CN113604602A

CN113604602A - 捕食线虫真菌寡孢节丛孢的str分子标记

Info

Publication number: CN113604602A
Application number: CN202111039221.6A
Authority: CN
Inventors: 周端咏; 张颖; 徐建平; 王瑞瑞; 李海霞; 李烁烁
Original assignee: Yunnan University YNU
Current assignee: Yunnan University YNU
Priority date: 2021-09-06
Filing date: 2021-09-06
Publication date: 2021-11-05
Anticipated expiration: 2041-09-06
Also published as: CN113604602B

Abstract

本发明公开了捕食线虫真菌寡孢节丛孢的STR分子标记，具体涉及DNA分子标记技术领域，包括以下具体步骤：步骤一、寡孢节丛孢全基因组STR扫描及引物设计，步骤二、寡孢节丛孢基因组DNA的提取和检测，步骤三、STR引物的初筛和及产物检测，步骤四、基于STR数据的遗传多样性分析。本发明通过在已经获得寡孢节丛孢基因组数据的基础之上，利用常规生物信息学方法，在基因组水平上检测其STR的分布，进行引物设计，利用分离自不同生长环境的寡孢节丛孢菌株样品，选取部分引物进行初筛、复筛后，得到20个具有多态性的STR分子标记，且该分子标记具有多态性高，重复性好，检测方便快捷和使用成本低廉等优势。

Description

捕食线虫真菌寡孢节丛孢的STR分子标记

技术领域

本发明涉及DNA分子标记技术领域，具体涉及捕食线虫真菌寡孢节丛孢的STR分子标记。

背景技术

分子标记是以个体间DNA序列变异为基础的遗传标记，可以检测个体间DNA特定区域的变异或多态性，能够直接反映DNA水平的遗传多样性，包括限制性片段长度多态性(RFLP)、扩增片段长度多态性(AFLP)、单核苷酸多态性(SNP)、短串联重复序列(STR)等多种类型。这些分子标记技术在生物遗传图谱构建、图位克隆、物种亲缘关系鉴定、***分类和基因诊断方面具有广泛的应用。在这些分子标记中，STR具有操作简单，对DNA要求不高，基因分型客观明确，重复性好，多态性高，能够区分纯合、杂合基因型等优势，可以检测到更多的等位基因，为个体间DNA序列多态性分析提供更加丰富的变异信息。

捕食线虫丝孢菌是一类包括水生和陆生的，在世界范围广泛分布的无性型真菌，腐生和线虫寄生相结合的生活方式使其具有极强的生态适应能力，它们是线虫种群自然控制的重要因子，也是植物病害生物防治的重要研究材料。寡孢节丛孢(Arthrobotrysoligospora)是研究捕食线虫真菌和线虫相互作用的模式种，在线虫生防领域极具生防潜力和应用价值。目前，关于寡孢节丛孢分子标记的研究主要集中在AFLP和多位点序列分型(MLST，属于SNP分子标记)两种类型。虽然两种类型的分子标记在寡孢节丛孢遗传多样性研究中都有应用，但不足之处非常明显：(1)能够检测到的等位基因数量有限，无法客观的反映自然界中寡孢节丛孢DNA水平的遗传变异；(2)AFLP分子标记对DNA的纯度和限制性内切酶的质量要求较高，MLST分子标记不仅对DNA纯度的要求较高，且依赖于DNA测序技术，两种分子标记都存在技术费用昂贵的问题。因此，有必要开发新的分子标记来弥补上述两种分子标记的不足。

发明内容

为此，本发明提供捕食线虫真菌寡孢节丛孢的STR分子标记，以解决现有技术中存在的问题。

为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：捕食线虫真菌寡孢节丛孢的STR分子标记，包括以下具体步骤：

步骤一、寡孢节丛孢全基因组STR扫描及引物设计：根据网上下载的寡孢节丛孢模式菌株(ATCC 24927)基因组(GenBank：ADOT00000000.)序列信息，利用MISA进行全基因组STR扫描，运用primer3，以被检测到的STR上下游100bp侧翼序列进行引物设计，选取部分引物进行初筛、复筛后，得到20个具有多态性的0.2g置于2.0mL的无菌离心管中，采用改进过的CTAB法提取基因组DNA：S1、向上述加入菌丝的离心管中加入灭菌的钢珠和0.5mL CTAB裂解液，配平后在高通量组织研磨仪50Hz条件下处理3分钟，重复4次，研磨完成后再向离心管中加入0.5mL CTAB裂解液，混匀；S2、将混匀后的离心管固定在泡沫板上，然后置于65℃水浴30分钟，其间每10分钟翻转离心管1次；S3、常温条件下，12000转离心10分钟，离心完成后取上清液0.8mL至新的2mL无菌离心管中；S4、加入等体积0.8mL的酚氯仿异戊醇，体积比25:24:1，pH>7.8，充分混匀后，常温条件下，12000转离心10分钟，取上清液0.6mL至新的2mL无菌离心管中；S5、加入0.6mL的酚氯仿异戊醇，体积比25:24:1，pH>7.8，重新抽提；充分混匀后，常温条件下，12000转离心10分钟，取上清液0.4mL至新的1.5mL无菌离心管中；S6、加入0.4mL的异丙醇和1/10体积的3.0M的醋酸钠，置于-20℃冰箱沉淀30分钟以上；S7、常温条件下，12000转离心10分钟，去掉上清液，加入1.0mL 70％的乙醇洗涤沉淀的DNA，重复两次；S8、倒置离心管于干纸巾上，尽量吸干离心管内壁的液体，后将离心管置于55℃恒温混匀仪上烘干；S9、向离心管中加入80μl的无菌水，置于4℃条件下过夜，使DNA沉淀充分溶解；S10、取3.0μl DNA样品进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测；S11、将DNA样品置于-20℃保存；

步骤三、STR引物的初筛和产物检测：在上述全基因组STR扫描及引物设计的结果中，随机从不同scaffold上挑选200对引物，并通过本地Blast检测这些引物在基因组中的专一性，合成引物，随机挑选8个寡孢节丛孢菌株进行PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测STR扩增产物多态性；通过预实验后，选取多态性较好的20对引物作为选定的STR引物，合成选定的STR引物时，在正向引物加上不同的荧光标记，然后对全部样品进行PCR扩增；

步骤四、基于STR数据的遗传多样性分析：对分离自中国境内的198株寡孢节丛孢样品进行遗传多样性分析；将STR数据导入R程序包“poppr”计算Bruvo’s distance矩阵，并将距离矩阵结果导入MEGA 6.0构建UPGMA树。

进一步地，在步骤一中，引物设计的条件如下：引物长度在20-23bp之间；退火温度为60℃；扩增序列长度在130bp-250bp之间，核心单位包含2-4个碱基的串联重复。

进一步地，在步骤三中，25μL的PCR扩增反应体系为：50ng/μL的模板1μL；25mM的MgCl₂ 2.5μL；10mM的dNTPs 1μL；10μM的正反向引物各1μL；5U/μL的DNATaq酶0.25μL；10×PCR反应缓冲液2.5μL；去离子水15.8μL。

进一步地，在步骤三中，PCR扩增反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共进行30个循环，最后72℃延伸5分钟；扩增产物上样，用1.0％的琼脂糖凝胶、1×TBE电泳液中电泳检测，PCR产物送相关单位进行基因分型。

进一步地，在步骤四中，在全部样品中20个STR位点的分型结果显示，每个位点的等位基因数目为3(位点A3)～21(位点A191)个，平均9.4个，多态性信息量(polymorphisminformation content PIC)范围在0.244(A3)～0.858(A191)之间，根据STR分子标记多态性信息量划分标准：20对STR位点中，13对具有高水平多态性(PIC>0.5)，6对具有中水平多态性(0.5>PIC>0.25)，仅1对低水平多态性(PIC>0.25)，20对STR位点整体多态性高。

进一步地，在步骤四中，UPGMA树结果表明：全部样品在UPGMA树上都成独立的分支，20个位点中的多态性信息已经把198个样品都区分开

本发明具有如下优点：

本发明通过在已经获得寡孢节丛孢基因组数据的基础之上，利用常规生物信息学方法，在基因组水平上检测其STR的分布，进行引物设计，利用分离自不同生长环境的寡孢节丛孢菌株样品，选取部分引物进行初筛、复筛后，得到20个具有多态性的STR分子标记，与现有技术相比，该分子标记具有多态性高，重复性好，检测方便快捷和使用成本低廉等优势。为后续的寡孢节丛孢遗传多样性，群体遗传学及筛选高环境适应性和强杀线虫活力的生防菌株提供强有力的研究工具。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。

图1为本发明提供的全部样品在UPGMA树上的结果示意图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

参照说明书附图1，该实施例的捕食线虫真菌寡孢节丛孢的STR分子标记，包括以下具体步骤：

步骤一、寡孢节丛孢全基因组STR扫描及引物设计：根据网上下载的寡孢节丛孢模式菌株(ATCC 24927)基因组(GenBank：ADOT00000000.)序列信息，利用MISA进行全基因组STR扫描，运用primer3，以被检测到的STR上下游100bp侧翼序列进行引物设计，引物设计的条件如下：引物长度在20-23bp之间；退火温度为60℃；扩增序列长度在130bp-250bp之间，核心单位包含2-4个碱基的串联重复；然后选取部分引物进行初筛、复筛后，得到20个具有多态性的STR分子标记；20个STR分子标记的编号为：A003，A005，A017，A025，A051，A074，A080，A083，A087，A101，A103，A126，A149，A154，A156，A160，A177，A187，A191和A192；

上述STR分子标记的核苷酸序列分别为：

A003(136bp)，由如下所示的核苷酸序列组成：

GGAGTGGAAGTTAGATTGGAGGTGGGGATGTCGAGGAGGAGAGGACGTAGAAGCGCCGAGGAGACGGAAGAGCTTGAAGTGGTGGTGGTGTCGCCTCCCCGCTGTGATCATAAATATGCAAGTAAATTAGTTCCCC；

A005(150bp)，由如下所示的核苷酸序列组成：

CGATGAAGACGTGAGTTAGTTGGTTGGTGGTTGGCAGATAGATGGTTTGGGTGGATGATGGATGGATGGATGGATGATGGGCGGTTGGCTGGTTGGCTGGCTGGCGTTGATGGAACGTGAAAGGGCGATGATTAAAGGTGGTGACAGACA；

A017(146bp)，由如下所示的核苷酸序列组成：

CTCTGCTGAGACGTTAATGATCAATGGTGGTGGTGGTGATGATTATGGTGGTGCATATAGGCCAATCCCAGACTTCACTTTTGCTTCGGACGCCTATCCAGGAAATCGACGATGTCATCCGTGCGAACCTCTTGGGTACGATTTAC；

A025(135bp)，由如下所示的核苷酸序列组成：

GGGCATACCTCTCTTCTCTTAGTAGTAGCAGTAGTAGTAGTAGCGGAGGCTGCAATACAAACACTGCTATTAATACATCCACACCCGTCCTGTCACAATCAGAAAAATATCTCCAAAGACCATACCTAGCAATCC；

A051(151bp)，由如下所示的核苷酸序列组成：

ATTAACAATGGTCCGAAACTTCCGTTACTCTGTGGGAAAGCAAGAAAGCAAGCAAGCAAGCAGGTCTTCTCATCACACAACCATGACCACCACACTCGCCCTCCAAAATGTTGGTTGGCGATGTTTTTGCACTAATGGCTTTCTCCTTGTC；

A074(141bp)，由如下所示的核苷酸序列组成：

GATCGATTCTCGCTTAAAGACGGTCGATGAAGTTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCAGTGCTTGATATGAATGTTGATGCTGATGCTGGGTTTGTGGCTCCTGATGTGGGGTGTGGGAATGAGAGTATAGTGGAGCAGGA；

A080(145bp)，由如下所示的核苷酸序列组成：

GGGACATCGACAATATGTAAGTATCATACGAATTCTCTTGGGCCGGGTGCGACATTAAAAACGCTGATGCTACTATTTTTGCACCTGCTGCTGCTGCTGCTGTAATATAGGCTAGGAGCTAGTGTTATGTCTCAAAGCAGAGCTC；

A083(144bp)，由如下所示的核苷酸序列组成：

GAATCTTTCGGTTTAATGGTTTTCTTTTTATTAACTTCTAACTATTCATGTGGTGATGATTGCTGCTTGGGGATGACTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTACTTCTGAGCGCTTCTTCTCTGTTTTACTATGATACCACCATTCCC；

A087(152bp)，由如下所示的核苷酸序列组成：

GGAGAAACATCAATCAATCAATCGAGCGAGCAAGCAAGCAAAAAAACGAGGACCAAGAGGCACATTATCTCCTTTCACAGTGGTGGAGGAGAAGGTGGTGGTCGATGAGTGGAAAGACGTGTCTGCCAAGTCGACATCTTGGTTCCTCTCAG；

A101(147bp)，由如下所示的核苷酸序列组成：

ACAACATCAACTACCATCCACACTCCCACTCCCACGCCCACTCTCACTCTCATTCTCGCTCGCTCTCTTCTCACCACCAAGGCGGCCATTCTCCTCCTCCGCCAGCACACGCTCCTCCTCCTCCCTCTTATCCTTCTTCCAATAGCC；

A103(150bp)，由如下所示的核苷酸序列组成：

TCACTGCACTATCTCCAATCTAGGTTTTAGGGAGGTGATGTATTGTATGTATGTATGTAGGAGGGAAACTAAAAAAaCAAAAAAaTGTCTAGACTTGACTTTGCGTCAAAAGTCTGGGGAAAGTATGTGAAGTATGTTTCGATGTCGTGT；

A126(200bp)，由如下所示的核苷酸序列组成：

GCCAGGTGGTTAGGAGTATAAACCAAAACGTAAAAAAAaGAAAGAAAGAAAAGAAAGAAAGTGCCCCGCTAAGCGTAATGGGAAAAAAAATTTCAGATGCATGCCAATGCTGACACGGGTCGCGGCACGAGAGAGAAGCCGACCGCCGAGGGCAAGATAACTAAAAAGGGATATCGATTGACGTTATGGTGGTTCAAATA；

A149(142bp)，由如下所示的核苷酸序列组成：

AAAGAATGTGTGTCATCGAATACACACAAGCACACACACACACCATCGGTCTTTCGAAGCGGGGGGATAGAAAAGGGAAAGGGAAAAAAGGTGAGGTACTATGTAATGGAGGCTACTAGTATACTGACGGAACTAGGATGAA；

A154(169bp)，由如下所示的核苷酸序列组成：

TAATCTGAATGGTTGGTTGTTTCTGTTGGTTGGTGCTAGCTAGCTAGCTAAGTAACTCCTAAGCTTTTCGTTCTAGATGCTAGTACCGTGACGGTATACACCCTCAGCTTCGAATCGCATTCCGAAGGAGAAAGCCGCCGCCGCGGGAGCTAGTTGACAGTCCTTCATG；

A156(151bp)，由如下所示的核苷酸序列组成：

ATGTTTAATTTCCCTCCAAACTTCAACAAAGAAATGGAGGGAAACTAGTTGGGATGAATGGGGAAGAGGAAAAAGATGACGATGATGGAGTTGATGATGATGATGGAGGGGAGGAATGACAACAGGGCAGGAGAATTGCGAGTTGAGAGAA；

A160(158bp)，由如下所示的核苷酸序列组成：

GAACATGCACGTGTGAGATATATTTTCTGTCCGTATGTCCTGGACATGTATGTAAGTAAGCATGTAGTAAGTTAGTAAGAGAATCAGTAAGAAAGGAAGTCAGTCAGTCAGTCAGTAAATACCTAGGTATGGGGGCCTGTATGGTCTCGTATGGAGTC；

A177(138bp)，由如下所示的核苷酸序列组成：

GTTCGAGGGATAGTAGTGGTTGAGGAGTAGAGAGAGAGAGAGAAGAAAAAACACGCAAGCCCGGAAAAAGGATATGTGATGCACAAGTCGGATGATTGGGTATAAATGATAAAATCGTAGGTAAAAGATATGCGTTGG；

A187(142bp)，由如下所示的核苷酸序列组成：

GTCCAAGTTTGTCCAGTACACCCCTCCTCCTCCTCTGAGCCTTGCTCTTACAATGCAGCTTGTCAGTTCAGTCAGTCTACTGTGTATAGACTAAGTAAGTAAGGAATTACTTAGCTAAGTAATTCGGTATATTCTCCACGAT；

A191(165bp)，由如下所示的核苷酸序列组成：

AACACATCTCATTCATCCATCCACCCATCCATCCATTCATCCATTCCCCACCCCCCCAAATAAGTAGTATCCAACTTATATTTAATTATCGGAACACCACCACCACCACCACCACGAACAAGATTATTTTTATCGTGTCAGAATGTCAACTGTCAAATGTCAGGT；

A192(166bp)，由如下所示的核苷酸序列组成：

CCTAATACCCAACCGAATAACACGCCGAATACAGAGCCAAACGGTCGACCTAATACAAACAACCCACCGAACACTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCAAGAGCCTACCGGACCAAACAATCTACCGCAAAGCAGCCCTTCACCGAACGAGAACCCAGTTACACCTGTTT；

上述STR分子标记的引物序列分别为：

A003-F：GGAGTGGAAGTTAGATTGGAG；

A003-R：GGGGAACTAATTTACTTGCAT；

A005-F：CGATGAAGACGTGAGTTAGTT；

A005-R：TGTCTGTCACCACCTTTAATC；

A017-F：CTCTGCTGAGACGTTAATGAT；

A017-R：GTAAATCGTACCCAAGAGGTT；

A025-F：GGGCATACCTCTCTTCTCTTA；

A025-R：GGATTGCTAGGTATGGTCTTT；

A051-F：ATTAACAATGGTCCGAAACTT；

A051-R：GACAAGGAGAAAGCCATTAGT；

A074-F：GATCGATTCTCGCTTAAAGAC；

A074-R：TCCTGCTCCACTATACTCTCA；

A080-F：GGGACATCGACAATATGTAAG；

A080-R：GAGCTCTGCTTTGAGACATAA；

A083-F：GAATCTTTCGGTTTAATGGTT；

A083-R：GGGAATGGTGGTATCATAGTA；

A087-F：GGAGAAACATCAATCAATCAA；

A087-R：CTGAGAGGAACCAAGATGTC；

A101-F：ACAACATCAACTACCATCCAC；

A101-R：GGCTATTGGAAGAAGGATAAG；

A103-F：TCACTGCACTATCTCCAATCT；

A103-R：ACACGACATCGAAACATACTT；

A126-F：GCCAGGTGGTTAGGAGTATAA；

A126-R：TATTTGAACCACCATAACGTC；

A149-F：AAAGAATGTGTGTCATCGAAT；

A149-R：TTCATCCTAGTTCCGTCAGTA；

A154-F：TAATCTGAATGGTTGGTTGTT；

A154-R：CATGAAGGACTGTCAACTAGC；

A156-F：ATGTTTAATTTCCCTCCAAAC；

A156-R：TTCTCTCAACTCGCAATTCT；

A160-F：GAACATGCACGTGTGAGATA；

A160-R：GACTCCATACGAGACCATACA；

A177-F：GTTCGAGGGATAGTAGTGGTT；

A177-R：CCAACGCATATCTTTTACCTA；

A187-F：GTCCAAGTTTGTCCAGTACAC；

A187-R：ATCGTGGAGAATATACCGAAT；

A191-F：AACACATCTCATTCATCCATC；

A191-R：ACCTGACATTTGACAGTTGAC；

A192-F：CCTAATACCCAACCGAATAAC；

A192-R：AAACAGGTGTAACTGGGTT；

步骤二、寡孢节丛孢基因组DNA的提取和检测：从PDA平板上刮取适量的寡孢节丛孢菌丝0.2g置于2.0mL的无菌离心管中，采用改进过的CTAB法提取基因组DNA：S1、向上述加入菌丝的离心管中加入灭菌的钢珠和0.5mL CTAB裂解液，配平后在高通量组织研磨仪50Hz条件下处理3分钟，重复4次，研磨完成后再向离心管中加入0.5mL CTAB裂解液，混匀；S2、将混匀后的离心管固定在泡沫板上，然后置于65℃水浴30分钟，其间每10分钟翻转离心管1次；S3、常温条件下，12000转离心10分钟，离心完成后取上清液0.8mL至新的2mL无菌离心管中；S4、加入等体积0.8mL的酚氯仿异戊醇，体积比25:24:1，pH>7.8，充分混匀后，常温条件下，12000转离心10分钟，取上清液0.6mL至新的2mL无菌离心管中；S5、加入0.6mL的酚氯仿异戊醇，体积比25:24:1，pH>7.8，重新抽提；充分混匀后，常温条件下，12000转离心10分钟，取上清液0.4mL至新的1.5mL无菌离心管中；S6、加入0.4mL的异丙醇和1/10体积的3.0M的醋酸钠，置于-20℃冰箱沉淀30分钟以上；S7、常温条件下，12000转离心10分钟，去掉上清液，加入1.0mL 70％的乙醇洗涤沉淀的DNA，重复两次；S8、倒置离心管于干纸巾上，尽量吸干离心管内壁的液体，后将离心管置于55℃恒温混匀仪上烘干；S9、向离心管中加入80μl的无菌水，置于4℃条件下过夜，使DNA沉淀充分溶解；S10、取3.0μl DNA样品进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测；S11、将DNA样品置于-20℃保存；

25μL的PCR扩增反应体系为：50ng/μL的模板1μL；25mM的MgCl₂ 2.5μL；10mM的dNTPs 1μL；10μM的正反向引物各1μL；5U/μL的DNATaq酶0.25μL；10×PCR反应缓冲液2.5μL；去离子水15.8μL；

PCR扩增反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共进行30个循环，最后72℃延伸5分钟；扩增产物上样，用1.0％的琼脂糖凝胶、1×TBE电泳液中电泳检测，PCR产物送相关单位进行基因分型；可以将PCR产物送北京擎科生物技术有限公司进行基因分型；

步骤四、基于STR数据的遗传多样性分析：对分离自中国境内的198株寡孢节丛孢样品进行遗传多样性分析；将STR数据导入R程序包“poppr”计算Bruvo’s distance矩阵，并将距离矩阵结果导入MEGA 6.0构建UPGMA树；

在全部样品中20个STR位点的分型结果显示，每个位点的等位基因数目为3(位点A3)～21(位点A191)个，平均9.4个，多态性信息量(polymorphism information contentPIC)范围在0.244(A3)～0.858(A191)之间，根据STR分子标记多态性信息量划分标准：20对STR位点中，13对具有高水平多态性(PIC>0.5)，6对具有中水平多态性(0.5>PIC>0.25)，仅1对低水平多态性(PIC>0.25)，20对STR位点整体多态性高；

UPGMA树结果表明，如图1所示，全部样品在UPGMA树上都成独立的分支，20个位点中的多态性信息已经能够把198个样品都区分开，说明这些引物在检测群体中能够为提供足够的多样性，能够用于后续的遗传多样性、群体遗传学及筛选高环境适应性和强杀线虫活力的生防菌株提供有力的研究工具。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.捕食线虫真菌寡孢节丛孢的STR分子标记，其特征在于：包括以下具体步骤：

步骤一、寡孢节丛孢全基因组STR扫描及引物设计：根据网上下载的寡孢节丛孢模式菌株(ATCC24927)基因组(GenBank：ADOT00000000.)序列信息，利用MISA进行全基因组STR扫描，运用primer3，以被检测到的STR上下游100bp侧翼序列进行引物设计，选取部分引物进行初筛、复筛后，得到20个具有多态性的STR分子标记；

步骤二、寡孢节丛孢基因组DNA的提取和检测：从PDA平板上刮取适量的寡孢节丛孢菌丝0.2g置于2.0mL的无菌离心管中，采用改进过的CTAB法提取基因组DNA：S1、向上述加入菌丝的离心管中加入灭菌的钢珠和0.5mL CTAB裂解液，配平后在高通量组织研磨仪50Hz条件下处理3分钟，重复4次，研磨完成后再向离心管中加入0.5mLCTAB裂解液，混匀；S2、将混匀后的离心管固定在泡沫板上，然后置于65℃水浴30分钟，其间每10分钟翻转离心管1次；S3、常温条件下，12000转离心10分钟，离心完成后取上清液0.8mL至新的2mL无菌离心管中；S4、加入等体积0.8mL的酚氯仿异戊醇，体积比25:24:1，pH>7.8，充分混匀后，常温条件下，12000转离心10分钟，取上清液0.6mL至新的2mL无菌离心管中；S5、加入0.6mL的酚氯仿异戊醇，体积比25:24:1，pH>7.8，重新抽提；充分混匀后，常温条件下，12000转离心10分钟，取上清液0.4mL至新的1.5mL无菌离心管中；S6、加入0.4mL的异丙醇和1/10体积的3.0M的醋酸钠，置于-20℃冰箱沉淀30分钟以上；S7、常温条件下，12000转离心10分钟，去掉上清液，加入1.0mL70％的乙醇洗涤沉淀的DNA，重复两次；S8、倒置离心管于干纸巾上，尽量吸干离心管内壁的液体，后将离心管置于55℃恒温混匀仪上烘干；S9、向离心管中加入80μl的无菌水，置于4℃条件下过夜，使DNA沉淀充分溶解；S10、取3.0μlDNA样品进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测；S11、将DNA样品置于-20℃保存；

步骤四、基于STR数据的遗传多样性分析：对分离自中国境内的198株寡孢节丛孢样品进行遗传多样性分析；将STR数据导入R程序包“poppr”计算Bruvo’sdistance矩阵，并将距离矩阵结果导入MEGA6.0构建UPGMA树。

2.根据权利要求1所述的捕食线虫真菌寡孢节丛孢的STR分子标记，其特征在于：在步骤一中，引物设计的条件如下：引物长度在20-23bp之间；退火温度为60℃；扩增序列长度在130bp-250bp之间，核心单位包含2-4个碱基的串联重复。

3.根据权利要求1所述的捕食线虫真菌寡孢节丛孢的STR分子标记，其特征在于：在步骤三中，25μL的PCR扩增反应体系为：50ng/μL的模板1μL；25mM的MgCl₂2.5μL；10mM的dNTPs1μL；10μM的正反向引物各1μL；5U/μL的DNATaq酶0.25μL；10×PCR反应缓冲液2.5μL；去离子水15.8μL。

4.根据权利要求1所述的捕食线虫真菌寡孢节丛孢的STR分子标记，其特征在于：在步骤三中，PCR扩增反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共进行30个循环，最后72℃延伸5分钟；扩增产物上样，用1.0％的琼脂糖凝胶、1×TBE电泳液中电泳检测，PCR产物送相关单位进行基因分型。

5.根据权利要求1所述的捕食线虫真菌寡孢节丛孢的STR分子标记，其特征在于：在步骤四中，在全部样品中20个STR位点的分型结果显示，每个位点的等位基因数目为3(位点A3)～21(位点A191)个，平均9.4个，多态性信息量(polymorphisminformationcontentPIC)范围在0.244(A3)～0.858(A191)之间，根据STR分子标记多态性信息量划分标准：20对STR位点中，13对具有高水平多态性(PIC>0.5)，6对具有中水平多态性(0.5>PIC>0.25)，仅1对低水平多态性(PIC>0.25)，20对STR位点整体多态性高。

6.根据权利要求1所述的捕食线虫真菌寡孢节丛孢的STR分子标记，其特征在于：在步骤四中，UPGMA树结果表明：全部样品在UPGMA树上都成独立的分支，20个位点中的多态性信息已经把198个样品都区分开。