CN109652361A - 一种人脐静脉血管内皮细胞的原代分离培养及鉴定方法 - Google Patents

一种人脐静脉血管内皮细胞的原代分离培养及鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明主要是涉及生物技术领域细胞的分离、培养与鉴定方法，尤其涉及一种分离培养脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)的方法，内容如下：采用健康产妇新生儿脐带，在生物安全柜内，将预热的I型胶原酶灌注入脐静脉血管，并浸没在预热的生理盐水中消化，消化完成后将静脉血管漂洗，合并离心后弃上清，培养基重悬细胞沉淀即可开始培养，本发明操作简单，整个消化过程处于操作台内，消化温度略低于37℃，适当的增加了消化时间，对于较细小的血管组织不会造成过度消化，同时避免了环境和其它杂细胞的污染风险，所得到的内皮细胞形态、表面的免疫表型及成管特性均为典型的内皮细胞特征，而且剩余的脐带组织仍可用于脐带组织其它细胞的分离处理如脐带间充质干细胞的分离培养。

Description

一种人脐静脉血管内皮细胞的原代分离培养及鉴定方法
技术领域
本发明为人脐静脉血管内皮细胞HUVEC 的原代分离及培养方法，属于生物技术领域。
背景技术
血管内皮细胞为血管内壁单层排列的细胞，在血液与组织的物质交换中起关键作用，其参与维持血管舒缩、抗凝血，并在炎症与免疫反应等方面起重要作用,体内内皮细胞的缺失与功能障碍会导致血管粥样硬化，血栓、脑血管病、糖尿病等疾病的发生，因此对血管内皮细胞研究将会为缺血性疾病的治疗及血管组织工程提供重要的帮助。
在内皮细胞的基础研究中，新生儿脐带取材方便，不受伦理限制，从其中分离得到的人体脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)可广泛用于实验研究的血管内皮细胞，亦可作为研究某些病理状态的模型，本实验应用改良酶TrypLE消化法进行HUVECs的原代分离、体外培养和扩增鉴定，获得高质量高纯度的内皮细胞，以用于血管内皮细胞的相关研究。
目前内皮细胞的分离均根据Jaffe的方法演变而来，使用酶在37℃水浴灌注消化，但这消化过程为半封闭的环境，使用水浴容易污染，且需要较大的容器，在37℃的温度下，较难控制消化时间，尤其对于细小的血管组织容易造成消化过度，从而影响细胞的纯度。
发明内容
本发明研究一种简单的脐静脉血管内皮细胞的分离及培养方法。
本发明是通过以下步骤得到的。
（1）取新生儿15-20cm 长的脐带，剪去两端有钳夹痕及血肿的部分，排出静脉血管中的污血血，用50ml注射器吸入部分生理盐水，去掉针头，***脐带静脉血管一端口处，冲洗脐带静脉血管，直至无血液流出。
（2）脐带用止血钳封住一端，用注射器从另一端灌入约5mL 0.1%Ⅰ型胶原酶使其充盈整个脐带，用脐带夹夹住两端端口。
（3）将脐带放置在15cm培养皿中，加入37℃预热的生理盐水，覆盖整根脐带，消化35~45min，消化完毕打开止血钳，将消化液流入事先准备好的离心管中，然后用生理盐水冲洗管腔3遍以上，流出液合并收集于离心管，400g，离心8min。
（4）离完心后使用4ml内皮细胞完全培养基培养基重悬沉淀，接种于1个T25中，置于5% CO2饱和度的37℃孵箱中静置培养，细胞培养12-24h后进行全量换液以除去未贴壁的细胞及残余组织直至细胞生长汇合至80%以上，进行细胞传代。
（5）细胞传代：倒掉培养基，用生理盐水清洗2 次，加入37℃预热的胰酶消化细胞，在显微镜下观察，一旦大部分细胞变圆，即加入3 倍的生理盐水稀释反应；用移液管将细胞吹打下来，并转移到一个50ml无菌离心管中，400g，离心8min，倒掉上清，新鲜培养基重悬，按照1.1×104/cm2接种传代。使用P3以前的细胞进行实验。
（6）细胞鉴定：形态学观察：在换液传代之前均需进行倒置显微镜下观察细胞形态和状态，HUVEC贴壁单层生长，呈短梭状或铺路石样镶嵌排列，细胞为扁平多角形；细胞表面免疫标记物检测：在血管内皮祖细胞逐步分化为成熟管内皮细胞的过程中，早期干细胞的表面标志CD133的表达下降，而CD34和VEGFR-2表达升高，并开始表达CD31、Ⅷ因子相关抗原vWF(von Willebrand factor)等成熟内皮细胞的标志，贴壁细胞洗涤2次，0.25%胰酶/EDTA消化后制成细胞悬液，过滤，密度为1 ×106/ml，每份细胞悬液取150 μL×2分装2个试管，分别加入FITC-KDR，FITC-CD31，FITC-vWF各10 μL，避光反应30 min，PBS洗涤2次测定，上机后收集10000个细胞，结果以各种抗原表达阳性百分率表示，成管能力的检测：96孔板每孔加入400μlMatrigel，37℃固化1h后，按5000/孔、 10000/孔、20000/孔的密度接种HUVEC（优选20000/孔），放置培养箱孵育3~6h后观察。
本发明的分离HUVEC方法操作简单，整个消化过程处于操作台内，消化温度略低于37℃，适当的增加了消化时间，对于较细小的血管组织不会造成过度消化，同时避免了环境和其它杂细胞的污染风险。所得到的内皮细胞形态、表面的免疫表型及成管特性均为典型的内皮细胞特征，而且剩余的脐带组织仍可用于脐带间充质干细胞等其它细胞的分离培养。
附图说明
图1为原代分离培养人脐静脉内皮细胞的形态学观察 A：接种24h后有少量细胞贴壁；B：细胞增殖至90%以上汇合。
图2为HUVEC血管形成能力的检测结果。
图3为脐静脉血管内皮细胞流式检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施实例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
（1) HUVEC 的分离：取新生儿15-20cm 长的脐带，剪去有钳夹痕及血肿的部分，挤出脐带中的血，用剪刀修齐两断面，放入15cm培养皿；用一个50ml注射器***脐带静脉管中，用37℃预热的生理盐水冲洗3次，至无血液流出；用止血钳封住一端，用注射器从另一端灌入约5mLⅠ型胶原酶使其充盈整个脐带，夹住端口，将脐带放置在15cm培养皿中，加入预热的生理盐水，覆盖整根脐带，消化30min，消化期间经常翻动脐带，使酶溶液在血管内流动，促使内皮细胞与酶均匀接触，消化完毕打开止血钳，将消化液流入事先准备好的离心管中，然后用生理盐水冲洗管腔3遍以上，流出液合并收集于离心管，400g，离心8min，离完心后重悬沉淀，接种于1个T25中，置于5% CO2饱和度的37℃孵箱中静置培养，细胞培养12-24h后进行全量换液以除去未贴壁的细胞及残余组织，用10ml移液管将培养上清吸出丢弃，另取一支新的10ml移液管取新鲜培养基于培养瓶，4ml/瓶。以后3天换一次培养基，直至细胞生长汇合至80%以上，进行细胞传代。
（2）HUVEC 的传代：倒掉培养基，用生理盐水清洗2 次，加入1.5ml 37℃预热的0.25%的胰酶消化细胞，在显微镜下观察，一旦大部分细胞变圆，即加入3 倍的生理盐水终止反应；用移液管将细胞吹打下来，并转移到一个50ml无菌离心管中，400g，离心8min,倒掉上清，新鲜培养基重悬，按照1：3接种传代，使用P3以前的细胞进行实验。
（3) HUVEC的鉴定：
1） 形态学观察：细胞贴壁单层生长，呈短梭状或铺路石样镶嵌排列，细胞为扁平多角形，见图1；
2)细胞表面免疫标记物的检测：贴壁细胞洗涤2次，0.25%胰酶/EDTA消化后制成细胞悬液，过滤，密度为1 ×106/ml，每份细胞悬液取150 μL×2分装2个试管，分别加入FITC -KDR，FITC-CD31，FITC-vWF各10 μL，避光反应30 min，PBS洗涤2次测定，上机后收集10000个细胞，结果以各种抗原表达阳性百分率表示，见图3；
3)成管能力的检测：96孔板每孔加入400μlMatrigel，37℃固化1h后，按5000/孔、10000/孔、20000/孔的密度接种HUVEC （优选20000/孔），放置培养箱孵育3~6h后观察，见图2。

Claims (10)

1.技术方案本发明主要是一种脐静脉血管内皮细胞(human umbilical veinendothelial cell，HUVEC)的原代分离、培养与鉴定方法，包括了以下步骤：
（1）取新生儿15-20cm 长的脐带，剪去两端有钳夹痕及血肿的部分，用镊子排出静脉血管中的血，用一个50ml注射器吸入部分生理盐水，去掉针头，***脐带静脉血管一端口处，冲洗脐带静脉血管，直至无血液流出；
（2）脐带用止血钳封住一端脐静脉，用注射器从另一端灌入约5mL 0.1%Ⅰ型胶原酶使其充盈整个脐静脉，用脐带夹夹住两端端口；
（3）放置在15cm培养皿中，加入37℃预热的生理盐水，覆盖整根脐带，消化35~45min，消化完毕打开脐带夹，将消化液流入事先准备好的离心管中，然后用生理盐水冲洗管腔至少3遍，流出液合并收集于离心管，400g，离心8min；
（4）离完心后使用4ml 血管内皮细胞完全培养基重悬沉淀，接种于1个T25中，置于5%CO2饱和度的37℃孵箱中静置培养，细胞培养12-24h后进行全量换液以除去未贴壁的细胞及残余组织直至细胞生长汇合至80%以上，进行细胞传代；
（5）细胞传代：倒掉培养基，用生理盐水清洗2 次，加入37℃预热的TrypLE消化细胞，在显微镜下观察，一旦大部分细胞变圆，即加入3 倍的生理盐水稀释反应；用移液管将细胞吹打下来，并转移到一个50ml无菌离心管中，400g，离心8min，倒掉上清，新鲜培养基重悬，按照1.1×104/cm2接种传代，使用P3以前的细胞进行实验；
（6）HUVEC的鉴定：
1） 形态学观察：在换液传代之前均需进行倒置显微镜下观察细胞形态和状态，HUVEC贴壁单层生长，呈短梭状或铺路石样镶嵌排列，细胞为扁平多角形；
2)细胞表面免疫标记物检测：收集生长对数期的P3细胞，贴壁细胞洗涤2次，0.25%胰酶/EDTA消化后制成细胞悬液，过滤，密度为1 ×106/ml，每份细胞悬液取150 μL×2分装2个试管，分别加入FITC-KDR，FITC-CD31，FITC-vWF各10 μL，避光反应30 min，PBS洗涤2次测定，上机后收集10000个细胞，结果以各种抗原表达阳性百分率表示；
3)成管能力的检测：96孔板每孔加入400μlMatrigel，37℃固化1h后，按5000/孔、10000/孔、20000/孔的密度接种HUVEC （优选20000/孔），放置培养箱孵育3~6h后观察。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（4）血管内皮细胞完全培养基，该培养基是由DMEM/F12，低浓度胎牛血清(2%)，hEGF，皮质醇，庆大霉素和两性霉素B，hVEGF，hbFGF，R3 -IGF-1，抗坏血酸，以及肝素钠配制而成。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（2）中Ⅰ型胶原酶浓度为0.1%；使用体积为0.4ml/cm长血管；消化时间为40min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（3）消化的操作过程在生物安全柜内进行，所需Ⅰ型胶原酶和生理盐水需提前预热至37℃。
5.根据权利要求4所述的方法，用注射器从脐带一端灌入Ⅰ型胶原酶使其充盈整个脐带，用脐带夹夹住两端端口，将脐带放置在15cm培养皿中，加入37℃预热的生理盐水，覆盖整根脐带。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（5），使用胰酶消化获得HUVEC后，以1.1×104/cm2的密度接种传代至175cm2内，放入37℃、5%CO2、饱和湿度中进行培养。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（3）中消化使用容器为15cm培养皿。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1）中脐带是24h内采集的。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（6）中的鉴定方法为细胞形态状态、流式检测细胞表面标记FITC-KDR，FITC-CD31，FITC-vWF和细胞的血管形成能力的检测来鉴定脐静脉血管内皮细胞。
10.根据根据权利要求9所述的方法，血管形成能力检测的过程为，96孔板每孔加入400μlMatrigel，37℃固化1h后，按5000~20000/孔（优选20000/孔）的密度接种HUVEC，放置培养箱孵育3~6h（优选4h）后，镜下观察拍照。
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