CN113636975A - 啶酰菌胺半抗原及其制备方法、抗原、抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种啶酰菌胺半抗原、制备该啶酰菌胺半抗原的中间体以及由该半抗原偶联载体蛋白得到的啶酰菌胺抗原、利用该啶酰菌胺抗原免疫动物得到的啶酰菌胺抗体、以及由此制备的啶酰菌胺胶体金层析检测装置和其用途，本发明利用层析式免疫胶体金原理，通过试纸条中检测线与质控线之间的比色来半定量检测中成药或保健食品中非法添加的啶酰菌胺的含量，该检测装置能够快速、准确地检测出诸如水果或蔬菜等中的啶酰菌胺，能满足监管部门、检测机构现场监督执法的需要。与现有技术相比，本发明具有敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、保质期长的优点。本发明可应用于诸如水果或蔬菜等中的啶酰菌胺的快速检测。

Description

啶酰菌胺半抗原及其制备方法、抗原、抗体及其应用
技术领域
本发明涉及食品安全检测领域。更具体地，本发明涉及一种啶酰菌胺半抗原及其制备方法、啶酰菌胺抗原、啶酰菌胺抗体以及上述半抗原、抗原和抗体在免疫学检测中的应用。
背景技术
啶酰菌胺(Boscalid)是德国巴斯夫公司开发的新型烟酰胺类内吸性杀菌剂，是线粒体呼吸链中琥珀酸-辅酶Q还原酶的抑制剂，主要用于防治白粉病、灰霉病、菌核病、褐腐病和根腐病等众多病害，可用于包括油菜、葡萄、果树、番茄、蔬菜和大田作物等作物相关病害的防治。
啶酰菌胺(Boscalid)具有特有的作用机理，与其它药物无交互抗性，对作物具有安全和有利的生态效果和毒理数据，是一种重要的新型杀菌剂。目前啶酰菌胺已经在我国黄瓜、苹果、甜瓜和草莓4种作物上进行了登记，最大允许残留分别为5mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、3mg/kg。已经有人报道了啶酰菌胺对油菜菌核病具有良好的防治效果，对草莓灰霉病菌具有较强的抑制作用，对草莓具有较好的保护作用。
在德国的一份报告中指出，高浓度的啶酰菌胺对小鼠和狗几乎没有毒性，没有观察到致癌毒性、生殖毒性、基因毒性和遗传毒性，轻微增加大鼠的甲状腺滤泡腺瘤的发病率。已有的研究成果发现大部分酰胺类的化合物对哺乳动物都是安全的。尽管已有的研究成果表明同为酰胺类农药的丁草胺对两栖动物具有遗传毒性作用，乙草胺对蝌蚪造成了活动异常的毒性，但现有的研究结果中没有对哺乳动物以外生物影响的数据，尤其是啶酰菌胺对环境中其他生物的影响不明。
但随着这种农药的普及，简单快速的检测方法的建立也变得尤为必要，现今啶酰菌胺主要的分析方法有：高效液相色谱法(HPLC法)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)及薄层色谱法(TLC)等。仪器分析方法灵敏度高，结果准确，但样品需经一系列复杂的净化处理，且操作繁琐费时，所需仪器设备昂贵，而且需特定的专业技术人员才能操作，不能进行现场检测，时效性差，难以推广普及。
在建立免疫学检测方法并应用该检测方法检测啶酰菌胺残留量时，关键技术在于能够获取到特异性强、灵敏度高的抗体，而要实现这一目标，前提条件就是得制备出合适的啶酰菌胺半抗原。但是，目前国内还没有针对啶酰菌胺半抗原合成及其相关快检产品的相关报道。
因此，本领域亟需设计和开发出一种合适的啶酰菌胺半抗原，藉此来实现通过免疫学检测分析方法来检测啶酰菌胺农药残留。
发明内容
有鉴于此，本发明设计并合成了一种啶酰菌胺半抗原、由此提供了相应的抗原、抗体、及其免疫学检测中的应用，以及包括上述抗原和抗体的免疫学检测装置。
根据本发明的第一方面，本发明提供了一种啶酰菌胺半抗原，其中，所述啶酰菌胺半抗原的结构如式(I)所示：
Figure BDA0003208404770000021
其中，n为2、3、4或5。
根据本发明的第二方面，本发明提供了用于制备式(I)所示的啶酰菌胺半抗原的中间体，其为：
Figure BDA0003208404770000031
其中，n为2、3、4或5。
根据本发明的第三方面，提供了一种制备本发明的第一方面所述的啶酰菌胺半抗原的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
1)在催化剂的作用下，使2-卤代硝基苯例如2-溴硝基苯与4-羟基苯硼酸反应，得到中间体1：
Figure BDA0003208404770000032
优选地，将2-卤代硝基苯、4-羟基苯硼酸溶解后加入碱和催化剂，得到中间体1；
优选地，所述反应在pH为8-10的条件下进行；
优选地，所述碱为碳酸氢钠、碳酸钠、碳酸氢钾、碳酸钾或碳酸铯；
优选地，所述催化剂为钯类催化剂，例如[1,1-双(二苯基磷)二茂铁]二氯化钯、醋酸钯或四(三苯基膦)钯；
优选地，2-卤代硝基苯与4-羟基苯硼酸的摩尔比为1：1；
2)使中间体1与卤代酯发生取代反应，得到中间体2：
Figure BDA0003208404770000033
其中n为2、3、4或5，
其中，所述卤代酯是2-卤代乙酸甲酯、2-卤代乙酸乙酯、2-卤代乙酸丙酯、2-卤代乙酸叔丁酯、3-卤代丙酸甲酯、3-卤代丙酸乙酯、3-卤代丙酸丙酯、3-卤代丙酸叔丁酯、4-卤代丁酸甲酯、4-卤代丁酸乙酯、4-卤代丁酸丙酯、4-卤代丁酸叔丁酯、5-卤代戊酸甲酯、5-卤代戊酸乙酯、5-卤代戊酸丙酯或5-卤代戊酸叔丁酯；
优选地，在pH 8-10的条件下，于50-90℃，使中间体1与所述卤代酯在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中反应，直至反应结束；
优选地，中间体1与所述卤代酯的摩尔比为1:1.2；
3)对中间体2进行硝基的还原反应，得到中间体3：
Figure BDA0003208404770000041
其中n为2、3、4或5；
优选地，所述还原反应在钯碳、三氯化铁和水合肼的共同作用下进行；
4)使中间体3与2-氯烟酰氯发生酰胺化反应，得到中间体4；
优选地，中间体3与2-氯烟酰氯的摩尔比为1:1；以及
5)使中间体4发生酯的水解反应，得到式(I)所示的化合物；
优选地，在氢氧化锂的作用下进行所述水解反应；
优选地，所述水解反应完成后，将溶液的pH调节至5-6；
优选地，中间体4与氢氧化锂的摩尔比为1:1.2。
根据本发明的第四方面，提供了一种啶酰菌胺抗原，其中，所述啶酰菌胺抗原包含：本发明的第一方面所述的啶酰菌胺半抗原，以及与所述啶酰菌胺半抗原偶联的载体蛋白。
根据本发明的第五方面，提供了一种啶酰菌胺抗体，其中，所述啶酰菌胺抗体为特异性针对本发明的第四方面所述的啶酰菌胺抗原的抗体；优选地，所述啶酰菌胺抗体为啶酰菌胺单克隆抗体或啶酰菌胺多克隆抗体。
根据本发明的第六方面，提供了本发明的第一方面所述的啶酰菌胺半抗原、本发明的第四方面所述的啶酰菌胺抗原、和/或本发明的第五方面所述的啶酰菌胺抗体在免疫学检测中的应用。
根据本发明的第七方面，提供了一种啶酰菌胺胶体金层析检测装置，包括试纸条和反应杯，其中，所述试纸条包括反应膜，所述反应膜上有检测线和质控线，并且其中，所述检测线包被有本发明的第四方面所述的啶酰菌胺抗原，并且其中，所述反应杯中含有胶体金标记的本发明的第五方面所述的啶酰菌胺抗体。
根据本发明的第八方面，提供了一种检测样品中啶酰菌胺的方法，所述方法包括：使用本发明的第七方面所述的胶体金层析检测装置对样品中的啶酰菌胺进行检测。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种啶酰菌胺半抗原，制备该啶酰菌胺半抗原的中间体以及制备该啶酰菌胺半抗原的方法，同时还提供了相应的啶酰菌胺抗原和啶酰菌胺抗体，此外还将其应用于免疫学检测中，并且由此提出了啶酰菌胺胶体金层析检测装置和检测样品中啶酰菌胺的方法。
在制备啶酰菌胺半抗原的方法中，通过多步合成来制备啶酰菌胺半抗原，所制备的啶酰菌胺半抗原最大程度地保留了啶酰菌胺的特征结构，增强了啶酰菌胺半抗原的免疫性，并且同时通过进行适当的化学修饰引入了与载体蛋白偶联的活性基团-羧基，将合成的半抗原与载体蛋白偶联制备人工抗原，利用人工抗原免疫动物获得抗体，为后续建立啶酰菌胺的各种免疫分析方法提供原材料。本发明的啶酰菌胺半抗原的制备，使用的化学试剂容易得到，实验操作过程容易掌握，每步反应产率较高，并且与仪器方法相比较，其检测成本较低。
此外，本发明提供的啶酰菌胺胶体金层析检测装置利用层析式免疫胶体金原理，通过试纸条中检测线与质控线之间的比色来半定量检测诸如水果或蔬菜等中的啶酰菌胺农药残留。该检测装置能够短时间内快速、准确地检测出诸如水果或蔬菜等中的啶酰菌胺，以确定啶酰菌胺是否超标。本发明提供的啶酰菌胺胶体金层析检测装置能够满足监管部门、检测机构现场监督执法的需要。
与现有技术相比，本发明提供的免疫学检测方法具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、保质期长等优点。本发明可应用于需要进行啶酰菌胺农药残留的快速检测的各个领域中。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的实施方案。
图1是根据本发明的实施方案的啶酰菌胺半抗原的质谱图。
图2是根据本发明的实施方案的啶酰菌胺胶体金层析检测装置的示意图。
图3示出了根据本发明的一些实施方案的采用本发明提供的方法检测啶酰菌胺的判定结果。
图4示出了根据本发明的一些实施方案的啶酰菌胺抗原的紫外吸收曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施方案和附图，对本发明进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施方案仅仅是本发明的一部分实施方案，而不是全部的实施方案。基于本发明中的实施方案，本领域普通技术人员可以获得的所有其他实施方案，都属于本发明保护的范围。
免疫学检测分析方法是一种利用抗原抗体特异性结合反应来检测各种物质(药物、激素、蛋白质、微生物等)的分析方法，建立小分子化合物的免疫学检测分析方法的关键是能够生产出对小分子化合物具有高亲和力和高特异性的抗体，而生产这样的抗体的关键在于人工抗原或者人工半抗原的设计和合成。具体到本发明，建立啶酰菌胺的免疫学检测分析方法的关键步骤就是要设计并合成出合适的啶酰菌胺半抗原。
因此，根据本发明的第一方面，本发明提供了一种啶酰菌胺半抗原，其中，所述啶酰菌胺半抗原的结构如式(I)所示：
Figure BDA0003208404770000071
其中，n为2、3、4或5。
如本领域技术人员所理解的，所谓半抗原，是指这样的一类小分子物质：其单独存在时并不能诱导免疫应答，即不具备免疫原性，但当其与大分子蛋白质或非抗原性的多聚赖氨酸等载体交联或结合后可获得免疫原性，从而诱导免疫应答。这类小分子物质可与应答效应产物结合，具备抗原性，即免疫反应性，但是不具有免疫原性。
具体到本发明，容易理解，啶酰菌胺半抗原针对啶酰菌胺抗体(单抗隆抗体或多克隆抗体均可)具有免疫反应性，但是不具备免疫原性。换言之，啶酰菌胺半抗原可以与其相对应的啶酰菌胺抗体结合发生抗原-抗体反应；然而，在将该啶酰菌胺半抗原接种到动物体内进行免疫时，不能单独刺激动物产生相应的抗体。
然而，由于啶酰菌胺小分子(如下式(Ⅱ)所示，CAS号：188425-85-6)上没有可以直接与载体偶联的活性基团，因此需先在啶酰菌胺小分子上的适当位置进行适当的化学修饰，以引入合适的连接臂和与载体蛋白偶联的活性基团。但是需要注意的是，该修饰应尽可能地少，并且尽可能多地保留能与抗体结合的位点，并且不同结构的连接臂、不同的偶联方法或连接臂的引入位置，都影响后续建立的免疫学方法检测的灵敏度和特异性。目前，尚未有关于制备啶酰菌胺半抗原的相关报道。
Figure BDA0003208404770000081
因此，根据本发明的第二方面，本发明提供了用于制备式(I)所示的啶酰菌胺半抗原的中间体，其为：
Figure BDA0003208404770000082
其中，n为2、3、4或5。
从下文详述的本发明第三方面方法中可以知晓，从中间体4可以直接制备得到最终产物(I)。
根据本发明的第三方面，本发明还提供了一种制备本发明第一方面提供的啶酰菌胺半抗原的方法，所述方法包括如下步骤：
1)在催化剂的作用下，使2-卤代硝基苯与4-羟基苯硼酸反应，得到中间体1：
Figure BDA0003208404770000083
2)使中间体1与卤代酯发生取代反应，得到中间体2：
Figure BDA0003208404770000084
其中n为2、3、4或5，
其中，所述卤代酯是2-卤代乙酸甲酯、2-卤代乙酸乙酯、2-卤代乙酸丙酯、2-卤代乙酸叔丁酯、3-卤代丙酸甲酯、3-卤代丙酸乙酯、3-卤代丙酸丙酯、3-卤代丙酸叔丁酯、4-卤代丁酸甲酯、4-卤代丁酸乙酯、4-卤代丁酸丙酯、4-卤代丁酸叔丁酯、5-卤代戊酸甲酯、5-卤代戊酸乙酯、5-卤代戊酸丙酯或5-卤代戊酸叔丁酯；
3)对中间体2进行硝基的还原反应，得到中间体3：
Figure BDA0003208404770000091
其中n为2、3、4或5；
4)使中间体3与2-氯烟酰氯发生酰胺化反应，得到中间体4；以及
5)使中间体4发生酯的水解反应，得到式(I)所示的化合物，即为目标物。
在上述制备方法中，具体的反应过程如下所示：
Figure BDA0003208404770000092
其中，n为2、3、4或5，x为卤素原子诸如F、Cl、Br或I。
在一个实施方案中，在步骤1)中，在催化剂的作用下，使2-卤代硝基苯与4-羟基苯硼酸进行Suzuki-Miyaura偶联反应。具体地，将2-卤代硝基苯、4-羟基苯硼酸将溶解于丙酮和乙醇的混合溶液中，再加入碱和催化剂，直至反应结束，得到中间体1。在一个具体实施方案中，所述2-卤代硝基苯为2-溴硝基苯；优选地，所述反应在pH为8-10的条件下进行；优选地，所述碱为碳酸氢钠、碳酸钠、碳酸氢钾、碳酸钾或碳酸铯；优选地，所述催化剂为钯类催化剂，更优选地，所述催化剂为[1,1-双(二苯基磷)二茂铁]二氯化钯、醋酸钯或四(三苯基膦)钯。具体地，将2-溴硝基苯、4-羟基苯硼酸、催化剂[1,1-双(二苯基磷)二茂铁]二氯化钯以及丙酮与乙醇加入到单口烧瓶中搅拌均匀，再取碳酸氢钠溶于水中后加入反应体系，回流反应3h。反应结束后，冷却至室温，过滤除去不溶物，滤液减压旋蒸，除去溶剂。用乙酸乙酯萃取，合并有机相蒸干，过柱纯化，得到黄色固体即为中间体1。在一个优选的实施方案中，2-卤代硝基苯与4-羟基苯硼酸的摩尔比为1:1。
如本领域技术人员所理解的，本发明所提及的“卤代”是指氢原子被卤素原子诸如F、Cl、Br、I取代。具体到发明，“2-卤代硝基苯”是指硝基苯的2位上的氢原子被卤素原子诸如F、Cl、Br、I取代后所形成的硝基苯。
如本领域技术人员所理解的，Suzuki-Miyaura偶联反应是在钯类催化剂的作用下，卤代烃与有机硼酸的交叉偶联反应。一般地，有机硼酸为芳基硼酸、烯基硼酸、炔基硼酸等；卤代烃为芳基、磺酸酯等。具体到本发明，有机硼酸为4-羟基苯硼酸，卤代烃为2-卤代硝基苯。当然，也可以使用可以生成中间体1的其他有机硼酸和卤代烃，本发明对此不作进一步的限定。
在一个实施方案中，在步骤2)中，使中间体1与卤代酯发生取代反应，得到中间体2，其中，所述卤代酯是2-卤代乙酸甲酯、2-卤代乙酸乙酯、2-卤代乙酸丙酯、2-卤代乙酸叔丁酯、3-卤代丙酸甲酯、3-卤代丙酸乙酯、3-卤代丙酸丙酯、3-卤代丙酸叔丁酯、4-卤代丁酸甲酯、4-卤代丁酸乙酯、4-卤代丁酸丙酯、4-卤代丁酸叔丁酯、5-卤代戊酸甲酯、5-卤代戊酸乙酯、5-卤代戊酸丙酯或5-卤代戊酸叔丁酯。具体地，在pH 8-10的条件下，使中间体1与所述卤代酯在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中于50-90℃的条件下反应，反应数小时直至反应结束，得到中间体2。更具体地，将中间体1、无水碳酸钾以及DMF加入到反应器中并于80℃下搅拌，再加入4-溴丁酸甲酯，在80℃下搅拌，反应结束后，冷却至室温，加适量的水稀释，并用乙酸乙酯萃取，得到中间体2。在一个优选的实施方案中，中间体1与卤代酯的摩尔比为1:1.2。
在一个实施方案中，在步骤3)中，将中间体2在乙醇中溶解后，在钯碳、三氯化铁以及水合肼下进行硝基还原。具体地，取中间体2，向加入钯碳、六水合三氯化铁，并用甲醇溶解；在原料完全溶解后，在室温搅拌下向其中滴加水合肼，加料完成后室温搅拌。待反应结束后，过滤，蒸干、纯化，即得中间体3。
在一个实施方案中，在步骤4)中，采用包括无水吡啶或四氢呋喃的试剂将中间体3与2-氯烟酰氯混合溶解，室温下反应直至反应结束，即得中间体4。具体地，将中间体3溶于无水吡啶中，室温下加入2-氯烟酰氯，加料完成后室温搅拌至反应完成后，蒸干吡啶，加适量的水稀释，用乙酸乙酯萃取，蒸干，纯化，即得中间体4。在一个优选的实施方案中，中间体3与2-氯烟酰氯的摩尔比为1:1
在一个实施方案中，在步骤5)中，使中间体4经过水解、调pH值、减压蒸发、上柱纯化之后得到目标物；优选地，在氢氧化锂的作用下进行所述水解反应；优选地，将反应完成后的溶液的pH调节至5-6；优选地，采用盐酸将溶液的pH调节至5-6。具体地，取中间体4，溶于甲醇，另取氢氧化锂溶于水并滴入体系，直至反应完成，然后用盐酸调节pH至5-6，然后蒸去甲醇，用乙酸乙酯萃取，合并有机相蒸干，过柱纯化，即得本发明的第一方面所述的化合物。在一个优选的实施方案中，中间体4与氢氧化锂的摩尔比为1:1.2。
在一个实施方案中，啶酰菌胺半抗原的制备方法包括如下步骤：
1)将2-溴硝基苯、4-羟基苯硼酸溶解于丙酮和乙醇的混合溶液中，再加入碱和催化剂，回流反应若干小时后冷却至室温，过滤除去不溶物，滤液减压旋蒸，除去溶剂，得到中间体1；
2)在碱性条件下，在DMF中，将中间体1与4-溴丁酸甲酯于50-90℃的条件下反应数小时，反应完之后加水并用乙酸乙酯进行萃取，得到中间体2；
3)将中间体2在乙醇中溶解后，在钯碳、三氯化铁以及水合肼下进行硝基还原，得到中间体3；
4)中间体3与2-氯烟酰氯混合采用包括无水吡啶或四氢呋喃的试剂溶解，后室温下反应数小时，得到中间体4；以及
5)中间体4经过水解、调pH值、减压蒸发、上柱纯化之后得到目标物。
在上述制备方法中，具体的反应过程如下所示：
Figure BDA0003208404770000121
本发明所制备的啶酰菌胺半抗原在保留啶酰菌胺基本结构的基础上引入连接臂结构和用于偶联大分子的活性基团，这样既有利于其与大分子偶联，又可以在偶联后充分暴露本身分子结构和分子量较小的啶酰菌胺基本结构，避免了其被大分子掩蔽而影响动物机体的识别。
如上所述，啶酰菌胺半抗原仅具有免疫反应性，而不具有免疫原性，并不能单独地刺激动物产生相应的抗体。因此，为了赋予啶酰菌胺半抗原以免疫原性，需要将啶酰菌胺半抗原与大分子蛋白质等载体偶联、结合或者交联在一起，由此产生既具有免疫反应性又具有免疫原性的啶酰菌胺偶联抗原。半抗原与载体分子之间的偶联、结合或者交联方法是本领域已知的。
因此，根据本发明的第四方面，本发明提供了一种啶酰菌胺抗原，包含本发明第一方面提供的啶酰菌胺半抗原，以及与所述啶酰菌胺半抗原偶联的载体蛋白。
本发明所提及的术语“载体蛋白”是任何能够与半抗原偶联、结合或者交联并由此产生既具有免疫原性又具有免疫反应性的物质，包括例如大分子蛋白质或者非抗原性的多聚赖氨酸等。作为示例，可以使用的载体蛋白包括，但不限于，大分子蛋白质，例如牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、鸡卵清白蛋白(OVA)、血蓝蛋白(KLH)。
抗原在进入机体后，刺激B细胞，诱导细胞的增殖和分化，继而产生特异性抗体。具体到本发明，利用本发明啶酰菌胺半抗原与载体蛋白偶联后得到的啶酰菌胺抗原去免疫动物，刺激动物免疫应答，从而可以产生特异性更强、灵敏度更高的抗体。
因此，根据本发明的第五方面，提供了一种啶酰菌胺抗体，该啶酰菌胺抗体为特异性针对本发明第四方面提供的啶酰菌胺抗原的抗体。
啶酰菌胺抗体可以为单克隆抗体或者多克隆抗体。另外，可以采用本领域普通技术人员已知的方法来制备啶酰菌胺抗体。例如，在啶酰菌胺抗体为多克隆抗体的情况下，可以通过采用啶酰菌胺抗原免疫接种哺乳动物例如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、灵长类动物(不包括人类)等，随后分离血清获得。在啶酰菌胺抗体为单克隆抗体的情况下，可以通过制造和培养杂交瘤细胞并收集培养基获得单克隆抗体，或者可以将由此制备获得的杂交瘤细胞通过腹腔注射接种到哺乳动物例如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、灵长类动物(不包括人类)等的体内，在被接种动物的腹部明显膨大时收集腹水，由此获得单克隆抗体。
如本领域技术人员所能理解的，对于啶酰菌胺抗体的来源，并没有特别的限制，其可以来源于任何哺乳动物，包括例如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、灵长类动物(不包括人类)等，但不限于此。在一个具体的实施方案中，啶酰菌胺抗体为来源于小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、灵长类动物(不包括人类)的多克隆或者单克隆抗体。
基于免疫学检测的需要，申请人将本发明的第一方面所述的啶酰菌胺半抗原、本发明的第四方面所述的啶酰菌胺抗原、本发明的第五方面所述的啶酰菌胺抗体应用于免疫学检测中，以检测啶酰菌胺农药残留量。
因此，根据本发明的第六方面，提供了本发明的第一方面所述的啶酰菌胺半抗原、本发明的第四方面所述的啶酰菌胺抗原、和/或本发明的第五方面所述的啶酰菌胺抗体在免疫学检测中的应用。
根据本发明的第七方面，提供了一种啶酰菌胺胶体金层析检测装置，包括试纸条和反应杯，其中，试纸条包括反应膜，反应膜上有检测线和质控线，并且其中，检测线包被有本发明的第四方面所述的啶酰菌胺抗原，并且其中，反应杯中含有胶体金标记的本发明的第五方面所述的啶酰菌胺抗体(简称“金标抗体”)。
根据本发明的一些实施方案，试纸条还可以包括诸如底板、样品吸收垫和吸水垫的其他组件。在这种情况下，在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、反应膜、吸水垫。在本发明中，样品吸收垫可以为玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚醋膜；反应膜可以为硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜；吸水垫可以为吸水滤纸或滤油纸；底板可以为不吸水的韧性材料例如硬质塑胶条如PVC底板或不吸水硬纸条或其它硬质不吸水材料。
在本发明中，反应膜包含检测线和质控线。通常情况下，将检测线设置在靠近样品吸收垫一侧。检测线由啶酰菌胺抗原(在本发明中即啶酰菌胺半抗原-载体蛋白偶联物)在反应膜上进行线性点样制得。质控线可以通过将抗原或者抗体在反应膜上进行线性点样获得。
在本发明的一个实施方案中，质控线由本发明提供的啶酰菌胺抗体的第二抗体点样获得。在胶体金标记的啶酰菌胺抗体移动至质控线时，其会与形成该质控线的第二抗体发生结合反应，由此显现颜色。
如果质控线显色，则指示该检测***成立，检测结果可用。相反，如果质控线不显色，则指示该检测***不成立，检测结果不可用。
如上所述，反应杯中含有胶体金标记的本发明第五方面提供的啶酰菌胺抗体，所述啶酰菌胺抗体特异性地针对本发明第四方面的啶酰菌胺抗原。
啶酰菌胺抗体只要能够与啶酰菌胺抗原发生抗原-抗体结合反应即可，而不管它是单克隆抗体还是多克隆抗体。然而，正如本领域技术人员可以理解的那样，从需要更高特异性的角度上考虑，单克隆抗体是更合适的。因此在本发明中，啶酰菌胺抗体优选地为单克隆抗体。
在本发明中，质控线的点样制备可以根据胶体金标记的啶酰菌胺抗体的类型来进行。具体地，若胶体金标记的啶酰菌胺抗体为啶酰菌胺单克隆抗体，则该质控线可以采用羊抗鼠抗抗体进行线性点样制得，若胶体金标记的啶酰菌胺抗体为啶酰菌胺多克隆抗体时，则该质控线可以采用羊抗兔抗抗体进行线性点样制得。
在本发明的一个实施方案中，本发明提供了一种啶酰菌胺胶体金层析检测装置，包括试纸条和反应杯，如图2所示，试纸条包含底板以及在其上依次铺设的样品吸收垫、反应膜和吸水纸，该反应膜在样品吸收垫至吸水纸方向上包括检测线和质控线，检测线由啶酰菌胺抗原制备获得；如图2所示，反应杯包含胶体金标记的啶酰菌胺抗体，啶酰菌胺抗体为特异性地针对啶酰菌胺抗原的鼠源单克隆抗体，并且质控线为针对该啶酰菌胺抗体的羊抗鼠抗抗体。
在本发明的一个实施方案中，可以通过下述制备方法来制备本发明的啶酰菌胺胶体金层析检测装置：制备反应膜，采用本发明的啶酰菌胺抗原在反应膜上进行线性点样制备检测线，并采用针对啶酰菌胺抗体的羊抗鼠抗抗体通过线性点样制备质控线；在底板上沿同一方向依次搭接粘贴样品吸收垫、反应膜和吸水纸，由此组装成试纸条；将本发明的胶体金标记的啶酰菌胺抗体加入微孔反应杯、冻干后，将微孔反应杯加上微孔塞。该制备方法中使用到的各成分或者组件如上文针对本发明的啶酰菌胺胶体金层析检测装置所描述。
根据本发明的第八方面，本发明提供了一种检测样品中啶酰菌胺的方法，该方法使用本发明的第七方面提供的啶酰菌胺胶体金层析检测装置进行检测。
在本发明中，该样品可以为任何疑似啶酰菌胺残留量超标的样品，其可以是蔬菜或水果等。
根据本发明的一些实施方案，在采用本发明的方法检测样品中的啶酰菌胺之前，可以根据样品的不同对其进行前处理，处理方法为本领域已知的用于检测的样品处理的一般方法，在此不对其进行特别限定。
在进一步的方案中，在对样品进行预处理之后，将其滴加至微孔反应杯中，混匀后，将试纸条***微孔反应杯，待检样品溶液与微孔中的金标抗体结合后一起向反应膜扩散，若观察到质控线显现出***条带，则指示该检测***成立、可用。图3示出了根据本发明的一些实施例的采用本发明提供的方法检测啶酰菌胺的判定结果，判断方法如下：
(1)若检测线(T线)不显色，或者与质控线(C线)相比显色更浅，则表明样品中含有啶酰菌胺。因为待检样品液中含有啶酰菌胺时，扩散过程中待检样品液中的啶酰菌胺可与金标抗体相结合，进而完全封闭金标抗体上啶酰菌胺的抗原结合点，阻止金标抗体与反应膜上的啶酰菌胺抗原结合，T线不显色或T线颜色比C线颜色更浅，而抗抗体则可与金标抗体结合，C线显色。
(2)若检测线同质控线一样显现出***条带，并且检测线的颜色深度与质控线的颜色深度相当或者更深，则表明样品不含啶酰菌胺。因为待检样品液中不含啶酰菌胺时，金标抗体上的抗原结合位点不能被封闭，进而金标抗体会与反应膜上的啶酰菌胺抗原偶联结合，T线显色，同时抗抗体也可与金标抗体结合，C线亦显色，此时，T线颜色比C线颜色深或颜色相同。
(3)若反应膜上T线和C线均未显色，则试纸条失效。
本发明的有益效果：
发明提供了一种啶酰菌胺半抗原，制备该啶酰菌胺半抗原的中间体以及制备该啶酰菌胺半抗原的方法，同时还提供了相应的啶酰菌胺抗原和啶酰菌胺抗体，此外还将其应用于免疫学检测中，并且由此提出了啶酰菌胺胶体金层析检测装置和检测样品中啶酰菌胺的方法。
在制备啶酰菌胺半抗原的方法中，通过多步合成来制备啶酰菌胺半抗原，所制备的啶酰菌胺半抗原最大程度地保留了啶酰菌胺的特征结构，增强了啶酰菌胺半抗原的免疫性，并且同时通过进行适当的化学修饰引入了与载体蛋白偶联的活性基团-羧基，将合成的半抗原与载体蛋白偶联制备人工抗原，利用人工抗原免疫动物获得抗体，为后续建立啶酰菌胺的各种免疫分析方法提供原材料。本发明的啶酰菌胺半抗原的制备，使用的化学试剂容易得到，实验操作过程容易掌握，每步反应产率较高，并且与仪器方法相比较，其检测成本较低。
此外，本发明提供的啶酰菌胺胶体金层析检测装置利用层析式免疫胶体金原理，通过试纸条中检测线与质控线之间的比色来半定量检测诸如水果或蔬菜等中的啶酰菌胺农药残留。该检测装置能够短时间内快速、准确地检测出诸如水果或蔬菜等中的啶酰菌胺，以确定啶酰菌胺是否超标。本发明提供的啶酰菌胺胶体金层析检测装置能够满足监管部门、检测机构现场监督执法的需要。
与现有技术相比，本发明提供的免疫学检测方法具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、保质期长等优点。本发明可应用于需要进行啶酰菌胺农药残留的快速检测的各个领域中。
下面结合附图和实施例对本发明进行更为具体和详细的描述，实施例仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明。若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。
实施例1：啶酰菌胺半抗原的制备与鉴定
制备：1)将原料2-溴硝基苯4.00g、4-羟基苯硼酸2.86g、催化剂[1,1-双(二苯基磷)二茂铁]二氯化钯100mg以及90mL丙酮与30mL乙醇加入到单口烧瓶中搅拌均匀，再取5.00g碳酸氢钠溶于30mL水，然后加入反应体系，回流反应3h。反应结束后，冷却至室温，过滤除去不溶物，滤液减压旋蒸，除去溶剂。用乙酸乙酯萃取2-3遍，合并有机相蒸干，过柱纯化，得到黄色固体即为中间体1。
2)取3.50g啶酰菌胺中间体1、无水碳酸钾5.00g以及DMF 30mL加入到100mL单口烧瓶中80℃下搅拌10min搅拌均匀，再加入4-溴丁酸甲酯3.53g，在80℃下搅拌反应过夜。反应结束后，冷却至室温，加适量的水稀释。用乙酸乙酯萃取2-3遍，合并有机相蒸干，过柱纯化，得到黄色油状物即中间体2。
3)取5.00g啶酰菌胺中间体2、加入钯碳0.5g、六水合三氯化铁0.5g，用甲醇50mL溶解。原料完全溶解后室温搅拌下滴加水合肼2.50g。加料完成后室温搅拌1h。待反应结束后过滤除去不溶物，蒸干溶剂后过柱纯化得到浅黄色油状物即中间体3。
4)将上一步得到的中间体3溶于20mL无水吡啶中，室温下加入2-氯烟酰氯2.79g。加料完成后室温搅拌1h。反应完成后蒸干吡啶，加适量的水稀释。用乙酸乙酯萃取2-3遍，合并有机相蒸干，过柱纯化，得到白色固体，即中间体4。
5)取1.50g啶酰菌胺中间体4，溶于15mL甲醇。另称取氢氧化锂169mg溶于2mL水滴入体系。加料完成后室温搅拌过夜。反应完成后用6N盐酸调节pH至5-6然后蒸去甲醇。用乙酸乙酯萃取2-3遍，合并有机相蒸干，过柱纯化，得到白色固体。
鉴定：采用质谱法来鉴定啶酰菌胺半抗原，所得到的质谱图如图1所示。从质谱图可以看出，半抗原的分子离子峰为m/z409.4[M-H]-，且为最高峰，其与该啶酰菌胺半抗原的分子量(410.1)相符，表明成功合成了式(I)所示的啶酰菌胺半抗原。
实施例2：啶酰菌胺抗原的制备与鉴定
制备：取实施例1制备的啶酰菌胺半抗原0.1mmol溶于2mL二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌加入27.5mg二环己基碳二亚胺(DCC)和14.4mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。4℃下磁力搅拌反应过夜，离心后保留上清夜，并将其标记为A液。称取牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)140mg，将其分别溶于10mL浓度为0.1mol/L的PBS(pH8.0)中，再加入DMF 1mL，搅拌溶解，由此制备获得B液。在磁力搅拌下，将A液逐渐滴入B液中，并于4℃反应12小时。离心后，取上清液，并于4℃用生理盐水透析3天，每天更换3次透析液，由此可以获得分别与牛血清白蛋白和血蓝蛋白偶联的啶酰菌胺偶联抗原。将所得啶酰菌胺偶联抗原以1mg/mL的浓度分装于0.5mL离心管中，并冻存于-20℃冰箱中。
鉴定：采用紫外扫描仪，分别对啶酰菌胺半抗原H、BSA、H-BSA、OVA、H-OVA进行200～400nm全波长扫描，观察偶联物与载体蛋白是否存在差别以此鉴定啶酰菌胺半抗原H与BSA、OVA是否发生偶联成功。从图4中可以看出，免疫原(H-BSA和H-OVA)的吸收曲线与啶酰菌胺半抗原(H)、BSA 、OVA明显不同，呈现出BSA或OVA与啶酰菌胺半抗原的累加吸收特征，这表明啶酰菌胺半抗原与载体蛋白BSA、OVA偶联成功。
实施例3：啶酰菌胺单克隆抗体的制备
利用实施例2制备的啶酰菌胺偶联抗原(啶酰菌胺-BSA)来制备啶酰菌胺单克隆抗体，具体如下：使用经鉴定的啶酰菌胺偶联抗原(啶酰菌胺-BSA)免疫10只8周龄昆明小鼠，加强免疫三次后，采血测效价。待血清效价不再上升，用两倍剂量的抗原不加佐剂免疫小鼠，三天后脱颈致死小鼠，在无菌条件下取脾脏制备脾细胞，与生长旺盛的小鼠骨髓瘤细胞按8:1的比例混合于50mL离心管，加入30mL无血清IPMI 1640培养基，1100r/min离心5min弃上清，将细胞团轻轻振松，置于37℃水浴中。把1mL 50％PEG-4000缓缓加入细胞中，在1min内滴完，同时轻轻搅动底部沉淀，静置1min后，前30s沿管壁缓慢匀速加入无血清培养基1mL，后30s加入2mL，然后快速加入27mL终止融合过程，1100r/min离心5min，弃上清，用HAT选择性培养基重悬后加到已铺有饲养细胞的96孔细胞培养板中，并于37℃、体积分数5％的CO2条件下培养。7d后将培养基换成HT培养液，待孔内的杂交细胞数量达到300个以上时，用间接ELISA法筛选，选择强阳性、抑制效果好、细胞生长旺盛的孔进行有限稀释克隆化，经3次以上的克隆培养和检测，均呈阳性的孔内细胞即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞扩大培养以备单克隆抗体的制备。
采用体内诱生腹水法生产抗啶酰菌胺单克隆抗体，具体如下：选4只经产昆明小鼠，腹腔注射液体石蜡油0.5mL/只，7d后腹腔注射杂交瘤细胞3-5×106/只，10d后，待小鼠腹部明显膨大时收集腹水。用正辛酸-硫酸铵沉淀法来纯化腹水，经紫外测定抗啶酰菌胺单克隆抗体的含量。
实施例4：兔抗鼠抗体的制备
用实施例3制备的啶酰菌胺单克隆抗体免疫新西兰白兔，免疫剂量为50μg-100μg/次，背部皮下分多点注射；首先，用啶酰菌胺单克隆抗体与等量弗氏完全佐剂乳化；加强免疫，用啶酰菌胺单克隆抗体与等量弗氏不完全佐剂乳化，连续免疫4-5次，每次间隔4-8周，最后一次免疫后10-15天，以酶联免疫吸附法(ELISA)法测其定效价达到105以上时，采血并分离收集高免血清，以饱和硫酸铵盐析法提取IgG抗体，-20℃冻存备用。
实施例5：啶酰菌胺胶体金层析检测装置的制备
5.1胶体金的制备
取1％氯金酸溶液1mL，加入99mL超纯水成终浓度0.01％的氯金酸溶液。将该溶液加热沸腾后，取1％柠檬酸三钠1.6mL一次性迅速加入煮沸的氯金酸溶液中，继续加热，直至溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为亮红色。颜色稳定后继续加热5min，室温冷却，补充失水至原体积。
5.2胶体金标记的单克隆抗体的制备
调节在实施例5.1中获得的胶体金溶液pH值至8.0，用恒速搅拌器均匀搅拌，同时逐滴加入实施例3制备的啶酰菌胺单克隆抗体，1h后加入抗体量相当的聚乙二醇(PEG)，充分反应30min后加入抗体量相当的牛血清蛋白(BSA)。加完后，继续搅拌30min。在9000rpm离心30min，获得均一性金标抗体沉淀物，再加对硝基苯酚丁酸酯(PNPB)重悬备用。
5.3啶酰菌胺胶体金层析检测装置的制备
检测线和质控线的制备：制备硝酸纤维素膜，并在该硝酸纤维素膜上将实施例2制备的啶酰菌胺偶联抗原进行线性点样，由此形成检测线；并将实施例4制备的兔抗鼠IgG抗体进行线性点样，由此形成质控线。
试纸条的制备：在一块底板上沿同一方向依次搭接粘贴样品垫、硝酸纤维素膜及吸水纸，由此制备获得试纸条。
反应杯的制备：将实施例5.2制备的胶体金标记的单克隆抗体加入至反应杯中，冻干，由此形成所需反应杯。
啶酰菌胺胶体金层析检测装置的制备：将所得到的试纸条和所得到的反应杯组合在一起，形成本发明的啶酰菌胺胶体金层析检测装置。
实施例6：样品中啶酰菌胺的检测
取新鲜蔬菜或者水果样品绞碎，并将其用30％乙醇提取，之后将提取物取样置于实施例5制备的反应杯中，室温孵育3min。随后将实施例5制备的试纸条***反应杯中，再于室温孵育5min。
取出试纸条，轻轻刮除试海绵垫，进行结果判读：
阴性(-)：若检测线(T线)与质控线(C线)同时显示***条带，并且检测线的颜色深度与质控线的颜色深度相当或者更深，则结果为阴性，表明样品中不含啶酰菌胺；
阳性(+)：若T线颜色比C线浅，或C线显色而T线不显色，则结果为阳性，表明样品中含有啶酰菌胺；
无效：若C线、T线均不显色，则检测装置已失效，建议更换试纸条重复测定。
实施例7：啶酰菌胺胶体金层析检测装置的灵敏度
设置一系列的浓度梯度，啶酰菌胺浓度分别为5、10、20、40、80ng/mL，用胶体金试纸条进行测试，测试后使用仪器比较检测线与质控线颜色深浅。当啶酰菌胺浓度为10ng/mL时，检测线颜色深度为质控线的90％以下，因此其灵敏度为10ng/mL。
选取10ng/mL平行实验5次，统计检测限颜色深度与质控线颜色深度的比例，其CV值小于15％。
实施例8：啶酰菌胺胶体金层析检测装置的特异性
在阴性样品中，分别加入啶酰菌胺10ng/mL、腐霉利10μg/mL、吡唑醚菌酯10μg/mL、氟吡菌胺10μg/mL、吡噻菌胺10μg/mL、氟吡菌酰胺10μg/mL、苯甲酰胺10μg/mL。实验结果发现，只有加入啶酰菌胺的样品能够检出，而加入腐霉利、吡唑醚菌酯、氟吡菌胺、吡噻菌胺、氟吡菌酰胺、苯甲酰胺的样品无法检出，说明本检测装置对啶酰菌胺的特异性较好。
实施例9：啶酰菌胺胶体金层析检测装置的保质期测定
用三批常规生产的产品分别做保质期实验，放置于室内室温环境保持，间隔1个月取12个装置，用质控样本检测，分别做阴性，10ng/mL，20ng/mL和40ng/mL样品，重复三次，观察产品显色变化，考察保质期时间。
阴性显色从13个月开始下降，这表明在1年时间内产品的品质无明显变化，因此确定保质期为1年。
以上仅为本发明的较佳实施方案而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种啶酰菌胺半抗原，其中，所述啶酰菌胺半抗原的结构如式(I)所示：
Figure FDA0003208404760000011
其中，n为2、3、4或5。
2.用于制备式(I)所示的啶酰菌胺半抗原的中间体，其为：
Figure FDA0003208404760000012
其中，n为2、3、4或5。
3.一种制备权利要求1所述的啶酰菌胺半抗原的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
1)在催化剂的作用下，使2-卤代硝基苯例如2-溴硝基苯与4-羟基苯硼酸反应，得到中间体1：
Figure FDA0003208404760000013
优选地，将2-卤代硝基苯、4-羟基苯硼酸溶解后加入碱和催化剂，得到中间体1；
优选地，所述反应在pH为8-10的条件下进行；
优选地，所述碱为碳酸氢钠、碳酸钠、碳酸氢钾、碳酸钾或碳酸铯；
优选地，所述催化剂为钯类催化剂，例如[1,1-双(二苯基磷)二茂铁]二氯化钯、醋酸钯或四(三苯基膦)钯；
优选地，2-卤代硝基苯与4-羟基苯硼酸的摩尔比为1：1；
2)使中间体1与卤代酯发生取代反应，得到中间体2：
Figure FDA0003208404760000021
其中n为2、3、4或5，
其中，所述卤代酯是2-卤代乙酸甲酯、2-卤代乙酸乙酯、2-卤代乙酸丙酯、2-卤代乙酸叔丁酯、3-卤代丙酸甲酯、3-卤代丙酸乙酯、3-卤代丙酸丙酯、3-卤代丙酸叔丁酯、4-卤代丁酸甲酯、4-卤代丁酸乙酯、4-卤代丁酸丙酯、4-卤代丁酸叔丁酯、5-卤代戊酸甲酯、5-卤代戊酸乙酯、5-卤代戊酸丙酯或5-卤代戊酸叔丁酯；
优选地，在pH 8-10的条件下，于50-90℃，使中间体1与所述卤代酯在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中反应，直至反应结束；
优选地，中间体1与所述卤代酯的摩尔比为1:1.2；
3)对中间体2进行硝基的还原反应，得到中间体3：
Figure FDA0003208404760000022
其中n为2、3、4或5；
优选地，所述还原反应在钯碳、三氯化铁和水合肼的共同作用下进行；
4)使中间体3与2-氯烟酰氯发生酰胺化反应，得到中间体4；
优选地，中间体3与2-氯烟酰氯的摩尔比为1:1；以及
5)使中间体4发生酯的水解反应，得到式(I)所示的化合物；
优选地，在氢氧化锂的作用下进行所述水解反应；
优选地，所述水解反应完成后，将溶液的pH调节至5-6；
优选地，中间体4与氢氧化锂的摩尔比为1:1.2。
4.一种啶酰菌胺抗原，其中，所述啶酰菌胺抗原包含：权利要求1所述的啶酰菌胺半抗原，以及与所述啶酰菌胺半抗原偶联的载体蛋白。
5.根据权利要求4所述的啶酰菌胺抗原，其中，所述载体蛋白包括牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或血蓝蛋白。
6.一种啶酰菌胺抗体，其中，所述啶酰菌胺抗体为特异性针对权利要求4或5所述的啶酰菌胺抗原的抗体；
优选地，所述啶酰菌胺抗体为啶酰菌胺单克隆抗体或啶酰菌胺多克隆抗体。
7.权利要求1所述的啶酰菌胺半抗原、权利要求4或5所述的啶酰菌胺抗原、和/或权利要求6所述的啶酰菌胺抗体在免疫学检测中的应用。
8.一种啶酰菌胺胶体金层析检测装置，包括试纸条和反应杯，其中，所述试纸条包括反应膜，所述反应膜上有检测线和质控线，并且其中，所述检测线包被有权利要求4或5所述的啶酰菌胺抗原，并且其中，所述反应杯中含有胶体金标记的权利要求6或7所述的啶酰菌胺抗体。
9.根据权利要求8所述的啶酰菌胺胶体金层析检测装置，其中，所述质控线包被有特异性针对所述啶酰菌胺抗体的第二抗体。
10.一种检测样品中啶酰菌胺的方法，所述方法包括：使用权利要求8至9任一项所述的胶体金层析检测装置对样品中的啶酰菌胺进行检测。
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