CN105063761A - 一种用dna条形码鉴别捕食线虫丝孢菌节丛孢属的方法 - Google Patents
一种用dna条形码鉴别捕食线虫丝孢菌节丛孢属的方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种用DNA条形码鉴别捕食线虫丝孢菌节丛孢属的方法,属真菌物种鉴定领域。该方法使用RPB2基因作为捕食线虫丝孢菌节丛孢属鉴定的目标DNA条形码基因,采用合并节丛孢属样本实验数据和目标真菌数据的策略构建高容量数据库,同时使用待鉴别真菌的RPB2基因与基因库进行比较,基于Kimura-2-parameter概率的遗传距离法和聚类分析的***发生树法设立鉴定的规则鉴别物种。有益效果在于:RPB2基因作为最适合鉴别捕食线虫丝孢菌的DNA条形码,具有通用、易扩增、易比对的特点;该鉴别方法的鉴定效率及其鉴定的可靠性和准确性也大大优于常规的DNA条形码方法,弥补了捕食线虫丝孢菌DNA条形码分子标记的空白,为捕食线虫丝孢菌的种质资源挖掘、生防应用和遗传多样性研究提供有力的研究工具。
Description
技术领域:
本发明属于真菌物种鉴定领域,具体而言,本发明涉及一种用DNA条形码鉴别捕食线虫丝孢菌节丛孢属的方法。
背景技术:
植物寄生线虫病是一类在世界范围内普遍发生的植物病害,目前已知的根结线虫种类就有70多种,危害3000多种植物,全球每年因线虫病造成的损失高达1580多亿美元。在我国,线虫危害蔬菜、烟草、花卉、林木、中药材、棉花、大豆等几乎所有的作物,松材线虫被称为无烟森林火灾,在国内多个省区广泛发生,成为农林业生产的重要限制因子之一。面临如此严重的线虫侵害现象,目前已开发多种杀线虫试剂,但长期使用化学农药除了造成环境污染、残留、破坏生态平衡等弊端外,更加剧了线虫的抗药性,开发对环境安全的生物农药已经越来越受到关注。捕食线虫丝孢菌作为病原线虫的重要天敌,是自然界中控制、平衡和调节线虫种群数量的重要生物因子,也是研究开发生物杀线虫剂的宝贵资源,保护和评估具有潜在经济价值的捕食线虫丝孢菌具有重要的科学和应用价值。目前国内外开发的线虫生防制剂已达6个,其中有两个Royal300和Royal350均是利用节丛孢属真菌开发的生防产品,节丛孢属真菌资源在线虫生防产品开发中具有举足轻重的地位。
目前全世界共报道捕食线虫丝孢菌96种,包含节丛孢属Arthrobotrys、亚隔指孢属Dactylellina和德氏霉属Drechslerella等重要属,其中节丛孢属54种。尽管目前已经有比较清晰的属级水平上的分类概念,但由于不同的研究者对种的概念有不同的理解,故捕食线虫丝孢菌在物种水平上的争议依然存在。物种的划分还是依赖于传统的形态结构,即分生孢子和分生孢子梗的形态,导致捕食线虫丝孢菌种间、种内分类同名异物、同物异名的问题普遍存在,至今还没有形成一个公认的分类***和种间清晰的分类界限,严重阻碍了该类重要菌种资源的挖掘和开发。
由于依靠形态学结构的传统分类在真菌分类中有很大的局限性,近年来分子数据受到了真菌分类学家们的青睐,基于DNA序列并加以形态结构特征辅佐的物种鉴定方法将快速取代早期仅依靠形态结构特征的物种鉴定方式。DNA条形码是一种基于DNA序列进行生物物种鉴定的技术,即利用标准化的一个或几个DNA片段进行序列分析,根据核苷酸序列差异,实现快速和准确地鉴定物种。通常,DNA条形码筛选有以下标准:(1)标准的短片段;(2)要有足够的变异能将物种分开来,种间差异比较大,便于进行种与种的区分,种内序列变异尽量小,从而使种间和种内变异有一个明晰的界定;(3)序列两段相对保守,以方便引物的设计。目前,还未报道有某条特定DNA条形码能够适用于所有真菌的鉴别,因此针对具体的真菌类群,仍需要进行实验来寻找到合适的基因序列作为DNA条形码使用。利用DNA条形码技术来对捕食线虫丝孢菌物种进行便捷准确地鉴定,对于扩大该类重要真菌种质资源,挖掘生物防治应用菌株,揭示重要捕食线虫丝孢菌的物种多样性和遗传多样性都具有十分重要的意义。
发明内容:
本发明的目的在于提供一种准确、快捷的用DNA条形码鉴别捕食线虫丝孢菌节丛孢属的方法。
本发明的技术方案如下:
一种用DNA条形码鉴别捕食线虫丝孢菌节丛孢属的方法,包括RPB2基因序列片段的基因库的建立和新样品的鉴别步骤;其中:
(1)RPB2基因序列片段的基因库的建立:收集《中国真菌志》第三十三卷《节丛孢及相关属》中记载的节丛孢属概念清晰的种为材料,然后提取其基因组DNA,以其为模板,优选SEQIDNO.55和SEQIDNO.56引物序列扩增样品的RPB2基因序列片段,由此建立包括捕食线虫丝孢菌节丛孢属菌株的基因库;所述基因库包括下述序列编号所示的RPB2基因序列片段:SEQIDNO.1-54;
(2)新样品的鉴别:通过将待鉴别真菌的序列与基因库内已有的序列之间的进行比对,基于Kimura-2-parameter概率的遗传距离法和基于聚类分析的***发生树法设立鉴定规则来鉴别物种,获得多个序列间的相似性,相似度最高或匹配度最高或遗传距离最小的对应物种即为待鉴别真菌的物种;具体如下:
a.基于Kimura-2-parameter概率的遗传距离法设立鉴定规则来鉴别物种
将新的待鉴别样品与此基因库的基因片段进行比对,使用Mega6.0软件计算未鉴定样品DNA条形码序列与数据库中每一个序列的Kimura-2-parameter遗传距离,计算种内种间变异值,鉴别物种;对于基因库内的捕食线虫丝孢菌序列,已经计算出捕食线虫丝孢菌节丛孢属的种内最大变异值,当新的待鉴别样品与此基因库的基因片段进行比对后,得到多个序列间最小变异值即种间最小变异值,这些值等于或小于已计算出的某物种的种内最大变异值,视为与其同一物种;
b.基于聚类分析的***发生树法设立鉴定规则来鉴别物种
应用MEGA或PAUP软件构建NJ、ML、MP***发育树,检验未鉴定样品的DNA条形码序列与数据库中序列聚类在一起的物种,若未知样品与数据库中的物种构成单支系,则鉴定为该物种。
本发明的有益效果在于:
1、优选RPB2基因作为最适合鉴别捕食线虫丝孢菌的DNA条形码,相比于其他基因,RPB2序列具有通用、易扩增、易比对的特点。
2、建立了包括捕食线虫丝孢菌节丛孢属菌株的基因库和新样品的鉴别方法,相比于传统的形态显微观察进行鉴定的方法,鉴定效率大大提高,对于样品的完整程度要求低,鉴别指标能够量化,加之同时使用Kimura-2-parameter概率的遗传距离法和基于聚类分析的***发生树法设立鉴定规则进行鉴定,其鉴定的可靠性和准确性也大大优于常规的DNA条形码方法,弥补了捕食线虫丝孢菌DNA条形码分子标记的空白,为捕食线虫丝孢菌的种质资源挖掘、生防应用和遗传多样性研究提供有力的研究工具。
附图说明:
图1是基于RPB2基因库中菌株和待鉴定菌株SP1的遗传距离构建的NJ树。
具体实施方式:
实施例1:捕食线虫丝孢菌节丛孢属DNA条形码即RPB2基因序列片段的基因库的建立
(1)所选菌株捕食线虫丝孢菌节丛孢属共计有32个种,54个菌株,均是《中国真菌志》第三十三卷《节丛孢及相关属》中记载的节丛孢属概念清晰的种,且每个常见种至少包含3个菌株,以满足后续计算种内最大遗传变异值的需要。详细信息见表1。
表1样品信息表
(2)将表1中所列样品纯培养菌株接种于CMA平板[玉米粉培养基:玉米粉30g,琼脂16g,水1000ml,自然pH,玉米粉加水适量煮沸30分钟,四层纱布过滤,滤液加水至1000ml,混匀,分装。121℃灭菌20-30分钟]和PDA平板[土豆培养基:去皮土豆200g,葡萄糖20g,琼脂16g,水1000ml,自然pH,将土豆削皮后,切成小块,加水适量煮沸30分钟,四层纱布过滤,滤液加水至1000ml,混匀,分装。121℃灭菌20-30分钟]。CMA平板转接的菌株待菌丝长满后保藏于4℃,以便后续使用。而PDA平板则用于富集营养菌丝,用于提取总DNA用。
(3)基因组DNA采用改进过的CTAB法提取:往步骤(2)中收集好菌丝的离心管中加入0.3g的石英砂(Sigma),再加入850μL的CTAB裂解液[2%CTAB(w/v);100mMTris-HCl;1.4MNaCl;20mMEDTA,pH8.0],用研磨棒充分研磨,直至呈匀浆状;置于65℃水浴锅水浴90min,,然后用酚∶氯仿(1:1)反复抽提,离心,直至获得澄清透亮的液体提取物且上下两相液面交界处没有白色沉积物;收集上清液并加入等体积的异丙醇(或2倍体积的无水乙醇)沉淀DNA,加入1mL75%的乙醇(4℃保存)洗涤DNA,待DNA沉淀完全干燥,加入50μL无菌水室温溶解沉淀;取5μLDNA溶液在1.5%琼脂糖凝胶上电泳检测基因组DNA的纯度和完整性;最后,所得DNA样品置-20℃保存备用。
(4)以步骤(3)获得的基因组DNA为模板,采用下述序列作为引物从所述待鉴别真菌的基因组DNA中扩增RPB2基因序列片段,(正向:5‘-TGGGGKWTGGTYTGYCCTGC-3’,反向:5‘-CCCATWGCYTGCTTMCCCAT-3’);PCR反应在EppendorfPCR仪上进行,用常规方法扩增的片段,反应程序如下:95℃预变性3min,95℃变性30s,60℃-56℃退火,每个温度梯度一个循环,1min,55℃-54℃退火,每度4个循环,1min,最后的退火温度为50℃,1min,20个循环,每次退火之后紧接72℃延伸1min,一共33个循环,最后72℃延伸10min,结束以4℃保存;PCR反应体系为25μL,内含10×扩增缓冲液2.5μL,200μMdNTP0.5μL,MgCl22.5μL,正反向引物各0.5μL,模板1μL,TagDNA聚合酶0.2μL,去离子无菌水17.8μL。其中10×扩增缓冲液、TagDNA聚合酶和dNTP均由生工生物工程(上海)有限公司生产;对检测到有清晰明亮条带的PCR产物,保存于-20℃或直接送华大基因进行测序,测序引物与扩增引物一致。
(5)测序后得到的序列首先在软件Chromas中检查峰图质量,确定峰图质量达到数据分析的要求之后,用DNASTAR软件包(DNASTARInc.,USA)中的SeqMan进行正反向序列的拼接;将测序序列合并GenBank数据库中已发表的同种序列,建立包括捕食线虫丝孢菌节丛孢属菌株的基因库。所述基因库包括下述序列编号所示的RPB2基因序列片段:SEQIDNO.1-54。数据库中的RPB2基因序列片段用软件MAFFTv7.149b自动比对,并借助Gblocks0.91b软件优化比对结果。同时,将比对结果导入使用Mega6.0软件计算出捕食线虫丝孢菌节丛孢属的种内最大变异值为0.041。
实施例2:节丛孢属真菌未知物种的鉴定
(1)选疑似但未经鉴定的,节丛孢属纯培养菌株SP1分为两份,一份用传统分类学方法鉴定,另一份用本发明中所用方法鉴定。
(2)采用实施例1中所述步骤提取菌株中的基因组DNA,以SEQIDNO.55和SEQIDNO.56作为引物扩增RPB2基因序列片段。如实施例1所示,进行PCR产物检测、测序、DNA条形码序列获得,然后进行下述结果判定。
(3)通过将待鉴别真菌的序列与基因库内已有的序列之间的进行比对,基于Kimura-2-parameter概率的遗传距离法和基于聚类分析的***发生树法设立鉴定规则来鉴别物种,获得多个序列间的相似性,相似度最高或匹配度最高或遗传距离最小的对应物种即为待鉴别真菌的物种。具体如下:
a.基于Kimura-2-parameter概率的遗传距离法设立鉴定规则来鉴别物种
使用Mega6.0软件计算未鉴定样品DNA条形码序列与数据库中每一个序列的Kimura-2-parameter遗传距离,得到多个序列间最小变异值(即“种间最小变异值”),这些值等于或小于已计算出的种内最大变异值0.041,视为节丛孢属真菌,而未知样品与基因库中的物种少孢节丛孢(Arthrobotrysoligospora)的遗传距离最小,与其三个菌株YMF1.03036、YMF1.03037和YMF1.03255的遗传距离分别为0.001、0和0.006,初步鉴定为少孢节丛孢。
b.基于聚类分析的***发生树法设立鉴定规则来鉴别物种
先应用CLUSTAL软件进行序列比对,应用MEGA或PAUP等软件构建NJ、ML、MP等***发育树,检验未鉴定样品SP1的DNA条形码序列与数据库中少孢节丛孢菌株YMF1.03036和YMF1.03037序列聚类在一起,且构成单支系,如图1所示,鉴定为该物种。
经本方法鉴别后的,得到的结论与传统分类学方法对比,结果一致,但经过比较,本方法对样品的要求比传统方法的要求易得。
SEQUENCELISTING
<110>云南大学
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<213>叶状枝节丛孢(Arthrobotryscladodes)
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<213>囊孢节丛孢(Arthrobotryscystosporia)
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<213>树状节丛孢(Arthrobotrysdendroides)
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<213>秀丽节丛孢(Arthrobotryelegans)
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<213>秀丽节丛孢(Arthrobotryelegans)
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<213>秀丽节丛孢(Arthrobotryelegans)
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<213>厚皮节丛孢(Arthrobotryeudermata)
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<213>厚皮节丛孢(Arthrobotryeudermata)
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<213>鞭式节丛孢(Arthrobotryflagrans)
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<213>纺锤形节丛孢(Arthrobotryfusiformis)
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<213>球状节丛孢(Arthrobotryglobospora)
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<213>贵州节丛孢(Arthrobotryguizhouensis)
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<213>两栖节丛孢(Arthrobotryjanus)
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<213>爪哇节丛孢(Arthrobotryjavanica)
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<213>爪哇节丛孢(Arthrobotryjavanica)
<400>20
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<213>长梗节丛孢(Arthrobotrylongiphora)
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<213>小舟节丛孢(Arthrobotrymicroscaphoides)
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<213>小舟节丛孢(Arthrobotrymicroscaphoides)
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<213>弯孢节丛孢(Arthrobotrymusiformis)
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<213>弯孢节丛孢(Arthrobotrymusiformis)
<400>27
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<213>无膈节丛孢(Arthrobotrynonsepte)
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<213>狮子山节丛孢(Arthrobotryshizishanna)
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<213>中华节丛孢(Arthrobotrysinensis)
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<213>球形节丛孢(Arthrobotrysphaeroides)
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<213>球形节丛孢(Arthrobotrysphaeroides)
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<213>球形节丛孢(Arthrobotrysphaeroides)
<400>47
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<213>多孢节丛孢(Arthrobotrysuperba)
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<213>奇妙节丛孢(Arthrobotrythaumasia)
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<213>奇妙节丛孢(Arthrobotrythaumasia)
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<213>蠕虫状节丛孢(Arthrobotryvermicola)
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<213>蠕虫状节丛孢(Arthrobotryvermicola)
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<213>云南节丛孢(Arthrobotryyunnanensis)
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<213>RPB2基因正向扩增引物
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<213>RPB2基因反向扩增引物
<400>56
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Claims (1)
1.一种用DNA条形码鉴别捕食线虫丝孢菌节丛孢属的方法,其特征在于该方法包括RPB2基因序列片段的基因库的建立和新样品的鉴别步骤;其中:
(1)RPB2基因序列片段的基因库的建立:收集《中国真菌志》第三十三卷《节丛孢及相关属》中记载的节丛孢属概念清晰的种为材料,然后提取其基因组DNA,以其为模板,优选SEQIDNO.55和SEQIDNO.56引物序列扩增样品的RPB2基因序列片段,由此建立包括捕食线虫丝孢菌节丛孢属菌株的基因库;所述基因库包括下述序列编号所示的RPB2基因序列片段:SEQIDNO.1-54;
(2)新样品的鉴别:通过将待鉴别真菌的序列与基因库内已有的序列之间的进行比对,基于Kimura-2-parameter概率的遗传距离法和基于聚类分析的***发生树法设立鉴定规则来鉴别物种,获得多个序列间的相似性,相似度最高或匹配度最高或遗传距离最小的对应物种即为待鉴别真菌的物种;具体如下:
a.基于Kimura-2-parameter概率的遗传距离法设立鉴定规则来鉴别物种
将新的待鉴别样品与此基因库的基因片段进行比对,使用Mega6.0软件计算未鉴定样品DNA条形码序列与数据库中每一个序列的Kimura-2-parameter遗传距离,计算种内种间变异值,鉴别物种;对于基因库内的捕食线虫丝孢菌序列,已经计算出捕食线虫丝孢菌节丛孢属的种内最大变异值,当新的待鉴别样品与此基因库的基因片段进行比对后,得到多个序列间最小变异值即种间最小变异值,这些值等于或小于已计算出的某物种的种内最大变异值,视为与其同一物种;
b.基于聚类分析的***发生树法设立鉴定规则来鉴别物种
应用MEGA或PAUP软件构建NJ、ML、MP***发育树,检验未鉴定样品的DNA条形码序列与数据库中序列聚类在一起的物种,若未知样品与数据库中的物种构成单支系,则鉴定为该物种。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20151118 |