CN115716867B - 一种V型分泌***MisL展呈表达新型冠状病毒受体结合域B细胞表位抗原和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了鸡伤寒沙门氏菌V型分泌***MisL及其展呈表达新型冠状病毒受体结合域B细胞表位靶标抗原中的应用。本发明基于鸡伤寒沙门氏菌V型分泌***MisL能够在载体菌表面表达，同时在其膜外区域功能性展呈新型冠状病毒受体结合域的B细胞表位靶标抗原，该靶标抗原能够识别和特异性结合新型冠状病毒凝集抗体。鉴于本发明具有快速特异、敏感、便捷等优势，有望成为新型冠状病毒抗体诊断、检测监测和评估的重要技术和平台。

Description

一种V型分泌***MisL展呈表达新型冠状病毒受体结合域B细 胞表位抗原和应用

技术领域

本发明属于生物医学和免疫诊断检测技术领域，具体涉及一种V型分泌***MisL及其构建方法和应用，尤其涉及新型冠状病毒(SARS-CoV-2)受体结合域B细胞表位抗原(QC07和QT05)在鸡伤寒沙门氏菌V型分泌***MisL展呈表达及其凝集抗体检测应用。

背景技术

在众多细菌分泌***中，V型分泌***中分泌装置最为单一，仅为一种前体多肽链蛋白分子，且该***分泌蛋白在转运过程中至今未发现任何能量和附加(蛋白)因子需求，因而该***又称自身转运蛋白分泌***。自V型分泌***最早在淋病奈瑟球菌IgA1蛋白酶中报道以来，该群分泌***不断发现、扩大，现为革兰氏阴性菌外膜孔道蛋白质转运中最大、最重要的一类家族，根据结构的特殊变化，分成a，b，c，d，e五种类型(最近有提出f类型)。该***所有分泌蛋白的一级结构和生物合成模型惊人地相似，即自身转运蛋白在细胞浆内以前前体蛋白质形式合成，以前蛋白体释放，其一级结构包括三个区：①信号肽序列或前导序列。②载客结构域，又称α结构域或N结构域，本质为V型分泌***自身转运蛋白中多种分泌型成熟蛋白。③蛋白转运单位，又称β结构域，辅助结构域，C结构域或自身转运蛋白结构域，该结构中自身编码的β片层能***外膜形成特征性桶状跨膜通道，在无任何辅助(蛋白)因子下，将与此相连的载客结构域转运分泌到细胞外膜表面(图1)。V型分泌***展示出蛋白酶活性、脂肪酶/酯酶活性、免疫逃逸相关效应因子和黏附素功能效应因子，值得注意的是，几乎所有类型的V型分泌***分泌蛋白均存在黏附作用，鉴于其自身转运蛋白载客结构域的广泛多样性和C末端蛋白转运单位不需要任何辅助蛋白(因子)就能形成类似细菌膜孔道蛋白的跨膜通道，并在革兰氏阴性菌菌表面分泌展示载客结构域。Klause等最先报道淋病奈瑟球菌IgA1蛋白酶能表达该载客结构域中的异源多肽-霍乱弧菌毒素B亚单位，并通过蛋白转运单位分泌到外膜并展示在大肠杆菌和伤寒沙门氏菌表面。Veiga等用该***表达和展示出能折迭形成二硫键空间构象的单链抗体ScFv。大肠杆菌自身转运蛋白AIDA-I(与扩散粘附有关的粘附素)在自身宿主细胞表面能分别展呈功能性Y-hsp60蛋白(小肠结肠炎耶森氏菌热休克蛋白60)的T细胞表位，酶学活性的β-内酰胺酶和具有直接摄入侵入Hela细胞活性的结核分枝杆菌毒力因子InVX。值得注意的是，沙门氏菌外膜纤连蛋白结合蛋白MisL(实质为膜***和分泌蛋白)，由肠炎沙门氏菌第3毒力岛ORF编码，与AIDI-1C末端结构域高度同源，也为自身转运蛋白，它不仅能在鼠伤寒和伤寒沙门氏菌表面功能性展呈日发恶性疟原虫环孢子蛋白的主要B-cell表位(NANP寡多肽重复单位)，且在大肠杆菌表面功能性展呈异源载客结构域容量达20kDa。基于V型分泌***表达人百日咳杆菌FHA丝状血凝素和Pertactin粘附素，及脑膜炎奈瑟球菌NadA黏附蛋白的重组疫苗最近已商品化上市。

因此，基于V型分泌***菌体表面蛋白黏附素作为启动感染、黏附定植和宿主互作的第一步和关键一步，非常期待研发抗感染的有效靶向药物、靶向疫苗和特异性诊断试剂。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了新型冠状病毒(SARS-CoV-2)受体结合域(RBD)B细胞表位的两种靶标抗原(TBE)，分别简称为QC07和QT05。

本发明还要解决的技术问题是提供了编码所述靶标B细胞表位抗原(TBE)的核酸或基因。

本发明还要解决的技术问题是提供了表达盒、重组载体、重组菌株或凝集抗体检测***。

本发明还要解决的技术问题是提供了重组表达载体或所述的凝集抗体检测***的构建方法。

本发明还要解决的技术问题是提供了结合SARS-CoV-2受体结合域B细胞表位的凝集抗体识别位点。

本发明还要解决的技术问题是提供了靶标抗原、所述的靶标抗原的核酸或基因、所述的表达盒、重组载体、重组菌株或凝集抗体检测***在制备检测新型冠状病毒凝集抗体的试剂或试剂盒中的应用。

本发明最后要解决的技术问题是提供了一种检测新型冠状病毒凝集抗体的试剂或试剂盒。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了新型冠状病毒受体结合域B细胞表位的靶标抗原，所述靶标抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.1：QAGSTPC，简称为QC07。SEQ ID NO.2：QAGST，简称为QT05。

本发明内容还包括编码所述的靶标抗原的核酸或基因，所述核酸或基因的序列如SEQ ID NO.3和/或SEQ ID NO.4所示。

SEQ ID NO.3：CAGGCCGGTAGCACACCTTGT；

SEQ ID NO.4：CAGGCCGGTAGCACA。

本发明内容还包括表达盒、重组载体、重组菌株或凝集抗体检测***，包含所述的核酸或基因。

本发明内容还包括所述的重组表达载体，所述重组表达载体是将所述靶标抗原的核酸或基因分别***鸡伤寒沙门氏菌V型分泌***MisL编码基因序列中，构建得到的表达载体。

具体地，将如SEQ ID NO.3和/或SEQ ID NO.4所示的靶标抗原的核酸或基因分别***鸡伤寒沙门氏菌V型分泌***MisL编码基因序列中，构建得到的表达载体pBR-MisL-QC07和pBR-MisL-QT05。

其中，所述凝集抗体检测***还包括将表达载体导入载体菌中即得。

具体地，所述凝集抗体检测***还包括将表达载体pBR-MisL-QC07和pBR-MisL-QT05分别导入载体菌中即得。

本发明内容还包括所述的重组表达载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)新型冠状病毒受体结合域B细胞表位的靶标抗原DNA序列的获得，所述靶标抗原的DNA序列如SEQ ID NO：3和/或SEQ ID NO：4所示；

(2)将步骤(1)得到的DNA序列***鸡伤寒沙门氏菌V型分泌***MisL编码基因序列中，构建表达载体。

本发明内容还包括所述的凝集抗体检测***的构建方法，所述构建方法除了包括步骤(1)和步骤(2)，还包括步骤(3)将表达载体通过电转化的方式导入载体菌中即得。

本发明内容还包括所述的靶标抗原、所述的靶标抗原的核酸或基因、所述的表达盒、重组载体、重组菌株或凝集抗体检测***在制备检测新型冠状病毒凝集抗体的试剂或试剂盒中的应用。

本发明内容还包括一种检测新型冠状病毒凝集抗体的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包括所述的B细胞表位靶标抗原、所述的表达盒、重组载体、重组菌株或凝集抗体检测***。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下显著优势：本发明所述新型冠状病毒(SARS-CoV-2)特异性靶标抗原QC07和QT05来自SARS-CoV-2RBD的B细胞表位序列，利用V型分泌***MisL实施功能性展呈表达特异性靶标抗原QC07和QT05。通过间接凝集试验，验证载体菌表达MisL，以及其菌体表面展示表达QC07和QT05，该TBE可精准识别和结合针对SARS-CoV-2受体结合域(RBD)B细胞表位的抗体，从而实现特异、敏感、快速的SARS-CoV-2凝集抗体检测。该凝集抗体检测***与其他人源冠状病毒阳性血清(包括非典病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征病毒(MERS-CoV)S蛋白感染小鼠血清)和动物源冠状病毒阳性血清(包括与牛冠状病毒BCV、猫冠状病毒FIPV、鸡冠状病毒IBV、猪冠状病毒包括猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的阳性感染血清，猪的丁型冠状病毒感染血清)不产生交叉反应。接种新冠灭活疫苗后第6天即可用本发明检测到特异性凝集抗体，该敏感性显著高于传统血清学检测技术，且能检测到特异性凝集抗体效价。鉴于本发明具有快速特异、敏感、便捷和成本低廉等优势，有望成为SARS-CoV-2早期感染诊断以及新冠疫苗免疫检测监测评估的重要技术和平台。

附图说明

图1、鸡伤寒沙门氏菌V型分泌***MisL结构示意图。

图2、鸡伤寒沙门氏菌V型分泌***MisL编码基因(misL基因)的PCR扩增鉴定电泳图。其中泳道M为Trans 2K plus II DNAMarker，泳道1为鸡伤寒沙门氏菌标准株NCTC13346的PCR扩增产物；泳道2为鸡伤寒沙门氏菌标准株C79-23的PCR扩增产物；泳道3为鸡伤寒沙门氏菌疫苗株SG01的PCR扩增产物；泳道4为禽致病性大肠杆菌分离株APEC-XM的基因组作为阴性对照；泳道5为大肠杆菌工程菌DH5α的基因组作为阴性对照。

图3、表达载体pBR-MisL酶切鉴定的核酸电泳图。其中泳道M为Trans 2K plus IIDNA Marker，泳道1为重组环状质粒pBR-MisL，泳道2为NheI单酶切pBR-MisL的DNA条带，泳道3为SalI单酶切pBR-MisL的DNA条带，泳道4为NheI和SalI双酶切pBR-MisL的DNA条带。

图4、***新冠病毒靶标抗原QC07和QT05序列后misL-QC07的PCR扩增鉴定电泳图。其中泳道M为Trans 2K Plus II DNA Marker，泳道1为misL基因的PCR扩增产物，模板DNA来自鸡伤寒沙门氏菌标准株NCTC 13346，作为阳性对照；泳道2为misL-QC07的PCR扩增产物；泳道3为misL-QT05的PCR扩增产物；泳道4为禽致病性大肠杆菌分离株APEC-XM的基因组作为阴性对照；泳道5为大肠杆菌工程菌DH5α的基因组作为阴性对照。

图5、含misL-QC07和misL-QT05基因的重组质粒pBR-MisL-QC07和pBR-MisL-QT05的酶切鉴定电泳图。其中泳道M为Trans 2K Plus II DNAMarker，泳道1为pBR322环状质粒阴性对照；泳道2为pBR-MisL-QC07环状质粒；泳道3为pBR-MisL-QC07的NheI单酶切产物；泳道4为pBR-MisL-QC07的SalI单酶切产物；泳道5为pBR-MisL-QC07的NheI和SalI双酶切产物；泳道6为pBR-MisL-QT05环状质粒；泳道7为pBR-MisL-QT05的NheI单酶切产物；泳道8为pBR-MisL-QT05的SalI单酶切产物；泳道9为pBR-MisL-QT05的NheI和SalI双酶切产物。

图6、表达载体pBR-MisL-QC07和pBR-MisL-QT05质粒示意图。

图7、SARS-CoV-2凝集抗体检测***DH-5α+pBR-MisL-QC07和DH-5α+pBR-MisL-QT05，分别与不同来源SARS-CoV-2阳性血清凝集反应结果图。A：两种凝集抗体检测***分别与国药新冠病毒灭活疫苗者血清样品的凝集反应；B：两种凝集抗体检测***分别与科兴新冠病毒灭活疫苗者血清样品的凝集反应；C：两种凝集抗体检测***分别与新冠康复志愿者血清样品的凝集反应；D：两种凝集抗体检测***分别与SARS-CoV-2的S蛋白免疫食蟹猴血清样品的凝集反应；E：阴性对照1，两种凝集抗体检测***与非典病毒(SARS-CoV)的S蛋白免疫小鼠血清样品均不凝集；F：阴性对照2，两种凝集抗体检测***与中东呼吸综合征病毒(MERS-CoV)的S蛋白免疫小鼠血清样品均不凝集；G：阴性对照3，两种凝集抗体检测***与牛冠状病毒(BCV)感染牛血清样品均不凝集；H：阴性对照4，两种凝集抗体检测***与犬冠状病毒(CCV)感染犬血清样品均不凝集；I：阴性对照5，两种凝集抗体检测***与猫冠状病毒(FCV)感染猫血清样品均不凝集；J：阴性对照6，两种凝集抗体检测***与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)感染猪血清样品均不凝集；K：阴性对照7，两种凝集抗体检测***与猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染猪血清样品均不凝集；L：阴性对照8，两种凝集抗体检测***与猪丁型冠状病毒(PDCoV)感染猪血清样品均不凝集。

图8、SARS-CoV-2凝集抗体检测***的抗体效价定量测试结果。

具体实施方式

实施例1鸡伤寒沙门氏菌V型分泌***MisL基因的克隆和在载体菌菌体表面展呈功能验证

MisL是沙门氏菌一种V型分泌***，位于细菌表面的一种关键毒力因子，由N端的信号肽序列，载客结构域(passenger domain，PD)，连接结构域和β-结构域(β筒状结构)4部分组成(图1)。其中，PD在分泌过程中能展示特殊功能肽段至胞外，通过V型分泌***表面展呈表达本申请发明的TBE。因此，V型分泌***MisL基因的克隆和功能鉴定是本发明的前提条件。基于鸡伤寒沙门氏菌源V型分泌***MisL基因的扩增和鉴定，克隆至pBR322表达质粒，通过电转化的方式将重组质粒pBR-MisL导入大肠杆菌载体菌中扩增表达，并进一步通过间接凝集试验表明携带重组质粒pBR-MisL的重组工程菌细菌悬液与鸡伤寒沙门氏菌阳性血清出现明显的凝集现象，验证大肠杆菌载体菌功能性表达鸡伤寒沙门氏菌V型分泌***MisL。具体实施程序如下：

根据NCBI公布的鸡伤寒沙门氏菌(Salmonella Gallinarum)287/91菌株全基因组序列(GenBank登录号AM933173.1，3860919-3863786)设计misL基因的分子克隆引物，上游引物SP misL Up 5’-GACGCTAGCATGCCAACTCCCCAAAATTACT-3’，下游引物SP misL Down 5’-CGCGTCGACTCAGAAACTGTATTTCATCCCCAA-3’，下划线序列分别代表NheI和SalI限制性酶切位点，上述引物由南京擎科生物科技有限公司合成。

以鸡伤寒沙门氏菌NCTC 13346菌株(购自中国兽医药品监察所，中国兽医微生物菌种保藏管理中心)的基因组为模板，利用上、下游引物SP misL Up/Down进行PCR扩增，扩增体系为：Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)1μL，2×Phanta Max Buffer 25μL，dNTPs 1μL，上下游引物(10mM)各2μL，鸡伤寒沙门氏菌NCTC 13346的基因组(250ng/μL)1μL，超纯水18μL。将上述体系混合均匀后利用热循环仪(Bio-Red)进行PCR扩增，程序如下：预变性95℃3min，扩增阶段共35个循环，包括变性95℃30s、退火58℃30s和延伸72℃3min，进一步扩增72℃5min，扩增结束后温度降低至12℃。鸡伤寒沙门氏菌标准株C79-23(购自中国兽医药品监察所，中国兽医微生物菌种保藏管理中心)和鸡伤寒沙门氏菌疫苗株SG01(Dai，Peng；Wu，Hu-Cong；Ding，Hai-Chuan；Li，Shou-Jun；Bao，En-Dong；Yang，Bao-Shou；Li，Ya-Jie；Gao，Xiao-Lei；Duan，Qiang-de；Zhu，Guo-Qiang.Safety and protective effects of an avirulent Salmonella Gallinarumisolate as a vaccine candidate against Salmonella Gallinarum infections inyoung chickens[J].Veterinary Immunology and Immunopathology，2022.253：110501.)的基因组作为阳性对照；禽致病性大肠杆菌分离株APEC-XM(刘家奇，武琥琮，尹义，张东，夏芃芃，任文凯，朱国强.禽源大肠杆菌致新生儿大肠杆菌型脑膜炎小鼠模型的构建研究[J].中国家禽，2019，41(10)：26-30.)和大肠杆菌工程菌DH5α的基因组作为阴性对照。

配置1％的琼脂糖凝胶，110V电泳45min后利用溴化乙锭染色后在紫外成像仪下成像观察，结果如图2所示，鸡伤寒沙门氏菌标准株NCTC 13346、鸡伤寒沙门氏菌标准株C79-23和鸡伤寒沙门氏菌疫苗株SG01均扩增出2886bp的DNA产物；禽致病性大肠杆菌分离株APEC-XM和大肠杆菌工程菌DH5α的基因组中未扩增出任何条带。利用通用型DNA纯化试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取鸡伤寒沙门氏菌标准株NCTC 13346基因组的PCR扩增产物。

提取pBR322质粒(商品化质粒，购自淼灵质粒平台，货号P0090)，利用NheI和SalI限制性内切酶(NEB)对鸡伤寒沙门氏菌标准株NCTC 13346的misL基因PCR扩增产物与pBR322质粒分别进行双酶切，然后利用T4 DNA连接酶(NEB)对上述线性DNA片段在16℃金属浴中过夜连接，次日将连接产物转化DH-5α感受态细胞，通过涂布含100μg/mL的氨苄青霉素固体培养基进行抗性菌落筛选。挑取平板上的单菌落接种至含100μg/mL的氨苄青霉素LB液体培养基中生长至平台期，提取质粒后经NheI、SalI单酶切和两种限制性内切酶双酶切。配置1％的琼脂糖凝胶，110V电泳45min后利用溴化乙锭染色后在紫外成像仪下成像观察，结果如图3所示，重组质粒pBR-MisL的NheI和SalI单酶切产物均为6807bp，双酶切产物为3939bp的线性载体和2868bp的MisL线性DNA片段，与预期片段大小一致，通过DNA测序验证(南京擎科生物科技有限公司)。

携带misL基因的重组质粒pBR-MisL的DH-5α工程菌在含100μg/mL的氨苄青霉素LB液体培养基中生长14小时至平台期，4000rpm离心5min后弃上清，用等体积无菌生理盐水重悬，离心洗涤2次后制备细菌悬液(终浓度1×10¹⁰CFU/mL)。将上述重组DH-5α工程菌细菌悬液与SPF鸡阴性血清(北京勃林格殷格翰公司)和鸡伤寒沙门氏菌阳性血清(经鸡伤寒沙门氏菌疫苗株SG01两次免疫SPF鸡，在免疫后30天采全血后析出获得)进行凝集试验，并利用含pBR322空载体的DH-5α工程菌的细菌悬液作为阴性对照。结果如表1所示，两种菌株的细菌悬液均不与阴性血清发生反应。携带重组质粒pBR-MisL的DH-5α工程菌细菌悬液与阳性血清出现明显的凝集现象，凝集颗粒大，背景清晰；而含pBR322空载体的DH-5α工程菌细菌悬液与阳性血清不发生凝集现象，无凝集颗粒，背景呈浑浊状。该结果表明来自鸡伤寒沙门氏菌的V型分泌***能够在DH-5α工程菌表面成功功能性展呈表达。

表1携带重组质粒pBR-MisL的DH-5α工程菌表达鸡伤寒沙门氏菌MisL的功能验证

实施例2携带新型冠状病毒B细胞表位靶标抗原(TBE)的V型分泌***MisL表达载体构建及其功能性表达验证

基于鸡伤寒沙门氏菌V型分泌***MisL基因的克隆和在载体菌菌体表面展呈功能验证的基础上，将新型冠状病毒(SARS-CoV-2)受体结合域(RBD)B细胞表位两种TBE(QC07和QT05)的DNA序列分别***鸡伤寒沙门氏菌V型分泌***MisL基因序列中，构建表达载体pBR-MisL-QC07和pBR-MisL-QT05，导入大肠杆菌载体菌中扩增表达，验证在载体菌菌体表面成功展示表达SARS-CoV-2特异性靶标抗原。具体实施程序如下：

通过NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)检索SARS-CoV-2武汉株(Wuhan-Hu-1)序列(登录号：OP268178.1)，从全基因组中找到刺突蛋白(S蛋白)基因序列和氨基酸序列。利用蛋白质数据库(https://www.rcsb.org/)找到已经解析的S蛋白晶体结构，为保障TBE在空间结构的独特性，因此需考虑到S蛋白受体结合域(RBD)存在开放与闭合两种状态(引用晶体结构的蛋白数据库ID为：6VXX和6ZGF)。利用NovoPro在线工具(https://www.novopro.cn/tools/)对S蛋白RBD区域氨基酸序列进行疏水性分析，筛选亲水基序，并通过蛋白质分析软件Pymol(https://pymol.org/2/)在空间结构上进行进一步分析和比对，筛选出2种表面暴露较好的靶标抗原的氨基酸序列，分别为：QC07：QAGSTPC，和QT05：QAGST。两种靶标抗原的基因序列分别为：CAGGCCGGTAGCACACCTTGT和CAGGCCGGTAGCACA。

同上方法，通过Pymol软件分析鸡伤寒沙门氏菌V型分泌***MisL蛋白结构中暴露性好的基序作为TBE替代区域。分析结果如表2所示，在MisL蛋白的筛共选到3个暴露性好的替代位点，由于上述筛选到的TBE均为亲水基序，因此根据3个替代序列的亲水性对替代位点进行评分，评分规则如下：序列中每存在一个疏水氨基酸-1分，每存在一个亲水氨基酸(包括极性氨基酸、酸性氨基酸和碱性氨基酸)+1分，得分最高的序列作为替代TBE的基序，即NDDDSETDRLQ，该序列亲水性评分达到9，包含10个亲水氨基酸，其基因序列为AACGATGATGATTCCGAAACGGACAGGCTGCAG。

表2筛选到的MisL蛋白的潜在TBE替代位点

由南京擎科生物科技有限公司合成两种嵌合基因，分别由QC07和QT05两种靶标抗原基因替换msiL基因序列中的替代位点，获得的嵌合基因命名为msiL-QC07和msiL-QT05。以上述2种嵌合基因为模板(1μL中含1ng嵌合基因)，鸡伤寒沙门氏菌标准株NCTC 13346基因组作为阳性对照，禽致病性大肠杆菌分离株APEC-XM基因组和大肠杆菌工程菌DH5α基因组作为阴性对照，并用实施例1中提到的一对引物SP misL Up和SP misL Down进行PCR扩增，PCR的体系和程序与实施例1中完全一致。配置1％的琼脂糖凝胶，110V电泳45min后利用溴化乙锭染色后在紫外成像仪下成像，PCR结果如图4所示，阳性对照的扩增大小为2886bp；msiL-QC07和msiL-QT05的PCR产物分别为：2874bp和2868bp；阴性对照无扩增条带。利用通用型DNA纯化试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取msiL-QC07和msiL-QT05的PCR扩增产物。

提取pBR322质粒，利用NheI和SalI限制性内切酶(NEB)对msiL-QC07和msiL-QT05的PCR扩增产物与pBR322质粒分别进行双酶切，然后利用T4 DNA连接酶(NEB)对上述线性DNA片段在16℃金属浴中过夜连接，次日将连接产物转化DH-5α感受态细胞，通过涂布含100μg/mL的氨苄青霉素固体培养基进行抗性筛选。挑取平板上的单菌落接种至含100μg/mL的氨苄青霉素LB液体培养基中生长至平台期，提取质粒后经NheI、SalI单酶切和两种限制性内切酶双酶切。配置1％的琼脂糖凝胶，110V电泳45min后利用溴化乙锭染色后在紫外成像仪下成像，结果如图5所示，重组质粒pBR-MisL-QC07和pBR-MisL-QT05的NheI和SalI单酶切产物分别为6798bp和6792bp；两种载体的双酶切产物菌包含3939bp的线性载体，以及2859bp的msiL-QC07和2853bp的msiL-msiL-QT05线性DNA片段，与预期大小一致。

携带重组质粒pBR-MisL-QC07和pBR-MisL-QT05的DH-5α工程菌在含100μg/mL的氨苄青霉素LB液体培养基中生长至平台期，4000rpm离心5min后弃上清，用等体积无菌生理盐水重悬，连续离心洗涤2次，制备细菌悬液(终浓度1×10¹⁰CFU/mL)。将携带上述重组质粒的重组DH-5α工程菌细菌悬液与SARS-CoV-2阴性血清(健康且未免疫新冠疫苗人血清10份)和SARS-CoV-2阳性血清(科兴、国药新冠灭活疫苗免疫自愿者血清各10份，新冠康复自愿者血清10份)分别进行凝集试验，并利用含pBR-MisL的DH-5α工程菌的细菌悬液作为阴性对照。结果如表3所示，所有菌株的细菌悬液均不与阴性血清发生反应；携带重组质粒pBR-MisL-QC07和pBR-MisL-QT05的重组DH-5α工程菌细菌悬液与阳性血清出现明显的凝集现象，凝集颗粒大，背景清晰；而仅含pBR-MisL质粒的DH-5α工程菌细菌悬液与阳性血清均不发生凝集现象，无凝集颗粒，背景呈浑浊状。该结果表明来自SARS-CoV-2刺突蛋白S的B细胞表位靶标抗原QC07和QT05能够通过V型分泌***MisL实现菌体表面展呈表达，并且能够特异性检测针对SARS-CoV-2的抗体。

在该抗体检测***中，DH-5α+pBR-MisL细菌悬液作为对照***，抗体检测***仅增加TBE，专一识别与结合特异性抗体，排除假阳性反应，从而确保个体精准诊断；DH-5α+pBR-MisL-QC07细菌悬液和DH-5α+pBR-MisL-QT05细菌悬液作为两种SARS-CoV-2特异性抗体检测***，特异性识别针对SARS-CoV-2的抗体。

表3载体菌DH-5α表面展呈表达MisL-QC07和MisL-QT05的功能验证

注：“-”代表凝集反应阴性；“+”代表凝集反应阳性

实施例3 SARS-CoV-2凝集抗体检测***的特异性和敏感性测试

基于载体菌DH-5α表面展呈表达新冠病毒靶标抗原QC07和QT05的功能验证，进一步对SARS-CoV-2凝集抗体检测***的特异性和敏感性测试，具体实施程序如下：

根据实施例2中的相同方法，准备对照***DH-5α+pBR-MisL细菌悬液、SARS-CoV-2凝集抗体检测***DH-5α+pBR-MisL-QC07细菌悬液和DH-5α+pBR-MisL-QT05细菌悬液。将上述三种细菌悬液分别与不同背景来源的血清进行凝集测试，以验证该凝集抗体检测***的特异性，参与检测的血清包括：107份健康人(未免疫新冠疫苗)血清、30份国药新冠病毒灭活疫苗志愿者血清、32份科兴新冠病毒灭活疫苗志愿者血清；50份新冠康复志愿者血清、30份健康食蟹猴血清、18份SARS-CoV-2的S蛋白免疫食蟹猴血清、3份健康SPF小鼠血清、10份非典病毒(SARS-CoV)的S蛋白免疫小鼠血清、10份中东呼吸综合征病毒(MERS-CoV)的S蛋白免疫小鼠血清、3份牛冠状病毒(BCV)感染牛血清、5份犬冠状病毒(CCV)感染犬血清、5份猫冠状病毒(FCV)感染猫血清、9份猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)感染猪血清、67份猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染猪血清和5份猪丁型冠状病毒(PDCoV)感染猪血清。检测结果如表4所示，30份国药新冠病毒灭活疫苗志愿者血清、32份科兴新冠病毒灭活疫苗志愿者血清、50份新冠康复志愿者血清样品与对照***不发生凝集，而与两种SARS-CoV-2抗体检测***均发生凝集反应；同时上述***与全部健康人(未免疫新冠疫苗)血清、健康食蟹猴血清、SARS-CoV-2的S蛋白免疫食蟹猴血清、健康SPF小鼠血清、非典病毒(SARS-CoV)的S蛋白免疫小鼠血清、中东呼吸综合征病毒(MERS-CoV)的S蛋白免疫小鼠血清、牛冠状病毒(BCV)感染牛血清、犬冠状病毒(CCV)感染犬血清、猫冠状病毒(FCV)感染猫血清、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)感染猪血清、猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染猪血清和猪丁型冠状病毒(PDCoV)感染猪血清均不发生凝集反应，其特异性为100％。凝集测试结果如图7所示。

表4基于鸡伤寒沙门氏菌V型分泌***MisL展呈表达靶标抗原QC07和QT05的SARS-CoV-2凝集抗体检测***的特异性验证

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注：“-”代表凝集反应阴性；“+”代表凝集反应阳性

本发明的测试中，分别收集了未免疫新冠疫苗血清200份，免疫新冠疫苗(国药或科兴，下同)1天的血清97份，免疫新冠疫苗2天的血清75份，免疫新冠疫苗3天的血清98份，免疫新冠疫苗4天的血清201份，免疫新冠疫苗5天的血清195份，免疫新冠疫苗6天的血清199份，免疫新冠疫苗7天的血清200份，免疫新冠疫苗8天的血清215份，免疫新冠疫苗9天的血清204份，免疫新冠疫苗10天的血清199，免疫新冠疫苗11天的血清134份，免疫新冠疫苗12天的血清155份，免疫新冠疫苗13天的血清195份，免疫新冠疫苗14天的血清175份，免疫新冠疫苗15天的血清140份。这些血清来自SARS-CoV-2灭活疫苗和采集血样的志愿者，并且我们对志愿者的年龄和性别没有要求。将上述2682份血清进行2ⁿ倍比稀释：在96孔板各孔中加入10μL无菌生理盐水，然后吸取10μL血清加入每一列的第一孔，与无菌生理盐水充分混合后将10μL稀释的血清加入下一孔，并以此为循环稀释至2¹²倍。将每个稀释度的血清与DH-5α+pBR-MisL、DH-5α+pBR-MisL-QC07和DH-5α+pBR-MisL-QT05细菌悬液分别进行凝集测试，其中DH-5α+pBR-MisL作为阴性对照，最后一个出现凝集颗粒的稀释度作为该血清抗体效价。凝集试验的阳性率结果如表5所示，接种者中最早可以在第6天检测到凝集抗体，该敏感性显著高于传统血清学检测技术，且随着免疫时长的增加，凝集测试的阳性率逐渐增加；定量测试结果如图8所示，在免疫后第11天，可测得凝集抗体效价达到1∶16。

综上所述，本发明的SARS-CoV-2凝集抗体测试方法的特异性和敏感性好。与目前针对SARS-CoV-2的免疫学检测方法(胶体金、免疫发光、ELISA等)报道的结果比较，本技术的敏感性显著性提高，且能定量检测到特异性凝集抗体效价。

表5基于鸡伤寒沙门氏菌V型分泌***MisL展呈表达靶标抗原QC07和QT05的SARS-CoV-2凝集抗体检测***的敏感性验证

综上所述，本发明提供新型冠状病毒(SARS-CoV-2)受体结合域(RBD)B细胞表位两种靶标抗原(TBE)QC07和QT05在鸡伤寒沙门氏菌V型分泌***展呈表达及其凝集抗体检测应用。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都要求在保护本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (9)

1.新型冠状病毒受体结合域B细胞表位的靶标抗原，其特征在于，所述靶标抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述的靶标抗原的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的序列如SEQ ID NO.3所示。

3.表达盒、重组载体、重组菌株或凝集抗体检测***，其特征在于，包含权利要求2所述的核酸分子。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体是将权利要求2所述的核酸分子***鸡伤寒沙门氏菌V型分泌***MisL编码基因序列中，构建得到的重组载体。

5.根据权利要求3所述的凝集抗体检测***，其特征在于，所述凝集抗体检测***是通过将权利要求4所述的重组载体导入载体菌中即得。

6.权利要求4所述的重组载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）新型冠状病毒受体结合域B细胞表位的靶标抗原DNA序列的获得，所述靶标抗原的DNA序列如SEQ ID NO.3所示；

（2）将步骤（1）得到的DNA序列***鸡伤寒沙门氏菌V型分泌***MisL编码基因序列中，构建表达载体。

7.权利要求5所述的凝集抗体检测***的构建方法，其特征在于，所述构建方法除了包括权利要求6的步骤（1）和步骤（2），还包括步骤（3）将表达载体通过电转化的方式导入载体菌中即得。

8.权利要求1所述的靶标抗原，权利要求2所述的核酸分子，权利要求3所述的表达盒、重组载体、重组菌株或凝集抗体检测***在制备检测新型冠状病毒凝集抗体的试剂或试剂盒中的应用。

9.一种检测新型冠状病毒凝集抗体的试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒包括权利要求1所述的靶标抗原或权利要求3所述的表达盒、重组载体、重组菌株或凝集抗体检测***。