CN113640524A

CN113640524A - 一种检测捻转血矛线虫感染的复合抗原与其应用

Info

Publication number: CN113640524A
Application number: CN202110881317.0A
Authority: CN
Inventors: 严若峰; 李祥瑞; 徐立新; 宋小凯; 赖旭东
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2021-08-02
Filing date: 2021-08-02
Publication date: 2021-11-12
Anticipated expiration: 2041-08-02
Also published as: CN113640524B

Abstract

本发明涉及一种检测捻转血矛线虫感染的复合抗原与其应用。一种复合型可用作该寄生虫早期感染诊断抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该抗原可以对感染捻转血矛线虫7天后的宿主血清中的抗体进行特异性识别，能在宿主排出虫卵2周前进行诊断。本发明利用该抗原建立了胶体金试纸条检测方法，具有敏感性好、特异性强、操作简便、用时短等优点，在牛、羊、鹿、骆驼等反刍动物捻转血矛线虫病的防控中具有较好的应用前景。

Description

一种检测捻转血矛线虫感染的复合抗原与其应用

技术领域

本发明属于兽医免疫学和分子生物学技术领域，涉及一种动物寄生虫病的血清学诊断方法。

背景技术

捻转血矛线虫是牛、羊、鹿、骆驼等反刍动物一种常见的消化道寄生虫，寄生于宿主第四胃，以宿主血液为营养。动物感染后出现贫血、消瘦、水肿、腹泻等症状，可致幼龄动物特别是羔羊大批死亡，成年动物死亡率较低，但感染后生长缓慢、饲料报酬降低，造成巨大的经济损失而常常不被发现。随着我国大力发展牛羊等草食动物及相关产业，捻转血矛线虫病的危害与其造成的经济损失日益明显与严重，对动物感染该寄生虫情况进行早期诊断具有积极意义。

目前，已有一个商品化的疫苗用于捻转血矛线虫病的预防，但因其生产成本高，应用有限。该病的防控仍以苯并咪唑、左旋咪唑、伊维菌素等药物治疗为主，然而不规范的用药加速了捻转血矛线虫耐药性虫株的产生和蔓延。短期内新疫苗和新药研发很难有突破性进展，快速准确的诊断该病、选择恰当的药物尽早治疗、避免感染后期成虫产生虫卵污染草场和圈舍，在该病的防控中发挥重要作用。

捻转血矛线虫病的诊断主要依据临床症状评估和粪便学检查结果进行。根据症状进行诊断虽比较方便简单，但需要专业技术人员，且通常只有在感染严重时其临床症状才会变得明显，不适用于轻度感染。粪便学检查方法目前应用最为广泛，但需要在感染后3周左右方能在粪便中检测到虫卵，很难用于早期感染的诊断。剖检法能够进行准确诊断，但需要处死动物，成本很高，很难推广。建立新的适用于动物早期感染和轻度感染的诊断技术和方法十分迫切和必要。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种捻转血矛线虫复合诊断抗原Hc-5C及其应用。

本发明的又一目的是提供一种捻转血矛线虫早期感染诊断技术。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

捻转血矛线虫复合诊断抗原Hc-5C在制备捻转血矛线虫感染诊断试剂中的应用，所述的捻转血矛线虫复合诊断抗原Hc-5C的氨基酸序列如SEQ ID NO.1。

作为本发明的一种优选，捻转血矛线虫复合诊断抗原Hc-5C在制备捻转血矛线虫感染的分子生物学诊断或血清学诊断试剂盒中的应用。

作为本发明的进一步优选，捻转血矛线虫复合诊断抗原Hc-5C在制备捻转血矛线虫感染的胶体金试纸条检测技术中的应用。

作为本发明的一种优选，所述的捻转血矛线虫复合诊断抗原Hc-5C通过以下方法制备：提取捻转血矛线虫总RNA，反转录合成cDNA的第一条链；以该cDNA为模板，分别以SEQID NO.2/SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4/SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6/SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8/SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10/SEQ ID NO.11所示的引物进行RT-PCR扩增，PCR产物再经过重叠延伸PCR技术获得Hc-5C基因；将Hc-5C基因***pET28a的BamH I和Xho I酶切位点间得到含有Hc-5C基因的重组表达质粒pET28a-Hc-5C；将该质粒转化大肠杆菌进行诱导表达并分离纯化获得所述的捻转血矛线虫Hc-5C蛋白。

一种检测捻转血矛线虫感染的胶体金试纸条检测技术，包含用胶体金标记的Hc-5C蛋白制备的金标垫，由Hc-5C蛋白包被检测线(T)以及抗Hc-5C蛋白抗体包被质控线(C)的试纸条。

作为本发明的一种优选，所述的捻转血矛线虫复合诊断抗原Hc-5C通过以下方法制备：提取捻转血矛线虫总RNA，反转录合成cDNA的第一条链；以该cDNA为模板，以SEQ IDNO.2-11所示的引物进行RT-PCR扩增，PCR产物再经过重叠延伸PCR技术获得Hc-5C基因；将Hc-5C基因***pET28a的BamH I和Xho I酶切位点间得到含有Hc-5C基因的重组表达质粒pET28a-Hc-5C；将该质粒转化大肠杆菌进行诱导表达并分离纯化获得所述的捻转血矛线虫Hc-5C蛋白。

作为本发明的一种优选，所述的抗Hc-5C抗体为Hc-5C的多克隆抗体。

作为本发明的一种优选，所述的抗Hc-5C抗体通过以下方法获得：用纯化的Hc-5C重组蛋白与弗氏完全佐剂乳化后免疫实验兔，与弗氏不完全佐剂乳化加强免疫3次；收集高免血清，纯化。

作为本发明的一种优选，所述的金标垫通过以下方法获得：用胶体金标记纯化的Hc-5C重组蛋白；金标垫浸泡、干燥；裁剪成合适大小；粘贴于试纸条底板上。

本发明建立在下列发现之上：

申请人前期研究发现捻转血矛线虫含冷休克结合域蛋白(CS)、肝癌细胞相关抗原59(HCA59)、甲基转移酶12型蛋白(Mt12)、NADH:泛醌氧化还原酶结构域蛋白(NDUDC)和含Ras结构域蛋白(Ras)5种蛋白均具有一定的诊断潜力，基于这些蛋白建立的间接ELISA方法均具有一定的敏感性和稳定性，但其特异性有待进一步提高。

本发明为进一步提高这5种蛋白的诊断能力，从每种蛋白中筛选一个特异性强的肽段并依次命名为Hc-CSf、Hc-HCA59f、Hc-Mt12f、Hc-NDUDCf和Hc-Rasf，按上述顺序组成Hc-5C复合抗原。对该复合抗原的诊断潜力进行分析并建立双抗原夹心胶体金免疫层析试纸条检测方法。对该方法的敏感性和特异性进行了分析，并将该检测方法应用于临床样本的检测。

胶体金试纸条检测技术是一种快速、方便、安全的血清学检测方法，而将该方法用于捻转血矛线虫感染的检测尚未见报道。Hc-5C作为一种复合型抗原，是从5种具有早期诊断潜力的蛋白中筛选出来的5个特异性肽段通过融合表达获得，其免疫功能、免疫诊断潜力等均未被报道。

本发明具有以下优点和效果：

1.目前资料报道的捻转血矛线虫抗体检测ELISA技术特异性不强，该发明通过筛选5种抗原的特异性表位，构成复合抗原，基于此建立的胶体金试纸条检测技术具有高度的特异性。

2.粪便学检查需在动物感染后21天左右才能进行诊断，本方法能在感染后7天做出准确诊断，具有早期诊断的优点。

3.基于该抗原建立的胶体金试纸条检测技术具有操作简便、所需时间短、不需要检测仪器等优点。

附图说明

图1 Hc-5C复合蛋白B细胞抗原表位(A)和T细胞抗原表位(B)分析

图2 Hc-CSf、Hc-HCA59f、Hc-Mt12f、Hc-NDUDCf、Hc-Rasf等片段PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳

M：DNA标准分子量；1-5：分别为Hc-CSf、Hc-HCA59f、Hc-Mt12f、Hc-NDUDCf及Hc-Rasf PCR扩增产物

图3融合扩增产物琼脂糖凝胶电泳

M:DNA标准分子量；1-4:分别为基因A、基因B、基因C及Hc-5C PCR扩增产物

图4重组质粒pET-28a/Hc-5C双酶切鉴定

M:DNA标准分子量；1:重组质粒pET-28a/Hc-5C的BamH I和Xho I双酶切产物

图5重组Hc-5C的表达

M:蛋白质标准分子量；1-2:依次为空载菌体诱导0h和6h裂解产物；3-9:依次为重组菌体诱导0、1、2、3、4、5和6h裂解产物；10-11:分别为超声后重组菌体诱导6h裂解产物上清、超声后重组菌体诱导6h裂解产物沉淀

图6重组Hc-5C的纯化

M:蛋白质标准分子量；1:未纯化的包涵体蛋白；2:纯化后的重组Hc-5C蛋白。

图7 rHc-5C与不同感染时期山羊阳性血清的WB结果

M:标准蛋白分子量；1-10:分别为感染前(0天)和感染后7、14、21、28、35、42、49、56及61天山羊阳性血清作为一抗与重组Hc-5C蛋白的结合。

图8胶体金试纸条结构图

图9试纸条特异性分析

1-2：分别为捻转血矛线虫感染阳性和阴性血清；3-4:分别为旋毛虫、弓形虫和大片吸虫阳性血清

图10试纸条敏感性分析

1-7:阳性血清稀释倍数依次为1:5、1:15、1:25、1:35、1:45、1:55及1:65

具体实施方式

基础材料：

1.捻转血矛线虫虫株：本实验室分离、鉴定、保存。

2.实验动物：4只本地山羊，5-6月龄，购于江苏省句容市某农场，饲养于南京农业大学动物房内。

3.PCR引物：扩增5个基因片段的上、下游引物序列分别如表1所列。

4.工具酶与试剂：制性核酸内切酶BamHⅠ、Xho I、DNA Marker(DL2000Plus、DL5000Plus)和

Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒均购于南京诺唯赞生物科技有限公司；

Reagent购于ThermoFisher生物科技公司；质粒少量提取试剂盒与琼脂糖凝胶回收试剂盒为美国E.Z.N.A·^TM公司产品，BCA蛋白定量分析试剂盒为美国Thermo公司产品；HisTrap^TMFF蛋白亲和层析柱购自美国GE公司，DAB显色试剂盒，HRP标记的兔抗山羊IgG购于上海碧云天生物科技公司；20nm胶体金溶液购自南京先丰纳米材料科技有限公司；pH试纸购自上海三爱思试剂有限公司；Sartorius CN140 NC膜、金标垫及样品垫等胶体金耗材购自上海杰一生物技术有限公司；辛酸、硫酸铵购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

5.临床检测样品：江苏省不同羊场随机选取54只山羊，分别采集其血清、粪便与皱胃样品。

6.主要仪器设备：PCR扩增仪(TaKaRa公司)，台式冷冻离心机(Eppendorf)、电压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)、超声破碎仪(宁波新芝科研仪器研究所)，凝胶成像***、蛋白电泳***、半干转印***及酶标仪(Bio-Red)，XYZ大平台三维划膜喷金仪HM3260(山海金标生物)，微电脑自动斩切机ZQ2002(山海金标生物)。

实施例1诊断用复合抗原Hc-5C的制备

1.1特异性肽段的筛选及Hc-5C复合蛋白的抗原表位分析

将捻转血矛线虫Hc-CS(GenBank登录号CDJ84294.1)、Hc-HCA59(CDJ80864.1)、Hc-Mt12(CDJ87424.1)、Hc-NDUDC(CDJ88764.1)和Hc-Ras(CDJ86500.1)氨基酸序列分别在NCBI数据库中进行Blast比对。以结果中共有且感染牛羊的“环纹背带线虫”为标准，筛选5种蛋白中与环纹背带线虫存在氨基酸差异的片段(长度约为25-60个氨基酸)。再将所选片段与NCBI数据库进行对比，分别以“Nematode”与“Goat”为关键词对结果进行过滤，确认所选片段与其他感染牛羊的线虫存在差异，且与山羊蛋白无相似片段。最终选择5个肽段分别包含其原蛋白第9-58、10-61、137-189、8-40、28-76氨基酸残基，用DNAStar Protean程序对各目的片段潜在的B细胞抗原表位和T细胞抗原表位进行分析，每个肽段分别含有B细胞抗原表位3、5、4、4和2个，T细胞抗原表位2、3、2、2和1个。将上述5个肽段进行融合获得Hc-5C复合蛋白，序列如SEQ ID NO.1所示，共编码251个氨基酸，相对分子质量(M.W.)为28.54kDa，理论等电点(pI)为5.97，与其他线虫蛋白相似部分重合率低于25％，相似度在36-88％之间，具有大量的B细胞抗原表位和T细胞抗原表位(见图1)。

1.2合成引物

根据Hc-CS、Hc-HCA59、Hc-Mt12、Hc-NDUDC及Hc-Ras等5种蛋白所筛选的片段共设计5对特异性引物，保证相连处有20bp重叠部分，序列如表1。

表1 PCR引物序列

注：所有引物波浪线指限制性酶切位点，阴影部分指重叠部分。

1.3捻转血矛线虫总RNA的提取

按照Inviotrgen TRIzol说明书方法进行成虫总RNA的提取，具体步骤如下：

(1)挑取20条捻转血矛线虫放入经DEPC水处理过的匀浆器中，加液氮研磨虫体。待虫体研磨较充分后加入TRIzol试剂1mL，冰上充分研磨(冰上研磨时间大于30min)；

(2)将研磨好的虫体转移至无RNA酶的离心管中，静置5min或者4℃离心12000rpm取上清；

(3)把上清再转移至新的离心管中，加入200uL经4℃预冷的氯仿，震荡30s乳化后静置5min；

(4)4℃离心机12000rpm离心15min，将上层水相小心转移至新的离心管中；加入遇冷的异丙醇，上下颠倒震荡1min后静置10min；

(5)4℃离心机12000rpm离心10min舍弃上清；

(6)用1mLDEPC水配制的75％乙醇重悬沉淀，4℃离心机12000rpm离心10min舍弃上清；

(7)重复一次步骤(6)后在风机下晾干离心管促使残留乙醇挥发，用30uL55℃的DEPC水溶解RNA；

(8)测定RNA纯度与浓度后，立即进行反转录或-80℃保存。

1.3 cDNA的合成

将上步提取合格的虫体总RNA，进行cDNA链的合成。以捻转血矛线虫总RNA为模板，应用反转录试剂盒合成cDNA的第一条链。

1.4 RT-PCR扩增

以cDNA为模板，采用以下反应体系进行RT-PCR：cDNA模板2.0μL，10×PCR Buffer5μL，MgCl₂(25mM)5μL，上游引物(10pM)2μL，下游引物(10pM)2μL，LA Taq酶(5U/μL)0.5μL，补加灭菌超纯水至50μL，充分混匀，于PCR仪上95℃预变性1min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸10min。5个基因片段均扩增成功，分别命名为Hc-CSf、Hc-HCA59f、Hc-Mt12f、Hc-NDUDCf及Hc-Rasf，大小分别为169bp、182bp、188bp、128bp及179bp，如图2所示。

1.5重叠延伸PCR获得复合蛋白Hc-5C的基因

以Hc-CSf、Hc-HCA59f、Hc-Mt12f、Hc-NDUDCf及Hc-Rasf基因片段为模板，按照Hc-CSf和Hc-HCA59f(新产物为融合基因A)，基因A和Hc-Mt12f(新产物为融合基因B)，基因B和Hc-NDUDCf(新产物为融合基因C)，基因C和Hc-Rasf(新产物为Hc-5C编码基因)的顺序进行重叠延伸PCR，融合基因A、B、C和Hc-5C的大小分别为331bp、436bp、544bp、766bp，如图3所示。

1.6原核表达载体的构建

取上述Hc-5C PCR产物25μl，1％琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下切下目的条带处琼脂糖凝胶，用大连宝生物公司的胶回收试剂盒回收纯化目的片段，方法参照说明书。取纯化的Hc-5C和pET28a载体用BamHⅠ和Xho I双酶切，回收Hc-5C和pET28a片段，按照合适比例进行连接，连接产物转化感受态大肠杆菌BL21，提取质粒，用BamHⅠ和Xho I双酶切鉴定，结果如图4。阳性克隆进行测序分析，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

1.7表达产物的纯化

1.7.1包涵体蛋白的准备

使用1mM浓度的IPTG诱导在1L LB培养基中培养的pET28a-Hc-5C表达菌，8000r/min离心5min收集菌体，使用约40ml PBS重新悬浮菌体，600W超声强度，工作1s，间隔3s，破碎30min。破碎后的悬液10000r/min离心20min，取沉淀弃上清，沉淀即为包涵体。向包涵体中加入20ml Elution Buffer，使用大号注射器充分吹吸悬浮，4℃过夜溶解包涵体，包涵体大部分溶解后10000r/min离心20min，弃沉淀取上清，0.22μm滤膜过滤后样品制备完毕(见图5)。

1.7.2重组蛋白的亲和层析纯化

按照0.5ml/min的流速使蛋白样品缓缓流过保存于4℃20％乙醇中的His Tag亲和层析柱(1ml×3串联)，使用5倍柱体积Binding Buffer清洗柱子。按照2ml/min的流速使用5-10倍柱床体积的Binding Buffer洗涤层析柱。再按照0.5ml/min的流速使用ElutionBuffer洗脱目的蛋白(见图6)。

实施例2复合蛋白Hc-5C的Western blot分析

2.1山羊感染捻转血矛线虫不同时期血清的制备

4只4-6月龄本地山羊，购于江苏省句容市某农场，饲养于南京农业大学动物房内。驱虫后用粪便学检查方法证实无寄生虫感染后，人工感染捻转血矛线虫三期幼虫(L3，5000条/只)。分别于感染前(0天，阴性对照)和感染后7、14、21、28、35、42、49、56、61天采血并分离血清。

2.2重组蛋白的Western blot分析

以山羊感染不同时期的血清作为一抗，兔抗山羊HRP-IgG作为二抗,对Hc-5C重组蛋白进行Western blot分析。结果(图7)发现，Hc-5C能够与感染后的7天至61天的血清发生反应，但未感染捻转血矛线虫的山羊血清与该重组蛋白不反应。表明Hc-5C可用于捻转血矛线虫早期及长期感染的诊断(表2)。

表2 不同感染时期山羊阳性血清与重组蛋白Hc-5C作用结果

实施例3基于重组Hc-5C蛋白建立胶体金试纸条检测技术

3.1胶体金免疫层析试纸条的组装

(1)将金标垫浸泡于胶体金标记抗原溶液中10min，37℃烘箱干燥30min，重复3次，最后裁剪成合适大小，4℃干燥保存备用。

(2)用划膜仪按照1μL/cm在NC膜上制备T线和C线，37℃烘箱烘干30min后，使用切条机裁剪至合适大小。

(3)将血清垫、NC膜、吸水纸依次粘贴于底板上。

(4)将裁剪后的上述材料按照图8顺序安装压紧，置于4℃干燥保存备用。

3.2胶体金标记Hc-5C抗原

(1)取10mL胶体金溶液至50mL离心管，使用0.1％K₂CO₃溶液调至pH值8.0；

(2)加入200ul重组Hc-5C(0.5mg/mL)并混匀，室温静置20min，4℃静置30min；

(3)加入10％BSA至终浓度1％，混匀后室温静置15min；

(4)再加入5％PEG20000至终浓度0.5％，混匀后室温静置15min；

(5)加入10％NaCI溶液至终浓度1％，混匀；

(6)4℃，1500rpm离心20min，取上清；

(7)4℃，12000rpm离心60min，弃上清；

(8)用原体积1/5的0.01mol/L PB溶液(含有2.5％蔗糖和1％BSA)重悬浮沉淀，4℃避光保存。

3.3检测线(T线)包被

(1)使用0.01mol/L PBS(pH7.4)将重组Hc-5C蛋白浓度调至0.774mg/mL、0.500mg/mL、0.250mg/mL及0.125mg/mL，分别划膜包被作为T线，37℃培养箱烘干30min；

(2)将金标垫、吸水纸、血清垫、底板与NC膜进行组装；

(3)每张试纸条向血清垫滴加按1:25稀释的感染捻转血矛线虫的山羊阳性血清50μL，10min后观察C、T线，确定最适T线抗原包被浓度为0.774mg/mL。

3.4质控线(C线)包被

(1)兔抗重组Hc-5C多克隆抗体的制备

用8周龄雌性新西兰大白兔进行4次免疫获得抗Hc-5C多克隆抗体。首免：500ugrHc-5C与等体积弗氏完全佐剂完全乳化，皮下多点注射免疫；二免：间隔两周，500ug rHc-5C与等体积弗氏不完全佐剂完全乳化，皮下多点注射免疫；三、四次免疫：均间隔1周；四免后第10天，耳中动脉采血，分离血清，将血清倍比稀释，rHc-5C间接ELISA步骤检测抗rHc-5C多克隆抗体效价；效价达标后，耳缘静脉注射7％水合氯醛麻醉白兔，腹中动脉采血并分离血清，分装血清后于-70℃保存。

(2)辛酸-硫酸铵法纯化多克隆抗体

4℃融解血清，按照1:2～1:4的比例向血清中加入0.06mol/L的醋酸盐缓冲液(pH4.0)，使用0.1mol/L NaOH或0.1mol HCI调溶液pH至4.5～4.8；室温30min内逐滴缓慢加入正辛酸(25μL/mL)，随后4℃静置2h；4℃，5000rpm离心30min，收集上清并用0.22μm滤器过滤；加入原溶液体积1/10的0.01mol/L PBS(pH7.4)缓冲液，再用0.1mol/L NaOH调pH至7.4；冰浴，30min内逐滴缓慢加入等体积饱和硫酸铵溶液并搅拌，4℃静置过夜；次日，4℃，12000rpm离心30min，弃上清；沉淀用原溶液体积1/10的0.01mol/L PBS(pH7.4)缓冲液重悬浮并移入透析袋，于20倍体积0.01mol/L PBS(pH7.4)缓冲液中4℃透析3次，每次6h；用PEG8000浓缩后0.22μm滤器过滤，分装后-20℃保存，使用BCA蛋白浓度试剂盒测量蛋白浓度。

(3)划膜包被C线

使用多抗稀释液(2mg/mL)划线包被，37℃培养箱烘干30min。

3.5特异性分析

分别向不同试纸条血清垫滴加按1:25稀释的感染捻转血矛线虫的山羊阳性血清、旋毛虫阳性血清、弓形虫阳性血清、大片形吸虫阳性血清50μL，10min后观察C、T线，判断试纸条特异性情况。结果(图9)显示，旋毛虫、弓形虫及大片形吸虫阳性血清T线处无条带，C线有条带出现。表明该方法特异性良好。

3.6敏感性分析

将人工感染捻转血矛线虫的山羊阳性血清用PBS按照1:5、1:15、1:25、1:35、1:45、1:55、1:65稀释后分别滴加50μL于不同试纸条，观察C、T线，判断试纸条敏感性。结果(图10)显示，该试纸条在血清1:35稀释后仍能区分捻转血矛线虫阳性及阴性血清，有较好的敏感性。

实施例4诊断方法的临床应用

对19只山羊分别采集其血清样品和皱胃样品。对这些样品分别进行成虫计数和胶体金试纸条检测，比较这两种诊断方法。结果(表3)发现，胶体金试纸条检测技术共检出阳性样品14份，检出率为73.4％(14/19)，该方法与剖检结果的符合率为84.2％((14+2)/19)。

表3 基于Hc-5C胶体金检测技术与剖检结果的比较

对35只山羊分别采集血清样品和粪便样品。对这些样品进行虫卵计数和胶体金试纸条检测。结果(表4)发现，胶体金试纸条检测技术共检出35份阳性血清，检出率为100％(35/35)，检出率高于粪便学检查方法。胶体金试纸条检测技术与粪检结果符合率为85.7％((30+0)/35)。

表4 基于Hc-5C胶体金检测技术与粪检结果对比

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种检测捻转血矛线虫感染的复合抗原与其应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 251

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Ser Met Ile Trp Ala Gln Arg Glu Ser Phe Leu Tyr Val Thr Ile

1 5 10 15

Glu Val Asp Asp Val Thr Ile Asp Asp Leu Ser Ala Asp Asp Asn Lys

20 25 30

Met His Phe Lys Gly Thr Ser His Thr Glu Val Tyr Glu Thr Thr Leu

35 40 45

Glu Phe Phe Ala Glu Glu Phe Met Asn Glu Ile Arg Glu Cys Phe Asn

50 55 60

Val Tyr Ser Gln Asp Gly Ile Val His Ser Ala Pro Gln Leu Arg Cys

65 70 75 80

Ile Leu Arg Ser Leu Gly Tyr Ser Pro Thr Ala Ala Lys Thr Ala Ala

85 90 95

Tyr Phe Ser Lys Ile Lys Gln Pro Met Asn Phe Glu Leu Met Glu Trp

100 105 110

Asp Thr His His Arg Met Phe Leu Tyr Ser Cys Asp Tyr Ser Ala Val

115 120 125

Ala Val Lys Val Leu Lys Glu His Glu Lys Tyr Asp Gly Ser Arg Ile

130 135 140

Ser Gly Phe Val Trp Asp Ile Thr Lys Asp Ala Pro Glu Ala Ala Pro

145 150 155 160

Ala Lys Glu Val Asp Met Gly Val Asp Lys Leu Ile Lys Phe Gly Arg

165 170 175

Ile Ile Lys Gln Ile Gly Gly Val Arg Ala Ala Leu Lys Lys Arg Tyr

180 185 190

Leu Met Asp Val Thr Arg Ala Lys Leu Met Arg Pro Leu Pro Asp Phe

195 200 205

Val Ser Lys Pro Gln Ile His Pro Thr Thr Val Ala Glu Gln Gln Val

210 215 220

Tyr Ser Gln Val Ala Val Pro Tyr Pro Ala Val Gln Ala His Val Glu

225 230 235 240

Pro Ala Val Ser Thr Gln Asp Ala Lys Glu Asn

245 250

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgggatccat gatttgggca caacgag 27

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgaattctt cagcgaagaa ctcca 25

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttcttcgctg aagaattcat gaatgagatc cgtgaatgtt 40

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgagctcga agttcattgg ctgct 25

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccaatgaact tcgagctcat ggagtgggac acacatcaca ga 42

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgtcgactt cttttgccgg agcag 25

<210> 8

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccggcaaaag aagtcgacat gggtgtcgac aagttaataa agtt 44

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ataagcttag cacgcgtgac atcc 24

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtcacgcgtg ctaagcttat gcgacccttg ccagat 36

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ccctcgagtt aattttcctt agcatcttgt g 31

Claims

1.捻转血矛线虫复合抗原Hc-5C在制备捻转血矛线虫感染诊断试剂中的应用，所述的捻转血矛线虫Hc-5C的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，捻转血矛线虫复合抗原Hc-5C在制备捻转血矛线虫感染的分子生物学诊断或血清学诊断试剂盒中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，捻转血矛线虫复合抗原Hc-5C在制备捻转血矛线虫感染的胶体金试纸条的应用。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于，所述的捻转血矛线虫复合抗原Hc-5C通过以下方法制备：提取捻转血矛线虫总RNA，反转录合成cDNA的第一条链，以该cDNA为模板，以SEQ ID NO.2-11所示的引物进行RT-PCR扩增，PCR产物再经过重叠延伸PCR技术获得Hc-5C基因；将Hc-5C基因***pET28a的BamHI和Xho I酶切位点间得到含有Hc-5C基因的重组表达质粒pET28a/Hc-5C；将该质粒转化大肠杆菌进行诱导表达并分离纯化获得所述的捻转血矛线虫Hc-5C蛋白。

5.一种检测捻转血矛线虫感染的胶体金试纸条，其特征在于，包含用胶体金标记的Hc-5C蛋白制备的金标垫，由Hc-5C蛋白包被检测线(T)以及抗Hc-5C蛋白抗体包被质控线(C)的试纸条。

6.根据权利要求5所述的胶体金试纸条检测技术，其特征在于，所述的捻转血矛线虫复合抗原Hc-5C通过以下方法制备：提取捻转血矛线虫总RNA，反转录合成cDNA的第一条链，以该cDNA为模板，以SEQ ID NO.2-11所示的引物进行RT-PCR扩增，PCR产物再经过重叠延伸PCR技术获得Hc-5C基因；将Hc-5C基因***pET28a的BamH I和Xho I酶切位点间得到含有Hc-5C基因的重组表达质粒pET28a-Hc-5C；将该质粒转化大肠杆菌进行诱导表达并分离纯化获得所述的捻转血矛线虫Hc-5C蛋白。

7.根据权利要求5所述的胶体金试纸条检测技术，其特征在于，所述的抗Hc-5C抗体为Hc-5C的多克隆抗体。

8.根据权利要求7所述的胶体金试纸条检测技术，其特征在于，所述的抗Hc-5C抗体通过以下方法获得：用纯化的Hc-5C重组蛋白与弗氏完全佐剂乳化后免疫兔，与弗氏不完全佐剂乳化加强免疫3次；收集高免血清，纯化。

9.根据权利要求5所述的胶体金试纸条检测技术，其特征在于，所述的金标垫通过以下方法获得：用胶体金标记纯化的Hc-5C重组蛋白；金标垫浸泡、干燥；裁剪成合适大小；粘贴于试纸条底板上。