CN110812497B - 特异性捕获CTCs的仿生型Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子及制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于CTCs特异性捕获的仿生型Janus磁‑介孔二氧化硅纳米粒子及其制备方法和应用。其制备方法包括以下步骤：1)制备羧基化的Janus磁‑介孔二氧化硅纳米粒子；2)制备融合细胞膜；3)将制得的融合细胞膜包覆在Janus磁‑介孔二氧化硅纳米粒子表面，得到仿生型Janus磁‑介孔二氧化硅纳米粒子。本发明的仿生型Janus磁‑介孔二氧化硅纳米粒子，其核心Janus磁‑介孔二氧化硅纳米粒子的非对称性结构和棒状形貌，具有大的比表面积；通过在其表面包覆融合细胞膜，能借助白细胞在循环***中不会聚集的特性，可减少对血细胞的非特异性吸附，能很好的应用于CTCs的检测。

Description

特异性捕获CTCs的仿生型Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子及 制备方法和应用
技术领域
本发明涉及纳米材料领域，特别涉及一种用于CTCs特异性捕获的仿生型Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子及制备方法和应用。
背景技术
癌症已成为严重威害人类生命健康的重要疾病，超过90％的癌症患者死于肿瘤的转移。在肿瘤转移过程中，癌细胞从原发肿瘤灶脱落，进入血液或淋巴循环***，成为循环肿瘤细胞(CTCs)。这些CTCs会在循环***中存活，并进一步在远端器官发展为转移肿瘤。因此，CTCs作为肿瘤原发灶与转移灶之间的重要媒介，是研究肿瘤转移发展过程、监控疗效和评价患者预后的黄金切入点。然而，CTCs在外周血中的丰度极低，分离和检测CTCs具有非常大的挑战性。
近些年来，以纳米材料为基础的CTCs捕获技术，因其操作简单方便，功能丰富、回收率高以及对细胞损伤小等特点，在CTCs的检测上展现了光明的应用前景。其中，免疫荧光磁球不仅能够特异性结合CTCs并通过磁性分离作用实现CTCs的捕获，还可以对捕获的CTCs进行荧光信号分析，因此，在CTCs检测应用上极具转化潜力。为进一步提高磁性纳米粒子的荧光信号强度，增强其与CTCs的结合能力，申请人在先前的专利201611270207.6中，公开了一种纳米载药体系及制备和应用其中，具体公开制备出了尺寸精确可控、具有不对称性质的磁-介孔二氧化硅纳米粒子，即Janus型磁-介孔二氧化硅纳米粒子(Janus Fe3O4-mSiO2)。在这种复合型组份中，介孔二氧化硅功能单元不仅提高了纳米粒子的生物相容性，同时极大地增加了纳米粒子的比表面积，既提高了纳米粒子对CTCs的吸附能力，又为荧光探针的结合以及功能基团的修饰提供了有利空间。此外，这种Janus Fe3O4-mSiO2具有明显的非对称结构优势，既磁球元件裸露在外，与介孔二氧化硅元件功能上互不干涉，能够很好地保持磁球原有的磁性能，为CTCs的磁分离提供了便利。然而，临床上对CTCs的检测技术要求更高。既要求纳米粒子对CTCs具有足够的灵敏性，能够从数以亿计的背景细胞中尽可能多地分离出极其稀少的CTCs，又要求纳米粒子具有极高的特异性，能够捕获较纯的CTCs而尽量降低背景细胞的干扰。因此，Janus Fe3O4-mSiO2的构筑需要更进一步地优化，以满足临床对高特异性，高灵敏度的CTCs检测技术的迫切需求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种用于CTCs特异性捕获的仿生型Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子及制备方法和应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：提供一种用于CTCs 特异性捕获的仿生型Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子，其包括Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子以及包覆在其表面的融合细胞膜。
本发明还提供一种如上所述的仿生型Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
1)制备羧基化的Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子；
2)制备融合细胞膜；
3)将制得的融合细胞膜包覆在Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子表面，得到仿生型Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子。
优选的是，所述步骤1)具体包括：
首先将磁性前驱体、聚丙烯酸通过高温水解法制备得到聚丙烯酸修饰的磁性纳米球，并纯化；
然后以磁性纳米粒子为基底，正硅酸四乙酯为硅源，十六烷基三甲基溴化铵为表面活性剂，通过溶胶-凝胶法制备得到Janus型磁-介孔二氧化硅纳米粒子；
随后将得到的Janus型磁-介孔二氧化硅纳米粒子与硅烷偶联剂反应，制备得到氨基化的纳米粒子，并对其进行羧基化修饰，制备带负电的纳米粒子，即为所需要的羧基化的Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子。
优选的是，所述步骤2)具体包括：
预先构建小鼠4T1乳腺癌肿瘤模型，并从该模型的肿瘤组织和血清中收集4T1细胞和白细胞，然后加入裂解液用匀浆器破裂细胞，进行梯度离心收集4T1细胞膜、中性粒细胞膜、淋巴细胞膜和巨噬细胞膜材料，并混合上述细胞膜材料，随后通过脂质体挤出仪制备出融合细胞膜。
优选的是，所述步骤3)具体包括：
将制备得到的羧基化的Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子与融合细胞膜在生理条件下混合均匀，利用脂质体挤出仪的多次挤压制备得到所述仿生型 Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子。
本发明还提供一种仿生型Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子在CTCs特异性检测中的应用。
本发明的有益效果是：本发明的仿生型Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子，其核心Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子的非对称性结构和棒状形貌，具有大的比表面积；通过在其表面包覆融合细胞膜，能借助白细胞在循环***中不会聚集的特性，可减少仿生型Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子对血细胞的非特异性吸附，能很好的应用于CTCs的检测。
附图说明
图1为本发明的实施例3中的仿生型Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒的透射电镜图片；
图2为本发明的实施例3中的zeta电势检测分析结果；
图3为本发明的实施例3中的生物安全性评价结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
下述实施例中涉及到的试剂均为市售产品，不同厂家及型号的试剂对于结果并不会带来明显的差别。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
实施例1
提供一种用于CTCs特异性捕获的仿生型Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子，其包括Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子以及包覆在其表面的融合细胞膜。
实施例2
提供实施例1所述的仿生型Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
1)制备羧基化的Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子(Janus Fe3O4-mSiO2-COOH)：
首先将磁性前驱体、聚丙烯酸(PAA)通过高温水解法制备得到聚丙烯酸修饰的磁性纳米球，并纯化；
然后以磁性纳米粒子为基底，正硅酸四乙酯(TEOS)为硅源，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)为表面活性剂和模板剂，通过溶胶-凝胶法制备得到Janus 型磁-介孔二氧化硅纳米粒子；
随后将得到的Janus型磁-介孔二氧化硅纳米粒子与硅烷偶联剂(APS)反应，制备得到氨基化的纳米粒子，并对其进行羧基化修饰，制备带负电的纳米粒子，即为所需要的羧基化的Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子。
在进一步优选的实施例中，步骤1)具体包括：
1-1)将磁性前驱体FeCl30.13g、聚丙烯酸PAA(9000)0.576g、二甘醇DEG 34ml，在氮气保护下，37℃下搅拌30min，转速550rpm，然后加热至260℃继续搅拌30min，转速550rpm，制得第一反应溶液；
在第一反应溶液中注入67.5℃的NaOH(20wt％)的二甘醇溶液3.8ml，继续搅拌反应，转速为550rpm，反应时间为1h，然后进行分离、水洗、干燥(纯化)，得到磁性粒子；
1-2)将制得的磁性粒子配制成8.6mg/ml的水溶液，取1ml磁性粒子水溶液加入到含表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵的水溶液(5mg/ml，10ml)中，充分分散，加入弱碱性试剂氨水(25％-28％)500ml，然后缓慢加入正硅酸乙酯 0.03ml，搅拌30min，采用乙醇洗去表面活性剂，制得磁-介孔二氧化硅纳米棒载体；
1-2)将制得的磁-介孔二氧化硅纳米棒载体溶于10ml乙醇中，超声分散后加入硅烷偶联剂1ml，反应液105℃温度下回流4h，分离、洗涤、干燥，制备得到氨基化的磁-介孔二氧化硅纳米棒载体；将氨基化的磁-介孔二氧化硅纳米棒载体加入到丁二酸酐的乙醇溶液(50mg/ml，10ml)，25℃搅拌24h，反应产物经磁性分离、洗涤，制备得羧基化载体，即JanusFe3O4-mSiO2-COOH；
2)制备融合细胞膜：
预先构建小鼠4T1乳腺癌肿瘤模型，并从该模型的肿瘤组织和血清中收集4T1细胞和白细胞，然后加入裂解液用匀浆器破裂细胞，进行梯度离心收集4T1细胞膜、中性粒细胞膜、淋巴细胞膜和巨噬细胞膜材料，并以不同比例混合上述细胞膜材料，随后通过脂质体挤出仪制备出粒径尺寸相对均一的融合细胞膜。
3)将制得的融合细胞膜包覆在Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子表面，得到仿生型Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子：
将制备得到的羧基化的Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子与融合细胞膜在生理条件下混合均匀，利用脂质体挤出仪的多次挤压制备得到所述仿生型 Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子。其中，通过调节羧基化的Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子与融合细胞膜的质量比可得到优选的组分配比。
实施例3
对实施例2得到的仿生型Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子进行性能评价
1、参照图1，为仿生型Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒的透射电镜图片，可以看出其呈棒状形貌。
2、羧基化的Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子(Janus Fe3O4-mSiO2-COOH)、融合细胞膜(TWM)、仿生型Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子(TWM-Janus Fe3O4-mSiO2)的zeta电势检测分析：参照图2为其检测结果，通过对材料zeta电势的表征，证明融合细胞膜成功包覆于纳米粒子表面。
3、生物安全性评价：
采用不同剂量(1.5625,3.125，6.25,12.5,50μg/mL)的仿生型Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子(TWM-Janus Fe3O4-mSiO2)与4T1细胞共孵育24h。并设置对比例，对比例为不同剂量(1.5625,3.125，6.25,12.5,50μg/mL)的Janus磁- 介孔二氧化硅纳米粒子(JanusFe3O4-mSiO2)与4T1细胞共孵育24h。其中对照组(CON)不加纳米粒子。通过SRB法检测得到仿生型Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子与Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子的细胞存活率均在90％以上，在细胞水平上证明了该仿生纳米粒子具有极好的生物安全性。参照图3。
4、对CTCs的特异性捕获能力：
采用不同浓度(6.25,12.5,50,100,150μg/mL)的仿生型Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子与1×105个4T1细胞的混合。在孵育第5分钟，15分钟，20分钟， 25分钟，30分钟后，对样品中的细胞进行磁性分离。随后对分离的细胞进行重悬，并利用细胞计数器对细胞计数。试验结果发现仿生型Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子的最佳使用浓度为50μg/mL，反应时间为20分钟，此时对 4T1细胞的捕获效率位75％，说明仿生型Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子对肿瘤细胞具有较好的选择性。
5、与非CTCs的非特异性吸附：
采用不同浓度(6.25,12.5,50,100,150μg/mL)的仿生型Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子与1×105个白细胞的混合。同样在孵育第5分钟，15分钟，20分钟，25分钟，30分钟后，对样品中的细胞进行磁性分离，重悬和细胞计数。试验结果发现纳米粒子的最佳使用浓度为50μg/mL，反应时间为20分钟，此时白细胞的捕获效率为11％。说明能仿生型Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子与白细胞的非特异性吸附较低。
本实施例中，仿生型Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子，其核心Janus磁- 介孔二氧化硅纳米粒子的非对称性结构和棒状形貌，具有大的比表面积。通过在其表面包覆融合细胞膜，能借助白细胞在循环***中不会聚集的特性，可减少仿生型Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子对血细胞的非特异性吸附。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (4)

1.一种用于CTCs特异性捕获的仿生型Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子，其特征在于，其包括Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子以及包覆在其表面的融合细胞膜；
所述的仿生型Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
1)制备羧基化的Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子；
2)制备融合细胞膜；
3)将制得的融合细胞膜包覆在Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子表面，得到仿生型Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子；
所述步骤2)具体包括：
预先构建小鼠4T1乳腺癌肿瘤模型，并从该模型的肿瘤组织和血清中收集4T1细胞和白细胞，然后加入裂解液用匀浆器破裂细胞，进行梯度离心收集4T1细胞膜、中性粒细胞膜、淋巴细胞膜和巨噬细胞膜材料，并混合上述细胞膜材料，随后通过脂质体挤出仪制备出融合细胞膜。
2.根据权利要求1所述的仿生型Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述步骤1)具体包括：
首先将磁性前驱体、聚丙烯酸通过高温水解法制备得到聚丙烯酸修饰的磁性纳米球，并纯化；
然后以磁性纳米球 为基底，正硅酸四乙酯为硅源，十六烷基三甲基溴化铵为表面活性剂，通过溶胶-凝胶法制备得到Janus型磁-介孔二氧化硅纳米粒子；
随后将得到的Janus型磁-介孔二氧化硅纳米粒子与硅烷偶联剂反应，制备得到氨基化的纳米粒子，并对其进行羧基化修饰，制备带负电的纳米粒子，即为所需要的羧基化的Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子。
3.根据权利要求2所述的仿生型Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述步骤3)具体包括：
将制备得到的羧基化的Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子与融合细胞膜在生理条件下混合均匀，利用脂质体挤出仪的多次挤压制备得到所述仿生型Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子。
4.如权利要求1-3中任意一项所述的仿生型Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子在CTCs特异性检测中的应用，其用于非疾病诊断目的。
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