小时之间才能达到的这个时间点，D-乳酸根浓度降低到低于最终总乳酸根的0.5％的水平。

C.同时的糖化和发酵，其中DOX在发酵结束时添加

将废物料流研磨，添加到发酵罐并灭菌。在50-55℃的温度和pH＝5.5-6.5下添加葡糖淀粉酶(0.1-1gr/L)和凝结芽孢杆菌(B.coagulans)(10⁶–10⁸个活细菌细胞)。在添加到发酵罐之前从所述废物取样，用于评估葡萄糖潜力和测量初始D-乳酸根浓度。也在发酵过程中取样，例如每1-10小时或每1-5小时，以监测葡萄糖和总乳酸根浓度。发酵持续到葡萄糖浓度达到零并且总乳酸根浓度不再增加。在需要花费20-48小时之间才能达到的这个时间点，将发酵液离心(9000g，10min)并舍弃固体相。向培养液上清液添加DOX酶(0.25-0.65mg/ml)，并将所述上清液在50-55℃和pH＝6-7下温育10-24小时。温育持续到D-乳酸根浓度降低到低于最终总乳酸根的0.5％的水平。

上述具体实施方式的描述如此充分地揭示了本发明的总体性质，使得其他人可以通过使用当前知识容易地修改和/或改编这些具体实施方式以适应于各种不同应用，而无需过多实验并且不背离所述通用概念，因此，这些改编和修改应该并且打算在所公开的实施方式的含义和等同性范围之内理解。应该理解，本文中使用的短语或术语是出于描述而不是限制的目的。在不背离本发明的情况下，用于执行所公开的各种不同功能的手段、材料和步骤可以采取各种不同的可替选形式。

序列表

<110> 三W有限公司

<120> 使用高特异性D-乳酸氧化酶处理有机废物

<130> PLW/007 PCT

<150> US 62/831,758

<151> 2019-04-10

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 477

<212> PRT

<213> Gluconobacter oxydans

<400> 1

Met Pro Glu Pro Val Met Thr Ala Ser Ser Ala Ser Ala Pro Asp Arg

1 5 10 15

Leu Gln Ala Val Leu Lys Ala Leu Gln Pro Val Met Gly Glu Arg Ile

20 25 30

Ser Thr Ala Pro Ser Val Arg Glu Glu His Ser His Gly Glu Ala Met

35 40 45

Asn Ala Ser Asn Leu Pro Glu Ala Val Val Phe Ala Glu Ser Thr Gln

50 55 60

Asp Val Ala Thr Val Leu Arg His Cys His Glu Trp Arg Val Pro Val

65 70 75 80

Val Ala Phe Gly Ala Gly Thr Ser Val Glu Gly His Val Val Pro Pro

85 90 95

Glu Gln Ala Ile Ser Leu Asp Leu Ser Arg Met Thr Gly Ile Val Asp

100 105 110

Leu Asn Ala Glu Asp Leu Asp Cys Arg Val Gln Ala Gly Ile Thr Arg

115 120 125

Gln Thr Leu Asn Val Glu Ile Arg Asp Thr Gly Leu Phe Phe Pro Val

130 135 140

Asp Pro Gly Gly Glu Ala Thr Ile Gly Gly Met Cys Ala Thr Arg Ala

145 150 155 160

Ser Gly Thr Ala Ala Val Arg Tyr Gly Thr Met Lys Glu Asn Val Leu

165 170 175

Gly Leu Thr Val Val Leu Ala Thr Gly Glu Ile Ile Arg Thr Gly Gly

180 185 190

Arg Val Arg Lys Ser Ser Thr Gly Tyr Asp Leu Thr Ser Leu Phe Val

195 200 205

Gly Ser Glu Gly Thr Leu Gly Ile Ile Thr Glu Val Gln Leu Arg Leu

210 215 220

His Gly Arg Pro Asp Ser Val Ser Ala Ala Ile Cys Gln Phe Glu Ser

225 230 235 240

Leu His Asp Ala Ile Gln Thr Ala Met Glu Ile Ile Gln Cys Gly Ile

245 250 255

Pro Ile Thr Arg Val Glu Leu Met Asp Ser Val Gln Met Ala Ala Ser

260 265 270

Ile Gln Tyr Ser Gly Leu Asn Glu Tyr Gln Pro Leu Thr Thr Leu Phe

275 280 285

Phe Glu Phe Thr Gly Ser Pro Ala Ala Val Arg Glu Gln Val Glu Thr

290 295 300

Thr Glu Ala Ile Ala Ser Gly Asn Asn Gly Leu Gly Phe Ala Trp Ala

305 310 315 320

Glu Ser Pro Glu Asp Arg Thr Arg Leu Trp Lys Ala Arg His Asp Ala

325 330 335

Tyr Trp Ala Ala Lys Ala Ile Val Pro Asp Ala Arg Val Ile Ser Thr

340 345 350

Asp Cys Ile Val Pro Ile Ser Arg Leu Gly Glu Leu Ile Glu Gly Val

355 360 365

His Arg Asp Ile Glu Ala Ser Gly Leu Arg Ala Pro Leu Leu Gly His

370 375 380

Val Gly Asp Gly Asn Phe His Thr Leu Ile Ile Thr Asp Asp Thr Pro

385 390 395 400

Glu Gly His Gln Gln Ala Leu Asp Leu Asp Arg Lys Ile Val Ala Arg

405 410 415

Ala Leu Ser Leu Asn Gly Ser Cys Ser Gly Glu His Gly Val Gly Met

420 425 430

Gly Lys Leu Glu Phe Leu Glu Thr Glu His Gly Pro Gly Ser Leu Ser

435 440 445

Val Met Arg Ala Leu Lys Asn Thr Met Asp Pro His His Ile Leu Asn

450 455 460

Pro Gly Lys Leu Leu Pro Pro Gly Ala Val Tyr Thr Gly

465 470 475

<210> 2

<211> 1434

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Polynucleotide

<400> 2

atgccggaac cagtcatgac cgcctcttcc gcctccgctc cggaccgcct tcaggccgtt 60

ctcaaagccc tccagcccgt catgggtgag cggatcagca cggcaccctc cgttcgcgaa 120

gagcacagcc acggcgaggc catgaatgcc tccaacctgc ccgaggcggt ggtgtttgct 180

gaaagtactc aggatgtcgc aaccgtcctg cggcactgcc atgaatggcg cgttccggtc 240

gtggcgttcg gcgctggcac gtccgtcgaa ggtcatgtcg tgccgcccga acaggccatc 300

agcctcgatc tgtcacgcat gacggggatc gtggacctga acgccgagga tctggattgc 360

cgggtccaag ccggcatcac gcgccagacg ctgaatgttg aaatccgcga tacgggcctg 420

ttctttccgg tcgatccggg tggggaagct acgatcggcg gtatgtgcgc cacccgcgcc 480

tcgggcacgg ccgccgtacg ctacggcacg atgaaagaaa atgtgctggg cctgacggtt 540

gttctcgcga ccggcgaaat catccgcaca ggtggccgcg tccgcaaatc gtccaccggc 600

tatgacctga catcgctgtt cgtcggctcg gaaggtacgc tcgggatcat caccgaagtc 660

cagctccgtc tgcatgggcg tccagacagt gtttcggccg cgatctgcca attcgaaagc 720

ctgcatgacg ccatccagac tgccatggaa atcatccagt gcggcatccc catcacccgc 780

gtggaactga tggacagcgt gcagatggca gcttccatcc agtattccgg cctgaacgaa 840

tatcagccgc tgaccacgct gtttttcgag ttcacaggct cgcccgcagc ggtacgcgag 900

caggtcgaga cgaccgaagc cattgcgtcc ggcaataacg ggcttggctt tgcctgggcc 960

gaaagtcccg aagaccgcac ccgcctctgg aaagcgcggc atgacgccta ctgggcggcc 1020

aaggccatcg ttccggatgc gcgcgtcatt tccacagact gcatcgtccc gatttcccgt 1080

ctgggcgaac tgatcgaggg cgtgcatcgc gatatcgagg cctccggcct gcgcgcgccc 1140

cttctgggcc atgtggggga cggcaatttc catacgctca tcatcacgga cgacaccccc 1200

gaagggcatc agcaggccct cgatctggac cggaagatcg tagcccgcgc cctttcgctg 1260

aacgggtcgt gcagcgggga acatggtgtc ggcatgggca agctggagtt tctggaaacc 1320

gagcatgggc ctggaagcct cagcgtgatg cgcgccctga agaacacgat ggatccgcac 1380

catatcctca atcccggcaa gctccttccg cccggtgctg tttacacggg ctga 1434

<210> 3

<211> 190

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Promoter

<400> 3

aagctgttgt gaccgcttgc tctagccagc tatcgagttg tgaaccgatc catctagcaa 60

ttggtctcga tctagcgata ggcttcgatc tagctatgta gaaacgccgt gtgctcgatc 120

gcttgataag gtccacgtag ctgctataat tgcttcaaca gaacatattg actatccggt 180

attacccggc 190

<210> 4

<211> 69

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Promoter

<400> 4

cttgataagg tccacgtagc tgctatagtt gcttcaacag aacatattga ctatccggta 60

ttacccggc 69

<210> 5

<211> 70

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Promoter

<400> 5

cctgataagg tccacagtag ctgctataat tgcttcaaca gaacatattg actatccggt 60

attacccggc 70

<210> 6

<211> 1692

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Polynucleotide

<400> 6

aagctgttgt gaccgcttgc tctagccagc tatcgagttg tgaaccgatc catctagcaa 60

ttggtctcga tctagcgata ggcttcgatc tagctatgta gaaacgccgt gtgctcgatc 120

gcttgataag gtccacgtag ctgctataat tgcttcaaca gaacatattg actatccggt 180

attacccggc cctctagaaa taattttgtt taactttaag aaggagatat acatatgcac 240

caccaccacc accacatgcc cgaaccagta atgacagctt caagcgcgag cgcgccggat 300

cgtctgcaag cggttctgaa ggcgctgcag ccggtgatgg gtgaacgtat cagcaccgcg 360

ccgagcgttc gtgaggaaca cagccacggc gaggcgatga acgcgagcaa cctgccggaa 420

gcggtggttt ttgcggagag cacccaggat gtggcgaccg ttctgcgtca ctgccacgaa 480

tggcgtgtgc cggtggttgc gtttggtgcg ggcaccagcg ttgaaggtca cgtggttccg 540

ccggagcaag cgatcagcct ggacctgagc cgtatgaccg gcattgtgga tctgaacgcg 600

gaggacctgg attgccgtgt tcaggcgggt atcacccgtc aaaccctgaa cgtggaaatt 660

cgtgacaccg gcctgttctt tccggttgat ccgggtggcg aggcgaccat cggtggcatg 720

tgcgcgaccc gtgcgagcgg taccgcggcg gtgcgttacg gcaccatgaa ggaaaacgtt 780

ctgggtctga ccgtggttct ggcgaccggc gagatcattc gtaccggtgg ccgcgtgcgt 840

aaaagcagca ccggttatga cctgaccagc ctgttcgttg gcagcgaagg taccctgggc 900

atcattaccg aggtgcaact gcgtctgcat ggccgtccgg acagcgttag cgcggcgatc 960

tgccaatttg aaagcctgca cgatgcgatt cagaccgcga tggagatcat tcaatgcggt 1020

atcccgatta cccgtgtgga actgatggat agcgttcaga tggcggcgag catccaatac 1080

agcggtctga acgaatatca gccgctgacc accctgttct ttgagtttac cggcagcccg 1140

gcggcggtgc gtgagcaagt tgaaaccacc gaggcgattg cgagcggtaa caacggtctg 1200

ggctttgcgt gggcggaaag cccggaggac cgtacccgtc tgtggaaggc gcgtcacgat 1260

gcgtactggg cggcgaaagc gattgtgccg gatgcgcgtg ttattagcac cgattgcatc 1320

gtgccgatta gccgtctggg tgaactgatc gagggcgttc accgtgacat tgaagcgagc 1380

ggtctgcgtg cgccgctgct gggtcacgtg ggtgatggca acttccacac cctgatcatt 1440

accgacgata ccccggaggg tcaccagcaa gcgctggacc tggatcgtaa gatcgtggcg 1500

cgtgcgctga gcctgaacgg tagctgcagc ggcgaacacg gtgttggcat gggcaagctg 1560

gagtttctgg aaaccgaaca cggcccgggt agcctgagcg ttatgcgtgc gctgaaaaac 1620

accatggatc cgcatcacat cctgaatccg ggcaagctgc tgccgccggg tgcggtttat 1680

accggttaat ga 1692

<210> 7

<211> 1571

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Polynucleotide

<400> 7

cttgataagg tccacgtagc tgctatagtt gcttcaacag aacatattga ctatccggta 60

ttacccggcc ctctagaaat aattttgttt aactttaaga aggagatata catatgcacc 120

accaccacca ccacatgccc gaaccagtaa tgacagcttc aagcgcgagc gcgccggatc 180

gtctgcaagc ggttctgaag gcgctgcagc cggtgatggg tgaacgtatc agcaccgcgc 240

cgagcgttcg tgaggaacac agccacggcg aggcgatgaa cgcgagcaac ctgccggaag 300

cggtggtttt tgcggagagc acccaggatg tggcgaccgt tctgcgtcac tgccacgaat 360

ggcgtgtgcc ggtggttgcg tttggtgcgg gcaccagcgt tgaaggtcac gtggttccgc 420

cggagcaagc gatcagcctg gacctgagcc gtatgaccgg cattgtggat ctgaacgcgg 480

aggacctgga ttgccgtgtt caggcgggta tcacccgtca aaccctgaac gtggaaattc 540

gtgacaccgg cctgttcttt ccggttgatc cgggtggcga ggcgaccatc ggtggcatgt 600

gcgcgacccg tgcgagcggt accgcggcgg tgcgttacgg caccatgaag gaaaacgttc 660

tgggtctgac cgtggttctg gcgaccggcg agatcattcg taccggtggc cgcgtgcgta 720

aaagcagcac cggttatgac ctgaccagcc tgttcgttgg cagcgaaggt accctgggca 780

tcattaccga ggtgcaactg cgtctgcatg gccgtccgga cagcgttagc gcggcgatct 840

gccaatttga aagcctgcac gatgcgattc agaccgcgat ggagatcatt caatgcggta 900

tcccgattac ccgtgtggaa ctgatggata gcgttcagat ggcggcgagc atccaataca 960

gcggtctgaa cgaatatcag ccgctgacca ccctgttctt tgagtttacc ggcagcccgg 1020

cggcggtgcg tgagcaagtt gaaaccaccg aggcgattgc gagcggtaac aacggtctgg 1080

gctttgcgtg ggcggaaagc ccggaggacc gtacccgtct gtggaaggcg cgtcacgatg 1140

cgtactgggc ggcgaaagcg attgtgccgg atgcgcgtgt tattagcacc gattgcatcg 1200

tgccgattag ccgtctgggt gaactgatcg agggcgttca ccgtgacatt gaagcgagcg 1260

gtctgcgtgc gccgctgctg ggtcacgtgg gtgatggcaa cttccacacc ctgatcatta 1320

ccgacgatac cccggagggt caccagcaag cgctggacct ggatcgtaag atcgtggcgc 1380

gtgcgctgag cctgaacggt agctgcagcg gcgaacacgg tgttggcatg ggcaagctgg 1440

agtttctgga aaccgaacac ggcccgggta gcctgagcgt tatgcgtgcg ctgaaaaaca 1500

ccatggatcc gcatcacatc ctgaatccgg gcaagctgct gccgccgggt gcggtttata 1560

ccggttaatg a 1571

<210> 8

<211> 1572

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Polynucleotide

<400> 8

cctgataagg tccacagtag ctgctataat tgcttcaaca gaacatattg actatccggt 60

attacccggc cctctagaaa taattttgtt taactttaag aaggagatat acatatgcac 120

caccaccacc accacatgcc cgaaccagta atgacagctt caagcgcgag cgcgccggat 180

cgtctgcaag cggttctgaa ggcgctgcag ccggtgatgg gtgaacgtat cagcaccgcg 240

ccgagcgttc gtgaggaaca cagccacggc gaggcgatga acgcgagcaa cctgccggaa 300

gcggtggttt ttgcggagag cacccaggat gtggcgaccg ttctgcgtca ctgccacgaa 360

tggcgtgtgc cggtggttgc gtttggtgcg ggcaccagcg ttgaaggtca cgtggttccg 420

ccggagcaag cgatcagcct ggacctgagc cgtatgaccg gcattgtgga tctgaacgcg 480

gaggacctgg attgccgtgt tcaggcgggt atcacccgtc aaaccctgaa cgtggaaatt 540

cgtgacaccg gcctgttctt tccggttgat ccgggtggcg aggcgaccat cggtggcatg 600

tgcgcgaccc gtgcgagcgg taccgcggcg gtgcgttacg gcaccatgaa ggaaaacgtt 660

ctgggtctga ccgtggttct ggcgaccggc gagatcattc gtaccggtgg ccgcgtgcgt 720

aaaagcagca ccggttatga cctgaccagc ctgttcgttg gcagcgaagg taccctgggc 780

atcattaccg aggtgcaact gcgtctgcat ggccgtccgg acagcgttag cgcggcgatc 840

tgccaatttg aaagcctgca cgatgcgatt cagaccgcga tggagatcat tcaatgcggt 900

atcccgatta cccgtgtgga actgatggat agcgttcaga tggcggcgag catccaatac 960

agcggtctga acgaatatca gccgctgacc accctgttct ttgagtttac cggcagcccg 1020

gcggcggtgc gtgagcaagt tgaaaccacc gaggcgattg cgagcggtaa caacggtctg 1080

ggctttgcgt gggcggaaag cccggaggac cgtacccgtc tgtggaaggc gcgtcacgat 1140

gcgtactggg cggcgaaagc gattgtgccg gatgcgcgtg ttattagcac cgattgcatc 1200

gtgccgatta gccgtctggg tgaactgatc gagggcgttc accgtgacat tgaagcgagc 1260

ggtctgcgtg cgccgctgct gggtcacgtg ggtgatggca acttccacac cctgatcatt 1320

accgacgata ccccggaggg tcaccagcaa gcgctggacc tggatcgtaa gatcgtggcg 1380

cgtgcgctga gcctgaacgg tagctgcagc ggcgaacacg gtgttggcat gggcaagctg 1440

gagtttctgg aaaccgaaca cggcccgggt agcctgagcg ttatgcgtgc gctgaaaaac 1500

accatggatc cgcatcacat cctgaatccg ggcaagctgc tgccgccggg tgcggtttat 1560

accggttaat ga 1572

<210> 9

<211> 1437

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Polynucleotide

<400> 9

atgcccgaac cagtaatgac agcttcaagc gcgagcgcgc cggatcgtct gcaagcggtt 60

ctgaaggcgc tgcagccggt gatgggtgaa cgtatcagca ccgcgccgag cgttcgtgag 120

gaacacagcc acggcgaggc gatgaacgcg agcaacctgc cggaagcggt ggtttttgcg 180

gagagcaccc aggatgtggc gaccgttctg cgtcactgcc acgaatggcg tgtgccggtg 240

gttgcgtttg gtgcgggcac cagcgttgaa ggtcacgtgg ttccgccgga gcaagcgatc 300

agcctggacc tgagccgtat gaccggcatt gtggatctga acgcggagga cctggattgc 360

cgtgttcagg cgggtatcac ccgtcaaacc ctgaacgtgg aaattcgtga caccggcctg 420

ttctttccgg ttgatccggg tggcgaggcg accatcggtg gcatgtgcgc gacccgtgcg 480

agcggtaccg cggcggtgcg ttacggcacc atgaaggaaa acgttctggg tctgaccgtg 540

gttctggcga ccggcgagat cattcgtacc ggtggccgcg tgcgtaaaag cagcaccggt 600

tatgacctga ccagcctgtt cgttggcagc gaaggtaccc tgggcatcat taccgaggtg 660

caactgcgtc tgcatggccg tccggacagc gttagcgcgg cgatctgcca atttgaaagc 720

ctgcacgatg cgattcagac cgcgatggag atcattcaat gcggtatccc gattacccgt 780

gtggaactga tggatagcgt tcagatggcg gcgagcatcc aatacagcgg tctgaacgaa 840

tatcagccgc tgaccaccct gttctttgag tttaccggca gcccggcggc ggtgcgtgag 900

caagttgaaa ccaccgaggc gattgcgagc ggtaacaacg gtctgggctt tgcgtgggcg 960

gaaagcccgg aggaccgtac ccgtctgtgg aaggcgcgtc acgatgcgta ctgggcggcg 1020

aaagcgattg tgccggatgc gcgtgttatt agcaccgatt gcatcgtgcc gattagccgt 1080

ctgggtgaac tgatcgaggg cgttcaccgt gacattgaag cgagcggtct gcgtgcgccg 1140

ctgctgggtc acgtgggtga tggcaacttc cacaccctga tcattaccga cgataccccg 1200

gagggtcacc agcaagcgct ggacctggat cgtaagatcg tggcgcgtgc gctgagcctg 1260

aacggtagct gcagcggcga acacggtgtt ggcatgggca agctggagtt tctggaaacc 1320

gaacacggcc cgggtagcct gagcgttatg cgtgcgctga aaaacaccat ggatccgcat 1380

cacatcctga atccgggcaa gctgctgccg ccgggtgcgg tttataccgg ttaatga 1437

Claims

1.一种用于处理有机废物的方法，所述方法包括：

(i)提供有机废物；和

2.权利要求1所述的方法，其中所述有机废物选自食品废物、城市废物、农业废物、植物材料及其组合。

3.权利要求1所述的方法，其中所述有机废物是食品废物。

4.权利要求1所述的方法，其中所述D-乳酸氧化酶来自于氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)。

5.权利要求4所述的方法，其中所述D-乳酸氧化酶与有机废物的接触在25-60℃范围内的温度下进行。

6.权利要求4所述的方法，其中所述D-乳酸氧化酶与有机废物的接触在5.5-7范围内的pH下进行。

7.权利要求1所述的方法，其中所述D-乳酸氧化酶与有机废物的接触进行6至48小时范围内的时间长度。

8.权利要求1所述的方法，其还包括将所述有机废物与一种或多种糖类降解酶接触，以降解所述有机废物中的糖类，释放出还原糖。

9.权利要求8所述的方法，其中所述一种或多种糖类降解酶是选自淀粉酶、纤维素酶和半纤维素酶的多糖降解酶。

10.权利要求8所述的方法，其中所述一种或多种糖类降解酶包含葡糖淀粉酶。

11.权利要求8所述的方法，其中与一种或多种糖类降解酶的接触和与D-乳酸氧化酶的接触同时进行。

12.权利要求8所述的方法，其中与一种或多种糖类降解酶的接触和与D-乳酸氧化酶的接触以任何顺序依次进行。

13.一种用于处理有机废物的***，所述***包含：

(a)有机废物源；和

(b)D-乳酸氧化酶，

其中将所述D-乳酸氧化酶与所述有机废物混合，并消除所述有机废物中存在的D-乳酸。

14.权利要求13所述的***，其中所述有机废物选自食品废物、城市废物、农业废物、植物材料及其组合。

15.权利要求13所述的***，其中所述有机废物是食品废物。

16.权利要求13所述的***，其中所述D-乳酸氧化酶来自于氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)。

17.权利要求16所述的***，其中将所述D-乳酸氧化酶与所述有机废物在25-60℃范围内的温度下混合。

18.权利要求16所述的***，其中将所述D-乳酸氧化酶与所述有机废物在5.5-7范围内的pH下混合。

19.权利要求13所述的***，其中将所述D-乳酸氧化酶与所述有机废物混合6至48小时范围内的时间长度。

20.权利要求13所述的***，所述***还包含一种或多种糖类降解酶，其与所述有机废物混合并降解所述有机废物中的糖类，以释放出还原糖。

21.权利要求20所述的***，其中所述一种或多种糖类降解酶是选自淀粉酶、纤维素酶和半纤维素酶的多糖降解酶。

22.权利要求20所述的***，其中所述一种或多种糖类降解酶包含葡糖淀粉酶。

23.权利要求20所述的***，其中所述D-乳酸氧化酶和一种或多种糖类降解酶同时与所述有机废物混合。

24.权利要求20所述的***，其中所述D-乳酸氧化酶和一种或多种糖类降解酶以任何顺序依次与所述有机废物混合。

25.一种用于从有机废物生产L-乳酸的方法，所述方法包括：

(i)使用D-乳酸氧化酶消除源自于所述有机废物的D-乳酸；和

(ii)用只产生L-乳酸根的产乳酸微生物发酵所述有机废物。

26.权利要求25所述的方法，其中使用D-乳酸氧化酶消除源自于所述有机废物的D-乳酸在用只产生L-乳酸根的产乳酸微生物发酵所述有机废物之前进行。

27.权利要求25所述的方法，其中使用D-乳酸氧化酶消除源自于所述有机废物的D-乳酸在用只产生L-乳酸根的产乳酸微生物发酵所述有机废物之后进行。

28.权利要求25所述的方法，其中使用D-乳酸氧化酶消除源自于所述有机废物的D-乳酸与用只产生L-乳酸根的产乳酸微生物发酵所述有机废物在同时进行。

29.权利要求25所述的方法，其中所述有机废物是食品废物。

30.权利要求25所述的方法，其中所述D-乳酸氧化酶来自于氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)。

31.一种用于从有机废物生产L-乳酸的方法，所述方法包括：

(i)提供有机废物；

(ii)通过将所述有机废物与D-乳酸氧化酶和一种或多种糖类降解酶接触，处理所述有机废物以消除所述废物中存在的D-乳酸并降解所述废物中的糖类以释放出可溶性还原糖；

(iii)用只产生L-乳酸的产乳酸微生物发酵处理过的有机废物，以获得L-乳酸；和

(iv)从发酵液回收所述L-乳酸。

32.权利要求31所述的方法，其中所述有机废物是食品废物。

33.权利要求31所述的方法，其中所述D-乳酸氧化酶来自于氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)。

34.权利要求31所述的方法，其中所述一种或多种糖类降解酶包含葡糖淀粉酶。

35.权利要求31所述的方法，其中与一种或多种糖类降解酶的接触和与D-乳酸氧化酶的接触同时进行。

36.权利要求31所述的方法，其中与一种或多种糖类降解酶的接触和与D-乳酸氧化酶的接触以任何顺序依次进行。

37.权利要求31所述的方法，其中步骤(ii)和步骤(iii)同时进行。

38.权利要求31所述的方法，其中步骤(ii)在步骤(iii)之前进行。

39.一种用于从有机废物生产L-乳酸的***，所述***包含：

(a)有机废物源；

(b)D-乳酸氧化酶；和

(c)只产生L-乳酸根的产乳酸微生物，

40.权利要求39所述的***，其还包含一种或多种糖类降解酶。

41.权利要求39所述的***，其包含：

(a)有机废物源；

(b)处理罐，其包含用于消除有机废物中存在的D-乳酸的D-乳酸氧化酶和任选的用于糖化所述有机废物的一种或多种糖类降解酶；和

(c)发酵罐，其包含所述只产生L-乳酸的产乳酸微生物，

其中在所述处理罐中用所述D-乳酸氧化酶并任选地用所述一种或多种糖类降解酶处理所述有机废物，并将处理过的废物转移到所述发酵罐用于生产L-乳酸。

42.权利要求39所述的***，其中所述有机废物是食品废物。

43.权利要求39所述的***，其中所述D-乳酸氧化酶来自于氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)。

44.权利要求40所述的***，其中所述一种或多种糖类降解酶包含葡糖淀粉酶。

45.一种用于表达D-乳酸氧化酶的核酸构建物，其包含SEQ ID NO：9中示出的编码D-乳酸氧化酶的核酸序列，所述核酸序列可操作连接到包含选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的启动子的至少一个调控序列。

46.权利要求45所述的核酸构建物，其选自SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。