CN113583938A - 体外诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构的方法 - Google Patents

体外诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113583938A
CN113583938A CN202110776877.XA CN202110776877A CN113583938A CN 113583938 A CN113583938 A CN 113583938A CN 202110776877 A CN202110776877 A CN 202110776877A CN 113583938 A CN113583938 A CN 113583938A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
islet
stem cells
culture medium
concentration
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110776877.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN113583938B (zh
Inventor
顾军
顾帅
兰丹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pluripotent Stem Cell Regeneration Medical Technology Guangzhou Co ltd
Original Assignee
Pluripotent Stem Cell Regeneration Medical Technology Guangzhou Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pluripotent Stem Cell Regeneration Medical Technology Guangzhou Co ltd filed Critical Pluripotent Stem Cell Regeneration Medical Technology Guangzhou Co ltd
Priority to CN202110776877.XA priority Critical patent/CN113583938B/zh
Publication of CN113583938A publication Critical patent/CN113583938A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113583938B publication Critical patent/CN113583938B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0676—Pancreatic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0667—Adipose-derived stem cells [ADSC]; Adipose stromal stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0668—Mesenchymal stem cells from other natural sources
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/135—Platelet-derived growth factor [PDGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C12N2506/1384—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from adipose-derived stem cells [ADSC], from adipose stromal stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C12N2506/1392—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from mesenchymal stem cells from other natural sources
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C12N2509/10—Mechanical dissociation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种体外诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构的方法，涉及生物技术领域，方法包括以下步骤：原料组织分离培养得到间充质干细胞；所得间充质干细胞传代培养；对所得传代间充质干细胞进行诱导分化，分化为胰岛样细胞。本发明采用特定的诱导培养基及前处理、诱导培养步骤，能够快速高效体外诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构，方法诱导率高、产物细胞质量高、应用效果好。

Description

体外诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种体外诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构的方法。
背景技术
糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。长期存在的高血糖，导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。
胰岛移植是本世纪兴起的从根本上治疗糖尿病的方法，但前期主要利用胰岛分离后移植，再结合适宜的免疫抑制方案，这类方案极度依赖供体，因此不能实现大规模应用。干细胞分化近年在医疗领域的应用逐渐受到人们的重视和初步开发，也有研究开始将目光投向通过干细胞分化制备胰岛细胞，但目前研究的方法均具有重复性差、产量低等问题，无法实现实验室外的应用，更无法广泛推广到临床应用。在该技术中，至关重要的是诱导干细胞向胰岛样细胞分化的部分，此部分多以间充质干细胞作为原料，间充质干细胞是中胚层中具有高度自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，广泛存在于全身多种组织中，在一定条件下可分化为胰岛β细胞或胰岛素生成细胞。但目前这一操作步骤普遍存在阻碍细胞生长、诱导因子多、诱导周期长、残留因子种类繁多等问题，降低了整体的诱导率，并且对产品的后续应用遗留不良影响。
发明内容
为解决上述现有方法中存在的诱导率低以及对产品质量产生负面影响等问题，本发明提供一种新的能够快速高效体外诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构的方法，诱导率高、产品质量高，具体方案如下：
一种体外诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构的方法，包括以下步骤：
S1、从原料组织分离培养得到间充质干细胞；
S2、所得间充质干细胞传代培养；
S3、对所得传代间充质干细胞进行诱导分化，分化为胰岛样细胞。
优选地，S1所述原料组织包括胎盘组织或脂肪组织中的一种或二种。
优选地，S1所述分离培养，包括：将原料组织清洗后剪碎，使用消化酶消化，离心后获得细胞沉淀，清洗后接种于细胞培养基培养。
优选地，上述消化酶包括Ⅰ型胶原酶或Ⅱ型胶原酶，消化时间45-60min。
优选地，上述离心，条件为1200-1500rpm离心5-8min；上述清洗，采用PBS，清洗3-5次。
优选地，上述接种于细胞培养基后，于37、℃5％CO2、95％饱和湿度条件下培养。
优选地，上述培养，包括：接种后于37、℃5％CO2、95％饱和湿度条件下培养3天后更换一半培养液，再培养3天后更换全部培养液，继续培养，至细胞融合度达80％-90％，除去培养液并清洗细胞，用胰酶消化后重悬稀释，离心取细胞沉淀，用细胞培养液重悬得到间充质干细胞。
优选地，S2所述传代培养包括：所得间充质干细胞加入传代培养基，于37、℃5％CO2、95％饱和湿度条件下培养，待细胞融合度达到80％-90％时，用胰蛋白酶-EDTA溶液进行消化，消化完成后按1:4进行传代培养。
优选地，上述胰蛋白酶-EDTA溶液包括质量浓度为0.25％的胰蛋白酶和质量浓度为0.02％的EDTA。
优选地，上述传代培养基包括：α-MEM培养基、血小板衍生因子、成纤维细胞生长因子和抗坏血酸；所述血小板衍生因子的浓度为10-15ng/mL；所述成纤维细胞生长因子的浓度为10-15ng/mL；所述抗坏血酸的浓度为25-50μg/mL。
优选地，上述传代培养，接种在直径10cm的平皿上，传代接种密度为(1-2)×104/cm2。
优选地，S3所述传代间充质干细胞为P3代以上传代细胞。
优选地，S3所述诱导分化所用诱导培养基，基础培养基为α-MEM培养基，其中包括β细胞素、EGF、尼克酰胺、人碱性成纤维细胞生长因子。
优选地，上述诱导培养基中，β细胞素浓度为3-5μg/L，EGF浓度为120-140pmol/L，尼克酰胺的浓度为15-18mmol/L，人碱性成纤维细胞生长因子浓度为7-10ug/L。
优选地，S3所述诱导分化，包括：将传代间充质干细胞接种于6孔超低吸附培养板中，每孔添加3ml诱导培养基，悬浮诱导，每3天更换诱导培养基，诱导培养时间为5-9天。
优选地，上述接种密度为1.5-2×105cells/孔。
优选地，S3所述诱导培养，在第一次更换诱导培养基前，除去培养基，用胰蛋白酶-EDTA溶液进行消化细胞20-30min，PBS缓冲液清洗细胞3-5次后，每孔添加3ml诱导培养基，继续悬浮诱导，每3天更换诱导培养基，诱导培养总时间为5-7天。
有益效果
本发明的有益效果在于：
本发明提供的体外诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构的方法采用特定的诱导培养基及前处理、诱导培养步骤，能够快速高效体外诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构，方法诱导率高、产物细胞质量高、应用效果好。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
除非特别指出，以下实施例和对比例为平行试验，采用同样的处理步骤和参数。
实施例1体外诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构：
S1、从原料组织分离培养得到间充质干细胞；
S2、所得间充质干细胞传代培养；
S3、对所得传代间充质干细胞进行诱导分化，分化为胰岛样细胞。
S1所述原料组织包括人胎盘组织。
S1所述分离培养，包括：将原料组织清洗后剪碎，使用消化酶消化，离心后获得细胞沉淀，清洗后接种于细胞培养基培养。
上述消化酶包括Ⅰ型胶原酶，消化时间45min。
上述离心，条件为1200rpm离心5min；上述清洗，采用PBS，清洗3次。
上述接种于细胞培养基后，于37、℃5％CO2、95％饱和湿度条件下培养。
上述培养，包括：接种后于37、℃5％CO2、95％饱和湿度条件下培养3天后更换一半培养液，再培养3天后更换全部培养液，继续培养，至细胞融合度达80％-90％，除去培养液并清洗细胞，用胰酶消化后重悬稀释，离心取细胞沉淀，用细胞培养液重悬得到间充质干细胞。
S2所述传代培养包括：所得间充质干细胞加入传代培养基，于37、℃5％CO2、95％饱和湿度条件下培养，待细胞融合度达到80％-90％时，用胰蛋白酶-EDTA溶液进行消化，消化完成后按1:4进行传代培养。
上述胰蛋白酶-EDTA溶液包括质量浓度为0.25％的胰蛋白酶和质量浓度为0.02％的EDTA。
上述传代培养基包括：α-MEM培养基、血小板衍生因子、成纤维细胞生长因子和抗坏血酸；所述血小板衍生因子的浓度为10ng/mL；所述成纤维细胞生长因子的浓度为10ng/mL；所述抗坏血酸的浓度为25μg/mL。
上述传代培养，接种在直径10cm的平皿上，传代接种密度为1×104/cm2。
S3所述传代间充质干细胞为P3代传代细胞。
S3所述诱导分化所用诱导培养基，基础培养基为α-MEM培养基，其中包括β细胞素、EGF、尼克酰胺、人碱性成纤维细胞生长因子。
上述诱导培养基中，β细胞素浓度为3μg/L，EGF浓度为120pmol/L，尼克酰胺的浓度为15mmol/L，人碱性成纤维细胞生长因子浓度为7ug/L。
S3所述诱导分化，包括：将传代间充质干细胞接种于6孔超低吸附培养板中，每孔添加3ml诱导培养基，悬浮诱导，每3天更换诱导培养基，诱导培养时间为5天。
上述接种密度为1.5×105cells/孔。
实施例2体外诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构：
S1、从原料组织分离培养得到间充质干细胞；
S2、所得间充质干细胞传代培养；
S3、对所得传代间充质干细胞进行诱导分化，分化为胰岛样细胞。
S1所述原料组织包括脂肪组织。
S1所述分离培养，包括：将原料组织清洗后剪碎，使用消化酶消化，离心后获得细胞沉淀，清洗后接种于细胞培养基培养。
上述消化酶包括Ⅱ型胶原酶，消化时间60min。
上述离心，条件为1500rpm离心8min；上述清洗，采用PBS，清洗5次。
上述接种于细胞培养基后，于37、℃5％CO2、95％饱和湿度条件下培养。
上述培养，包括：接种后于37、℃5％CO2、95％饱和湿度条件下培养3天后更换一半培养液，再培养3天后更换全部培养液，继续培养，至细胞融合度达80％-90％，除去培养液并清洗细胞，用胰酶消化后重悬稀释，离心取细胞沉淀，用细胞培养液重悬得到间充质干细胞。
S2所述传代培养包括：所得间充质干细胞加入传代培养基，于37、℃5％CO2、95％饱和湿度条件下培养，待细胞融合度达到80％-90％时，用胰蛋白酶-EDTA溶液进行消化，消化完成后按1:4进行传代培养。
上述胰蛋白酶-EDTA溶液包括质量浓度为0.25％的胰蛋白酶和质量浓度为0.02％的EDTA。
上述传代培养基包括：α-MEM培养基、血小板衍生因子、成纤维细胞生长因子和抗坏血酸；所述血小板衍生因子的浓度为15ng/mL；所述成纤维细胞生长因子的浓度为15ng/mL；所述抗坏血酸的浓度为50μg/mL。
上述传代培养，接种在直径10cm的平皿上，传代接种密度为2×104/cm2。
S3所述传代间充质干细胞为P3代传代细胞。
S3所述诱导分化所用诱导培养基，基础培养基为α-MEM培养基，其中包括β细胞素、EGF、尼克酰胺、人碱性成纤维细胞生长因子。
上述诱导培养基中，β细胞素浓度为5μg/L，EGF浓度为140pmol/L，尼克酰胺的浓度为18mmol/L，人碱性成纤维细胞生长因子浓度为10ug/L。
S3所述诱导分化，包括：将传代间充质干细胞接种于6孔超低吸附培养板中，每孔添加3ml诱导培养基，悬浮诱导，每3天更换诱导培养基，诱导培养时间为9天。
上述接种密度为2×105cells/孔。
实施例3体外诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构：
S1、从原料组织分离培养得到间充质干细胞；
S2、所得间充质干细胞传代培养；
S3、对所得传代间充质干细胞进行诱导分化，分化为胰岛样细胞。
S1所述原料组织包括胎盘组织。
S1所述分离培养，包括：将原料组织清洗后剪碎，使用消化酶消化，离心后获得细胞沉淀，清洗后接种于细胞培养基培养。
上述消化酶包括Ⅰ型胶原酶或Ⅱ型胶原酶，消化时间50min。
上述离心，条件为1400rpm离心6min；上述清洗，采用PBS，清洗4次。
上述接种于细胞培养基后，于37、℃5％CO2、95％饱和湿度条件下培养。
上述培养，包括：接种后于37、℃5％CO2、95％饱和湿度条件下培养3天后更换一半培养液，再培养3天后更换全部培养液，继续培养，至细胞融合度达80％-90％，除去培养液并清洗细胞，用胰酶消化后重悬稀释，离心取细胞沉淀，用细胞培养液重悬得到间充质干细胞。
S2所述传代培养包括：所得间充质干细胞加入传代培养基，于37、℃5％CO2、95％饱和湿度条件下培养，待细胞融合度达到80％-90％时，用胰蛋白酶-EDTA溶液进行消化，消化完成后按1:4进行传代培养。
上述胰蛋白酶-EDTA溶液包括质量浓度为0.25％的胰蛋白酶和质量浓度为0.02％的EDTA。
上述传代培养基包括：α-MEM培养基、血小板衍生因子、成纤维细胞生长因子和抗坏血酸；所述血小板衍生因子的浓度为12ng/mL；所述成纤维细胞生长因子的浓度为12ng/mL；所述抗坏血酸的浓度为40μg/mL。
上述传代培养，接种在直径10cm的平皿上，传代接种密度为1.5×104/cm2。
S3所述传代间充质干细胞为P3代传代细胞。
S3所述诱导分化所用诱导培养基，基础培养基为α-MEM培养基，其中包括β细胞素、EGF、尼克酰胺、人碱性成纤维细胞生长因子。
上述诱导培养基中，β细胞素浓度为4μg/L，EGF浓度为130pmol/L，尼克酰胺的浓度为16mmol/L，人碱性成纤维细胞生长因子浓度为9ug/L。
S3所述诱导分化，包括：将传代间充质干细胞接种于6孔超低吸附培养板中，每孔添加3ml诱导培养基，悬浮诱导，每3天更换诱导培养基，诱导培养时间为7天。
上述接种密度为1.7×105cells/孔。
实施例4体外诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构：
S1、从原料组织分离培养得到间充质干细胞；
S2、所得间充质干细胞传代培养；
S3、对所得传代间充质干细胞进行诱导分化，分化为胰岛样细胞。
S1所述原料组织包括胎盘组织。
S1所述分离培养，包括：将原料组织清洗后剪碎，使用消化酶消化，离心后获得细胞沉淀，清洗后接种于细胞培养基培养。
上述消化酶包括Ⅰ型胶原酶或Ⅱ型胶原酶，消化时间50min。
上述离心，条件为1400rpm离心6min；上述清洗，采用PBS，清洗4次。
上述接种于细胞培养基后，于37、℃5％CO2、95％饱和湿度条件下培养。
上述培养，包括：接种后于37、℃5％CO2、95％饱和湿度条件下培养3天后更换一半培养液，再培养3天后更换全部培养液，继续培养，至细胞融合度达80％-90％，除去培养液并清洗细胞，用胰酶消化后重悬稀释，离心取细胞沉淀，用细胞培养液重悬得到间充质干细胞。
S2所述传代培养包括：所得间充质干细胞加入传代培养基，于37、℃5％CO2、95％饱和湿度条件下培养，待细胞融合度达到80％-90％时，用胰蛋白酶-EDTA溶液进行消化，消化完成后按1:4进行传代培养。
上述胰蛋白酶-EDTA溶液包括质量浓度为0.25％的胰蛋白酶和质量浓度为0.02％的EDTA。
上述传代培养基包括：α-MEM培养基、血小板衍生因子、成纤维细胞生长因子和抗坏血酸；所述血小板衍生因子的浓度为12ng/mL；所述成纤维细胞生长因子的浓度为12ng/mL；所述抗坏血酸的浓度为40μg/mL。
上述传代培养，接种在直径10cm的平皿上，传代接种密度为1.5×104/cm2。
S3所述传代间充质干细胞为P3代传代细胞。
S3所述诱导分化所用诱导培养基，基础培养基为α-MEM培养基，其中包括β细胞素、EGF、尼克酰胺、人碱性成纤维细胞生长因子。
上述诱导培养基中，β细胞素浓度为4μg/L，EGF浓度为130pmol/L，尼克酰胺的浓度为16mmol/L，人碱性成纤维细胞生长因子浓度为9ug/L。
S3所述诱导分化，包括：将传代间充质干细胞接种于6孔超低吸附培养板中，每孔添加3ml诱导培养基，悬浮诱导，每3天更换诱导培养基，诱导培养时间为7天。
上述接种密度为1.7×105cells/孔。
S3所述诱导培养，在第一次更换诱导培养基前，除去培养基，用胰蛋白酶-EDTA溶液进行消化细胞25min，PBS缓冲液清洗细胞4次后，每孔添加3ml诱导培养基，继续悬浮诱导，每3天更换诱导培养基，诱导培养总时间为5-7天。
对比例1体外诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构：
S1、从原料组织分离培养得到间充质干细胞；
S2、所得间充质干细胞传代培养；
S3、对所得传代间充质干细胞进行诱导分化，分化为胰岛样细胞。
S1所述原料组织包括胎盘组织。
S1所述分离培养，包括：将原料组织清洗后剪碎，使用消化酶消化，离心后获得细胞沉淀，清洗后接种于细胞培养基培养。
上述消化酶包括Ⅰ型胶原酶或Ⅱ型胶原酶，消化时间50min。
上述离心，条件为1400rpm离心6min；上述清洗，采用PBS，清洗4次。
上述接种于细胞培养基后，于37、℃5％CO2、95％饱和湿度条件下培养。
上述培养，包括：接种后于37、℃5％CO2、95％饱和湿度条件下培养3天后更换一半培养液，再培养3天后更换全部培养液，继续培养，至细胞融合度达80％-90％，除去培养液并清洗细胞，用胰酶消化后重悬稀释，离心取细胞沉淀，用细胞培养液重悬得到间充质干细胞。
S2所述传代培养包括：所得间充质干细胞加入传代培养基，于37、℃5％CO2、95％饱和湿度条件下培养，待细胞融合度达到80％-90％时，用胰蛋白酶-EDTA溶液进行消化，消化完成后按1:4进行传代培养。
上述胰蛋白酶-EDTA溶液包括质量浓度为0.25％的胰蛋白酶和质量浓度为0.02％的EDTA。
上述传代培养基包括：α-MEM培养基、血小板衍生因子、成纤维细胞生长因子和抗坏血酸；所述血小板衍生因子的浓度为12ng/mL；所述成纤维细胞生长因子的浓度为12ng/mL；所述抗坏血酸的浓度为40μg/mL。
上述传代培养，接种在直径10cm的平皿上，传代接种密度为1.5×104/cm2。
S3所述传代间充质干细胞为P3代传代细胞。
S3所述诱导分化所用诱导培养基，包括0.1mmol/Lβ-巯基乙醇、5ug/L人碱性成纤维细胞生长因子、10mmol/L***及含质量浓度为10％的FBS的α-MEM。
S3所述诱导分化，包括：将传代间充质干细胞接种于6孔超低吸附培养板中，每孔添加3ml诱导培养基，悬浮诱导，每3天更换诱导培养基，诱导培养时间为7天。
对比例2体外诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构：
S1、从原料组织分离培养得到间充质干细胞；
S2、所得间充质干细胞传代培养；
S3、对所得传代间充质干细胞进行诱导分化，分化为胰岛样细胞。
S1所述原料组织包括胎盘组织。
S1所述分离培养，包括：将原料组织清洗后剪碎，使用消化酶消化，离心后获得细胞沉淀，清洗后接种于细胞培养基培养。
上述消化酶包括Ⅰ型胶原酶或Ⅱ型胶原酶，消化时间50min。
上述离心，条件为1400rpm离心6min；上述清洗，采用PBS，清洗4次。
上述接种于细胞培养基后，于37、℃5％CO2、95％饱和湿度条件下培养。
上述培养，包括：接种后于37、℃5％CO2、95％饱和湿度条件下培养3天后更换一半培养液，再培养3天后更换全部培养液，继续培养，至细胞融合度达80％-90％，除去培养液并清洗细胞，用胰酶消化后重悬稀释，离心取细胞沉淀，用细胞培养液重悬得到间充质干细胞。
S2所述传代培养包括：所得间充质干细胞加入传代培养基，于37、℃5％CO2、95％饱和湿度条件下培养，待细胞融合度达到80％-90％时，用胰蛋白酶-EDTA溶液进行消化，消化完成后按1:4进行传代培养。
上述胰蛋白酶-EDTA溶液包括质量浓度为0.25％的胰蛋白酶和质量浓度为0.02％的EDTA。
上述传代培养基包括：α-MEM培养基、血小板衍生因子、成纤维细胞生长因子和抗坏血酸；所述血小板衍生因子的浓度为12ng/mL；所述成纤维细胞生长因子的浓度为12ng/mL；所述抗坏血酸的浓度为40μg/mL。
上述传代培养，接种在直径10cm的平皿上，传代接种密度为1.5×104/cm2。
S3所述传代间充质干细胞为P3代传代细胞。
S3所述诱导分化所用诱导培养基，包括0.1mmol/Lβ-巯基乙醇、5ug/L人碱性成纤维细胞生长因子、10mmol/L***及含质量浓度为10％的FBS的α-MEM。
S3所述诱导分化，包括：取第三代胎盘间充质干细胞，质量浓度为0.25％的胰蛋白酶+0.02％EDTA消化细胞，以2×105/mL密度接种于6平板中，24h后，待细胞铺满60％，去除旧培养基，用PBS缓冲液清洗细胞3次，每孔加3mL诱导培养基，诱导培养2天后，去除旧培养基，继续每孔加入3mL诱导培养基培养，以此类推，继续诱导培养14天。
对上述实施例及对比例所得胰岛样细胞分化结果进行鉴定：
设置对照组：与实施例3的区别为：在S3步骤采用含质量浓度为10％的FBS的α-MEM培养基代替诱导培养基。
显微镜观察：未经诱导的胎盘间充质干细胞呈长梭形贴壁生长，诱导后的细胞逐渐变圆，并聚集成团。
(1)双硫腙染色反应：取诱导培养后获得的胰岛样细胞，移出原培养基，PBS洗3次，各加入1mLPBS和50uL双硫腙工作液，37℃孵育10min，移出染色液，PBS洗涤2次，观察细胞着色情况并拍照。
结果：所有实施例和对比例双硫腙染色后呈红色，为阳性反应，对照组为阴性；
(2)化学发光免疫分析法检测胰岛素水平：收集诱导培养后细胞培养的上清，检测胰岛素的含量。
结果：对照组检测胰岛素浓度为零。实施例1-4分别为413mU/L、426mU/L、429mU/L、449mU/L，对比例1为361mU/L，对比例2为313mU/L。可见，本发明的诱导培养基及诱导培养方法可以显著提高诱导效率。
(3)葡萄糖刺激实验：每份样品挑取50个胰岛样细胞团(50-100um)至1.5mL离心管中，用PBS清洗2遍，加入1mL无糖DMEM预培养4h，然后以400uL含有6.0mmol/L葡萄糖、18mmol/L葡萄糖的DMEM依次培养2h，收集上清液，用ELISA法检测上清中不同浓度葡萄糖刺激下胰岛素的分泌量。
结果：对照组细胞上清中几乎检测不到胰岛素。全部实施例及对比例样品在低糖条件下均有胰岛素分泌，且在高糖条件下胰岛素分泌量显著升高，18mmol/L葡萄糖的DMEM依次培养2h后，胰岛素分泌量，实施例3为实施例1的1.17倍，实施例4为实施例3的1.21倍，实施例3为对比例1的1.83倍，实施例3为对比例2的2.76倍。可见，本法发明提供的方法诱导得到的胰岛样细胞，可以根据外界环境葡萄糖刺激程度给出相应反应，并且本发明诱导效率高，细胞质量高，更适用于实际应用。
以上对本发明优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明构思的前提下作出各种变化。

Claims (10)

1.一种体外诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、从原料组织分离培养得到间充质干细胞；
S2、所得间充质干细胞传代培养；
S3、对所得传代间充质干细胞进行诱导分化，分化为胰岛样细胞。
2.根据权利要求1所述的体外诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构的方法，其特征在于：S1所述原料组织包括胎盘组织或脂肪组织中的一种或二种；S1所述分离培养，包括：将原料组织清洗后剪碎，使用消化酶消化，离心后获得细胞沉淀，清洗后接种于细胞培养基培养。
3.根据权利要求2所述的体外诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构的方法，其特征在于：S1所述消化酶包括Ⅰ型胶原酶或Ⅱ型胶原酶，消化时间45-60min；上述离心，条件为1200-1500rpm离心5-8min；上述清洗，采用PBS，清洗3-5次。
4.根据权利要求3所述的体外诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构的方法，其特征在于：S1所述培养，包括：接种后于37℃、5％CO2、95％饱和湿度条件下培养3天后更换一半培养液，再培养3天后更换全部培养液，继续培养，至细胞融合度达80％-90％，除去培养液并清洗细胞，用胰酶消化后重悬稀释，离心取细胞沉淀，用细胞培养液重悬得到间充质干细胞。
5.根据权利要求1所述的体外诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构的方法，其特征在于：S2所述传代培养包括：所得间充质干细胞加入传代培养基，于37℃、5％CO2、95％饱和湿度条件下培养，待细胞融合度达到80％-90％时，用胰蛋白酶-EDTA溶液进行消化，消化完成后按1:4进行传代培养。
6.根据权利要求5所述的体外诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构的方法，其特征在于：S2所述传代培养基包括：α-MEM培养基、血小板衍生因子、成纤维细胞生长因子和抗坏血酸；所述血小板衍生因子的浓度为10-15ng/mL；所述成纤维细胞生长因子的浓度为10-15ng/mL；所述抗坏血酸的浓度为25-50μg/mL。
7.根据权利要求6所述的体外诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构的方法，其特征在于：S2所述传代培养，接种在直径10cm的平皿上，传代接种密度为(1-2)×104/cm2。
8.根据权利要求1所述的体外诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构的方法，其特征在于：S3所述诱导分化所用诱导培养基，基础培养基为α-MEM培养基，其中包括β细胞素、EGF、尼克酰胺、人碱性成纤维细胞生长因子。
9.根据权利要求8所述的体外诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构的方法，其特征在于：S3所述诱导培养基中，β细胞素浓度为3-5μg/L，EGF浓度为120-140pmol/L，尼克酰胺的浓度为15-18mmol/L，人碱性成纤维细胞生长因子浓度为7-10ug/L；S3所述诱导分化，包括：将传代间充质干细胞接种于6孔超低吸附培养板中，每孔添加3ml诱导培养基，悬浮诱导，每3天更换诱导培养基，诱导培养时间为5-9天。
10.根据权利要求9所述的体外诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构的方法，其特征在于：S3所述诱导培养，在第一次更换诱导培养基前，除去培养基，用胰蛋白酶-EDTA溶液进行消化细胞20-30min，PBS缓冲液清洗细胞3-5次后，每孔添加3ml诱导培养基，继续悬浮诱导，每3天更换诱导培养基，诱导培养总时间为5-7天。
CN202110776877.XA 2021-07-09 2021-07-09 体外诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构的方法 Active CN113583938B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110776877.XA CN113583938B (zh) 2021-07-09 2021-07-09 体外诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110776877.XA CN113583938B (zh) 2021-07-09 2021-07-09 体外诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113583938A true CN113583938A (zh) 2021-11-02
CN113583938B CN113583938B (zh) 2023-04-07

Family

ID=78246682

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110776877.XA Active CN113583938B (zh) 2021-07-09 2021-07-09 体外诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113583938B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116574670A (zh) * 2023-05-12 2023-08-11 广东华夏健康生命科学有限公司 一种诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化的方法及其用途

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102618491A (zh) * 2012-03-21 2012-08-01 协和干细胞基因工程有限公司 诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化的培养液及诱导方法和用途
CN105062951A (zh) * 2015-08-06 2015-11-18 深圳爱生再生医学科技有限公司 诱导液和诱导培养基及诱导培养间充质干细胞的方法
CN105132360A (zh) * 2015-09-24 2015-12-09 山东新医学中西医结合医学研究院有限公司 一种诱导胎盘间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法
CN105670986A (zh) * 2015-11-23 2016-06-15 王意忠 一种诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛样细胞的培养基及其诱导方法
CN106854638A (zh) * 2017-01-19 2017-06-16 黑龙江天晴干细胞股份有限公司 一种诱导间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法
CN109847102A (zh) * 2019-02-28 2019-06-07 山西宾大干细胞生物科技有限公司 一种间充质干细胞人工胰岛的制备方法
CN112626011A (zh) * 2020-10-09 2021-04-09 广东芙金干细胞再生医学有限公司 间充质干细胞传代培养方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102618491A (zh) * 2012-03-21 2012-08-01 协和干细胞基因工程有限公司 诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化的培养液及诱导方法和用途
CN105062951A (zh) * 2015-08-06 2015-11-18 深圳爱生再生医学科技有限公司 诱导液和诱导培养基及诱导培养间充质干细胞的方法
CN105132360A (zh) * 2015-09-24 2015-12-09 山东新医学中西医结合医学研究院有限公司 一种诱导胎盘间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法
CN105670986A (zh) * 2015-11-23 2016-06-15 王意忠 一种诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛样细胞的培养基及其诱导方法
CN106854638A (zh) * 2017-01-19 2017-06-16 黑龙江天晴干细胞股份有限公司 一种诱导间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法
CN109847102A (zh) * 2019-02-28 2019-06-07 山西宾大干细胞生物科技有限公司 一种间充质干细胞人工胰岛的制备方法
CN112626011A (zh) * 2020-10-09 2021-04-09 广东芙金干细胞再生医学有限公司 间充质干细胞传代培养方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张卓然等: "《使用细胞培养技术》", 31 December 2012, 人民卫生出版社 *
杨涛等: "《基因诊断与细胞治疗》", 31 August 2018, 科学技术文献出版社 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116574670A (zh) * 2023-05-12 2023-08-11 广东华夏健康生命科学有限公司 一种诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化的方法及其用途
CN116574670B (zh) * 2023-05-12 2024-01-02 中科中銮生物科技(广东)有限公司 一种诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化的方法及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
CN113583938B (zh) 2023-04-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108359636B (zh) 一种提高多能干细胞定向分化为心肌细胞的诱导方法
Ghazanfari et al. Effects of cyclic stretch on proliferation of mesenchymal stem cells and their differentiation to smooth muscle cells
US11339372B2 (en) Serum-free medium inducing differentiation of umbilical cord mesenchymal stem cell into insulin-secretion-like cell and preparation method and use thereof
CN105238751A (zh) 一种脐带组织间充质干细胞的分离培养方法
CN104762260A (zh) 脂肪间充质干细胞及其制剂的制备方法和用途
CN106399230A (zh) 一种皮肤来源的成纤维细胞的培养方法
CN110564681B (zh) 一种乳牙牙髓干细胞的分离培养和神经定向分化方法
CN110747163B (zh) 一种提高人脂肪间充质干细胞成脂分化的方法及其专用培养基
CN106754664B (zh) 一种诱导骨骼肌肌源性干细胞成脂分化的培养基及其应用和成脂分化方法
CN104651305A (zh) 一种利用脐带间充质干细胞获取生物活性蛋白的方法
CN113583938B (zh) 体外诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构的方法
CN109234230B (zh) 一种皮肤间充质干细胞的原代分离方法
CN106834214B (zh) 一种诱导多能干细胞形成角质形成细胞的诱导培养基及诱导方法
CN112877286B (zh) 一种干细胞体外诱导方法
CN112941015B (zh) 一种基于多能干细胞分化制备角质细胞的添加剂及方法
CN108410796A (zh) 一种诱导人间充质干细胞向血管内皮细胞分化的方法
CN112680410B (zh) 诱导多能干细胞分化培养心脏成纤维细胞的方法及其培养液
CN110628712B (zh) 基于诱导多能干细胞的治疗级间充质干细胞制备方法及应用
CN114790443A (zh) 一种间充质干细胞体外培养方法及其培养基
CN109652361A (zh) 一种人脐静脉血管内皮细胞的原代分离培养及鉴定方法
CN113073076A (zh) 一种将多能干细胞分化为瓣膜内皮细胞与瓣膜***的分化方法
CN102776150A (zh) 一种诱导脐带间充质干细胞分化为内皮细胞的方法
CN113046300A (zh) 一种基于多能干细胞分化制备角质细胞的培养方法
CN111733133A (zh) 一种促进表皮干细胞分化和生长的方法
CN102492653B (zh) 一种从成体兔的成熟脂肪细胞诱导分化为心肌样细胞的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant