CN114747541B - 一种psgl-1人源化非人类动物模型的构建方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种PSGL‑1人源化非人类动物模型的构建方法及应用。本发明利用CRISPR/Cas9技术,在非人类动物的Rosa26loci位点定点敲入人PSGL‑1基因,构建可以表达人源PSGL‑1的非人类动物模型。通过相关实验,分别在核酸水平和蛋白水平上说明本发明成功构建了人源化PSGL‑1非人类动物模型。利用该非人类动物模型可进行人PSGL‑1蛋白在炎症相关疾病发病过程中的研究,并实现人源化PSGL‑1抗体药物的安全性和有效性评价。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,具体而言,本发明涉及一种PSGL-1人源化非人 类动物模型的构建方法及应用。
背景技术
白细胞束缚和滚动是炎症反应发生的起始步骤,体内发炎血管的束缚和滚 动主要是由选择素(selectin)介导的。而P-选择蛋白糖蛋白配体-1(PSGL-1) 是一种持续表达在所有白细胞(包括单核细胞,粒细胞,淋巴细胞某些CD34+ 干细胞)表面的,能够和选择素结合的二聚体型,粘蛋白型糖蛋白配体。选择 素有三个亚型,包括P-selectin,E-selectin和L-selectin,其中P-selectin表达于激 活的血小板和血管内皮细胞表面,E-selectin表达于激活的内皮细胞表面,L- selectin表达于大部分白细胞表面。PSGL-1能与三种选择素结合,但是与P- selectin结合能力最强。PSGL-1与激活的血管内皮表面P-selectin/E-selectin结合 之后启动白细胞与血管内皮的粘附和滚动,促进白细胞向内膜下的浸润,促进 炎症因子的分泌;PSGL-1与活化的血小板表面的P-selectin结合,导致白细胞- 血小板复合体的形成,进一步促进炎症细胞的粘附和浸润;PSGL-1与T细胞表 面的L-selectin的结合能调节T细胞的归巢,促进后续炎症因子的分泌。
人PSGL-1蛋白的结构包括结合区,跨膜区和胞质区(PSGL-1 as a noveltherapeutic target.Constantin G.Drug News Perspect 2004)。粘蛋白在其上形成二硫键结合的同二聚体。人PSGL-1富含丝氨酸,苏氨酸和脯氨酸,并包含15个 十聚体重复序列。残基46、48和51的三个NH2末端酪氨酸位于有利于酪氨酸 硫酸化的阴离子共有序列中。潜在的O-连接的糖基化位点存在于苏氨酸44、57、 69和70中。P-选择素通过与聚簇的酪氨酸硫酸盐和附近的核心2O-聚糖与唾液 酸化的Lewis x(sLex)表位立体定向相互作用,与PSGL-1的N末端结合。类 似地,L-选择蛋白通过与三个硫酸化酪氨酸残基和适当定位的C2-O-sLex O-聚 糖的协同相互作用,以高亲和力与PSGL-1的N末端区域结合。E-选择蛋白-PSGL-1的结合似乎不依赖于硫酸盐化,需要岩藻糖基转移酶使sLex和PSGL-1 糖基化。越来越多的研究表明,PSGL-1和炎症性疾病的发生发展密切相关,如 胰腺炎、结肠炎、缺血再灌注损伤、血栓、动脉粥样硬化等。PSGL-1在炎症相 关疾病中发挥重要作用。
目前已经研发出多个针对人PSGL-1基因靶点的抗体,如Neihulizumab和 SelK-2。然而,由于人PSGL-1基因与动物PSGL-1基因同源性低,存在较大的 差异。这些针对人PSGL-1基因靶点的抗体或者药物并不能识别动物PSGL-1基 因靶点,导致无法用普通野生型动物评价这类抗体的有效性及安全性。故需对 野生型动物的PSGL-1基因进行人源化改造,使其含有人PSGL-1基因,并表达 人PSGL-1蛋白,用于评价抗体或药物的体内有效性及安全性。
发明内容
大多数关于PSGL-1的研究都是基于PSGL-1敲除的非人类动物模型,尚未 见人源化PSGL-1非人类动物模型报道。本发明的目的是提供一种hPSGL-1人 源化非人类动物模型及其构建方法,利用该人源化非人类动物模型可进行人 PSGL-1蛋白在炎症相关疾病发病过程中的研究,并实现人源化PSGL-1抗体药 物的安全性和有效性评价。本发明提供了一种敲入人PSGL-1基因的方式,构建 可以表达人源PSGL-1的非人类动物模型,对实现其它人源基因的定点敲入亦有 参考价值。
本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现:
本发明的第一方面提供了一种基于CRISPR/Cas9技术构建的非人类动物模 型,该模型为人源PSGL-1敲入非人类动物模型。
进一步,所述非人类动物模型敲入位点为Rosa26位点。
进一步,PSGL-1的序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步,所述动物是啮齿动物。
进一步,所述啮齿动物是小鼠。
进一步,所述小鼠是C57BL/6J小鼠。
本发明的第二方面提供了一种用于编辑PSGL-1的sgRNA,所述sgRNA的 序列如SEQID NO.3-13所示。
进一步,sgRNA序列如SEQ ID NO.3-4,SEQ ID NO.10-13所示。
进一步,sgRNA序列如SEQ ID NO.3,SEQ ID NO.10所示。
本发明的第三方面提供了一种表达人源PSGL-1基因的打靶载体,所述打靶 载体包括5’同源臂、人源PSGL-1基因、终止密码子、WPRE元件、Poly A和3’ 同源臂。
进一步,所述PSGL-1的序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第四方面提供了一种用于在Rosa26位点定点敲入人源PSGL-1基 因的CRISPR/Cas9***,所述CRISPR/Cas9***包含本发明第三方面所述的打 靶载体。
本发明的第五方面提供了一种构建人源PSGL-1非人类动物模型的方法,所 述方法通过将PSGL-1引入非人类动物的单细胞胚胎或胚胎干细胞的基因组来修 饰非人类动物的基因组。
在一些实施方案中,核酸序列可操作性的连接到表达载体中。所述的表达 载体目前已经完全可以通过商购的途径购买获得,例如一些病毒载体、质粒、 噬菌体。
作为可选择的实施方案,表达载体向细胞中的导入可以使用电穿孔法、磷 酸钙法、脂质体法、DEAE葡聚糖法、显微注射、病毒感染、脂质体转染、与 细胞膜透过性肽的结合等周知的方法。
进一步,所述方法包括以下步骤:
(1)构建打靶载体;
(2)制备sgRNA和Cas9 mRNA;
(3)将所述打靶载体、Cas9和sgRNA混合,注射入受精***,并移植 到假孕动物的输卵管中,获得敲入人源PSGL-1的F0代阳性动物;
(4)将F0代阳性动物与野生型动物杂交,获得F1代阳性杂合动物;
(5)将F1代阳性杂合动物自交获得稳定遗传的人源PSGL-1非人类动物模 型。
进一步,敲入位点为Rosa26位点。
进一步,所述Rosa26 loci的基因组序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步,步骤(1)所述的打靶载体包括5’同源臂、人源PSGL-1基因、终 止密码子、WPRE元件、Poly A和3’同源臂。
进一步,所述PSGL-1的序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步,步骤(2)所述的sgRNA序列如SEQ ID NO.3-13所示。
进一步,sgRNA序列如SEQ ID NO.3-4,SEQ ID NO.10-13所示。
进一步,sgRNA序列如SEQ ID NO.3,SEQ ID NO.10所示。
进一步,鉴定敲入人源PSGL-1动物的方法为PCR鉴定。
进一步,PCR鉴定F0代阳性动物所用引物的序列如SEQ ID NO.14-19所示。
PCR鉴定F1代阳性动物所用引物的序列如SEQ ID NO.16-19所示。
PCR鉴定稳定遗传的人源PSGL-1非人类动物模型所用引物的序列如SEQ IDNO.20-23所示。
本发明的第六方面提供了一种获得敲入人源PSGL-1的非人类动物的方法, 饲养本发明第五方面所述的方法构建的人源PSGL-1敲入的模型动物。
进一步,获得人源PSGL-1敲入的模型动物的子代。
进一步,所述动物是啮齿动物。
进一步,所述啮齿动物是小鼠。
进一步,所述小鼠是C57BL/6J小鼠。
本发明的第七方面提供了本发明第五方面所述的方法或本发明第六方面所 述的方法获得的模型动物在筛选预防或治疗炎症相关疾病药物中的应用。
进一步,所述炎症相关疾病包括结肠炎、胰腺炎、腹主动脉瘤、动脉粥硬 化。
本发明的第八方面提供了本发明第五方面所述的方法或本发明第六方面所 述的方法获得的模型动物在药物的安全性和有效性评估中的应用。
进一步,所述药物选自抗体类药物。
本发明的优点和有益效果:本发明提供了一种hPSGL-1人源化非人类动物 模型及其构建方法,利用该人源化非人类动物模型可进行人PSGL-1蛋白在炎症 相关疾病发病过程中的研究,并实现人源化PSGL-1抗体药物的安全性和有效性 评价。
附图说明
图1是人源PSGL-1基因片段定点敲入策略图;
图2是Cas9体外酶切结果分析图;
图3是F0代hPSGL-1小鼠凝胶电泳分析图;其中,3A是检测RD-KI-W32-2(1- 8)小鼠转基因条带的凝胶电泳图,3B是转基因条带阳性小鼠RD-KI-W32-2(2, 3,7,8)5’端和3’敲入条带的凝胶电泳图,3C是检测RD-KI-W32-3(1-11,WT) 小鼠转基因条带的凝胶电泳图,3D是检测转基因条带阳性小鼠RD-KI-W32-3 (4,5,6)5’端和3’敲入条带的凝胶电泳图,3E是DNA条带指示图;
图4是F1代hPSGL-1小鼠凝胶电泳分析图;其中,4A是琼脂糖凝胶电泳检测 5’端***情况图,4B是琼脂糖凝胶电泳检测3’端***情况图;
图5是不同组别小鼠心、脾、肺、肾组织中hPSGL-1mRNA的相对表达水平图;
图6是不同组别小鼠心、肝、脾、肺组织中PSGL-1蛋白表达水平图;其中,6A 是不同组别小鼠心组织中PSGL-1蛋白表达水平图;6B是不同组别小鼠肝组织 中PSGL-1蛋白表达水平图;6C是不同组别小鼠脾组织中PSGL-1蛋白表达水平 图;6D是不同组别小鼠肺组织中PSGL-1蛋白表达水平图。
具体实施方式
本发明提供了一种敲入人PSGL-1基因的方式,构建可以表达人源PSGL-1 的非人类动物模型。
PSGL-1包括野生型、突变型或其片段。该术语涵盖全长,未加工的PSGL- 1,以及源自细胞中加工的任何形式的PSGL-1。该术语涵盖PSGL-1的天然发 生变体(例如剪接变体或等位变体)。该术语涵盖例如PSGL-1基因,人的 PSGL-1以及来自任何其它脊椎动物来源,包括哺乳动物,诸如灵长动物和啮齿 动物(例如小鼠和大鼠)的PSGL-1。作为一种优选的实施方案,在本发明中, PSGL-1为人的基因,位于12q24.11染色体上,基因ID为6404。
本文中使用的术语“基因敲入”,是指是使用不同DNA序列置换染色体基 因座中编码的遗传信息而产生的遗传修饰,即利用基因同源重组,将外源有功 能基因(基因组原先不存在、或已失活的基因),转入细胞与基因组中的同源序 列进行同源重组,***到基因组中,在细胞内获得表达的技术。
本文中使用的术语“人源化”,是指这样的核酸或蛋白质,即,其结构(即 核苷酸或氨基酸序列)包含与在非人动物中天然存在的特定基因或蛋白质的结 构基本或相同对应的部分,还包含不同于在相关特定非人基因或蛋白质中存在 的而与相应的人基因或蛋白质中存在的相当结构较近似地对应的部分。在一些 实施方案中,“人源化”基因是编码基本上具有人多肽的氨基酸序列的多肽的基 因(例如,人蛋白质或其特征性部分)。
本发明提供了一种构建人源PSGL-1非人类动物模型的方法,所述方法通 过将PSGL-1引入非人类动物的单细胞胚胎或胚胎干细胞的基因组来修饰非人 类动物的基因组。
如本文所用,术语“非人类动物模型”是指具有或显示出疾病或病状的特 征的非人类动物。用作动物模型是指动物用于研究疾病或状况的任何用途,例 如用于研究进展或发展或对新疗法或现有疗法的反应的用途。
本文所用,术语“非人类动物”包括非人类脊椎动物,更优选地是哺乳动 物,例如驯养的家畜(例如牛,马,猪),宠物(例如狗,猫),或啮齿动物。
作为可选择的实施方案,所述非人类动物是啮齿动物。
术语“啮齿类”是指***发育类啮齿动物的任何和所有成员(例如,小鼠, 大鼠,松鼠,海狸,土拨鼠,地鼠,田鼠,土拨鼠,仓鼠,豚鼠和刺豚鼠),包 括从中衍生的所有后代的任何后代。
在一些实施方案中,本公开的啮齿动物包括作为非限制性实例的小鼠、大 鼠和仓鼠。在一些实施方案中,本公开的啮齿动物包括作为非限制性实例的小 鼠和大鼠。在一些实施方案中,啮齿动物选自总科鼠总科(Muroidea)。在一些 实施方案中,本公开的啮齿动物来自选自下列的家族:丽仓鼠科(Calomyscidae)(例如,类小鼠的仓鼠)、仓鼠科(Cricetidae)(例如,仓鼠、 新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠科(Muridae)(真小鼠和大鼠、沙鼠、棘鼠、冠 鼠)、马岛鼠科(Nesomyidae)(攀鼠、岩鼠、具尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺山鼠科(Platacanthomyidae)(例如,刺棒睡鼠)和鼹形鼠科 (Spalacidae)(例如,鼹鼠、竹鼠和鼢鼠)。在一些实施方案中,本公开的啮齿 动物选自真小鼠或大鼠(鼠科)、沙鼠、棘鼠和冠鼠。在一些实施方案中,本公 开的小鼠来自鼠科(Muridae)的成员。
在本发明的具体实施方案中,所述啮齿动物是小鼠。
术语“胚胎干细胞”是指衍生自植入前阶段的胚胎的原始(未分化)细 胞,其能够在培养中长时期地***而不分化,并且已知会发育成三个主要胚层 的细胞和组织。
术语“基因组”通常是指以一个或多个核酸序列的形式的遗传信息的完整 集合,包括其文本或计算机表示。基因组可以包括DNA或RNA,取决于其起 源的生物体。大多数生物体具有DNA基因组,而一些病毒具有RNA基因组。
术语“基因组序列”是指存在于基因组中的序列。因为RNA转录自基因 组,所以该术语涵盖存在于生物体的核基因组中的序列,以及存在于从该基因 组转录的RNA(例如mRNA)的cDNA拷贝中的序列。
在本发明一些实施方案中,构建人源PSGL-1非人类动物模型的方法如 下:
(1)构建打靶载体;
(2)制备sgRNA和Cas9 mRNA;
(3)将所述打靶载体、Cas9和sgRNA混合,注射入受精***,并移植 到假孕动物的输卵管中,获得敲入人源PSGL-1的F0代阳性动物;
(4)将F0代阳性动物与野生型动物杂交,获得F1代阳性杂合动物;
(5)将F1代阳性杂合动物自交获得稳定遗传的人源PSGL-1非人类动物 模型。
术语“受精卵”是描述通过两个配子结合形成的细胞,其经历原核发生和 原核融合发育,并起始首次细胞***,或者更广义地,是指由配子产生的发育 中个体。
术语“阳性”意指与其它野生型的标志物量或浓度作为参照物相比,本目 标标志物以大量或高浓度存在。
本发明包括任何本领域可用的用于检测本文所述的人源PSGL-1基因表达 的方法。“检测表达”是指确定内在基因的RNA转录物或其表达产物的量或存 在。检测本公开的内在基因表达,即基因表达概况分析的方法包括基于多核苷 酸杂交分析的方法、基于多核苷酸测序的方法、免疫组化方法、和基于蛋白质 组学的方法。这些方法通常检测本文所述的内在基因的表达产物(例如 mRNA)。在优选的实施方案中,使用基于PCR的方法,例如逆转录PCR(RT- PCR),和基于阵列的方法例如微阵列。“微阵列”指可杂交阵列元件,如,例 如,多核苷酸探针,在基质上的有序排列。
在本发明优选实施方案中,检测本文所述的人源PSGL-1基因表达的方法 为PCR。本发明通过设计合成针对人源PSGL-1的引物来鉴定是否敲入人源 PSGL-1基因。
术语“引物”是指在适宜的条件下(即在四种不同核苷三磷酸以及聚合反 应试剂例如DNA或RNA聚合酶或逆转录酶的存在下)在适宜的缓冲液中并且 在适宜的温度下能够与核酸杂交(也称为“退火”)并且用作核苷酸(RNA或 DNA)聚合反应的起始位点的寡核苷酸。引物的适当的长度取决于引物的预期 用途,但是典型地引物是至少7个核苷酸长度,更典型地范围从10个核苷酸至 30个核苷酸,或甚至更典型地从15个核苷酸至30个核苷酸长度。其他引物可 以是稍微更长的,例如30至50个核苷酸长度。在此上下文中,“引物长度”是指杂交到互补的“靶”序列上并且引发核苷酸合成的寡核苷酸或核酸的部分。短 引物分子总体上需要更冷的温度以与模板形成足够稳定的杂交复合体。引物不 必反映模板的确切序列但是必须是足够互补的以与模板杂交。
本发明提供了前面所述的人源PSGL-1非人类动物模型在筛选预防或治疗 炎症相关疾病药物中的应用。
在一些实施方案中,“炎症相关疾病”是指与炎症相关联的任何和所有异 常,包括慢性和急性炎症性疾病,包括但不限于免疫介导的炎症性疾病 (IMID)和自身免疫性疾病关节炎、肾小球性肾炎、血管炎、牛皮癣关节炎、 全身性红斑狼疮(SLE)、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、牛皮癣、斯蒂尔病 (Still’sdisease)(巨噬细胞活化综合征)、葡萄膜炎、硬皮病、肌炎、莱特尔氏 综合征(Reiter’ssyndrome)、以及韦格纳氏综合征(Wegener’ssyndrome)。与炎 症相关联的病症的其它实例包括,但不限于,寻常痤疮、哮喘、乳糜泻、慢性 ***炎、超敏反应、***症性疾病、炎症性肠病、再灌注损伤、肉瘤样 病、移植排斥、血管炎、间质性膀胱炎、克罗恩病(Crohn’sdisease)、结肠炎、 皮炎、憩室炎、肝炎、帕金森病(Parkinson’s)、动脉粥样硬化、阿尔茨海默病 (Alzeimer)以及癌症。此外,慢性炎症性疾病像类风湿性关节炎、炎症性肠 病、牛皮癣、以及肝病导致“病态行为”,包括疲劳、不适、以及缺乏社交兴 趣。
在本发明中,术语“预防或治疗”,其中,预防是指完全或部分地防止或抑 制疾病的症状或此类症状出现的频率,或者减少获得疾病的给定症状的风险。 在本发明的具体实施例中,所述疾病为炎症相关疾病。预防包括抑制或防止炎 症相关疾病的相关症状、降低炎症相关疾病相关症状的严重性或改善与炎症相 关疾病有关的征候和症状,预防包括抑制、防止或降低炎症相关疾病相关症状 的严重性,该术语包括在患者开始罹患炎症相关疾病或相关病症之前发生的这 样的作用,即延迟炎症疾病相关的症状发作,或抑制或降低炎症疾病相关症状 的严重性;治疗是指减少或消除炎症疾病症状的严重性、这样的症状出现的频 率,该术语包括当患者患有炎症疾病或相关病症时发生的这样的作用,即减少 炎症疾病相关症状的一种或多种症状或影响的严重性。
作为本发明的一种实施方案,本发明提供了前面所述的人源PSGL-1非人 类模型动物在药物的安全性和有效性评估中的应用。
作为一种优选的实施方案,所述药物选自抗体类药物。
术语“抗体”指包括整个抗体分子、抗原结合片段、单价抗体、以及其单 条链。抗体分子属于被称作免疫球蛋白的血浆蛋白家族,其基本构件(basic building block),免疫球蛋白折叠或结构域,以各种形式在免疫***和其它生物 识别***的许多分子中被使用。天然抗体和免疫球蛋白通常是大约150,000道 尔顿的异源四聚体糖蛋白,由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构 成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连,而不同免疫球蛋白同种型重链 之间的二硫键联结数目不同。每条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫桥。 每条轻链由轻链可变区(这里缩写为VL)和轻链恒定区(这里缩写为CL)构 成。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)构成,其中重链恒定 区由三个结构域CH1,CH2和CH3及铰链区构成。轻链恒定区与重链第一恒定 区(CH1)对准,轻链可变区与重链可变区对准,形成所谓的“Fab片段”。重 链的CH1和CH2彼此被过所谓的铰链区隔开,该铰链区允许抗体分子的Fab “臂”旋转一定程度。铰链区通常包含一个或多个半胱氨酸,这些半胱氨酸能 够与抗体分子内另一重链的铰链区的半胱氨酸形成二硫桥。
本发明中所使用的术语“抗体类药物”是指由抗体物质组成的一类药物。
下面结合具体实施例进一步阐述此发明。应理解的是,在此描述的特定实 施方式通过举例的方式来表示,并不作为对本发明的限制。在不偏离本发明范 围的情况下,本发明的主要特征可以用于各种实施方式。
实施例1 PSGL-1人源化小鼠模型建立
(1)确定人源片段敲入位置及敲入的人源序列
选择与小鼠对应的SELPLG-201(ENST00000228463.6)转录本的CDS在小鼠 上进行人源基因的敲入,敲入位置为Rosa26位点,Rosa26 loci基因组序列如 SEQ ID NO.2所示,***的人源PSGL-1序列如SEQ ID NO.1所示。
(2)Cas9/gRNA靶点的设计与活性检测
使用软件设计针对目标D N A寡聚核苷酸链序列的sgRNA序列(表1), 采用Cas9/gRNA靶点效率检测试剂盒检测以上gRNA靶点体外酶切活性。Cas9 体外酶切结果可以看出M-ROSA-L1和M-ROSA-R3活性最高(图2)。
表1 sgRNA靶点序列
(3)Donor质粒的构建
构建携带靶位点同源臂及***序列Donor vector,将Donor vector转化到 DH5a感受态细胞中,扩大培养后提取质粒并纯化,获得donor片段产物。
(4)显微注射受精卵构建F0代小鼠
将体外转录合成的Cas9 mRNA、sgRNA和获得的donor片段混合并调整浓 度,显微注射到小鼠受精卵中,再将受精卵移植到假孕的母鼠输卵管中,等待 F0代小鼠出生,共出生F0代小鼠19只(表2)。F0代小鼠出生2周后,剪取 鼠尾,提取鼠尾组织DNA,设计靶区域引物(表3),通过PCR的方式进行基 因型鉴定,PCR反应体系见表4,PCR反应程序见表5。得到F0代阳性鼠三 只,即RD-KI-W32-2-2#,RD-KI-W32-3-5#,RD-KI-W32-3-6#(图3)。
表2受精卵注射日期,小鼠出生日期、出生编号
表3 F0代小鼠鉴定引物
表4 PCR反应体系
表5 PCR反应程序
(5)建立稳定遗传的Rosa-SELPLG小鼠品系
在Rosa-SELPLG敲入阳性小鼠6-8周龄时,与野生型小鼠合笼交配,得到 F1代小鼠。采用SEQ ID NO.16-19中的引物对得到的F1代小鼠进行PCR鉴 定。对PCR鉴定为阳性的小鼠进行测序分析,测序分析正确的克隆为阳性F1 代小鼠。经PCR(图4)和测序确认,2#,3#小鼠为阳性F1代小鼠。
F1代阳性杂合小鼠(PSGL-1人源化基因敲入小鼠)进行自交,得到F2纯合 小鼠。
实施例2人源化PSGL-1小鼠中人源PSGL-1mRNA表达水平验证
1、实验方法
组织RNA提取和RT-PCR:提取F2纯合小鼠的心、肝、脾、肺、肾组织 的RNA,使用Trizol试剂(Invitrogen,CA)提取总RNA,并使 PrimeScriptTM RT Master Mix(RR036A,TaKaRa)转录为cDNA。用SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems,CA)扩增cDNA,并使用7500 Fast Real-time PCR System Machine(Applied Biosystems,CA)进行检测,扩增 引物如表6所示。
表6 F2代小鼠扩增引物
2、实验结果
实验结果如图6所示,图6为4月龄野生型C57BL6J小鼠及人源化B6- hPSGL-1小鼠心、脾、肺、肾组织中人源PSGL-1mRNA的表达水平情况, PSGL-1mRNA表达水平以RQ值展示,即2-△△Ct。从图中可以看出,野生型 小鼠中不表达人源PSGL-1mRNA,而人源化PSGL-1小鼠高表达PSGL-1 mRNA。数据以Mean±SD展示,N=3-5。该结果从核酸水平上说明本发明成功 构建了人源化PSGL-1小鼠模型。
实施例3人源化PSGL-1小鼠中人源PSGL-1蛋白表达水平验证
1、实验方法
组织蛋白提取和Western blot:使用含蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液 (P0013B,碧云天生物)从心、肝、脾、肺、肾组织中提取总蛋白,然后通过 BCA蛋白测定试剂盒(P0010S,碧云天生物)测定其浓度。将等量的蛋白质样 品上样至SDS-PAGE胶上,然后转移到硝酸纤维素膜上。用5%脱脂牛奶封闭 后,将膜与抗仅识别人源PSGL-1蛋白(ab78188,Abcam)在4℃孵育过夜,然 后与辣根过氧化物酶标记的二抗孵育。蛋白条带通过Tanon 5500化学发光成像 ***进行成像。
2、实验结果
Western blot实验结果见图6,从图中可以看出B6-hPSGL-1小鼠心、肝、 脾、肺、肾组织中高表达人源PSGL-1蛋白,而C57BL/6J小鼠中未见人源PSGL-1蛋白表达。数据以Mean±SD展示,N=3-5,p<0.01(t检验),其中 C57BL/6J和B6-hPSGL-1小鼠心脏组织中PSGL-1蛋白的灰度值分别为4.18, 57.42;肝脏组织中PSGL-1蛋白的灰度值分别为20.28,112.11;脾脏组织 PSGL-1蛋白的灰度值分别为12.26、111.03,肺脏组织PSGL-1蛋白的灰度值分 别为4.86、108.57。该结果从蛋白水平上说明本发明成功构建了人源化PSGL-1 小鼠模型。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出, 对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本 发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范 围内。
序列表
<110> 中国医学科学院医学实验动物研究所
<120> 一种PSGL-1人源化非人类动物模型的构建方法及应用
<141> 2022-04-19
<160> 23
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1287
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggcagtgg gggccagtgg tctagaagga gataagatgg ctggtgccat gcctctgcaa 60
ctcctcctgt tgctgatcct actgggccct ggcaacagct tgcagctgtg ggacacctgg 120
gcagatgaag ccgagaaagc cttgggtccc ctgcttgccc gggaccggag acaggccacc 180
gaatatgagt acctagatta tgatttcctg ccagaaacgg agcctccaga aatgctgagg 240
aacagcactg acaccactcc tctgactggg cctggaaccc ctgagtctac cactgtggag 300
cctgctgcaa ggcgttctac tggcctggat gcaggagggg cagtcacaga gctgaccacg 360
gagctggcca acatggggaa cctgtccacg gattcagcag ctatggagat acagaccact 420
caaccagcag ccacggaggc acagaccact caaccagtgc ccacggaggc acagaccact 480
ccactggcag ccacagaggc acagacaact cgactgacgg ccacggaggc acagaccact 540
ccactggcag ccacagaggc acagaccact ccaccagcag ccacggaagc acagaccact 600
caacccacag gcctggaggc acagaccact gcaccagcag ccatggaggc acagaccact 660
gcaccagcag ccatggaagc acagaccact ccaccagcag ccatggaggc acagaccact 720
caaaccacag ccatggaggc acagaccact gcaccagaag ccacggaggc acagaccact 780
caacccacag ccacggaggc acagaccact ccactggcag ccatggaggc cctgtccaca 840
gaacccagtg ccacagaggc cctgtccatg gaacctacta ccaaaagagg tctgttcata 900
cccttttctg tgtcctctgt tactcacaag ggcattccca tggcagccag caatttgtcc 960
gtcaactacc cagtgggggc cccagaccac atctctgtga agcagtgcct gctggccatc 1020
ctaatcttgg cgctggtggc cactatcttc ttcgtgtgca ctgtggtgct ggcggtccgc 1080
ctctcccgca agggccacat gtaccccgtg cgtaattact cccccaccga gatggtctgc 1140
atctcatccc tgttgcctga tgggggtgag gggccctctg ccacagccaa tgggggcctg 1200
tccaaggcca agagcccggg cctgacgcca gagcccaggg aggaccgtga gggggatgac 1260
ctcaccctgc acagcttcct cccttag 1287
<210> 2
<211> 4529
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgcacgggga ttcccagtgc cggcgccagg ggcacgcggg acacgccccc tcccgccgcg 60
ccattggcct ctccgcccac cgccccacac ttattggccg gtgcgccgcc aatcagcgga 120
ggctgccggg gccgcctaaa gaagaggctg tgctttgggg ctccggctcc tcagagagcc 180
tcggctaggt aggggatcgg gactctggcg ggagggcggc ttggtgcgtt tgcggggatg 240
ggcggccgcg gcaggccctc cgagcgtggt ggagccgttc tgtgagacag ccgggtacga 300
gtcgtgacgc tggaaggggc aagcgggtgg tgggcaggaa tgcggtccgc cctgcagcaa 360
ccggaggggg agggagaagg gagcggaaaa gtctccaccg gacgcggcca tggctcgggg 420
gggggggggc agcggaggag cgcttccggc cgacgtctcg tcgctgattg gcttcttttc 480
ctcccgccgt gtgtgaaaac acaaatggcg tgttttggtt ggcgtaaggc gcctgtcagt 540
taacggcagc cggagtgcgc agccgccggc agcctcgctc tgcccactgg gtggggcggg 600
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gaggggaggg agggtcagcg aaagtagctc gcgcgcgagc ggccgcccac cctccccttc 720
ctctggggga gtcgttttac ccgccgccgg ccgggcctcg tcgtctgatt ggctctcggg 780
gcccagaaaa ctggcccttg ccattggctc gtgttcgtgc aagttgagtc catccgccgg 840
ccagcggggg cggcgaggag gcgctcccag gttccggccc tcccctcggc cccgcgccgc 900
agagtctggc cgcgcgcccc tgcgcaacgt ggcaggaagc gcgcgctggg ggcggggacg 960
ggcagtaggg ctgagcggct gcggggcggg tgcaagcacg tttccgactt gagttgcctc 1020
aagaggggcg tgctgagcca gacctccatc gcgcactccg gggagtggag ggaaggagcg 1080
agggctcagt tgggctgttt tggaggcagg aagcacttgc tctcccaaag tcgctctgag 1140
ttgttatcag taagggagct gcagtggagt aggcggggag aaggccgcac ccttctccgg 1200
aggggggagg ggagtgttgc aatacctttc tgggagttct ctgctgcctc ctggcttctg 1260
aggaccgccc tgggcctggg agaatccctt ccccctcttc cctcgtgatc tgcaactcca 1320
gtctttctag aagatgggcg ggagtcttct gggcaggctt aaaggctaac ctggtgtgtg 1380
ggcgttgtcc tgcaggggaa ttgaacaggt gtaaaattgg agggacaaga cttcccacag 1440
attttcggtt ttgtcgggaa gttttttaat aggggcaaat aaggaaaatg ggaggatagg 1500
tagtcatctg gggttttatg cagcaaaact acaggttatt attgcttgtg atccgcctcg 1560
gagtattttc catcgaggta gattaaagac atgctcaccc gagttttata ctctcctgct 1620
tgagatcctt actacagtat gaaattacag tgtcgcgagt tagactatgt aagcagaatt 1680
ttaatcattt ttaaagagcc cagtacttca tatccatttc tcccgctcct tctgcagcct 1740
tatcaaaagg tattttagaa cactcatttt agccccattt tcatttatta tactggctta 1800
tccaacccct agacagagca ttggcatttt ccctttcctg atcttagaag tctgatgact 1860
catgaaacca gacagattag ttacatacac cacaaatcga ggctgtagct ggggcctcaa 1920
cactgcagtt cttttataac tccttagtac actttttgtt gatcctttgc cttgatcctt 1980
aattttcagt gtctatcacc tctcccgtca ggtggtgttc cacatttggg cctattctca 2040
gtccagggag ttttacaaca atagatgtat tgagaatcca acctaaagct taactttcca 2100
ctcccatgaa tgcctctctc ctttttctcc atttataaac tgagctatta accattaatg 2160
gtttccaggt ggatgtctcc tcccccaata ttacctgatg tatcttacat attgccaggc 2220
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aagtaaaatg attaagcaac aaatgtattt gtgaagcttg gtttttaggt tgttgtgttg 2580
tgtgtgcttg tgctctataa taatactatc caggggctgg agaggtggct cggagttcaa 2640
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atttgtgaaa ttgttttcaa gtgatagtt 4529
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tccaccaccc agttgctgta 20
Claims (13)
1.一种基于CRISPR/Cas9技术构建的非人类动物模型,其特征在于,该模型为人源PSGL-1敲入非人类动物模型;
所述非人类动物模型敲入位点为Rosa26位点;
PSGL-1的序列如SEQ ID NO.1所示;
所述动物是啮齿动物;
所述啮齿动物是小鼠;
所述小鼠是C57BL/6J小鼠。
2.一种用于编辑PSGL-1的sgRNA,其特征在于,所述sgRNA的序列如SEQ ID NO.3-13所示。
3.根据权利要求2所述的sgRNA,其特征在于,所述sgRNA序列如SEQ ID NO.3-4,SEQ IDNO.10-13所示。
4.根据权利要求3所述的sgRNA,其特征在于,所述sgRNA序列如SEQ ID NO.3,SEQ IDNO.10所示。
5.一种表达人源PSGL-1基因的打靶载体,其特征在于,所述打靶载体包括5’同源臂、人源PSGL-1基因、终止密码子、WPRE元件、Poly A和3’同源臂;
所述PSGL-1的序列如SEQ ID NO.1所示。
6.一种用于在Rosa26位点定点敲入人源PSGL-1基因的CRISPR/Cas9***,其特征在于,所述CRISPR/Cas9***包含权利要求5所述的打靶载体。
7.构建人源PSGL-1非人类动物模型的方法,其特征在于,所述方法通过将PSGL-1引入非人类动物的单细胞胚胎或胚胎干细胞的基因组来修饰非人类动物的基因组;
所述方法包括以下步骤:
(1)构建打靶载体;
(2)制备sgRNA和Cas9 mRNA;
(3)将所述打靶载体、Cas9 mRNA和sgRNA混合,注射入受精***,并移植到假孕动物的输卵管中,获得敲入人源PSGL-1的F0代阳性动物;
(4)将F0代阳性动物与野生型动物杂交,获得F1代阳性杂合动物;
(5)将F1代阳性杂合动物自交获得稳定遗传的人源PSGL-1非人类动物模型;
敲入位点为Rosa26位点;
Rosa26 loci的基因组序列如SEQ ID NO.2所示;
步骤(1)所述的打靶载体包括5’同源臂、人源PSGL-1基因、终止密码子、WPRE元件、PolyA和3’同源臂;
所述PSGL-1的序列如SEQ ID NO.1所示;
步骤(2)所述的sgRNA序列如SEQ ID NO.3-13所示。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述sgRNA序列如SEQ ID NO.3-4,SEQ IDNO.10-13所示。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述sgRNA序列如SEQ ID NO.3,SEQ IDNO.10所示。
10.根据权利要求7-9任一项所述的方法,其特征在于,鉴定敲入人源PSGL-1的方法为PCR鉴定;
PCR鉴定F0代阳性动物所用引物的序列如SEQ ID NO.14-19所示;
PCR鉴定F1代阳性动物所用引物的序列如SEQ ID NO.16-19所示;
PCR鉴定稳定遗传的人源PSGL-1非人类动物模型所用引物的序列如SEQ ID NO.20-23所示。
11.一种获得敲入人源PSGL-1的非人类动物的方法,其特征在于,饲养权利要求7-10任一项所述的方法构建的人源PSGL-1敲入的模型动物。
12.根据权利要求7-11任一项所述的方法,其特征在于,所述动物是啮齿动物;
所述啮齿动物是小鼠;
所述小鼠是C57BL/6J小鼠。
13.权利要求7-12任一项所述的方法获得的模型动物在筛选预防或治疗炎症相关疾病药物中的应用;
所述炎症相关疾病包括结肠炎、胰腺炎、腹主动脉瘤、动脉粥硬化。
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