CN113896743B - 一种敌百虫半抗原及其制备方法、抗原、抗体及其应用 - Google Patents

一种敌百虫半抗原及其制备方法、抗原、抗体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113896743B
CN113896743B CN202111299579.2A CN202111299579A CN113896743B CN 113896743 B CN113896743 B CN 113896743B CN 202111299579 A CN202111299579 A CN 202111299579A CN 113896743 B CN113896743 B CN 113896743B
Authority
CN
China
Prior art keywords
trichlorfon
hapten
dipterex
antibody
antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202111299579.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113896743A (zh
Inventor
杨星星
周佳
付辉
李澍才
李道霞
姚欢
余晓琴
王炳志
马涛
杨国伟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sichuan Institute Of Food Inspection
SHENZHEN BIOEASY BIOTECHNOLOGY CO LTD
Original Assignee
Sichuan Institute Of Food Inspection
SHENZHEN BIOEASY BIOTECHNOLOGY CO LTD
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sichuan Institute Of Food Inspection, SHENZHEN BIOEASY BIOTECHNOLOGY CO LTD filed Critical Sichuan Institute Of Food Inspection
Priority to CN202111299579.2A priority Critical patent/CN113896743B/zh
Publication of CN113896743A publication Critical patent/CN113896743A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113896743B publication Critical patent/CN113896743B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/28—Phosphorus compounds with one or more P—C bonds
    • C07F9/38—Phosphonic acids [RP(=O)(OH)2]; Thiophosphonic acids ; [RP(=X1)(X2H)2(X1, X2 are each independently O, S or Se)]
    • C07F9/40—Esters thereof
    • C07F9/4003—Esters thereof the acid moiety containing a substituent or a structure which is considered as characteristic
    • C07F9/4006—Esters of acyclic acids which can have further substituents on alkyl
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/77—Ovalbumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
    • G01N33/548—Carbohydrates, e.g. dextran
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
    • G01N33/587—Nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2430/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving synthetic organic compounds as analytes
    • G01N2430/10—Insecticides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及药物免疫检测合成技术领域，具体公开了一种敌百虫半抗原、敌百虫半抗原中间体及其合成方法、基于该敌百虫半抗原的敌百虫抗原、特异性针对该敌百虫抗原的敌百虫抗体、其应用等。在将本发明的敌百虫抗原和抗体应用于敌百虫胶体金层析检测装置时，其灵敏度可达到100μg/kg。

Description

一种敌百虫半抗原及其制备方法、抗原、抗体及其应用
技术领域
本发明涉及药物免疫检测合成技术领域，特别是涉及一种高纯度敌百虫半抗原及其合成方法、应用。
背景技术
敌百虫是一种有机磷杀虫剂，属磷酸酯类，为白色晶状粉末，其挥发性较低。1952年，敌百虫由德国拜耳公司合成，在中国生产使用也有近50多年的历史，其在农业上应用范围很广，主要用于防治菜青虫、桑野蚕、象鼻虫、果蝇等多种害虫。但由于其毒性，2017年10月27日，敌百虫被世界卫生组织国际癌症研究机构列为3类致癌物，唐龙等人的研究表明敌百虫对雄性动物具有生殖毒性。
敌百虫的检测分析可采用催化光度法、气相色谱法、气相色谱质谱法、液相色谱质谱法等等。
催化光度法需进行水浴加热，显色容易受到金属离子的干扰；气相色谱法需要转换、萃取等多个环节，操作复杂且容易引入误差；气相色谱质谱法需要进行水样前处理，将敌百虫转化成敌敌畏后测定，操作繁琐，或者测定敌百虫的分解产物，但可能导致测定结果的偏差和定性错误；范俊采用萃取后进样的液相色谱质谱法，耗时较长且萃取和净化所用的试剂污染环境。色谱法的灵敏度较其它方法较高，这些方法能以较高的精度解决部分实际问题。但通常情况下，这些理化分析方法的样本前处理过程相当复杂，所需的仪器也较昂贵，效率比较低下，分析成本较高，对待测物的理化性质的限制严格。这些方法对出现动物可食组织中的敌百虫残留问题不能做出迅速反应，也不适合作为敌百虫在可食动物组织中残留的初筛方法。
针对目前我国对食品安全要求越来越严格的趋势，建立灵敏度高、特异性强、简便易行的动物源性食品中敌百虫残留量的测定方法，为加强食品的贸易进出口把关意义重大。免疫检测法弥补了理化检测方法的缺憾，它最突出的优点是取样量少、前处理简单、容量大、仪器化程度低、灵敏度高，分析效率可达色谱分析方法的几十倍，适用于大批量样本敌百虫残留的快速筛选性检测。它可以同时测定大批量样品，用于大批量检测的初筛；投资少而且操作简便，适合基层监督部门使用。
在建立免疫学检测方法并应用该检测方法检测敌百虫残留量时，关键技术在于能够获取到特异性强、灵敏度高的抗体，而要实现这一目标，前提条件是制备出合适的敌百虫半抗原。然而，在这方面，相关的报道非常有限。因此，亟需进一步探索敌百虫半抗原的新的合成方法以及由此得到的新敌百虫半抗原，从而助力敌百虫残留的大批量快速筛选。
发明内容
为了克服现有技术中的上述缺陷，本发明人针对敌百虫的结构特点开发出了一种敌百虫半抗原的合成方法，并由此获得了一种新的敌百虫半抗原、抗原及其抗体。利用该敌百虫半抗原、抗原及其抗体，可以通过免疫检测的方式来对样品中的敌百虫进行有效检测。
因此，在本发明的第一方面，提供了一种敌百虫半抗原，其结构式如式(I)所示：
其中，所述R1选自C0-C6亚烷基；R2选自C1-C6亚烷基。
在本发明的第二方面，提供了一种用于制造本发明第一方面的敌百虫半抗原的中间体，其结构式如式(II)所示：
其中，R1选自C0-C6亚烷基。
在本发明的第三方面，提供了一种制备本发明第一方面的敌百虫半抗原的方法，所述方法包括以下步骤：
步骤1：在低温下，使三氯化磷与结构式如的化合物1反应，经减压蒸馏后得到中间体1：
其中，R1选自C0-C6亚烷基；
步骤2：在低温下，使所述中间体1在碱性条件下与无水甲醇和吡啶反应，得到中间体2：
步骤3：在缚酸剂条件下，使所述中间体2与三氯乙醛反应，得到中间体3：
步骤4：使所述中间体3与结构式如的化合物2在引发剂的存在下进行反应，得到式(I)所示的敌百虫半抗原：
其中，R2选自C1-C6亚烷基。
在本发明的第四方面，提供了一种敌百虫抗原，所述免疫抗原包含：本发明第一方面的敌百虫半抗原、以及与所述敌百虫半抗原偶联的载体蛋白。
在本发明的第五方面，提供了一种敌百虫抗体，所述敌百虫抗体为特异性地针对本发明第四方面的敌百虫抗原的抗体。
在本发明的第六方面，提供了本发明第一方面的敌百虫半抗原、本发明第四方面的敌百虫抗原、本发明第五方面的敌百虫抗体在敌百虫免疫检测分析中的应用。
在本发明的第七方面，提供了一种敌百虫胶体金层析检测装置，包括试纸条和反应杯，所述试纸条包括反应膜，所述反应膜上有检测线和质控线，所述检测线包被有本发明第四方面的敌百虫抗原，所述反应杯中含有胶体金标记的本发明第五方面的敌百虫抗体。
在本发明的第八方面，提供了一种检测样品中敌百虫的方法，所述方法包括：使本发明第七方面的胶体金层析检测装置与样品接触。
本发明具有如下有益效果：
本发明中，在不改变敌百虫结构的基础上合成出带有烯烃的敌百虫衍生物，再通过点击化反应衍生出带有羧基连接臂的敌百虫半抗原。由此合成的敌百虫半抗原既最大程度保留了敌百虫的特征结构，并且还具有可以与载体蛋白发生偶联的羧基，从而可以在与载体蛋白偶联后可以获得具有免疫原性的敌百虫抗原。
使用本发明的敌百虫抗原免疫动物，可以刺激动物进行免疫应答，从而产生特异性更强、灵敏度更高、且保质期长的抗体。
本发明中敌百虫半抗原的合成方法，使用的原料易得，反应操作较为简单，反应条件易于控制。
本发明的敌百虫半抗原合成方法，敌百虫半抗原的纯度和收率高，合成的半抗原的收率可达50％以上，整体的合成成本更具优势。
附图说明
图1为本发明的敌百虫半抗原的质谱图。
图2为本发明的敌百虫抗原的紫外吸收曲线。
图3为实施例4制备的胶体金检测装置的示意图。
图4是根据本发明的实施方案的结果判定的示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施方案和附图，对本发明进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施方案仅仅是本发明的一部分实施方案，而不是全部的实施方案。基于本发明中的实施方案，本领域普通技术人员可以获得的所有其他实施方案，都属于本发明保护的范围。
免疫学检测分析方法是一种利用抗原抗体的特异性结合来检测各种物质(药物、激素、蛋白质、微生物等)的分析方法，建立小分子化合物的免疫学检测分析方法的关键是能够生产出对小分子化合物具有高亲和力和高特异性的抗体，而生产这样的抗体的关键在于人工抗原或者人工半抗原的设计和合成。具体到本发明，建立敌百虫的免疫学检测分析方法的关键步骤就是要设计并合成出合适的敌百虫半抗原。
因此，在第一方面，本发明提供了一种敌百虫半抗原，其结构式如式(I)所示：
其中，所述R1选自C0-C6亚烷基；所述R2选自C1-C6亚烷基。
具体地，所述R1可以不存在(即当R1为C0时)或者为-CH2-、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-或-(CH2)6-；R2可以为-CH2-、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-或-(CH2)6-。
在一个优选的实施方案中，R1为-(CH2)2-，R2为-(CH2)2-，此时所述敌百虫半抗原具有如下所示的结构式(I-1)：
如本领域技术人员所理解的，所谓半抗原，是指这样的一类小分子物质：其单独存在时并不能诱导免疫应答，即不具备免疫原性，但当其与大分子蛋白质或非抗原性的多聚赖氨酸等载体交联或结合后可获得免疫原性，从而诱导免疫应答。这类小分子物质可与应答效应产物结合，具备抗原性，即免疫反应性，但是不具有免疫原性。
敌百虫的分子结构式如下所示：
敌百虫自身不具有抗原或者半抗原属性。因此，如果要产生敌百虫抗体，需要先对敌百虫分子进行改造。在本发明中，发明人在不改变敌百虫结构的基础上，使敌百虫分子上的一个甲氧基(CH3-O-)与烯醇反应，从而合成出带有烯烃的敌百虫衍生物，再通过点击化反应使所述衍生物带有羧基连接臂，从而成为半抗原。经试验发现，使此敌百虫半抗原与载体蛋白发生偶联而获得的敌百虫抗原在免疫动物后，会刺激动物进行免疫应答，并产生特异性更强、灵敏度更高的抗体，为后续建立敌百虫的各种免疫分析方法提供基础。
本发明的敌百虫半抗原，不仅合成方法简便、纯度较高，而且能应用于合成适于动物免疫的抗原体系，弥补了国内敌百虫免疫学检测方法技术领域的空白，为敌百虫免疫检测方法的进一步发展奠定了基础。
在第二方面，本发明提供了一种用于制备本发明第一方面的敌百虫半抗原的中间体，其结构式如式(II)所示：
其中，R1选自C0-C6亚烷基。
具体地，所述R1可以不存在(即当R1为C0时)或者选自-CH2-、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-或-(CH2)6-。
在一个优选的实施方案中，R1为-(CH2)2-，此时所述敌百虫半抗原的中间体具有如下所示的结构式(II-1)：
从下文详述的本发明第三方面方法可以知晓，从该中间体可以直接制备得到最终产物(I)，即本发明的敌百虫半抗原。
在第三方面，本发明还提供了一种制备本发明第一方面的敌百虫半抗原的方法，包括以下步骤：
步骤1：在低温下，使三氯化磷与结构式为的化合物1反应，经减压蒸馏后得到中间体1：
其中，R1选自C0-C6亚烷基；
步骤2：在低温下，使所述中间体1在碱性条件下与无水甲醇、吡啶反应，得到中间体2：
步骤3：在缚酸剂条件下，使所述中间体2与三氯乙醛反应，得到中间体3：
步骤4：使所述中间体3与结构式如的化合物2在引发剂的存在下进行反应，得到式(I)所示的敌百虫半抗原：
其中，R2选自C1-C6亚烷基。
本发明这一方面的基团R1和R2与本发明第一方面涉及到的基团R1和R2相同，因此其定义具体可以参见本发明第一方面的相关描述，在此不再赘述。
本发明方法具体的反应过程如下所示：
在一个优选的实施方案中，在步骤1中，三氯化磷和化合物1的摩尔比为1:(1-1.1)。
在一个优选的实施方案中，在步骤1中，将反应体系充满氮气，将三氯化磷降温至-75℃至-85℃例如-78℃后开始滴加化合物1；在滴加过程中不断用氮气吹出生成的氯化氢，滴加时间大于5h；滴加完成后，停止制冷，在氮气氛围下保持搅拌，缓慢升温并反应过夜；反应完成后减压蒸馏，收集0.1-0.3kPa例如0.2kPa、45℃至50℃的馏分即中间体1。
在一个优选的实施方案中，在步骤2中，所述中间体1、无水甲醇和吡啶的摩尔比为1:1:(2-5)。
在一个优选实施方案中，在步骤2中，将所述中间体1溶于四氢呋喃中，并降温至-75℃至-85℃例如-78℃；将无水甲醇以及部分吡啶溶于四氢呋喃中，并于-75℃至-85℃例如-78℃缓慢滴加至反应体系中，滴加时间0.8-1.2h如1h。滴加完成后，于-75℃至-85℃例如-78℃反应，之后再升温至室温并搅拌；反应完成后，降温至-1℃至1℃例如0℃，将水以及另一部分吡啶溶解于四氢呋喃中，滴入反应体系，滴完后继续反应；反应完成后进行过滤，滤液旋干过柱得到中间体2。
在一个优选的实施方案中，在步骤3中，所述中间体2、三氯乙醛和缚酸剂的摩尔比为1:(1-1.2):(1-3)。
在一个优选实施方案中，在步骤3中，将中间体2溶于二氯甲烷中，再加入缚酸剂和三氯乙醛，室温搅拌过夜，反应完成后旋干过柱得到中间体3。
在一个进一步优选的实施方案中，所述缚酸剂选自选自有机碱，所述有机碱选自三乙胺、二乙胺、N,N-二异丙基乙胺、4-二甲氨基吡啶、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯、四甲基乙二胺和吡啶中的至少一种。
在一个优选的实施方案中，在步骤4中，所述中间体3、化合物2和引发剂的摩尔比为1:(1-2):(0.1-0.3)。
在一个优选的实施方案中,所述引发剂包括安息香双甲醚、和/或偶氮二异丁腈。
在一个优选的实施方案中，在步骤4中，将中间体3、化合物2以及引发剂加入二氯甲烷使其溶解，在350nm-380nm以及250nm–280nm紫外灯共同照射下室温反应。反应完成后，旋干，过柱。
在本发明的一个优选实施方案中，所述的方法包括以下步骤：
步骤1：在低温下，使三氯化磷与3-丁烯-1-醇进行反应，经减压蒸馏后得到中间体1’：
步骤2：在低温下，使所述中间体1’在碱性条件下与无水甲醇、吡啶反应，得到中间体2’：
步骤3：在缚酸剂条件下，使所述中间体2’与三氯乙醛进行反应，得到中间体3’：
步骤4：使所述中间体3’与3-巯基丙酸进行反应，得到式(I-1)所示的敌百虫半抗原：
上述本发明方法的具体的反应过程如下所示：
在一个优选的实施方案中，在步骤1中，三氯化磷和3-丁烯-1-醇的摩尔比为1:(1-1.1)。
在一个优选的实施方案中，在步骤1中，将三氯化磷置于三口烧瓶，将3-丁烯-1-醇置于恒压滴液漏斗中；将整个体系充满氮气并将三口烧瓶中的三氯化磷降温至-78℃后开始滴加3-丁烯-1-醇；在滴加过程中不断用氮气吹出生成的氯化氢，滴加时间大于5h；滴加完成后，停止制冷，在氮气氛围下保持搅拌缓慢升温反应过夜；反应完成后加装刺型分馏塔温水浴减压蒸馏，收集0.2kPa、45℃至50℃的馏分即中间体1’。
在一个优选的实施方案中，在步骤2中，所述中间体1’、无水甲醇和吡啶的摩尔比为1:1:(2-5)。
在一个优选实施方案中，在步骤2中，将所述中间体1’溶于四氢呋喃中，并置于圆底烧瓶降温至-78℃；称取无水甲醇以及部分吡啶，将其溶于四氢呋喃中，并于-78℃缓慢滴加至反应体系中，滴加时间约1h；滴加完成后，于-78℃反应，之后再升温至室温并搅拌；反应完成后，降温至0℃，取水以及另一部分吡啶溶解于四氢呋喃中，滴入反应体系，滴完后继续反应；反应完成后进行过滤，滤饼用二氯甲烷洗涤，滤液旋干后用二氯甲烷过柱得到中间体2’。
在一个优选的实施方案中，在步骤3中，所述中间体2’、三氯乙醛和缚酸剂的摩尔比为1:(1-1.2):(1-3)。
在一个优选实施方案中，在步骤3中，将中间体2’溶于二氯甲烷中，加入三乙胺以及三氯乙醛；室温搅拌过夜，反应完成后直接旋干过柱得到中间体3’。
在一个优选的实施方案中，在步骤4中，反应体系为中间体3’、3-巯基丙酸、和引发剂，其中，中间体3’、3-巯基丙酸和引发剂的质量比为1:(1-2):(0.1-0.3),引发剂包含安息香双甲醚、偶氮二异丁腈。
在一个优选的实施方案中，在步骤4中，将中间体3’、3-巯基丙酸以及安息香双甲醚加入二氯甲烷使其溶解，在365nm以及275nm紫外灯共同照射下室温反应；反应完成后，旋干，过柱。
本发明根据敌百虫的结构特点，合理设计敌百虫半抗原的合成方法，使用的原料易得，反应操作较为简单，反应条件易于控制。通过采用本发明的敌百虫半抗原合成方法，所获得的敌百虫半抗原的纯度和收率高，合成的半抗原的收率可达50％以上，整体的合成成本更具优势。
值得注意的是，本发明对上述反应时间并没有特别的限制，具体以完全反应的时间为准，上述反应时间限定仅仅是一种示例，并不局限于此。
如上所述，敌百虫半抗原仅具有免疫反应性，而不具有免疫原性，并不能单独地刺激动物产生相应的抗体。因此，为了赋予敌百虫半抗原以免疫原性，需要将敌百虫半抗原与大分子蛋白质等载体偶联、结合或者交联在一起，由此产生既具有免疫反应性又具有免疫原性的敌百虫偶联抗原。半抗原与载体分子之间的偶联、结合或者交联方法是本领域已知的。
因此，根据本发明的第四方面，本发明提供了一种敌百虫抗原，包含本发明第一方面的敌百虫半抗原，以及与所述敌百虫半抗原偶联的载体蛋白。
本发明所提及的术语“载体蛋白”是任何能够与半抗原偶联、结合或者交联并由此产生既具有免疫原性又具有免疫反应性的物质，包括例如大分子蛋白质或者非抗原性的多聚赖氨酸等。作为示例，可以使用的载体蛋白包括，但不限于，大分子蛋白质，例如牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、鸡卵清白蛋白(OVA)、血蓝蛋白(KLH)。
抗原在进入机体后，会刺激B细胞，诱导细胞的增殖和分化，继而产生特异性抗体。具体到本发明，利用本发明敌百虫半抗原与载体蛋白偶联后得到的敌百虫抗原去免疫动物，会刺激动物进行免疫应答，从而可以产生特异性强、灵敏度高且保质期长的抗体。
因此，根据本发明的第五方面，提供了一种敌百虫抗体，该敌百虫抗体为特异性针对本发明第四方面的敌百虫抗原的抗体。
敌百虫抗体可以为单克隆抗体或者多克隆抗体。另外，可以采用本领域普通技术人员已知的方法来制备敌百虫抗体。例如，在敌百虫抗体为多克隆抗体的情况下，可以通过采用敌百虫抗原免疫接种哺乳动物例如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、灵长类动物(不包括人类)等，随后分离血清获得。在敌百虫抗体为单克隆抗体的情况下，可以通过制造和培养杂交瘤细胞并收集培养基获得单克隆抗体，或者可以将由此制备获得的杂交瘤细胞通过腹腔注射接种到哺乳动物例如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、灵长类动物(不包括人类)等的体内，在被接种动物的腹部明显膨大时收集腹水，由此获得单克隆抗体。
如本领域技术人员所能理解的，对于敌百虫抗体的来源，并没有特别的限制，其可以来源于任何哺乳动物，包括例如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、灵长类动物(不包括人类)等，但不限于此。在一个具体的实施方案中，敌百虫抗体为来源于小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、灵长类动物(不包括人类)的多克隆或者单克隆抗体。
基于免疫学检测的需要，发明人将本发明的第一方面的敌百虫半抗原、本发明的第四方面的敌百虫抗原、本发明的第五方面的敌百虫抗体应用于免疫学检测中，以检测敌百虫农药残留量。
因此，根据本发明的第六方面，提供了本发明的第一方面的敌百虫半抗原、本发明的第四方面的敌百虫抗原、和/或本发明的第五方面的敌百虫抗体在免疫学检测中的应用。
根据本发明的第七方面，提供了一种敌百虫胶体金层析检测装置，包括试纸条和反应杯，其中，试纸条包括反应膜，反应膜上有检测线和质控线，并且其中，检测线包被有本发明的第四方面的敌百虫抗原，并且其中，反应杯中含有胶体金标记的本发明的第五方面的敌百虫抗体(简称“金标抗体”)。
根据本发明的一些实施方案，试纸条还可以包括诸如底板、样品吸收垫和吸水垫的其他组件。在这种情况下，在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、反应膜、吸水垫。在本发明中，样品吸收垫可以为玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚醋膜；反应膜可以为硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜；吸水垫可以为吸水滤纸或滤油纸；底板可以为不吸水的韧性材料例如硬质塑胶条如PVC底板或不吸水硬纸条或其它硬质不吸水材料。
在本发明中，反应膜包含检测线和质控线。通常情况下，将检测线设置在靠近样品吸收垫一侧。检测线由敌百虫抗原(在本发明中即敌百虫半抗原-载体蛋白偶联物)在反应膜上进行线性点样制得。质控线可以通过将抗原或者抗体在反应膜上进行线性点样获得。
在本发明的一个实施方案中，质控线由本发明提供的敌百虫抗体的第二抗体点样获得。在胶体金标记的敌百虫抗体移动至质控线时，其会与形成该质控线的第二抗体发生结合反应，由此显现颜色。
如果质控线显色，则指示该检测***成立，检测结果可用。相反，如果质控线不显色，则指示该检测***不成立，检测结果不可用。
如上所述，反应杯中含有胶体金标记的本发明第五方面的敌百虫抗体，所述敌百虫抗体特异性地针对本发明第四方面的敌百虫抗原。
敌百虫抗体只要能够与敌百虫抗原发生抗原-抗体结合反应即可，而不管它是单克隆抗体还是多克隆抗体。然而，正如本领域技术人员可以理解的那样，从需要更高特异性的角度上考虑，单克隆抗体是更合适的。因此在本发明中，敌百虫抗体优选地为单克隆抗体。
在本发明中，质控线的点样制备可以根据胶体金标记的敌百虫抗体的类型来进行。具体地，若胶体金标记的敌百虫抗体为敌百虫单克隆抗体，则该质控线可以采用羊抗鼠抗抗体进行线性点样制得，若胶体金标记的敌百虫抗体为敌百虫多克隆抗体时，则该质控线可以采用羊抗兔抗抗体进行线性点样制得。
在本发明的一个实施方案中，本发明提供了一种敌百虫胶体金层析检测装置，包括试纸条和反应杯。如图3所示，试纸条包含底板以及在其上依次铺设的样品吸收垫、反应膜和吸水纸，该反应膜在样品吸收垫至吸水纸方向上包括检测线和质控线，检测线由敌百虫抗原制备获得；如图3所示，反应杯包含胶体金标记的敌百虫抗体，敌百虫抗体为特异性地针对敌百虫抗原的鼠源单克隆抗体，并且质控线为针对该敌百虫抗体的羊抗鼠抗抗体。
在本发明的一个实施方案中，可以通过下述制备方法来制备本发明的敌百虫胶体金层析检测装置：制备反应膜，采用本发明的敌百虫抗原在反应膜上进行线性点样制备检测线，并采用针对敌百虫抗体的羊抗鼠抗抗体通过线性点样制备质控线；在底板上沿同一方向依次搭接粘贴样品吸收垫、反应膜和吸水纸，由此组装成试纸条；将本发明的胶体金标记的敌百虫抗体加入微孔反应杯、冻干后，将微孔反应杯加上微孔塞。该制备方法中使用到的各成分或者组件如上文针对本发明的敌百虫胶体金层析检测装置所描述。
根据本发明的第八方面，本发明提供了一种检测样品中敌百虫的方法，该方法包括：使本发明的第七方面提供的敌百虫胶体金层析检测装置与样品接触。
在本发明中，该样品可以为任何疑似敌百虫残留量超标的样品，其可以是蔬菜、水果、可食动物组织、水或土壤。
根据本发明的一些实施方案，在采用本发明的方法检测样品中的敌百虫之前，可以根据样品的不同对其进行前处理，所述前处理方法为本领域已知的对用于检测的样品进行前处理的一般方法，在此不对其进行特别限定。
在进一步的实施方案中，在对样品进行前处理之后，将其滴加至微孔反应杯中，混匀后，将试纸条***微孔反应杯，待检样品溶液与微孔中的金标抗体结合后一起向反应膜扩散，若观察到质控线显现出***条带，则指示该检测***成立、可用。图4示出了根据本发明的一些实施方案的采用本发明提供的方法检测敌百虫的判定结果，判断方法如下：
(1)若检测线(T线)不显色，或者与质控线(C线)相比显色更浅，则表明样品中含有敌百虫。因为待检样品液中含有敌百虫时，扩散过程中待检样品液中的敌百虫可与金标抗体相结合，进而完全封闭金标抗体上敌百虫的抗原结合点，阻止金标抗体与反应膜上的敌百虫抗原结合，T线不显色或T线颜色比C线颜色更浅，而抗抗体则可与金标抗体结合，C线显色。
(2)若检测线同质控线一样显现出***条带，并且检测线的颜色深度与质控线的颜色深度相当或者更深，则表明样品不含敌百虫。因为待检样品液中不含敌百虫时，金标抗体上的抗原结合位点不能被封闭，进而金标抗体会与反应膜上的敌百虫抗原偶联结合，T线显色，同时抗抗体也可与金标抗体结合，C线亦显色，此时，T线颜色比C线颜色深或颜色相同。
(3)若反应膜上T线和C线均未显色，则试纸条失效。
下面结合实施例对本发明进行详细的说明，实施例仅是本发明的优选实施方式，不是对本发明的限定。
实施例1.敌百虫半抗原的合成和鉴定
本发明敌百虫半抗原的合成方法包括如下步骤：
步骤1：称取三氯化磷(190.4g，1.387mol)加入三口烧瓶中，将3-丁烯-1-醇(100.61g，1.387mol)置于恒压滴液漏斗中。将整个体系充满氮气并将三口烧瓶中的三氯化磷降温至-78℃，之后开始滴加3-丁烯-1-醇。在滴加过程中不断用氮气吹出生成的氯化氢，滴加时间大于5h。滴加完成后，停止制冷，在氮气氛围下保持搅拌，缓慢升温并反应过夜。反应完成后，加装刺型分馏塔温水浴减压蒸馏，收集0.2kPa、45℃至50℃的馏分，即中间体
步骤2：称取敌百虫半抗原中间体1’(8.16g，47.2mmol)，将其溶于160mL四氢呋喃中，并置于圆底烧瓶降温至-78℃。称取无水甲醇(1.521g，47.2mmol)以及吡啶(3.734g，47.2mmol，3.80mL)，将其溶于20mL四氢呋喃中，并于-78℃缓慢滴加至反应体系中，滴加时间1h。滴加完成后，于-78℃反应2小时，之后再升温至室温，搅拌2小时。反应完成后，降温至0℃，取水(0.9mL)以及吡啶(4.11g，52mmol，18mL)溶于20mL四氢呋喃中，滴入反应体系，滴完后继续反应1.5小时。反应完成后进行过滤，滤饼用二氯甲烷洗涤，滤液旋干后用二氯甲烷过柱得到无色油状物即中间体2’
步骤3：称取敌百虫半抗原中间体2’(6.7g，44.634mmol)，溶于103mL二氯甲烷中，加入三乙胺(836mg，8.266mmol，1.15mL)以及三氯乙醛(6.09g，41.328mmol)。室温搅拌过夜，反应完成后直接旋干过柱得无色油状物即中间体
步骤4：称取敌百虫半抗原中间体3’(1g，3.361mmol)、3-巯基丙酸(357mg，3.361mmol)以及安息香双甲醚(258mg，1.008mmol)，加40mL绝对干燥的二氯甲烷溶解，在365nm以及275nm紫外灯共同照射下室温反应2h。反应完成后，旋干，过柱，得无色油状物，即敌百虫半抗原
鉴定：采用质谱法EI-MS(negative)来鉴定敌百虫半抗原，所得质谱图如图1所示。从质谱图可以看出，半抗原的分子离子峰为m/z：401[M-H]-，且为最高峰，其与该敌百虫半抗原的分子量(402)相符，表明成功合成了式(I-1)所示的敌百虫半抗原。
实施例2.敌百虫抗原的制备和鉴定
制备：取实施例1制备的敌百虫半抗原0.1mmol溶于2mL二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌加入41.3mg二环己基碳二亚胺(DCC)和17.3mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。4℃下磁力搅拌反应过夜，离心后保留上清夜，并将其标记为A液。称取牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)各140mg，将其分别溶于10mL浓度为0.1mol/L的PBS(pH8.0)中，再加入DMF 1mL，搅拌溶解，由此制备获得B液。在磁力搅拌下，将A液逐渐滴入B液中，并于4℃反应12小时。离心后，取上清液，并于4℃用生理盐水透析3天，每天更换3次透析液，由此可以获得分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联的敌百虫偶联抗原。将所得敌百虫偶联抗原以1mg/mL的浓度分装于0.5mL离心管中，并冻存于-20℃冰箱中。
鉴定：采用紫外扫描仪，分别对敌百虫半抗原(Hapten)、BSA、Hapten-BSA、OVA、Hapten-OVA进行200nm～600nm全波长扫描，以观察偶联物与载体蛋白是否存在差别以此鉴定敌百虫半抗原Hapten与BSA、OVA是否发生偶联成功。从图2中可以看出，免疫原(Hapten-BSA和Hapten-OVA)的吸收曲线与敌百虫半抗原(Hapten)、BSA、OVA明显不同，呈现出BSA或OVA与敌百虫半抗原的累加吸收特征，这表明敌百虫半抗原与载体蛋白BSA、OVA偶联成功。
实施例3.敌百虫单克隆抗体的制备
利用实施例2制备的敌百虫免疫抗原(Hapten-BSA)制备敌百虫单克隆抗体。具体地，使用经鉴定的敌百虫免疫抗原免疫4只6周龄BALB/C小鼠，加强免疫三次后，采血测效价，待血清效价不再上升，用两倍剂量的抗原不加佐剂免疫小鼠，三天后脱颈致死小鼠，在无菌条件下取脾脏制备脾细胞，与生长旺盛的小鼠骨髓瘤细胞按8:1的比例混合于50mL离心管，加入30mL无血清IPMI1640培养基，1100r/min离心5min弃上清，将细胞团轻轻振松，置于37℃水浴中。把1mL的50％PEG-4000缓缓加入细胞中，在1min内滴完，同时轻轻搅动底部沉淀，静置1min后，前30s沿管壁缓慢匀速加入无血清培养基1mL，后30s加入2mL，然后快速加入27mL终止融合过程，1100r/min离心5min，弃上清，用HAT选择性培养基重悬后加到已铺有饲养细胞的96孔细胞培养板中，37℃、体积分数5％的CO2条件下培养。7天后换成HT培养液，待孔内的杂交细胞数量达到300个以上时，用间接ELISA法筛选，选择强阳性、抑制效果好、细胞生长旺盛的孔进行有限稀释克隆化，经3次以上的克隆培养和检测，均呈阳性的孔内细胞即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞扩大培养以备单克隆抗体的制备。
采用体内诱生腹水法生产抗敌百虫单克隆抗体。选4只经产昆明小鼠，腹腔注射液体石蜡油0.5mL/只，7天后腹腔注射上述杂交瘤细胞3-5×106/只，10天后，待小鼠腹部明显膨大时收集腹水。用正辛酸-硫酸铵沉淀法来纯化腹水，经紫外测定抗敌百虫单克隆抗体的含量。
实施例4.敌百虫胶体金检测装置
4.1胶体金的制备
取1％氯金酸溶液1mL，加99mL超纯水成终浓度0.01％的氯金酸溶液，加热沸腾后，取1％柠檬酸三钠1.6mL一次性迅速加入煮沸的氯金酸溶液中，继续加热至溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为亮红色，颜色稳定后继续加热5min，室温冷却，补充失水至原体积。
4.2胶体金标记的敌百虫单克隆抗体的制备
调节胶体金溶液pH值至8.0，用恒速搅拌器均匀搅拌，同时逐滴加入敌百虫单克隆抗体，1h后加入抗体量相当的聚乙二醇(PEG)，充分反应30min后加入抗体量相当的牛血清白蛋白(BSA)，加完后，继续搅拌30min。在9000rpm下离心30min获得均一性金标抗体沉淀，再加对硝基苯酚丁酸酯(PNPB)重悬备用。
4.3胶体金检测装置的制备
如图3所示，在底板上，沿同一方向依次将样品垫、喷涂有敌百虫Hapten-BSA(检测线)和羊抗鼠IgG(质控线)的硝酸纤维素膜和吸水纸依次搭接粘连。
反应杯内加入胶体金标记单克隆抗体，冻干。
实施例5.敌百虫的胶体金快速检测
5.1样品的预处理：取5g剪碎的果蔬样品，加入到至含有5mL pH7.4磷酸盐缓冲溶液的提取瓶，拧紧瓶盖大力摇匀约30秒，混匀后即为待测液。
5.2检测：拧开试剂瓶上盖，垂直滴加9-10滴(约200μL)待测液于反应杯中，并上下抽吸10次混匀。20℃-40℃开始第一步反应，并计时3分钟；将测试条***到反应杯中，20℃-40℃下开始第二步反应，并计时3分钟；从微孔中取出测试条，轻轻刮去测试条下端的样品垫，并进行结果判读，结果如表1。
5.3结果判读
表1
与其他验证方法的结果对比，结果如表2。
表2
实施例6.敌百虫胶体金检测装置的灵敏度
采用梯度实验，将25μg/kg、50μg/kg、100μg/kg、150μg/kg、200μg/kg等不同梯度浓度的标准品加入到反应杯中，用试纸条进行检测，检测线T线恰好消带时的浓度即为该胶体金检测装置的灵敏度。实验发现，当添加浓度为100μg/kg的标准品时T线消失，表明本发明中敌百虫胶体金检测装置的灵敏度为：敌百虫100μg/kg。
实施例7.敌百虫胶体金检测装置的特异性实验
在阴性样品中，分别加入敌百虫100μg/kg、敌敌畏10mg/kg、甲胺磷10mg/kg、乙拌磷10mg/kg、乐果10mg/kg、氧乐果10mg/kg、毒死蜱10mg/kg、辛硫磷10mg/kg。实验结果发现，只有加入敌百虫的样品能够检出，而加入敌敌畏、甲胺磷、乙拌磷、乐果、氧乐果、毒死蜱、辛硫磷的样品无法检出，说明本检测装置对敌百虫的特异性较好。
实施例8.敌百虫胶体金检测装置的保质期实验
用三批常规生产的产品分别做保质期实验，放置于室内室温环境保持，每隔1个月取12个装置，用质控样本检测，分别做阴性和50μg/kg、100μg/kg、150μg/kg加标实验，重复三次，观察数据变化，考察保质期时间。阴性显色从13个月开始下降，在1年时间内产品品质无明显变化，因此确定保质期为1年。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (18)

1.一种敌百虫半抗原，其特征在于，所述敌百虫半抗原的结构式如式(I)所示：
其中，所述R1选自C0-C6亚烷基；所述R2选自C1-C6亚烷基。
2.根据权利要求1所述的敌百虫半抗原，其特征在于，所述敌百虫半抗原具有如式(I-1)所示的结构：
3.一种用于制备权利要求1或2所述的敌百虫半抗原的中间体，其结构式如式(II)所示：
其中，所述R1选自C0-C6亚烷基。
4.根据权利要求3所述的敌百虫半抗原的中间体，其特征在于，所述中间体具有如式(II-1)所示的结构：
5.一种制备权利要求1或2所述的敌百虫半抗原的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1：在低温下，使三氯化磷与结构式为的化合物1反应，经减压蒸馏后得到中间体1：
其中，R1选自C0-C6亚烷基；
步骤2：在低温下，使所述中间体1在碱性条件下与无水甲醇和吡啶反应，得到中间体2：
步骤3：在缚酸剂条件下，使所述中间体2与三氯乙醛反应，得到中间体3：
步骤4：使所述中间体3与结构式为的化合物2在引发剂的存在下进行反应，得到式(I)所示的敌百虫半抗原：
其中，R2选自C1-C6亚烷基。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，三氯化磷和所述化合物1的摩尔比为1:(1-1.1)。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述中间体1、无水甲醇和吡啶的摩尔比为1:1:(2-5)。
8.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述中间体2、三氯乙醛和缚酸剂的摩尔比为1:(1-1.2):(1-3)。
9.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述缚酸剂选自有机碱，所述有机碱选自三乙胺、二乙胺、N,N-二异丙基乙胺、4-二甲氨基吡啶、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯、四甲基乙二胺和吡啶中的至少一种。
10.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述中间体3、化合物2和引发剂的摩尔比为1:(1-2):(0.1-0.3)。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述引发剂为安息香双甲醚、和/或偶氮二异丁腈。
12.一种敌百虫抗原，所述敌百虫免疫抗原包含：权利要求1或2所述的敌百虫半抗原、以及与所述敌百虫半抗原偶联的载体蛋白。
13.根据权利要求12所述的敌百虫抗原，其特征在于，所述载体蛋白包括牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或血蓝蛋白。
14.一种敌百虫抗体，其特征在于，所述敌百虫抗体为特异性针对权利要求12或13所述的敌百虫抗原的抗体。
15.根据权利要求14所述的敌百虫抗体，其特征在于，所述敌百虫抗体为敌百虫单克隆抗体或敌百虫多克隆抗体。
16.权利要求1或2所述的敌百虫半抗原、权利要求12或13所述的敌百虫抗原、权利要求14或15所述的敌百虫抗体在敌百虫免疫学检测中的应用。
17.一种敌百虫胶体金层析检测装置，其特征在于，所述敌百虫胶体金层析检测装置包括试纸条和反应杯，其中，所述试纸条包括反应膜，所述反应膜上有检测线和质控线，所述检测线包被有权利要求12或13所述的敌百虫抗原，所述反应杯中含有胶体金标记的权利要求14或15所述的敌百虫抗体。
18.一种检测样品中敌百虫的方法，所述方法包括：使权利要求17所述的胶体金层析检测装置与样品接触，其中，所述样品为蔬菜、水果、可食动物组织、水或土壤。
CN202111299579.2A 2021-11-04 2021-11-04 一种敌百虫半抗原及其制备方法、抗原、抗体及其应用 Active CN113896743B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111299579.2A CN113896743B (zh) 2021-11-04 2021-11-04 一种敌百虫半抗原及其制备方法、抗原、抗体及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111299579.2A CN113896743B (zh) 2021-11-04 2021-11-04 一种敌百虫半抗原及其制备方法、抗原、抗体及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113896743A CN113896743A (zh) 2022-01-07
CN113896743B true CN113896743B (zh) 2024-03-15

Family

ID=79028147

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111299579.2A Active CN113896743B (zh) 2021-11-04 2021-11-04 一种敌百虫半抗原及其制备方法、抗原、抗体及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113896743B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102002103A (zh) * 2009-09-03 2011-04-06 天津科技大学 一种抗农药敌百虫的特异性抗体
CN108469517A (zh) * 2018-03-16 2018-08-31 北方工业大学 一种检测敌百虫的时间分辨荧光试纸条及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102002103A (zh) * 2009-09-03 2011-04-06 天津科技大学 一种抗农药敌百虫的特异性抗体
CN108469517A (zh) * 2018-03-16 2018-08-31 北方工业大学 一种检测敌百虫的时间分辨荧光试纸条及其应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A monoclonal antibody-based sensitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the analysis of the organophosphorous pesticides chlorpyrifos-methyl in real samples;Guoliang Qian et al.;Food Chemistry;20090329;第117卷;364-370 *
A study on biomimetic immunoassay-capillary electrophoresis method based on molecularly imprinted polymer for determination of trace trichlorfon residue in vegetables;Jie Li et al.;Food Chemistry;20161108;第221卷;1285-1290 *
Development of Enzyme-Linked Immunosorbent Assays for the Insecticide Chlorpyrifos. 1. Monoclonal Antibody Production and Immunoassay Design;Juan J. Manclu ́s et al.;J. Agric. Food Chem.;19961231;第44卷(第12期);4052-4062 *
兔抗敌百虫多克隆抗体的制备;范世奇 等;湖北农业科学;20090430;第48卷(第4期);928-930 *
有机磷农药半抗原设计及多特异性抗体识别机制研究;徐振林 等;中国科学: 化学;20150104;第45卷(第2期);168-176 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113896743A (zh) 2022-01-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111187346B (zh) 一种检测氟虫腈及其代谢物的胶体金试纸条及其制备方法
CN110441512B (zh) 一种乙基麦芽酚半抗原以及乙基麦芽酚的胶体金免疫层析检测装置
CN113264834B (zh) 一种冷杉醇半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用
CN110845444A (zh) 烯酰吗啉半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用
CN111943882B (zh) 腐霉利半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用
CN111269262B (zh) 丙溴磷半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用
CN108558718B (zh) 氟苯尼考及氟苯尼考胺抗原、抗体及其同时检测酶联免疫分析方法
CN111978271B (zh) 噻螨酮半抗原及其制备方法、噻螨酮抗原、抗体及其应用
CN115215811B (zh) 丙硫菌唑半抗原、抗原、抗体、检测装置及其制备和应用
CN110981875B (zh) 一种阿托品半抗原及其合成方法、抗原、抗体和应用
CN113896743B (zh) 一种敌百虫半抗原及其制备方法、抗原、抗体及其应用
CN115340986B (zh) 一株分泌甲拌磷单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
CN110927375A (zh) 一种检测喹乙醇残留的荧光微球免疫层析试纸条及其应用
CN113005097B (zh) 一株分泌抗卡马西平单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
CN109608479A (zh) 一种毒鼠强半抗原及单克隆抗体的制备方法与应用
CN109942624B (zh) 草铵膦半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法与检测装置
CN108132348B (zh) 苏丹红iii半抗原、偶联抗原、抗体及胶体金快速检测装置及其用途
CN112480167A (zh) 水胺硫磷半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用
CN116120242B (zh) 茶叶中喹螨醚快速检测装置及其制备和应用
CN118084965B (zh) 久效磷半抗原、抗原、抗体、检测装置及其制备和应用
CN110927376A (zh) 一种喹乙醇的磁免疫化学发光检测试剂盒及其应用
CN111943881B (zh) 溴虫腈半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用
CN115322089B (zh) 一种覆盆子酮半抗原、人工抗原及其制备方法、抗体和应用
CN111825566B (zh) 六氯苯半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用
CN114317450B (zh) 一株分泌氟苯虫酰胺单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant