CN113667643A - 一种用于捕获循环肿瘤细胞的免疫磁球组合及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了一种用于捕获循环肿瘤细胞的免疫磁球组合及制备方法，用于检测已经脱离肺癌实体瘤进入外周血中的循环肿瘤细胞，其特征在于，具有EGFR免疫磁球、Vimentin免疫脂质磁球、FA免疫脂质磁球，能够对血液中的循环肿瘤细胞进行特异性靶向快速分离从而捕获循环肿瘤细胞，具有较高的肺癌细胞亲和能力和比较稳定的捕获能力，能够实现捕获缺乏EpCAM蛋白的循环肿瘤细胞或已经发生上皮间质转化的循环肿瘤细胞，因此通过本申请能够对血液中非常稀少的循环肿瘤细胞进行精确、快速捕获，从而提供肿瘤形成、分化、转移的本质信息。
Description
技术领域
本申请涉及生物技术与生物医学领域，具体涉及一种用于捕获循环肿瘤细胞的免疫磁球组合及制备方法。
背景技术
癌症的晚期经常发生转移，肿瘤的转移导致约90％的癌症死亡，使其成为了癌症治疗的焦点。肿瘤细胞可以从原发部位迁移到循环***(例如：血液，淋巴液和脑脊液等)然后扩散到其他器官。此时癌细胞亚群离开原发肿瘤，通过血液等循环迁移并定植到新的脏器组织形成新的肿瘤块。因此，早期识别通过血液循环传播的癌细胞，及时准确地检测稀有和极少数循环肿瘤细胞，对于癌症治疗的成功和改善患者的生存是至关重要的。
然而，血液中的循环肿瘤细胞的丰度极低，检测循环肿瘤细胞是一项挑战，从患者获得的7.5mL血液样本中识别和捕获极少数的肿瘤细胞存在一定的困难。以往常用于检测癌症患者血液中循环肿瘤细胞的技术较成熟的为CellSearch，其他各种捕获技术，包括免疫磁珠、功能化微纳米结构、活体流式细胞仪等也都正在发展与应用中。其中，基于免疫化学的磁性纳米颗粒能够高效率和高选择性地识别和捕获全血中的循环肿瘤细胞。CellSearch就是基于抗体包被的磁性纳米颗粒连接上皮细胞粘附分子捕获循环肿瘤细胞的技术。考虑到基于抗体的循环肿瘤细胞捕获技术的局限性，例如不能够捕获缺乏EpCAM蛋白的循环肿瘤细胞或已经发生上皮间质转化的循环肿瘤细胞。
因此，本领域技术人员提供了一种用于捕获循环肿瘤细胞的免疫磁球组合及制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
发明内容
本申请是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种用于捕获循环肿瘤细胞的免疫磁球组合及制备方法，本申请的磁珠经蛋白抗体修饰，能够实现捕获缺乏EpCAM蛋白的循环肿瘤细胞或已经发生上皮间质转化的循环肿瘤细胞。
本申请提供了一种用于捕获循环肿瘤细胞的免疫磁球组合，用于检测已经脱离肺癌实体瘤进入外周血中的循环肿瘤细胞，包括EGFR免疫脂质磁球、Vimentin免疫脂质磁球和FA免疫脂质磁球，其中EGFR免疫脂质磁球、Vimentin免疫脂质磁球和FA免疫脂质磁球的数量比为1:0.6:0.7～1:1.5:1.4。
进一步地，一种用于捕获循环肿瘤细胞的免疫磁球组合，EGFR免疫脂质磁球、Vimentin免疫脂质磁球和FA免疫脂质磁球的数量比为1:1:1。
进一步地，一种用于捕获循环肿瘤细胞的免疫磁球组合的制备方法，EGFR免疫脂质磁球的制备过程如下：
S1：将Fe3O4磁性纳米颗粒与二氯甲烷混合，得到磁球悬浮液；所述Fe3O4磁性纳米颗粒的质量与二氯甲烷的体积比为300mg:3.53ml；
S2：在磷酸缓冲盐溶液中加入胆固醇、壳聚糖十六烷基季胺盐、二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵、1,2-二油酰基卵磷脂，得到混合溶液；其中胆固醇、壳聚糖十六烷基季胺盐、二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵、1,2-二油酰基卵磷脂的质量比为1:1:1:1；
S3：将磁球悬浮液和混合溶液混合，然后使用探针式超声波仪对其进行超声振荡，使其完全乳化，得到脂质磁球溶液；其中磁球悬浮液和混合溶液的体积比为1:1～1:1.3；
S4：取0.6mgEGFR多肽溶于10mL异丙醇中，加入到步骤S3中得到的脂质磁球溶液，保持3.9～4.1℃匀速搅拌24小时，即可获得EGFR修饰的脂质磁球；其中异丙醇与脂质磁球溶液体积比为1:6～1:11。
进一步地，一种用于捕获循环肿瘤细胞的免疫磁球组合的制备方法，还包括Vimentin免疫脂质磁球，用于捕获所述循环肿瘤细胞，其制备过程如下：
S1：将Fe3O4磁性纳米颗粒与二氯甲烷混合，得到磁球悬浮液；所述Fe3O4磁性纳米颗粒的质量与二氯甲烷的体积比为300mg:3.53ml；
S2：在磷酸缓冲盐溶液中加入胆固醇、壳聚糖十六烷基季胺盐、二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵、1,2-二油酰基卵磷脂，得到混合溶液；其中胆固醇、壳聚糖十六烷基季胺盐、二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵、1,2-二油酰基卵磷脂的质量比为1:1:1:1；
S3：将磁球悬浮液和混合溶液混合，然后使用探针式超声波仪对其进行超声振荡，使其完全乳化，得到脂质磁球溶液；其中磁球悬浮液和混合溶液的体积比为1:1～1:1.3；
S4：取0.6mg上皮细胞黏附分子溶于10mL异丙醇中，加入到步骤S3中得到的脂质磁球溶液，保持3.9～4.1℃匀速搅拌24小时，即可获得Vimentin免疫脂质磁球；其中异丙醇与脂质磁球溶液体积比为1:6～1:11。
进一步地，一种用于捕获循环肿瘤细胞的免疫磁球组合的制备方法，还包括FA免疫脂质磁球，用于捕获所述循环肿瘤细胞，其制备过程如下：
S1：将Fe3O4磁性纳米颗粒与二氯甲烷混合，得到磁球悬浮液；所述Fe3O4磁性纳米颗粒的质量与二氯甲烷的体积比为300mg:3.53ml；
S2：在磷酸缓冲盐溶液中加入胆固醇、壳聚糖十六烷基季胺盐、二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵、1,2-二油酰基卵磷脂，得到混合溶液；其中胆固醇、壳聚糖十六烷基季胺盐、二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵、1,2-二油酰基卵磷脂的质量比为1:1:1:1；
S3：将磁球悬浮液和混合溶液混合，然后使用探针式超声波仪对其进行超声振荡，使其完全乳化，得到脂质磁球溶液；其中磁球悬浮液和混合溶液的体积比为1:1～1:1.3；
S4：取0.6mg叶酸溶于10mL异丙醇中，加入到步骤S3中得到的脂质磁球溶液，保持3.9～4.1℃匀速搅拌24小时，即可获得FA免疫脂质磁球；其中异丙醇与脂质磁球溶液体积比为1:6～1:11。
进一步地，一种用于捕获循环肿瘤细胞的免疫磁球组合的制备方法，步骤S2中加入的磷酸缓冲盐溶液浓度为0.1mol/L，pH为7.4。
进一步地，一种用于捕获循环肿瘤细胞的免疫磁球组合的制备方法，步骤S3中进行的超声震荡为间隔震荡，在温度25℃条件下，超声2S，间隔1S，总时间6min。
本申请在采用了上述方案后，其有益效果在于：
根据本申请所涉及的肺癌用于捕获循环肿瘤细胞的免疫磁球组合及其制备方法，因为具有EGFR免疫磁球、Vimentin免疫脂质磁球、FA免疫脂质磁球，能够对血液中的循环肿瘤细胞进行特异性靶向快速分离从而捕获循环肿瘤细胞，具有较高的肺癌细胞亲和能力和比较稳定的捕获能力。另外，免疫磁珠为经过上皮细胞黏附分子修饰的磁性纳米微球，它对体液肿瘤细胞的捕获能力强，对细胞的毒性较低。
此外，在免疫磁球的制备过程中，EGFR多肽、上皮细胞黏附分子和叶酸是最后添加进去的，避免了提前添加后的后续步骤对EGFR多肽、上皮细胞黏附分子的活性产生不利的影响使其活力降低从而影响所制备的免疫磁球对肺癌循环肿瘤细胞的捕获效率的问题，因此免疫磁球具有高活性、高纯度且能够强特异性、高灵敏度、最大程度上捕获受检者外周血中的循环肿瘤细胞，尽可能减少循环肿瘤细胞漏捕。此外，整个免疫磁球的制备过程在室温条件下即可完成，制备工艺简单，生产成本较低。
附图说明
为了使本申请所述的内容更加便于理解，下面结合附图与具体实施方式对本申请所述的技术方案做进一步的说明，但是本申请不仅限于此。
图1为本申请的原子力显微镜观察图；
图2为本申请的紫外光谱图。
具体实施方式
为了使本申请实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，以下实施例结合附图对本申请一种用于捕获循环肿瘤细胞的免疫磁球组合及制备方法作具体阐述。
实施例1
本实施例提供了一种用于捕获循环肿瘤细胞的免疫磁球组合，用于检测已经脱离肺癌实体瘤进入外周血中的循环肿瘤细胞，包括EGFR免疫脂质磁球、Vimentin免疫脂质磁球和FA免疫脂质磁球，其中EGFR免疫脂质磁球、Vimentin免疫脂质磁球和FA免疫脂质磁球的数量比为1:1:1。
一种用于捕获循环肿瘤细胞的免疫磁球组合的制备方法，EGFR免疫脂质磁球的制备过程如下：
S1：将Fe3O4磁性纳米颗粒与二氯甲烷混合，得到磁球悬浮液；所述Fe3O4磁性纳米颗粒的质量与二氯甲烷的体积比为300mg:3.53ml；
S2：在浓度为0.1mol/L、pH为7.4的磷酸缓冲盐溶液中加入胆固醇、壳聚糖十六烷基季胺盐、二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵、1,2-二油酰基卵磷脂，得到混合溶液；其中胆固醇、壳聚糖十六烷基季胺盐、二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵、1,2-二油酰基卵磷脂的质量比为1:1:1:1；
S3：将磁球悬浮液和混合溶液混合，然后使用探针式超声波仪对其进行超声振荡，使其完全乳化，得到脂质磁球溶液；其中磁球悬浮液和混合溶液的体积比为1:1～1:1.3；超声震荡为间隔震荡，在温度25℃条件下，超声2S，间隔1S，总时间6min；
S4：取0.6mgEGFR多肽溶于10mL异丙醇中，加入到步骤S3中得到的脂质磁球溶液，保持3.9～4.1℃匀速搅拌24小时，即可获得EGFR修饰的脂质磁球；其中异丙醇与脂质磁球溶液体积比为1:6～1:11。
一种用于捕获循环肿瘤细胞的免疫磁球组合的制备方法，还包括Vimentin免疫脂质磁球，用于捕获所述循环肿瘤细胞，其制备过程如下：
S1：将Fe3O4磁性纳米颗粒与二氯甲烷混合，得到磁球悬浮液；所述Fe3O4磁性纳米颗粒的质量与二氯甲烷的体积比为300mg:3.53ml；
S2：在浓度为0.1mol/L、pH为7.4的磷酸缓冲盐溶液中加入胆固醇、壳聚糖十六烷基季胺盐、二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵、1,2-二油酰基卵磷脂，得到混合溶液；其中胆固醇、壳聚糖十六烷基季胺盐、二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵、1,2-二油酰基卵磷脂的质量比为1:1:1:1；
S3：将磁球悬浮液和混合溶液混合，然后使用探针式超声波仪对其进行超声振荡，使其完全乳化，得到脂质磁球溶液；其中磁球悬浮液和混合溶液的体积比为1:1～1:1.3；超声震荡为间隔震荡，在温度25℃条件下，超声2S，间隔1S，总时间6min；
S4：取0.6mg上皮细胞黏附分子溶于10mL异丙醇中，加入到步骤S3中得到的脂质磁球溶液，保持3.9～4.1℃匀速搅拌24小时，即可获得Vimentin免疫脂质磁球；其中异丙醇与脂质磁球溶液体积比为1:6～1:11。
一种用于捕获循环肿瘤细胞的免疫磁球组合的制备方法，还包括FA免疫脂质磁球，用于捕获所述循环肿瘤细胞，其制备过程如下：
S1：将Fe3O4磁性纳米颗粒与二氯甲烷混合，得到磁球悬浮液；所述Fe3O4磁性纳米颗粒的质量与二氯甲烷的体积比为300mg:3.53ml；
S2：在浓度为0.1mol/L、pH为7.4的磷酸缓冲盐溶液中加入胆固醇、壳聚糖十六烷基季胺盐、二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵、1,2-二油酰基卵磷脂，得到混合溶液；其中胆固醇、壳聚糖十六烷基季胺盐、二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵、1,2-二油酰基卵磷脂的质量比为1:1:1:1；
S3：将磁球悬浮液和混合溶液混合，然后使用探针式超声波仪对其进行超声振荡，使其完全乳化，得到脂质磁球溶液；其中磁球悬浮液和混合溶液的体积比为1:1～1:1.3；超声震荡为间隔震荡，在温度25℃条件下，超声2S，间隔1S，总时间6min；
S4：取0.6mg叶酸溶于10mL异丙醇中，加入到步骤S3中得到的脂质磁球溶液，保持3.9～4.1℃匀速搅拌24小时，即可获得FA免疫脂质磁球；其中异丙醇与脂质磁球溶液体积比为1:6～1:11。
应用例
1、免疫磁球的材料学表征
1.1对EGFR、Vimentin和FA免疫脂质磁球进行原子力显微镜观察，其结果如图1所示。
由图可知，三种免疫磁性微球为大小不一的球形，没有发生团聚现象，说明免疫磁性微球稳定性较好，形状较规则，大小在200nm左右，具有脂质体的囊泡特性。
1.2对EGFR、Vimentin和FA免疫脂质磁球进行紫外光谱测试，其结果如图2所示。
图中可以发现，三种抗体免疫磁球约在276nm处出现一个宽的吸收峰，表明磁球表面上确实接上了EGFR、Vimentin和FA。
2、免疫磁球的捕获效率实验
选取26例经病理学确诊的肺癌患者的血液样，患者年龄36～75岁，平均年龄55.3岁。样本采集方法是用医用抗凝采血管采集患者外周血7.5mL，抗凝剂为EDTA·K2。所有选取的病例均履行告知义务并签署知情同意书。
医用抗凝采血管采集7.5mL外周血，抗凝剂为EDTA·K2、4℃保存，在存储、处理和运输过程中避免冷冻，48h内进行检测。首先将血液经1500r/min离心10min，取上清液使用本申请实施例1所制免疫脂质磁球组合捕获循环肿瘤细胞，并将捕获到的循环肿瘤细胞进行检测，然后与组织检测结果对比，结果如表1所示：
表1组织检测与循环肿瘤细胞检测基因突变情况比对
注：“+”基因检测结果呈阳性；“-”基因检测结果呈阴性
结果表明联合使用三种磁球对循环肿瘤细胞有更高的检出率。本申请通过联合使用EGFR、Vimentin和FA三种免疫脂质磁球作为循环肿瘤细胞捕获的靶点，用以增加循环肿瘤细胞检测的敏感性是新型实用的检测手段。通过这个策略，更多异质性循环肿瘤细胞能够被捕获，可用于早期癌症的诊断及其复发评估。
以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡依本申请范围所做的均等变化与修饰，皆应属本申请的涵盖范围。此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (7)
1.一种用于捕获循环肿瘤细胞的免疫磁球组合，其特征在于：包括EGFR免疫脂质磁球、Vimentin免疫脂质磁球和FA免疫脂质磁球，其中EGFR免疫脂质磁球、Vimentin免疫脂质磁球和FA免疫脂质磁球的数量比为1:0.6:0.7～1:1.5:1.4。
2.根据权利要求1所述的一种用于捕获循环肿瘤细胞的免疫磁球组合，其特征在于：EGFR免疫脂质磁球、Vimentin免疫脂质磁球和FA免疫脂质磁球的数量比为1:1:1。
3.根据权利要求1所述的一种用于捕获循环肿瘤细胞的免疫磁球组合的制备方法，其特征在于：EGFR免疫脂质磁球的制备过程如下：
S1：将Fe3O4磁性纳米颗粒与二氯甲烷混合，得到磁球悬浮液；所述Fe3O4磁性纳米颗粒的质量与二氯甲烷的体积比为300mg:3.53ml；
S2：在磷酸缓冲盐溶液中加入胆固醇、壳聚糖十六烷基季胺盐、二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵、1,2-二油酰基卵磷脂，得到混合溶液；其中胆固醇、壳聚糖十六烷基季胺盐、二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵、1,2-二油酰基卵磷脂的质量比为1:1:1:1；
S3：将磁球悬浮液和混合溶液混合，然后使用探针式超声波仪对其进行超声振荡，使其完全乳化，得到脂质磁球溶液；其中磁球悬浮液和混合溶液的体积比为1:1～1:1.3；
S4：取0.6mgEGFR多肽溶于10mL异丙醇中，加入到步骤S3中得到的脂质磁球溶液，保持3.9～4.1℃匀速搅拌24小时，即可获得EGFR修饰的脂质磁球；其中异丙醇与脂质磁球溶液体积比为1:6～1:11。
4.根据权利要求1所述的一种用于捕获循环肿瘤细胞的免疫磁球组合的制备方法，其特征在于：Vimentin免疫脂质磁球的制备过程如下：
S1：将Fe3O4磁性纳米颗粒与二氯甲烷混合，得到磁球悬浮液；所述Fe3O4磁性纳米颗粒的质量与二氯甲烷的体积比为300mg:3.53ml；
S2：在磷酸缓冲盐溶液中加入胆固醇、壳聚糖十六烷基季胺盐、二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵、1,2-二油酰基卵磷脂，得到混合溶液；其中胆固醇、壳聚糖十六烷基季胺盐、二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵、1,2-二油酰基卵磷脂的质量比为1:1:1:1；
S3：将磁球悬浮液和混合溶液混合，然后使用探针式超声波仪对其进行超声振荡，使其完全乳化，得到脂质磁球溶液；其中磁球悬浮液和混合溶液的体积比为1:1～1:1.3；
S4：取0.6mg上皮细胞黏附分子溶于10mL异丙醇中，加入到步骤S3中得到的脂质磁球溶液，保持3.9～4.1℃匀速搅拌24小时，即可获得Vimentin免疫脂质磁球；其中异丙醇与脂质磁球溶液体积比为1:6～1:11。
5.根据权利要求1所述的一种用于捕获循环肿瘤细胞的免疫磁球组合的制备方法，其特征在于：FA免疫脂质磁球的制备过程如下：
S1：将Fe3O4磁性纳米颗粒与二氯甲烷混合，得到磁球悬浮液；所述Fe3O4磁性纳米颗粒的质量与二氯甲烷的体积比为300mg:3.53ml；
S2：在磷酸缓冲盐溶液中加入胆固醇、壳聚糖十六烷基季胺盐、二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵、1,2-二油酰基卵磷脂，得到混合溶液；其中胆固醇、壳聚糖十六烷基季胺盐、二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵、1,2-二油酰基卵磷脂的质量比为1:1:1:1；
S3：将磁球悬浮液和混合溶液混合，然后使用探针式超声波仪对其进行超声振荡，使其完全乳化，得到脂质磁球溶液；其中磁球悬浮液和混合溶液的体积比为1:1～1:1.3；
S4：取0.6mg叶酸溶于10mL异丙醇中，加入到步骤S3中得到的脂质磁球溶液，保持3.9～4.1℃匀速搅拌24小时，即可获得FA免疫脂质磁球；其中异丙醇与脂质磁球溶液体积比为1:6～1:11。
6.根据权利要求3-5任一所述的一种用于捕获循环肿瘤细胞的免疫磁球组合的制备方法，其特征在于：步骤S2中加入的磷酸缓冲盐溶液浓度为0.1mol/L，pH为7.4。
7.根据权利要求3-5任一所述的一种用于捕获循环肿瘤细胞的免疫磁球组合的制备方法，其特征在于：步骤S3中进行的超声震荡为间隔震荡，在温度25℃条件下，超声2S，间隔1S，总时间6min。
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