CN113637636B - 一种提高体外培养初始t细胞比例的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高体外培养初始T细胞比例的方法，本申请创造性的对培养方法进行改进，静置培养激活24h后通过磁石去除CD3/CD28抗体偶联磁珠，相比于传统的不去除磁珠的方法，激活24小时后去除磁珠可减少T细胞分化、显著提高初始T细胞的比例，以提高终点获得的T细胞群体中初始T细胞占比；本发明所涉及的培养方法可提高初始T细胞的比例，培养终点获得的T细胞群体中初始T细胞占比超过70％，同时整个步骤操作简单，规模可扩大，适合用于大规模生产Tn进行临床转化，由于初始T细胞可最大限度保留T细胞分化潜能，被认为在T细胞过继免疫治疗中具有更好的治疗效果，因而本发明提供的方法具有很高的临床应用价值。

Description

一种提高体外培养初始T细胞比例的方法
技术领域
本发明涉及T细胞培养技术领域，具体为一种提高体外培养初始T细胞比例的方法。
背景技术
T淋巴细胞简称T细胞，来源于淋巴干细胞，在胸腺中分化、发育成熟后，通过淋巴和血液循环而分布到全身的免疫器官和组织中发挥免疫功能。T细胞具有多种生物学功能，如直接杀伤靶细胞，辅助其它淋巴细胞发挥功能，对特异性抗原或促有丝***原的应答反应以及产生细胞因子，是身体抵御疾病感染、防止肿瘤形成的主要免疫细胞之一。在体外富集、活化、扩增这类免疫细胞，可用于回输治疗多种疾病，包括恶性肿瘤、感染、自身免疫病等。
T细胞根据其分化程度可分为初始T细胞(Tn)，记忆T细胞(Tcm)，效应T细胞(Tem)。初始T细胞在胸腺中发育成熟迁移至外周淋巴组织中(如脾脏、***)。肿瘤患者体内初始T细胞接触肿瘤细胞表面肿瘤相关抗原，在抗原呈递细胞的识别和呈递下，以及一系列的信号通路，增殖分化为效应T细胞和记忆T细胞。效应T细胞和记忆T细胞有着不同的功能，前者分泌穿孔素、颗粒素酶和颗粒溶素等物质，并通过Fas配体直接杀伤肿瘤细胞，但在体内存活时间较短(3～4个月)，且无法继续增殖。记忆T细胞能够在血液***中长期存在，遇到肿瘤细胞表面肿瘤相关抗原后还能再次被激活，并***增殖为具有杀伤功能的效应性T细胞。
初始T细胞(Tn)的表面分子标志物组合可定义为CD45RA+CCR7+。Tn具有自我更新并分化为其它效应和记忆T细胞亚群的能力。因而在T细胞过继免疫治疗中，扩增后回输的T细胞群体中初始T细胞的比例是与疗效相关的重要指标。提高T细胞过继免疫治疗中终末初始T细胞的比例，可以增加细胞回输病人体内之后的免疫效应时间。
现有技术的T细胞培养方法并不能选择性的维持或扩增Tn亚群以达到在终末回输的T细胞群体中富集Tn的目的，在临床应用时治疗效果较差，基于该情况，我们公开了一种提高体外培养初始T细胞比例的方法，以解决该问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高体外培养初始T细胞比例的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
一种提高体外培养初始T细胞比例的方法，包括以下步骤：
(1)分离PBMC细胞；
(2)静置培养：取分离好的PBMC细胞悬液，通过抗体偶联磁珠培养激活后，培养24h转移至培养瓶中继续培养3d；
(3)振荡培养：取步骤(2)培养的T细胞，振荡培养，离心收获细胞。
较优化的方案，步骤(2)静置培养步骤为：取分离好的PBMC细胞悬液，转移至培养瓶中，并加入抗体偶联磁珠和IL-2，在37℃、5％二氧化碳条件下静置培养24h，磁石除去抗体偶联磁珠；
步骤(3)振荡培养步骤为：
S1：将步骤(2)中的培养物转移至新的培养瓶中继续培养，培养3d后，检测T细胞密度，并转移至培养袋中，加入含有IL-2的培养基，使细胞密度降低到0.5×106个/ml；
S2：取培养的T细胞，在37℃、5％二氧化碳条件下振荡培养，培养4d后保持细胞密度为0.5×106个/ml，继续培养4d，离心收获细胞。
步骤S2具体为：取培养的T细胞，在至37℃、5％二氧化碳条件下的WAVE反应器中，振荡培养4d后，加入含有IL-2的培养基，保持细胞密度为0.5×106个/ml，继续培养4d，离心收获细胞。WAVE反应器中振荡培养转速为10rpm，转角为6°。
较优化的方案，步骤(2)、步骤(3)中，IL-2的终浓度均为100IU/mL。
较优化的方案，步骤(2)中，培养瓶中细胞密度为0.8-1.2×106个/ml。
较优化的方案，步骤(2)中，抗体偶联磁珠的添加量为总细胞数的3倍。
较优化的方案，步骤(2)中，所述抗体偶联磁珠为CD3/CD28抗体偶联磁珠。
较优化的方案，步骤(1)中，采用密度离心法从人全血中新鲜分离PBMC细胞。
较优化的方案，培养瓶为T75培养瓶，培养基为T细胞无血清培养基，所述T细胞无血清培养基为X-Vivo-15、OpTmizer、OptiVitro中的任意一种。
与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：
在现有技术中，现有技术一般会加入CD3/CD28抗体以诱导促进干细胞样记忆性T细胞(TSCM)的增殖，但在此之后的操作中并不会去除CD3/CD28抗体，而本申请创造性的对培养方法进行改进，静置培养激活24h后通过磁石去除CD3/CD28抗体偶联磁珠，相比于传统的不去除磁珠的方法，激活24小时后去除磁珠可减少T细胞分化、显著提高初始T细胞的比例，以实现扩增终点的T细胞群体中富集Tn，提高终点获得的T细胞群体中初始T细胞占比。
本申请提供了一种提高体外培养初始T细胞比例的方法，和传统T细胞培养方法相比，本发明所涉及的培养方法可提高初始T细胞的比例，使得扩增终点的T细胞群体中富集Tn，培养终点获得的T细胞群体中初始T细胞占比超过70％，同时整个步骤操作简单，规模可扩大，适合用于大规模生产Tn进行临床转化，由于初始T细胞可最大限度保留T细胞分化潜能，被认为在T细胞过继免疫治疗中具有更好的治疗效果，因而本发明提供的方法具有很高的临床应用价值。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是本发明实施例1对应的流式检测结果示意图；
图2是本发明对比例1对应的流式检测结果示意图；
图3是本发明实施例2对应的流式检测结果示意图；
图4是本发明对比例2对应的流式检测结果示意图；
图5是本发明实施例3对应的流式检测结果示意图；
图6是本发明对比例3对应的流式检测结果示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本申请以下实施例所采用的实验材料如下：
(1)CD3/CD28抗体偶联磁珠：GIBCO品牌，货号11132D，品名Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation；
(2)T细胞无血清培养基：
Lonza(龙沙)品牌，货号BE02-060F，品名免疫细胞无血清培养基；
GIBCO品牌，货号A1048501，品名T细胞扩增SFM培养基；
Excellbio(依科赛)品牌，货号TE000-N022，品名T细胞无血清培养基；
(3)流式测试抗体：
Biolegend品牌，货号304106，品名FITC anti-human CD45RA抗体，货号353212，品名APC/Cyanine7 anti-human CCR7抗体。
实施例1：
一种提高体外培养初始T细胞比例的方法，包括以下步骤：
(1)采用密度离心法从人全血中新鲜分离PBMC细胞，以用于T细胞的激活扩增；
(2)取分离好的PBMC细胞悬液，转移至T75培养瓶中，使用15mLX-Vivo-15(Lonza)培养基，培养瓶中细胞密度为1×106个/ml，并加入CD3/CD28抗体偶联磁珠和终浓度100IU/mL的IL-2，CD3/CD28抗体偶联磁珠的添加量为4.5×107，放入37℃，5％二氧化碳培养箱内继续培养24h，磁石除去CD3/CD28抗体偶联磁珠；
(3)培养物转移至新的T75培养瓶中继续培养，培养3d后，检测T细胞密度，将T细胞转入培养袋中，加入适量新鲜的含有终浓度100IU/mL的IL2的T细胞无血清培养基，使细胞密度降低到0.5×106个/ml；
(4)将上述培养袋置于37℃、5％二氧化碳条件下的WAVE反应器中，振荡培养时转速为10rpm，转角为6°，振荡培养4d后，加入适量新鲜的含有终浓度100IU/mL的IL2的T细胞无血清培养基，保持细胞密度为0.5×106个/ml，继续培养4d，离心收获细胞，并进行对细胞表现标志物CD45RA和CCR7进行流式细胞仪检测。
对比例1：
一种提高体外培养初始T细胞比例的方法，包括以下步骤：
(1)采用密度离心法从人全血中新鲜分离PBMC细胞，以用于T细胞的激活扩增；
(2)取分离好的PBMC细胞悬液，转移至T75培养瓶中，使用15mLX-Vivo-15(Lonza)培养基，培养瓶中细胞密度为1×106个/ml，并加入终浓度10μg/mL的CD3抗体，终浓度5μg/mL的CD28抗体和终浓度100IU/mL的IL-2，放入37℃，5％二氧化碳培养箱内继续培养；
(3)培养3d后，检测T细胞密度，将T细胞转入培养袋中，加入适量新鲜的含有终浓度100IU/mL的IL2的T细胞无血清培养基，使细胞密度降低到0.5×106个/ml；
(4)将上述培养袋置于37℃、5％二氧化碳条件下的WAVE反应器中，振荡培养时转速为10rpm，转角为6°，振荡培养4d后，加入适量新鲜的含有终浓度100IU/mL的IL2的T细胞无血清培养基，保持细胞密度为0.5×106个/ml，继续培养4d，离心收获细胞，并进行对细胞表现标志物CD45RA和CCR7进行流式细胞仪检测。
实施例2：
一种提高体外培养初始T细胞比例的方法，包括以下步骤：
(1)采用密度离心法从人全血中新鲜分离PBMC细胞，以用于T细胞的激活扩增；
(2)取分离好的PBMC细胞悬液，转移至T75培养瓶中，使用15mLOpTmizer(GIBCO)培养基，培养瓶中细胞密度为1×106个/ml，并加入CD3/CD28抗体偶联磁珠和终浓度100IU/mL的IL-2，CD3/CD28抗体偶联磁珠的添加量为4.5×107，放入37℃，5％二氧化碳培养箱内继续培养24h，磁石除去CD3/CD28抗体偶联磁珠；
(3)培养物转移至新的T75培养瓶中继续培养，培养3d后，检测T细胞密度，将T细胞转入培养袋中，加入适量新鲜的含有终浓度100IU/mL的IL2的T细胞无血清培养基，使细胞密度降低到0.5×106个/ml；
(4)将上述培养袋置于37℃、5％二氧化碳条件下的WAVE反应器中，振荡培养时转速为10rpm，转角为6°，振荡培养4d后，加入适量新鲜的含有终浓度100IU/mL的IL2的T细胞无血清培养基，保持细胞密度为0.5×106个/ml，继续培养4d，离心收获细胞，并进行对细胞表现标志物CD45RA和CCR7进行流式细胞仪检测。
对比例2：
一种提高体外培养初始T细胞比例的方法，包括以下步骤：
(1)采用密度离心法从人全血中新鲜分离PBMC细胞，以用于T细胞的激活扩增；
(2)取分离好的PBMC细胞悬液，转移至T75培养瓶中，使用15mLOpTmizer(GIBCO)培养基，培养瓶中细胞密度为1×106个/ml，并加入终浓度10μg/mL的CD3抗体，终浓度5μg/mL的CD28抗体和终浓度100IU/mL的IL-2，放入37℃，5％二氧化碳培养箱内继续培养；
(3)培养3d后，检测T细胞密度，将T细胞转入培养袋中，加入适量新鲜的含有终浓度100IU/mL的IL2的T细胞无血清培养基，使细胞密度降低到0.5×106个/ml；
(4)将上述培养袋置于37℃、5％二氧化碳条件下的WAVE反应器中，振荡培养时转速为10rpm，转角为6°，振荡培养4d后，加入适量新鲜的含有终浓度100IU/mL的IL2的T细胞无血清培养基，保持细胞密度为0.5×106个/ml，继续培养4d，离心收获细胞，并进行对细胞表现标志物CD45RA和CCR7进行流式细胞仪检测。
实施例3：
一种提高体外培养初始T细胞比例的方法，包括以下步骤：
(1)采用密度离心法从人全血中新鲜分离PBMC细胞，以用于T细胞的激活扩增；
(2)取分离好的PBMC细胞悬液，转移至T75培养瓶中，使用15mLOptiVitro(Excellbio)培养基，培养瓶中细胞密度为1×106个/ml，并加入CD3/CD28抗体偶联磁珠和终浓度100IU/mL的IL-2，CD3/CD28抗体偶联磁珠的添加量为4.5×107，放入37℃，5％二氧化碳培养箱内继续培养24h，磁石除去CD3/CD28抗体偶联磁珠；
(3)培养物转移至新的T75培养瓶中继续培养，培养3d后，检测T细胞密度，将T细胞转入培养袋中，加入适量新鲜的含有终浓度100IU/mL的IL2的T细胞无血清培养基，使细胞密度降低到0.5×106个/ml；
(4)将上述培养袋置于37℃、5％二氧化碳条件下的WAVE反应器中，振荡培养时转速为10rpm，转角为6°，振荡培养4d后，加入适量新鲜的含有终浓度100IU/mL的IL2的T细胞无血清培养基，保持细胞密度为0.5×106个/ml，继续培养4d，离心收获细胞，并进行对细胞表现标志物CD45RA和CCR7进行流式细胞仪检测。
对比例3：
一种提高体外培养初始T细胞比例的方法，包括以下步骤：
(1)采用密度离心法从人全血中新鲜分离PBMC细胞，以用于T细胞的激活扩增；
(2)取分离好的PBMC细胞悬液，转移至T75培养瓶中，使用15mLOptiVitro(Excellbio)培养基，培养瓶中细胞密度为1×106个/ml，并加入终浓度10μg/mL的CD3抗体，终浓度5μg/mL的CD28抗体和终浓度100IU/mL的IL-2，放入37℃，5％二氧化碳培养箱内继续培养；
(3)培养3d后，检测T细胞密度，将T细胞转入培养袋中，加入适量新鲜的含有终浓度100IU/mL的IL2的T细胞无血清培养基，使细胞密度降低到0.5×106个/ml；
(4)将上述培养袋置于37℃、5％二氧化碳条件下的WAVE反应器中，振荡培养时转速为10rpm，转角为6°，振荡培养4d后，加入适量新鲜的含有终浓度100IU/mL的IL2的T细胞无血清培养基，保持细胞密度为0.5×106个/ml，继续培养4d，离心收获细胞，并进行对细胞表现标志物CD45RA和CCR7进行流式细胞仪检测。
实施例4：
一种提高体外培养初始T细胞比例的方法，包括以下步骤：
(1)采用密度离心法从人全血中新鲜分离PBMC细胞，以用于T细胞的激活扩增；
(2)取分离好的PBMC细胞悬液，转移至T75培养瓶中，使用15mLOptiVitro(Excellbio)培养基，培养瓶中细胞密度为0.8×106个/ml，并加入CD3/CD28抗体偶联磁珠和终浓度100IU/mL的IL-2，CD3/CD28抗体偶联磁珠的添加量为3.6×107，放入37℃，5％二氧化碳培养箱内继续培养24h，磁石除去CD3/CD28抗体偶联磁珠；
(3)培养物转移至新的T75培养瓶中继续培养，培养3d后，检测T细胞密度，将T细胞转入培养袋中，加入适量新鲜的含有终浓度100IU/mL的IL2的T细胞无血清培养基，使细胞密度降低到0.5×106个/ml；
(4)将上述培养袋置于37℃、5％二氧化碳条件下的WAVE反应器中，振荡培养时转速为10rpm，转角为6°，振荡培养4d后，加入适量新鲜的含有终浓度100IU/mL的IL2的T细胞无血清培养基，保持细胞密度为0.5×106个/ml，继续培养4d，离心收获细胞，并进行对细胞表现标志物CD45RA和CCR7进行流式细胞仪检测。
实施例5：
一种提高体外培养初始T细胞比例的方法，包括以下步骤：
(1)采用密度离心法从人全血中新鲜分离PBMC细胞，以用于T细胞的激活扩增；
(2)取分离好的PBMC细胞悬液，转移至T75培养瓶中，使用15mLOptiVitro(Excellbio)培养基，培养瓶中细胞密度为1.2×106个/ml，并加入CD3/CD28抗体偶联磁珠和终浓度100IU/mL的IL-2，CD3/CD28抗体偶联磁珠的添加量为5.4×107，放入37℃，5％二氧化碳培养箱内继续培养24h，磁石除去CD3/CD28抗体偶联磁珠；
(3)培养物转移至新的T75培养瓶中继续培养，培养3d后，检测T细胞密度，将T细胞转入培养袋中，加入适量新鲜的含有终浓度100IU/mL的IL2的T细胞无血清培养基，使细胞密度降低到0.5×106个/ml；
(4)将上述培养袋置于37℃、5％二氧化碳条件下的WAVE反应器中，振荡培养时转速为10rpm，转角为6°，振荡培养4d后，加入适量新鲜的含有终浓度100IU/mL的IL2的T细胞无血清培养基，保持细胞密度为0.5×106个/ml，继续培养4d，离心收获细胞，并进行对细胞表现标志物CD45RA和CCR7进行流式细胞仪检测。
检测试验：
1、根据上述实施例1-5、对比例1-3所公开的详细步骤培养T细胞，第12天离心收集细胞，并进行对细胞表现标志物CD45RA和CCR7进行流式细胞仪检测，记录并统计CD45RA和CCR7双阳性(CD45RA+CCR7+)Tn的比例，具体数据如下表所示：
项目 实施例1 对比例1 实施例2 对比例2
双阳性(CD45RA+CCR7+)Tn 72.9％ 32.5％ 81.2％ 37.5％
项目 实施例3 对比例3 实施例4 实施例5
双阳性(CD45RA+CCR7+)Tn 85.1％ 37.8％ 84.3％ 86.7％
结论：如图1、图2所示，实施例1中显示CD45RA和CCR7双阳性(CD45RA+CCR7+)Tn的比例达72.9％，远高于对比例1公开的传统静置培养方法的32.5％。
如图3、图4所示，实施例2中显示CD45RA和CCR7双阳性(CD45RA+CCR7+)Tn的比例达81.2％，远高于对比例2公开的传统静置培养方法的37.5％。
如图5、图6所示，实施例3中显示CD45RA和CCR7双阳性(CD45RA+CCR7+)Tn的比例达85.1％，远高于对比例3公开的传统静置培养方法的37.8％。
由上数据可知：本申请提供了一种提高体外培养初始T细胞比例的方法，和传统T细胞培养方法相比，本发明所涉及的培养方法可提高初始T细胞的比例，使得扩增终点的T细胞群体中富集Tn，培养终点获得的T细胞群体中初始T细胞占比超过70％，同时整个步骤操作简单，规模可扩大，适合用于大规模生产Tn进行临床转化，由于初始T细胞可最大限度保留T细胞分化潜能，被认为在T细胞过继免疫治疗中具有更好的治疗效果，因而本发明提供的方法具有很高的临床应用价值。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种提高体外培养初始T细胞比例的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）分离PBMC细胞；
（2）静置培养：取分离好的PBMC细胞悬液，转移至含T细胞无血清培养基的培养瓶中，并加入抗体偶联磁珠和IL-2，在37℃、5%二氧化碳条件下静置培养24h，磁石除去所述抗体偶联磁珠；培养瓶中细胞密度为0.8-1.2×106个/ml；抗体偶联磁珠的添加量为总细胞数的3倍；所述抗体偶联磁珠为CD3/CD28抗体偶联磁珠；
（3）振荡培养：
S1：将步骤（2）中的培养物转移至新的培养瓶中继续培养，培养3d后，检测T细胞密度，并转移至培养袋中，加入含有IL-2的培养基，使细胞密度降低到0.5×106个/ml；
S2： 取培养的T细胞，在37℃、5%二氧化碳条件下的WAVE反应器中，振荡培养4d后，加入含有IL-2的培养基，保持细胞密度为0.5×106个/ml，继续培养4d，离心收获细胞；
所述培养瓶为T75培养瓶，所述培养基为T细胞无血清培养基，所述T细胞无血清培养基为X-Vivo-15、OpTmizer、OptiVitro中的任意一种。
2.根据权利要求1所述的一种提高体外培养初始T细胞比例的方法，其特征在于：WAVE反应器中振荡培养转速为10rpm，转角为6°。
3.根据权利要求1中所述的一种提高体外培养初始T细胞比例的方法，其特征在于：步骤（2）、步骤（3）中，IL-2的终浓度均为100IU/mL。
4.根据权利要求1所述的一种提高体外培养初始T细胞比例的方法，其特征在于：步骤（1）中，采用密度离心法从人全血中分离PBMC细胞。
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